Claims (18)
1. Эспрессирующий вектор для секреторного продуцирования человеческого интерферона альфа (hIFNα), содержащий полинуклеотид, кодирующий модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II, полученную путем замены одной или нескольких из 4-й, 20-й и 22-й аминокислот сигнальной последовательности термостабильного энтеротоксина II E.coli, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID No:3, другими аминокислотами, и полинуклеотид, кодирующий hIFNα, лигированный с его 3’-концом.1. An expression vector for secretory production of human interferon alpha (hIFNα), containing a polynucleotide encoding a modified signal sequence of thermostable enterotoxin II, obtained by replacing one or more of the 4th, 20th and 22nd amino acids of the signal sequence of thermostable enterotoxin II E .coli having the amino acid sequence of SEQ ID No: 3, other amino acids, and a polynucleotide encoding hIFNα ligated to its 3'-end.
2. Экспрессирующий вектор по п.1, где указанная модифицированная сигнальная последовательность термостабильного энтеротоксина II выбрана из группы, состоящей из полипетида, полученного путем замены 4-го аспарагина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином, полипетида, полученного путем замены 4-го аспарагина и 22-го тирозина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином и глутамином, соответственно, полипетида, полученного путем замены 4-го и 20-го аспарагинов аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином и глутамином, соответственно; и полипетида, полученного путем замены 4-го аспарагина, 20-го аспарагина и 22-го тирозина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином, валином и глутамином, соответственно.2. The expression vector according to claim 1, where the specified modified signal sequence of thermostable enterotoxin II is selected from the group consisting of a polypetide obtained by replacing the 4th asparagine amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine, a polypetide obtained by replacing the 4th asparagine and the 22nd tyrosine of the amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine and glutamine, respectively, the polypetide obtained by replacing the 4th and 20th asparagines of the amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine and glutamine, respectively; and a polypetide obtained by replacing the 4th asparagine, 20th asparagine, and 22nd tyrosine of the amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine, valine, and glutamine, respectively.
3. Экспрессирующий вектор по п.1, где указанный полинуклеотид, кодирующий hIFNα, кодирует IFNα-2a SEQ ID No:1 или IFNα-2b SEQ ID No:2.3. The expression vector of claim 1, wherein said polynucleotide encoding hIFNα encodes IFNα-2a SEQ ID No: 1 or IFNα-2b SEQ ID No: 2.
4. Экспрессирующий вектор по п.1, который, кроме того, включает последовательность Шайна-Дальгарно термостабильного энтеротоксина II E.coli (последовательность SD, SEQ ID No:8) или ее мутант, лигированный перед 5’-концом полинуклеотида, кодирующего модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II.4. The expression vector according to claim 1, which also includes a Shine-Dalgarno sequence of thermostable E. coli enterotoxin II (sequence SD, SEQ ID No: 8) or its mutant ligated before the 5'-end of the polynucleotide encoding the modified signal sequence of thermostable enterotoxin II.
5. Экспрессирующий вектор по п.4, где указанный мутант имеет последовательность, полученную путем деления 1 или 2 нуклеотидов из области, расположенной за GAGG, находящейся на 5’-конце SEQ ID No:8.5. The expression vector according to claim 4, where the specified mutant has a sequence obtained by dividing 1 or 2 nucleotides from the region located behind the GAGG, located at the 5’-end of SEQ ID No: 8.
6. Экспрессирующий вектор по п.4, где указанный мутант последовательности SD имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No:9.6. The expression vector of claim 4, wherein said SD sequence mutant has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 9.
7. Экспрессирующий вектор по п.1, выбранный из группы, состоящей из плазмид: pT14SSIα-2a-4T, pT14OSSIα-2a-4T, pT14SSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, pT14NSSIα-2a-4T22Q, pT14MSSIα-2a-4T22Q, pT14SSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T22Q, и pT14OSSIα-2b-4T20V22Q.7. The expression vector according to claim 1, selected from the group consisting of plasmids: pT14SSIα-2a-4T, pT14OSSISI-2a-4T, pT14SSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, pT14NSS -4T22Q, pT14MSSIα-2a-4T22Q, pT14SSIα-2b-4T, pT14OSSISI-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T22Q, and pT14OSSIα-2b-4T20V22Q.
