Claims (27)
1. Способ определения наличия у млекопитающего алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, отличающийся тем, что он включает: i) выделение плазмы из образца крови, взятого у указанного млекопитающего; ii) выделение из указанной плазмы алло-антител к фактору VIII; iii) приведение указанных алло-антител к фактору VIII в контакт с фактором VIII на период времени, достаточный для обеспечения расщепления указанного фактора VIII указанными алло-антителами к фактору VIII; и iv) определение, после указанного периода времени, эффективно ли указанные алло-антитела к фактору VIII расщепили указанный фактор VIII.1. A method for determining the presence in a mammal of an allo-antibody to factor VIII capable of cleaving factor VIII, characterized in that it includes: i) isolation of plasma from a blood sample taken from said mammal; ii) the allocation from the specified plasma allo-antibodies to factor VIII; iii) contacting said allo-antibodies to factor VIII with a factor VIII for a period of time sufficient to permit cleavage of said factor VIII with said allo-antibodies to factor VIII; and iv) determining, after a specified period of time, whether said allo-antibodies to factor VIII have efficiently cleaved said factor VIII.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (ii) указанные алло-антитела к фактору VIII выделяют из указанной плазмы, объединяя их с указанным фактором VIII, причём указанный фактор VIII предпочтительно связан с матриксом.2. The method according to claim 1, characterized in that in step (ii) said allo-antibodies to factor VIII are isolated from said plasma, combining them with said factor VIII, moreover, said factor VIII is preferably associated with a matrix.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на этапе (ii) указанные алло-антитела к фактору VIII выделяют с помощью аффинной хроматографии.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that in step (ii) said allo-antibodies to factor VIII are isolated using affinity chromatography.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что на этапе (ii) указанная аффинная хроматография включает использование фактора VIII, ковалентно связанного с матриксом сефарозы, предпочтительно активированным цианоген-бромидом.4. The method according to claim 3, characterized in that in step (ii) said affinity chromatography involves the use of factor VIII covalently linked to a Sepharose matrix, preferably activated cyanogen bromide.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что на этапе (iii) указанный фактор VIII помечен метящим агентом, предпочтительно радиоактивно-метящим агентом, в частности, таким как 125I.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that in step (iii) said factor VIII is labeled with a labeling agent, preferably a radioactive labeling agent, in particular, such as 125 I.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на этапе (iii) указанный фактор VIII приводят в контакт с алло-антителами к фактору VIII на период времени от приблизительно 0,5 ч до приблизительно 30 ч, предпочтительно около 10 ч, при температуре от приблизительно 15°С до приблизительно 40°С, предпочтительно 38°С.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that in step (iii) said factor VIII is brought into contact with allo-antibodies to factor VIII for a period of time from about 0.5 hours to about 30 hours, preferably about 10 hours, at a temperature of from about 15 ° C to about 40 ° C, preferably 38 ° C.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что этап (iv) проводят путём определения, включающего метод разделения, такой как электрофорез в геле, в частности, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), или гель-фильтрацию, в частности, такую как быстрая жидкостная гель-фильтрационная хроматография белков, и технику визуализации, в частности, такую как авторадиография.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that step (iv) is carried out by determining, including a separation method, such as gel electrophoresis, in particular polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) or gel filtration, in particular, such as rapid liquid gel filtration chromatography of proteins, and a visualization technique, in particular, such as autoradiography.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что он дополнительно включает: v) получение характеристик сайта (сайтов) молекулы указанного фактора VIII, в котором (которых) происходит расщепление указанными алло-антителами к фактору VIII.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it further includes: v) obtaining the characteristics of the site (s) of the molecule of said factor VIII, in which (which) cleavage by said allo-antibodies to factor VIII occurs.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанное получение характеристик осуществляют, приводя указанный фактор VIII в контакт с указанными алло-антителами к фактору VIII, способными расщеплять фактор VIII, разделяя и затем секвенируя полученные вследствие такой процедуры фрагменты фактора VIII.9. The method according to claim 8, characterized in that the characterization is carried out by bringing said factor VIII into contact with said allo-antibodies to factor VIII, capable of cleaving factor VIII, separating and then sequencing the fragments of factor VIII resulting from this procedure.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что указанное разделение проводят, используя такую технику, как электрофорез в геле, в частности, такую как SDS-PAGE.10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that the separation is carried out using a technique such as gel electrophoresis, in particular, such as SDS-PAGE.
11. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что указанное секвенирование осуществляют, используя такую технику, как N-концевое секвенирование, в частности, с использованием автоматического белкового микросеквенатора.11. The method according to any one of claims 8 to 10, characterized in that said sequencing is carried out using techniques such as N-terminal sequencing, in particular using an automatic protein micro sequencer.
