Claims (13)
1. Способ получения очищенных рекомбинантных белков в растворимой биологически активной форме как физиологического раствора, который является непосредственно приемлемым для медицинского использования, при этом указанные белки получают из белковых агрегатов (“телец включения”), полученных в результате бактериальной экспрессии, и которые являются нерастворимыми в экспрессионной среде, отличающийся тем, что включает следующие этапы: помещение выделенных нерастворимых белковых агрегатов в органические денатурирующие реагенты, очистку раствора, полученного на этапе (i) путем, по крайней мере, одного хроматографического этапа при использовании существенно неорганических, небуферированных, щелочных, солесодержащих элюентов, и нейтрализацию щелочного раствора, полученного в результате заключительного этапа очистки, при этом указанный раствор содержит растворенный, ренатурированный и биологически активный белок.1. A method of obtaining purified recombinant proteins in a soluble biologically active form as a physiological solution that is directly acceptable for medical use, while these proteins are obtained from protein aggregates (“inclusion bodies”) resulting from bacterial expression, and which are insoluble in expression medium, characterized in that it includes the following steps: placement of the selected insoluble protein aggregates in organic denaturing reagents, purification the solution obtained in step (i) by at least one chromatographic step using substantially inorganic, unbuffered, alkaline, saline-containing eluents, and neutralizing the alkaline solution obtained as a result of the final purification step, wherein said solution contains dissolved, renatured and biologically active protein.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемым денатурирующим реагентом является гидрохлорид гуанидина.2. The method according to claim 1, characterized in that the denaturing reagent used is guanidine hydrochloride.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемый денатурирующий реагент удаляется из денатурирующего раствора путем связывания растворенного рекомбинантного белка с хроматографическим материалом и замены денатурирующего раствора на существенно неорганический, небуферированный, щелочной элюент, который имеет концентрацию соли, обеспечивающую связывание белка с указанным материалом обменника.3. The method according to claim 1, characterized in that the denaturing reagent used is removed from the denaturing solution by binding the dissolved recombinant protein to the chromatographic material and replacing the denaturing solution with a substantially inorganic, unbuffered, alkaline eluent that has a salt concentration that provides protein binding to the specified exchanger material.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что связанный рекомбинантный белок элюируют с помощью увеличивающейся концентрации соли и в процессе обработки освобождают от загрязнений.4. The method according to claim 3, characterized in that the bound recombinant protein is eluted using an increasing salt concentration and freed from contamination during processing.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что увеличения концентрации соли достигают путем создания градиента.5. The method according to claim 4, characterized in that the increase in salt concentration is achieved by creating a gradient.
6. Способ по любому из пп.3-5, отличающийся тем, что используемый хроматографический материал представляет собой анионитовый фильтр.6. The method according to any one of claims 3 to 5, characterized in that the chromatographic material used is an anion exchange filter.
7. Способ по любому из пп.3-7, отличающийся тем, что проводят, по крайней мере, один дальнейший этап хроматографической очистки.7. The method according to any one of claims 3 to 7, characterized in that at least one further step of chromatographic purification is carried out.
8. Способ по п.8, отличающийся тем, что проводимый этап дальнейшей хроматографической очистки представляет собой хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия и/или гель-фильтрацию.8. The method according to claim 8, characterized in that the step for further chromatographic purification is a hydrophobic interaction chromatography and / or gel filtration.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что используемый хроматографический элюент представляет собой NaOH, NaHCO3 и NaCl.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the chromatographic eluent used is NaOH, NaHCO 3 and NaCl.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что нейтрализацию проводят после окончания очистки в интервале рН между 6,5-8,0.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the neutralization is carried out after cleaning in the pH range between 6.5-8.0.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что HCl используют для нейтрализации.11. The method according to claim 10, characterized in that HCl is used to neutralize.
12. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что указанные рекомбинантные белки представляют собой аллергены, варианты аллергенов или фрагменты аллергенов или вариантов аллергенов.12. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that said recombinant proteins are allergens, allergen variants or fragments of allergens or allergen variants.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что выбирают рекомбинантные варианты аллергена Bet v 1.13. The method according to p. 12, characterized in that the recombinant variants of the Bet v 1 allergen are selected.