8. Микроорганизм, трансформированный экспрессирующиим вектором по любому из пп.1-7.8. A microorganism transformed with an expression vector according to any one of claims 1 to 7.
9. Микроорганизм по п.8, которым является E.coli.9. The microorganism of claim 8, which is E. coli.
10. Микроорганизм по п.9, выбранный из группы, состоящей из BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T E.coli (HM 10602), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T E.coli (HM 10603; номер доступа KCCM-10175), BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10604), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10611; номер доступа КССМ 10176), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q E.coli (HM10612), BL21(DE3)/pT14NSSIa-2a-4T22Q E.coli (HM 10613), BL21(DE3)/, pT14MSSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10614), BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T E.coli (HM 10702), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T (HM 10703, номер доступа КССМ-10177), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q (HM 10711, номер доступа КССМ-10178) и BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q (HM 10712).10. The microorganism according to claim 9, selected from the group consisting of E. coli BL21 (DE3) / pT14SSIα-2a-4T (HM 10602), E. coli BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2a-4T (HM 10603; number access code KCCM-10175), BL21 (DE3) / pT14SSIα-2a-4T22Q E. coli (HM 10604), BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2a-4T22Q E. coli (HM 10611; access number KCCM 10176), BL21 (DE3 ) / pT14OSSIα-2a-4T20V22Q E.coli (HM10612), BL21 (DE3) / pT14NSSIa-2a-4T22Q E.coli (HM 10613), BL21 (DE3) /, pT14MSSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10614) , BL21 (DE3) / pT14SSIα-2b-4T E. coli (HM 10702), BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2b-4T (HM 10703, accession number KSSM-10177), BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2b-4T22Q (HM 10711, accession number KSSM-10178) and BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2b-4T20V22Q (HM 10712).
11. Способ секреторного продуцирования hIFNα, не имеющего дополнительного метионинового остатка, присоединенного у его N-конца, где указанный способ включает стадии трансформации микроорганизма экспрессирующим вектором для секреторного продуцирования hIFNa, содержащим полинуклеотид, кодирующий модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II, полученную путем замены одной или нескольких из 4-й, 20-й и 22-й аминокислот сигнальной последовательности термостабильного энтеротоксина II E.coli, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID No:3, другими аминокислотами, и полинуклеотид, кодирующий hIFNa, лигированный с его 3’-концом, и культивирования указанного трансформированного микроорганизма.11. A method for secretory production of hIFNα lacking an additional methionine residue attached at its N-terminus, wherein said method comprises the steps of transforming a microorganism with an expression vector for secretory production of hIFNa containing a polynucleotide encoding a modified signal sequence of thermostable enterotoxin II obtained by replacing one or of several of the 4th, 20th and 22nd amino acids of the signal sequence of thermostable enterotoxin II E. coli having the amino acid sequence SEQ ID No: 3 with other amino acids, and a polynucleotide encoding hIFNa, ligated from its 3 'end, and culturing said transformed microorganism.
12. Способ по п.11, где указанная модифицированная сигнальная последовательность термостабильного энтеротоксина II выбрана из группы, состоящей из полипетида, полученного путем замены 4-го аспарагина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином, полипетида, полученного путем замены 4-го аспарагина и 22-го тирозина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином и глутамином, соответственно, полипетида, полученного путем замены 4-го и 20-го аспарагинов аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином и глутамином, соответственно, и полипетида, полученного путем замены 4-го аспарагина, 20-го аспарагина и 22-го тирозина аминокислотной последовательности SEQ ID No:3 треонином, валином и глутамином, соответственно.12. The method according to claim 11, where the specified modified signal sequence of thermostable enterotoxin II is selected from the group consisting of a polypetide obtained by replacing the 4th asparagine amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine, a polypetide obtained by replacing the 4th asparagine and The 22nd tyrosine of the amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine and glutamine, respectively, the polypetide obtained by replacing the 4th and 20th asparagines of the amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine and glutamine, respectively, and a polypetide obtained by replacing the 4th asparagine, 20th asparagine, and 22nd tyrosine of the amino acid sequence of SEQ ID No: 3 with threonine, valine, and glutamine, respectively.
