Claims (204)
1. Векторная конструкция, включающая:1. Vector design, including:
(а) первую транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с первой неспаренной донорской последовательностью сплайсинга,(a) a first transcriptional regulatory sequence operably linked to a first unpaired splicing donor sequence,
(б) вторую транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную со второй неспаренной донорской последовательностью сплайсинга.(b) a second transcriptional regulatory sequence operably linked to a second unpaired splicing donor sequence.
2. Векторная конструкция по п.1, в которой первая транскрипционная регуляторная последовательность находится в той же ориентации, что и вторая транскрипционная регуляторная последовательность.2. The vector construct of claim 1, wherein the first transcriptional regulatory sequence is in the same orientation as the second transcriptional regulatory sequence.
3. Векторная конструкция по п.1, в которой первая транскрипционная регуляторная последовательность находится в обратной ориентации относительно второй транскрипционной регуляторной последовательности.3. The vector construct of claim 1, wherein the first transcriptional regulatory sequence is in reverse orientation relative to the second transcriptional regulatory sequence.
4. Вектор по п.2 или 3, который был линеаризован.4. The vector according to claim 2 or 3, which has been linearized.
5. Векторная конструкция, содержащая в порядке следования:5. Vector construction, containing in the following order:
(а) транскрипционную регуляторную последовательность,(a) a transcriptional regulatory sequence,
(б) неспаренный донорский сайт сплайсинга,(b) an unpaired donor splicing site,
(в) редкий сайт рестрикции,(c) a rare restriction site,
(г) сайт линеаризации.(d) linearization site.
6. Векторная конструкция, содержащая в порядке следования:6. Vector construction, containing in the following order:
(а) транскрипционную регуляторную последовательность,(a) a transcriptional regulatory sequence,
(б) экзон, содержащий редкий сайт рестрикции,(b) an exon containing a rare restriction site,
(в) неспаренный донорский сайт сплайсинга,(c) an unpaired donor splicing site,
(г) сайт линеаризации.(d) linearization site.
7. Векторная конструкция по п.6, дополнительно содержащая второй редкий сайт рестрикции между неспаренным донорским сайтом сплайсинга и сайтом линеаризации.7. The vector structure of claim 6, further comprising a second rare restriction site between the unpaired splicing donor site and the linearization site.
8. Векторная конструкция, содержащая первую транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с селекционным маркером, не имеющим сигнала полиаденилирования, и дополнительно содержащая вторую транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с неспаренным донорским сайтом сплайсинга.8. A vector construct containing a first transcriptional regulatory sequence operably linked to a selection marker lacking a polyadenylation signal, and further comprising a second transcriptional regulatory sequence operably linked to an unpaired splicing donor site.
9. Векторная конструкция по п.1 или 8, в которой первая транскрипционная регуляторная последовательность или вторая транскрипционная регуляторная последовательность представляет собой промотор.9. The vector construct according to claim 1 or 8, in which the first transcriptional regulatory sequence or second transcriptional regulatory sequence is a promoter.
10. Векторная конструкция по п.9, в которой промотор выбран из группы, состоящей из промотора самых ранних генов CMV, промотора Т-антигена SV40, индуцируемого тетрациклином промотора и промотора β-актина.10. The vector construct of claim 9, wherein the promoter is selected from the group consisting of the promoter of the earliest CMV genes, the SV40 T-antigen promoter, the tetracycline-induced promoter, and the β-actin promoter.
11. Векторная конструкция по любому из пп.5-7, в которой транскрипционная регуляторная последовательность представляет собой промотор.11. The vector construct according to any one of claims 5-7, wherein the transcriptional regulatory sequence is a promoter.
12. Векторная конструкция по п.11, в которой промотор выбран из группы, состоящей из промотора самых ранних генов CMV, промотора Т-антигена SV40, индуцируемого тетрациклином промотора и промотора β-актина.12. The vector construction of claim 11, wherein the promoter is selected from the group consisting of the promoter of the earliest CMV genes, the SV40 T-antigen promoter, the tetracycline-induced promoter, and the β-actin promoter.
