Claims (17)
1. Способ удлинения праймера или пары праймеров с использованием ферментативной циклической реакции удлинения праймера при температурах ниже, чем приблизительно 80°C, включающий стадию смешивания ДНК-матрицы с праймером или парой праймеров и встречающийся в природе или модифицированной формой умеренно термостабильной ДНК-полимеразы из организма, выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax и Bacillus caldolyticus, в растворе, содержащем примерно от 10 до 20% (об./об.) глицерина, этиленгликоля или их смеси, в таких условиях, что температура циклической реакции колеблется между температурой плавления, примерно равной 70°C, и температурой отжига, примерно равной 37°C, так что ДНК-полимераза неоднократно удлиняет праймер или пару праймеров.1. A method of extending a primer or a pair of primers using the enzymatic cyclic reaction of primer extension at temperatures lower than about 80 ° C, comprising the step of mixing a DNA template with a primer or a pair of primers and occurring in nature or in a modified form of a moderately thermostable DNA polymerase from the body selected from the group consisting of Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax and Bacillus caldolyticus, in a solution containing from about 10 to 20% (vol./about.) glycerol, ethylene glycol or mixtures thereof, under conditions such that the temperature The reaction cycle fluctuates between a melting point of approximately 70 ° C and an annealing temperature of approximately 37 ° C, so that DNA polymerase repeatedly extends the primer or pair of primers.
2. Способ по п.1, где глицерин, этиленгликоль или их смесь присутствует в концентрации, примерно равной 15% (об./об.).2. The method according to claim 1, where glycerin, ethylene glycol or a mixture thereof is present in a concentration of approximately equal to 15% (vol./vol.).
3. Способ по п.1, где ДНК-полимераза характеризуется оптимальной ферментативной активностью, при примерно 65°C.3. The method according to claim 1, where the DNA polymerase is characterized by optimal enzymatic activity, at about 65 ° C.
4. Способ по п.1, где ДНК-полимераза характеризуется аминокислотной последовательностью, которая проявляет не менее 95% гомологии в отношении ДНК-полимеразы, выделенной из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus.4. The method according to claim 1, where the DNA polymerase is characterized by an amino acid sequence that exhibits at least 95% homology with respect to DNA polymerase isolated from Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax or Bacillus caldolyticus.
5. Способ по п.1, который включает дальнейшую стадию повторения циклической реакции удлинения праймера.5. The method according to claim 1, which includes a further step of repeating the cyclic reaction of primer extension.
6. Способ по п.1, где копии выбранного сегмента двухцепочечной ДНК амплифицируют в присутствии прямого праймера и обратного праймера на матрице путем неоднократных циклов нагревания и охлаждения.6. The method according to claim 1, where copies of the selected double-stranded DNA segment are amplified in the presence of a forward primer and a reverse primer on the matrix by repeated heating and cooling cycles.
7. Способ по п.6, где прямой праймер и обратный праймер могут быть различных длин.7. The method according to claim 6, where the forward primer and reverse primer can be of various lengths.
8. Способ по п.1, где молекулы единственного праймера различной длины удлиняются с терминациями на специфичных нуклеотидах в присутствии ddNTP или их аналогов для циклического секвенирования.8. The method according to claim 1, where the molecules of a single primer of various lengths are extended with terminations on specific nucleotides in the presence of ddNTP or their analogues for cyclic sequencing.
9. Способ удлинения молекул праймера, подвергнутого отжигу на ДНК-матрицу, для прямого циклического секвенирования амплифицированных in vitro двухцепочечных продуктов ДНК без предварительного выделения или очистки, включающий стадии:9. A method of lengthening primer molecules annealed to a DNA template for direct cyclic sequencing of in vitro amplified double-stranded DNA products without prior isolation or purification, comprising the steps of:
(i) смешивания разведенного неочищенного амплифицированного продукта реакции с избыточным количеством секвенирующего праймера, четырьмя стандартными ddNTP-терминаторами или соответствующими им аналогами, встречающейся в природе или модифицированной формой умеренно термостабильной ДНК-полимеразы, относящейся к организму, выбранному из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax и Bacillus caldolyticus, подходящей концентрацией dNTP, и композицией, включающей буфер в растворе, содержащем примерно от 10 до 20% глицерина, этиленгликоля или их смеси, и(i) mixing the diluted crude amplified reaction product with an excess of sequencing primer, four standard ddNTP terminators or their corresponding analogs, a naturally occurring or modified form of a moderately thermostable DNA polymerase belonging to an organism selected from the group consisting of Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax and Bacillus caldolyticus, a suitable concentration of dNTP, and a composition comprising a buffer in a solution containing from about 10 to 20% glycerol, ethylene glycol, or a mixture thereof, and
(ii) осуществления циклической(-их) реакции(-ий) удлинения праймера при температуре ниже 80°C столько раз, сколько достаточно для удлинения молекул секвенирующего праймера до требуемых длин, причем данные молекулы специфично терминируются посредством ddNTP или соответствующих им аналогов.(ii) carrying out the cyclic reaction (s) of primer extension at a temperature below 80 ° C as many times as is sufficient to extend the molecules of the sequencing primer to the desired lengths, these molecules being specifically terminated by ddNTP or their corresponding analogues.