13. Способ по п.11, где указанный полинуклеотид, кодирующий hIFNα, кодирует IFNα-2a SEQ ID No:1 или IFNα-2b SEQ ID No:2.13. The method according to claim 11, where the specified polynucleotide encoding hIFNα encodes IFNα-2a SEQ ID No: 1 or IFNα-2b SEQ ID No: 2.
14. Способ по п.11, в котором экспрессирующий вектор, кроме того, включает последовательность SD термостабильного энтеротоксина II E.coli (SEQ ID No; 8) или ее мутант, лигированный перед 5’-концом полинуклеотида, кодирующего модифицированную сигнальную последовательность термостабильного энтеротоксина II.14. The method according to claim 11, in which the expression vector further comprises the SD sequence of thermostable enterotoxin II E. coli (SEQ ID No; 8) or its mutant ligated before the 5'-end of the polynucleotide encoding the modified signal sequence of thermostable enterotoxin II.
15. Способ по п.14, где указанный мутант имеет последовательность, полученную путем делеции 1 или 2 нуклеотидов из области, расположенной за GAGG, находящейся на 5’-конце SEQ ID No:8.15. The method according to 14, where the specified mutant has a sequence obtained by deletion of 1 or 2 nucleotides from the region located behind the GAGG, located at the 5’-end of SEQ ID No: 8.
16. Способ по п.14, где указанный мутант последовательности SD имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No:9.16. The method according to 14, where the specified mutant sequence SD has the nucleotide sequence of SEQ ID No: 9.
17. Способ по п.11, где экспрессирующий вектор выбран из группы, состоящей из плазмид: pT14SSIα-2a-4T, pT14OSSIα-2a-4Т, pT14SSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, pT14NSSIα-2a-4T22Q, pT14MSSIα-2a-4T22Q, pT14SSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T22Q, и pT14OSSIα-2b-4T20V22Q.17. The method according to claim 11, where the expression vector is selected from the group consisting of plasmids: pT14SSIα-2a-4T, pT14OSSIα-2a-4T, pT14SSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, pT14NI -2a-4T22Q, pT14MSSIα-2a-4T22Q, pT14SSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T22Q, and pT14OSSIα-2b-4T20V22Q.
18. Способ по п.11, где указанный трансформированный микроорганизм выбран из группы, состоящей из BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T E.coli (HM 10602), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T E.coli (HM 10603, номер доступа КССМ-10175), BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10604), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10611, номер доступа КССМ 10176), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q E.coil (HM 10612), BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q E.coil (HM 10613), BL2L(DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10614), BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T E.coli (HM 10702), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T (HM 10703, номер доступа КССМ-10177), BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q (HM 10711, номер доступа КССМ-10178) и BL21(DE3)/pT14OSSIa-2b-4T20V22Q (HM 10712).18. The method according to claim 11, where the specified transformed microorganism is selected from the group consisting of BL21 (DE3) / pT14SSIα-2a-4T E.coli (HM 10602), BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2a-4T E.coli ( HM 10603, access number KSSM-10175), BL21 (DE3) / pT14SSIα-2a-4T22Q E. coli (HM 10604), BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2a-4T22Q E. coli (HM 10611, access number KSSM 10176) , BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2a-4T20V22Q E.coil (HM 10612), BL21 (DE3) / pT14NSSIα-2a-4T22Q E.coil (HM 10613), BL2L (DE3) / pT14MSSIα-2a-4T22Q E.coli (HM 10614), BL21 (DE3) / pT14SSIα-2b-4T E. coli (HM 10702), BL21 (DE3) / pT14OSSIα-2b-4T (HM 10703, accession number KSSM-10177), BL21 (DE3) / pT14OSSIα -2b-4T22Q (HM 10711, access number KSSM-10178) and BL21 (DE3) / pT14OSSIa-2b-4T20V22Q (HM 10712).