Claims (2)
1. Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза, включающий серологический анализ сывороток больных животных в иммуноферментном анализе (ИФА) и обнаружение противобруцеллезных антител, отличающийся тем, что серологический анализ сывороток в ИФА проводят с использованием меченного пероксидазой хрена антигенного иммуноферментного конъюгата (ИФК), в котором в качестве носителя специфического антигена используют электрофоретически очищенную в полиакриламидном геле (ПААГ) полипептидную фракцию с молекулярной массой (м.м.), 41,8 кД и по количеству продуктов ферментативной реакции определяют наличие искомых антител и ставят диагноз на бруцеллез, а за диагностический титр (дифференциальный критерий) специфических антител в ИФА принимают положительную реакцию в разведениях исследуемых сывороток 1:100 и выше с коэффициентом специфичности (Ксп) 2,1 и выше.1. A method for differential diagnosis of brucellosis, including serological analysis of sera of sick animals in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and detection of anti-brucellosis antibodies, characterized in that the serological analysis of serum in ELISA is carried out using horseradish peroxidase-labeled antigenic enzyme-linked immunosorbent enzyme (IFA), in which as a specific antigen carrier, a polypeptide fraction with a molecular weight (m.m.) of 41.8 kD and the amount of enzymatic reaction products is determined by the presence of the desired antibodies and diagnosed with brucellosis, and for the diagnostic titer (differential criterion) of specific antibodies in ELISA, a positive reaction is taken in dilutions of the studied sera 1: 100 and higher with a specificity coefficient (Ksp) of 2.1 and higher.
2. Способ получения противобруцеллезного антигенного иммуноферментного конъюгата (ИФК) для дифференциации больных бруцеллезом животных от вакцинированных, включающий извлечение из дезинтегрированных бруцелл специфического антигена для ИФА-теста используют электрофоретически очищенную в полиакриламидном геле (ПААГ) полипептидную фракцию с м.м. 41,8 Кд, получаемую путем радиоинактивации вирулентного штамма бруцелл В.abortus 54 в дозе 3,0-3,5·104 Гр, растворения их в лизирующем растворе, приготовленном на 0,062-0,125 м трис-HCl-буфере рН-6,8 и содержащем 2-5% додецилсульфата натрия (SDSNa) и 5 N (β-меркапэтанолам, наносят пробы в лунки концентрирующего геля в количестве 50-100 мкг по белку и электрофорезе при режимах 40 мА на две пластин геля до вхождения красят и после вхождения красителя при силе тока 80 мА на две пластины в течение 2-2,5 ч с последующей фиксацией пластин геля в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 1 ч и окрашиванием после окончания электрофореза их в 0,1%-ном растворе "кумасси" бриллиантовым голубым R-250, дополнительным окрашиванием фракционированных в ПААГ полипептидов серебром с использованием раствора формальдегида, денситометрирования пластин гелей на сканере Sharp 330 Vx в проходящем свете, определения молекулярной массы и иммунологической компетентности фракций методом иммуноблотинга, специфическую и серологическую активную фракцию вырезают из гелевых пластин, элюируют 0,1%-ным раствором HCl, определяют в полученной фракции антигена содержание белка по Лоури, доводят его содержание до 10 мг/мл и проводят конъюгирование полипептидной фракции с ферментной меткой - пероксидазой хрена из расчета 20 мг белка на 1 мг пероксидазы, конъюгирование проводят при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 20 мин, полученный иммунопероксидазный конъюгат (ИФК) используют в качестве специфического антигенного диагностикума в ИФА.2. A method for producing anti-brucellosis antigenic enzyme-linked immunosorbent conjugate (IFC) for differentiating animals with vaccinated brucellosis from vaccinated animals, comprising extracting a specific antigen from the disintegrated brucella for the ELISA test using polyacrylamide gel (PAG) electrophoretically purified polypeptide fraction m with m. 41.8 cd obtained by radioactivation of a virulent strain of B. abortus 54 brucella in a dose of 3.0-3.5 · 10 4 Gy, dissolving them in a lysis solution prepared on 0.062-0.125 m Tris-HCl-buffer pH-6, 8 and containing 2-5% sodium dodecyl sulfate (SDSNa) and 5 N (β-mercapetanolam), apply samples to the wells of a concentration gel in an amount of 50-100 μg for protein and electrophoresis at 40 mA on two plates of the gel before entering and stain and after entering dye at a current strength of 80 mA on two plates for 2-2.5 hours, followed by fixation of the gel plates in a solution containing 40% isopropyl alcohol and 10% acetic acid for 1 h and staining after electrophoresis of them in 0.1% Coomassie solution with brilliant blue R-250, additional staining of polypeptides fractionated in PAG with silver using formaldehyde solution, densitometry of gel plates on Sharp 330 Vx scanner in transmitted light, determining the molecular weight and immunological competence of the fractions by immunoblotting, the specific and serological active fraction are cut out from gel plates, eluted with 0.1% HC l, determine the protein content in the obtained antigen fraction according to Lowry, adjust its content to 10 mg / ml and conduct conjugation of the polypeptide fraction with the enzyme label - horseradish peroxidase at the rate of 20 mg of protein per 1 mg of peroxidase, conjugation is carried out with constant stirring at room temperature in for 20 min, the resulting immunoperoxidase conjugate (IFC) is used as a specific antigenic diagnosticum in ELISA.