13. Векторная конструкция по п.8, в которой селекционный маркер выбран из группы, состоящей из гена неомицина, гена гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы, гена пуромицина, гена дигидрооротазы, гена глутаминсинтетазы, гена D гистидина, гена карбамилфосфатсинтетазы, гена дигидрофолатредуктазы, гена 1 множественной устойчивости к лекарственным препаратам, гена аспартаттранскарбамилазы, гена ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы, гена аденозиндезаминазы и гена тимидинкиназы.13. The vector construction of claim 8, in which the selection marker is selected from the group consisting of the neomycin gene, hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene, puromycin gene, dihydrorotase gene, glutamine synthetase gene, histidine gene D, resistance gene for carbamyl phosphate synthetase 1, gene for carbamyl phosphate synthetase, to drugs, aspartate transcarbamylase gene, xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene, adenosine deaminase gene and thymidine kinase gene.
14. Эукариотическая клетка-хозяина, содержащая векторную конструкцию по любому из пп.1, 5, 6, 7 и 8.14. A eukaryotic host cell containing the vector construct according to any one of claims 1, 5, 6, 7 and 8.
15. Эукариотическая клетка по п.14, где клетка является клеткой животного.15. The eukaryotic cell of claim 14, wherein the cell is an animal cell.
16. Эукариотическая клетка по п.15, где клетка животного выбрана из группы, состоящей из клеток млекопитающих, клеток насекомых, клеток птиц, клеток аннелид, клеток амфибий, клеток рептилий и клеток рыб.16. The eukaryotic cell of claim 15, wherein the animal cell is selected from the group consisting of mammalian cells, insect cells, bird cells, annelid cells, amphibian cells, reptile cells and fish cells.
17. Эукариотическая клетка по п.15, где клетка животного является клеткой млекопитающего.17. The eukaryotic cell of claim 15, wherein the animal cell is a mammalian cell.
18. Эукариотическая клетка по п.17, где клетка млекопитающего является клеткой человека.18. The eukaryotic cell of claim 17, wherein the mammalian cell is a human cell.
19. Эукариотическая клетка по п.14, где клетка является клеткой растения.19. The eukaryotic cell of claim 14, wherein the cell is a plant cell.
20. Эукариотическая клетка по п.14, где клетка является клеткой гриба.20. The eukaryotic cell of claim 14, wherein the cell is a fungal cell.
21. Эукариотическая клетка по п.20, где клетка гриба является дрожжевой клеткой.21. The eukaryotic cell of claim 20, wherein the fungal cell is a yeast cell.
22. Эукариотическая клетка по п.15, где клетка является изолированной клеткой.22. The eukaryotic cell according to clause 15, where the cell is an isolated cell.
23. Эукариотическая клетка по п.15, где векторная конструкция встроена в геном этой клетки.23. The eukaryotic cell of claim 15, wherein the vector construct is integrated into the genome of the cell.
24. Молекула праймера, содержащая ПЦР-амплифицируемую последовательность и вырожденный 3'-конец, которая имеет структуру:24. A primer molecule containing a PCR amplified sequence and a degenerate 3'-end, which has the structure:
5'-(dT)n-X-Nb-TTTATT-3',5 '- (dT) n -XN b -TTTATT-3',
где а - целое число от 1 до 100, Х - ПЦР-амплифицируемая последовательность, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты длиной в 10-20 нуклеотидов, N -любой нуклеотид и b - целое число от 0 до 6.where a is an integer from 1 to 100, X is a PCR amplified sequence consisting of a nucleic acid sequence of 10-20 nucleotides in length, N is any nucleotide and b is an integer from 0 to 6.
