Claims (4)
1. Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (рчГ-КСФ), пригодного для медицинского применения, из нерастворимых тел включения рекомбинантных клеток Е.coli, трансформированных плазмидой, содержащей ген Г-КСФ человека, предусматривающий разрушение бактериальных клеток, выделение тел включения, удаление примесных белков, растворение тел включения, восстановление, ренатурацию, хроматографическую очистку и стабилизацию рчГ-КСФ, при этом удаление примесных белков из тел включения проводят нейтральным буферным раствором, содержащим детергенты и мочевину, растворение тел включения проводят 6-8 М мочевиной или 4-6 М гуанидинхлоридом, восстановление проводят 2-меркаптоэтанолом или дитиотриэтолом, ренатурацию восстановленного рчГ-КСФ проводят разбавлением нейтральным буфером с рН 7-9, содержащим детергенты, глицерин и этилендиаминтетрауксусную кислоту до концентрации суммарного белка 0,3-0,1 мг/мл при температуре 4-20°С в течение 20-48 часов или при помощи диализа восстановленного рчГ-КСФ против буфера с рН 7-9, содержащего детергенты, глицерин и ЭДТА при температуре 4-20°С в течение 20-48 часов, хроматографическую очистку рчГ-КСФ осуществляют при помощи ионообменной хроматографии при разных рН в две стадии, сначала на анионообменном сорбенте при рН 7-9 и затем на последовательно соединенных анионообменном и катиоонообменном сорбентах при рН 4-5 с последующим элюированием целевого белка с катионообменного сорбента в линейном градиенте хлористого натрия (от 0,2 до 1,0 М) в буфере с рН 4-5, и стабилизацию рчГ-КСФ осуществляют при помощи диализа против буфера с рН 4-5, с последующим добавлением к раствору рчГ-КСФ полисахаридов, или многоатомных спиртов, или поливинилпирролидонов, или моносахаридов, или аминосахаров, или белка, или аминокислот и детергентов.1. A method for the preparation, isolation, purification and stabilization of a recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF), suitable for medical use, from insoluble inclusion bodies of recombinant E. coli cells transformed with a plasmid containing the human G-CSF gene, which destroys bacterial cells , isolation of inclusion bodies, removal of impurity proteins, dissolution of inclusion bodies, restoration, renaturation, chromatographic purification and stabilization of rhG-CSF, while removal of impurity of trays from inclusion bodies is carried out with a neutral buffer solution containing detergents and urea, dissolution of inclusion bodies is carried out with 6-8 M urea or 4-6 M guanidine chloride, restoration is carried out with 2-mercaptoethanol or dithiotriethol, renaturation of the reduced rhG-CSF is carried out by dilution with a neutral buffer with pH 7 -9 containing detergents, glycerol and ethylenediaminetetraacetic acid to a total protein concentration of 0.3-0.1 mg / ml at 4-20 ° C for 20-48 hours or by dialysis of reduced rcG-CSF against the buffer pH 7-9, containing detergents, glycerin and EDTA at a temperature of 4-20 ° C for 20-48 hours, chromatographic purification of rhG-CSF is carried out using ion exchange chromatography at different pH in two stages, first on an anion exchange sorbent at pH 7- 9 and then on series-connected anion-exchange and cation-exchange sorbents at pH 4-5, followed by elution of the target protein from the cation-exchange sorbent in a linear gradient of sodium chloride (from 0.2 to 1.0 M) in a buffer with a pH of 4-5, and stabilization of rhG -KSF carried out using dialysis against buffer with a pH of 4-5, followed by the addition of polysaccharides, or polyols, or polyvinylpyrrolidones, or monosaccharides, or amino sugars, or protein, or amino acids and detergents to the rhG-CSF solution.
2. Способ по п.1, где в качестве детергента используют неионные, ионные или амфотерные детергенты или их смесь.2. The method according to claim 1, where non-ionic, ionic or amphoteric detergents or a mixture thereof is used as a detergent.
3. Способ по п.1 и 2, где полученный рчГ-КСФ хранят в полимерных или стеклянных емкостях с силиконизированной поверхностью при 4±2°С.3. The method according to claim 1 and 2, where the resulting rcG-CSF is stored in polymer or glass containers with a siliconized surface at 4 ± 2 ° C.
4. Иммунобиологическое средство, стимулирующее гемопоез, представляющее собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека, полученный, выделенный, очищенный и стабилизированный в соответствии с пп.1-3.4. An immunobiological agent that stimulates a hematopoiesis, which is a granulocyte colony stimulating factor in humans, obtained, isolated, purified and stabilized in accordance with claims 1-3.