10. Способ по п.9, где амплифицированные in vitro двухцепочечные ДНК-продукты получают путем удлинения праймера или пары праймеров с использованием ферментативной циклической реакции удлинения праймера при температурах ниже, чем примерно 80°C, включающий стадию смешивания целевого сегмента ДНК с праймером или парой праймеров и встречающейся в природе или модифицированной формой умеренно термостабильной ДНК-полимеразы из организма, выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax и Bacillus caldolyticus, в растворе, содержащем примерно от 10 до 20% (об./об.) глицерина, этиленгликоля или их смеси, в таких условиях, что температура циклической реакции колеблется между температурой плавления, примерно равной 70°C, и температурой охлаждения, примерно равной 37°C, так что ДНК-полимераза неоднократно удлиняет праймер или пару праймеров.10. The method according to claim 9, where the amplified in vitro double-stranded DNA products are obtained by extension of a primer or a pair of primers using an enzymatic cyclic reaction of primer extension at temperatures lower than about 80 ° C, comprising the step of mixing the target DNA segment with a primer or a pair primers and naturally occurring or modified form of moderately thermostable DNA polymerase from an organism selected from the group consisting of Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax and Bacillus caldolyticus, in a solution containing from about 1 0 to 20% (v / v) glycerol, ethylene glycol or mixtures thereof, under such conditions that the temperature of the cyclic reaction varies between a melting point of approximately 70 ° C and a cooling temperature of approximately 37 ° C, so that DNA -polymerase repeatedly extends the primer or a pair of primers.
11. Способ по п.9, где умеренно термостабильная ДНК-полимераза характеризуется аминокислотной последовательностью, которая проявляет не менее 95% гомологии в отношении ДНК-полимеразы, выделенной из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus.11. The method according to claim 9, where the moderately thermostable DNA polymerase is characterized by an amino acid sequence that exhibits at least 95% homology with respect to DNA polymerase isolated from Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax or Bacillus caldolyticus.
12. Сухая или жидкая готовая к употреблению реакционная смесь, подходящая для применения в низкотемпературной циклической реакции удлинения праймера при температурах ниже, чем примерно 80°C, включающая умеренно термостабильную, встречающуюся в природе или модифицированную ДНК-полимеразу из организма, выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus, которая предварительно смешана, по крайней мере, с одним компонентом ферментативной реакции удлинения ДНК-праймера, подходящим для применения при амплификации ДНК или для специфичных терминаций удлинения посредством дидезоксирибонуклеотидных аналогов.12. A dry or liquid ready-to-use reaction mixture suitable for use in a low temperature cyclic primer extension reaction at temperatures lower than about 80 ° C, including moderately thermostable, naturally occurring or modified DNA polymerase from an organism selected from the group consisting of from Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax or Bacillus caldolyticus, which is pre-mixed with at least one component of the enzymatic extension reaction of the DNA primer, suitable for use in amplification of DN To or for specific terminations of extension by dideoxyribonucleotide analogues.
13. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.12, где умеренно термостабильная ДНК-полимераза представляет собой встречающуюся в природе или модифицированную ДНК-полимеразу из организма выбранного из группы, состоящей из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus, или умеренно термостабильную ДНК-полимеразу, характеризующейся аминокислотной последовательностью, которая проявляет не менее 95% гомологии в отношении ДНК-полимеразы, выделенной из Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax или Bacillus caldolyticus.13. The ready-to-use reaction mixture of claim 12, wherein the moderately thermostable DNA polymerase is a naturally occurring or modified DNA polymerase from an organism selected from the group consisting of Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax or Bacillus caldolyticus, or moderately thermostable DNA a polymerase characterized by an amino acid sequence that exhibits at least 95% homology with respect to DNA polymerase isolated from Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax or Bacillus caldolyticus.
14. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.12, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам.14. The ready-to-use reaction mixture according to claim 12, which is pre-distributed in microcentrifuge tubes or multi-well plates.
15. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.13, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам.15. The ready-to-use reaction mixture according to claim 13, which is pre-distributed in microcentrifuge tubes or multi-well plates.
16. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.14, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам и остается стабильной при температурах от 22 до 25°C, по крайней мере, в течение восьми недель.16. The ready-to-use reaction mixture of claim 14, which is pre-distributed in microcentrifuge tubes or multi-well plates and remains stable at temperatures from 22 to 25 ° C for at least eight weeks.
17. Готовая к употреблению реакционная смесь по п.15, которая предварительно распределена по микроцентрифужным пробиркам или многолуночным планшетам и остается стабильной при температурах от 22 до 25°C, по крайней мере, в течение восьми недель.17. The ready-to-use reaction mixture according to claim 15, which is pre-distributed in microcentrifuge tubes or multi-well plates and remains stable at temperatures from 22 to 25 ° C for at least eight weeks.