25. Молекула праймера по п.24, в которой ПЦР-амплифицируемая последовательность содержит один или несколько сайтов рестрикции.25. The primer molecule according to paragraph 24, in which the PCR amplified sequence contains one or more restriction sites.
26. Молекула праймера по п.24, в которой а является целым числом от 10 до 30.26. The primer molecule according to paragraph 24, in which a is an integer from 10 to 30.
27. Молекула праймера по п.24, содержащая одну или несколько молекул гаптенов, конъюгированных с одним или несколькими основаниями молекулы праймера.27. The primer molecule according to paragraph 24, containing one or more hapten molecules conjugated to one or more bases of the primer molecule.
28. Молекула праймера по п.27, в которой молекулы гаптена выбраны из группы, состоящей из биотина, дигоксигенина, антитела, фермента, липополисахарида, апотранс-феррина, ферротрансферрина, инсулина, цитокина, белков внеклеточного матрикса, интегрина, анкирина, С3bi, фибриногена, спектрина, рецептора цитокина, рецептора инсулина, рецептора трансферрина, полимиксина В, эндотоксин-нейтрализующего белка (ENP), специфического субстрата фермента, белка А, белка G, поверхностного рецептора Fc, специфичного к антителу антигена, специфичного к антителу пептида, авидина и стрептавидина.28. The primer molecule of claim 27, wherein the hapten molecules are selected from the group consisting of biotin, digoxigenin, antibody, enzyme, lipopolysaccharide, apotrans ferrin, ferrotransferrin, insulin, cytokine, extracellular matrix proteins, integrin, ankyrin, C3bi, fibri , spectrin, cytokine receptor, insulin receptor, transferrin receptor, polymyxin B, endotoxin-neutralizing protein (ENP), specific enzyme substrate, protein A, protein G, surface Fc receptor specific for antibody antigen specific for antibody ne Chida, avidin and streptavidin.
29. Молекула праймера по п.27, в которой молекула гаптена представляет собой биотин.29. The primer molecule of claim 27, wherein the hapten molecule is biotin.
30 Способ синтеза первой цепи кДНК, включающий:30 A method for synthesizing a first cDNA strand, comprising:
(а) гибридизацию праймера по п.24 с матричной молекулой РНК с образованием комплекса праймер-РНК,(a) hybridization of the primer according to paragraph 24 with the matrix RNA molecule to form a primer-RNA complex,
(б) обработку комплекса праймер-РНК обратной транскриптазой в присутствии одного или нескольких дезоксинуклеотидов в условиях, способствующих синтезу первой цепи кДНК путем обратной транскрипции комплекса праймер-РНК.(b) treatment of the primer-RNA complex with reverse transcriptase in the presence of one or more deoxynucleotides under conditions conducive to the synthesis of the first cDNA strand by reverse transcription of the primer-RNA complex.
31. Векторная конструкция, содержащая транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с неспаренной донорской последовательностью сплайсинга и одним или несколькими амплифицируемыми маркерами, причем эта конструкция не содержит последовательности для гомологического встраивания.31. A vector construct containing a transcriptional regulatory sequence operably linked to an unpaired donor splicing sequence and one or more amplifiable markers, this construct not containing a sequence for homologous insertion.
32. Векторная конструкция, содержащая транскрипционную регуляторную последовательность, амплифицируемый маркер и вирусное начало репликации.32. Vector construct containing a transcriptional regulatory sequence, an amplifiable marker and viral origin of replication.
33. Векторная конструкция, содержащая селекционный маркер, транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с кодоном инициации трансляции, сигнальную последовательность секреции, эпитопную метку, специфический протеазный сайт и неспаренный донорский сайт сплайсинга.33. Vector construct containing a selection marker, a transcriptional regulatory sequence operably linked to a translation initiation codon, a secretion signal sequence, an epitope tag, a specific protease site and an unpaired splicing donor site.