12. Способ по любому из пп.8-11, отличающийся тем, что указанное секвенирование следующим образом локализует способные к расщеплению связи: Arg372-Ser373, находящаяся между доменами А1 и А2, Tyr1680-Asp1681, находящаяся на N-конце домена A3, и Glu1794-Asp1795, находящаяся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.12. The method according to any one of claims 8 to 11, characterized in that said sequencing locates cleavable bonds as follows: Arg 372 -Ser 373 , located between domains A1 and A2, Tyr 1680 -Asp 1681 , located at the N-terminus A3 domain, and Glu 1794- Asp 1795 , located inside the A3 domain of the molecule of factor VIII.
13. Аминокислотная последовательность: Ser Val Ala Lys Lys His Pro.13. Amino acid sequence: Ser Val Ala Lys Lys His Pro.
14. Аминокислотная последовательность: Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.14. Amino acid sequence: Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.
15. Аминокислотная последовательность: Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.15. Amino acid sequence: Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.
16. Пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности по любому из пп.13-15, отличающийся тем, что он способен ингибировать любой сайт в молекуле фактора VIII, который чувствителен к разрыву алло-антителами к фактору VIII.16. The peptide or non-peptide analogue of the amino acid sequence according to any one of paragraphs.13-15, characterized in that it is able to inhibit any site in the molecule of factor VIII, which is sensitive to rupture with allo antibodies to factor VIII.
17. Ингибитор расщепления фактора VIII, катализируемого алло-антителами к фактору VIII.17. Inhibitor of the cleavage of factor VIII, catalyzed by allo-antibodies to factor VIII.
18. Ингибитор по п.17, отличающийся тем, что он представляет собой ингибитор протеаз, в частности, такой как 4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторид-гидрохлорид.18. The inhibitor according to 17, characterized in that it is a protease inhibitor, in particular, such as 4- (2-aminoethyl) benzylsulfonyl fluoride-hydrochloride.
19. Ингибитор по п.17 или 18, отличающийся тем, что указанный ингибитор ингибирует расщепление способных к расщеплению связей: Arg372-Ser373, находящейся между доменами А1 и А2, Tyr1680-Asp1681, находящейся на N-конце домена A3, и Glu1794-Asp1795, находящейся внутри домена A3 молекулы фактора VIII.19. The inhibitor according to claim 17 or 18, characterized in that said inhibitor inhibits the cleavage of cleavable bonds: Arg 372 -Ser 373 located between domains A1 and A2, Tyr 1680 -Asp 1681 located at the N-terminus of domain A3, and Glu 1794- Asp 1795 located within the A3 domain of the factor VIII molecule.
20. Ингибитор по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что он включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности: Ser Val Ala Lys Lys His Pro.20. The inhibitor according to any one of paragraphs.17-19, characterized in that it includes a peptide or non-peptide analogue of the amino acid sequence: Ser Val Ala Lys Lys His Pro.
21. Ингибитор по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что он включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности: Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.21. The inhibitor according to any one of paragraphs.17-19, characterized in that it includes a peptide or non-peptide analogue of the amino acid sequence: Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser.
22. Ингибитор по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что он включает пептидный или непептидный аналог аминокислотной последовательности: Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.22. The inhibitor according to any one of paragraphs.17-19, characterized in that it comprises a peptide or non-peptide analogue of the amino acid sequence: Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu.
23. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, особенно таких, как получаемые при осуществлении способа по любому из пп.1-6.23. A pharmaceutical composition, characterized in that it contains a pharmaceutically effective amount of allo-antibodies to factor VIII, capable of cleaving factor VIII, especially those obtained by the method according to any one of claims 1 to 6.
24. Применение алло-антител к фактору VIII, способных расщеплять фактор VIII, для приготовления фармацевтической композиции для лечения млекопитающего, страдающего патологией, являющейся результатом ненормального уровня содержания фактора VIII в его крови.24. The use of allo-antibodies to factor VIII, capable of cleaving factor VIII, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a mammal suffering from a pathology resulting from an abnormal level of the content of factor VIII in his blood.
25. Применение по п.24, отличающееся тем, что указанная патология является результатом наличия избытка фактора VIII в его крови.25. The application of paragraph 24, wherein the pathology is the result of an excess of factor VIII in his blood.
26. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит фармацевтически эффективное количество ингибитора расщепления фактора VIII по любому из пп.17-22.26. A pharmaceutical composition, characterized in that it contains a pharmaceutically effective amount of a factor VIII cleavage inhibitor according to any one of claims 17-22.
27. Применение ингибитора расщепления фактора VIII для приготовления фармацевтической композиции, в частности, для лечения млекопитающего, страдающего патологией, являющейся результатом суб-физиологического уровня содержания фактора VIII в его крови.27. The use of a factor VIII cleavage inhibitor for the preparation of a pharmaceutical composition, in particular for the treatment of a mammal suffering from a pathology resulting from a sub-physiological level of the content of factor VIII in his blood.