34. Векторная конструкция, содержащая транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с кодоном инициации трансляции, сигнальную последовательность секреции, эпитопную метку, специфический протеазный сайт и неспаренный донорский сайт сплайсинга.34. A vector construct containing a transcriptional regulatory sequence operably linked to a translation initiation codon, a secretion signal sequence, an epitope tag, a specific protease site, and an unpaired splicing donor site.
35. Вектор, содержащий:35. A vector containing:
(а) транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с кодоном инициации трансляции,(a) a transcriptional regulatory sequence operably linked to a translation initiation codon,
(б) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность из четырех или более аминокислот, в которой сама аминокислотная последовательность недостаточна для образования активности сигнального пептида, но достаточна для образования активности сигнального пептида, когда последовательность нуклеиновой кислоты сочетается с экзоном эндогенного гена или находится перед ним,(b) a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence of four or more amino acids, in which the amino acid sequence itself is insufficient for the activity of the signal peptide, but sufficient for the activity of the signal peptide when the nucleic acid sequence is combined with or in front of the endogenous exon,
(в) неспаренный донорский сайт сплайсинга.(c) an unpaired donor splicing site.
36. Векторная конструкция по любому из пп.33-35, дополнительно содержащая один или несколько амплифицируемых маркеров.36. Vector construction according to any one of claims 33-35, further comprising one or more amplifiable markers.
37. Векторная конструкция по любому из пп.31 и 33-35, в которой транскрипционная регуляторная последовательность представляет собой промотор.37. Vector construction according to any one of paragraphs.31 and 33-35, in which the transcriptional regulatory sequence is a promoter.
38. Векторная конструкция по п.37, в которой промотор является вирусным промотором.38. Vector construction according to clause 37, in which the promoter is a viral promoter.
39. Векторная конструкция по п.38, в которой вирусный промотор является промотором самых ранних генов цитомегаловируса.39. The vector construct of claim 38, wherein the viral promoter is a promoter of the earliest cytomegalovirus genes.
40. Векторная конструкция по п.38, в которой промотор является невирусным промотором.40. Vector construction according to § 38, in which the promoter is a non-viral promoter.
41. Векторная конструкция по п.38, в которой промотор является индуцибельным промотором.41. Vector construction according to § 38, in which the promoter is an inducible promoter.
42. Клетка, содержащая векторную конструкцию по любому из пп.31-35.42. A cell containing the vector construct according to any one of paragraphs.31-35.
43. Клетка, содержащая векторную конструкцию по п.36.43. A cell containing the vector construction according to clause 36.
44. Клетка по п.42, в которой векторная конструкция встроилась в клеточный геном.44. The cell of claim 42, wherein the vector construct is integrated into the cellular genome.
45. Клетка по п.43, в которой векторная конструкция встроилась в клеточный геном.45. The cell according to item 43, in which the vector construct is embedded in the cellular genome.
46. Клетка по п.44 или 45, в которой эндогенный ген суперэкспрессируется при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью векторной конструкции.46. The cell of claim 44 or 45, wherein the endogenous gene is overexpressed upon stimulation of the gene by a transcriptional regulatory sequence of a vector construct.
47. Клетка по п.42, представляющая собой изолированную клетку.47. The cell of claim 42, which is an isolated cell.
48. Клетка по п.43, представляющая собой изолированную клетку.48. The cell according to item 43, which is an isolated cell.
49. Способ получения клетки-хозяина, включающий введение в клетку конструкции по любому из пп.31-35.49. A method of obtaining a host cell, comprising introducing into the cell a construct according to any one of claims 31-35.
50. Способ получения продукта экспрессии эндогенного клеточного гена или его части, включающий:50. A method of obtaining an expression product of an endogenous cellular gene or part thereof, comprising:
(а) введение конструкции по любому из пп.31-35 в клетку, имеющую геном,(a) introducing a construct according to any one of paragraphs.31-35 into a cell having a genome,
(б) встраивание конструкции в геном этой клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding the construct in the genome of this cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена в этой клетке.(c) overexpression of the endogenous gene in this cell.
51. Способ по п.50, в котором суперэкспрессия осуществляется in vitro.51. The method according to item 50, in which superexpression is carried out in vitro.
52. Способ по п.50, в котором суперэкспрессия осуществляется in vivo.52. The method according to item 50, in which superexpression is carried out in vivo.
53. Способ по п.50, дополнительно включающий выделение продукта экспрессии из клетки.53. The method of claim 50, further comprising isolating the expression product from the cell.
54. Библиотека клеток, содержащая коллекцию клеток, трансформированных конструкцией по любому из пп.31-35, где эта конструкция встроена в геном клеток путем негомологической рекомбинации.54. A cell library containing a collection of cells transformed with a construct according to any one of claims 31 to 35, wherein the construct is inserted into the cell genome by non-homologous recombination.
55. Способ получения генного продукта из библиотеки клеток, включающий скринирование библиотеки по п.54 на экспрессию генного продукта, отбор из библиотеки клетки, суперэкспрессирующей генный продукт, и получение генного продукта из отобранной клетки.55. A method of obtaining a gene product from a cell library, comprising screening the library of claim 54 for expression of a gene product, selecting from a library of a cell that overexpresses the gene product, and obtaining the gene product from the selected cell.
56. Способ получения продукта экспрессии эндогенного гена клетки, включающий:56. A method of obtaining an expression product of an endogenous gene of a cell, comprising:
(а) введение в клетку вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с последовательностью сигнала секреции и неспаренной донорской последовательностью сплайсинга,(a) introducing into the cell a vector containing a transcriptional regulatory sequence operably linked to a secretion signal sequence and an unpaired splicing donor sequence,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на суперэкспрессию эндогенного гена или его части,(d) screening a cell for overexpression of an endogenous gene or part thereof,
(д) выращивание клетки в условиях, способствующих образованию продукта экспрессии эндогенного гена или его части этой клеткой.(e) growing a cell under conditions conducive to the formation of an expression product of an endogenous gene or part of it by that cell.
57. Способ по п.56, дополнительно включающий выделение продукта экспрессии.57. The method of claim 56, further comprising isolating the expression product.
58. Способ суперэкспрессии эндогенного гена в клетке in vivo, включающий:58. A method of overexpressing an endogenous gene in an in vivo cell, comprising:
(а) введение в клетку вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность,(a) introducing into the cell a vector containing a transcriptional regulatory sequence,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на суперэкспрессию эндогенного гена,(d) screening a cell for overexpression of an endogenous gene,
(д) введение выделенной и клонированной клетки в организм животного в условиях, способствующих суперэкспрессии эндогенного гена этой клеткой in vivo.(e) introducing an isolated and cloned cell into the animal’s body under conditions conducive to superexpression of the endogenous gene by this cell in vivo.
59. Способ получения продукта экспрессии эндогенного клеточного гена in vivo, включающий:59. A method of obtaining an endogenous cell gene expression product in vivo, comprising:
(а) введение в клетку вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с неспаренной донорской последовательностью сплайсинга,(a) introducing into the cell a vector containing a transcriptional regulatory sequence operably linked to an unpaired splicing donor sequence,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на суперэкспрессию эндогенного гена,(d) screening a cell for overexpression of an endogenous gene,
(д) введение выделенной и клонированной клетки в организм животного в условиях, способствующих суперэкспрессии эндогенного гена этой клеткой in vivo.(e) introducing an isolated and cloned cell into the animal’s body under conditions conducive to superexpression of the endogenous gene by this cell in vivo.
60. Способ получения продукта экспрессии эндогенного клеточного гена, включающий:60. A method of obtaining an expression product of an endogenous cell gene, comprising:
(а) введение в клетку вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность и один или несколько амплифицируемых маркеров,(a) introducing into the cell a vector containing a transcriptional regulatory sequence and one or more amplifiable markers,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на суперэкспрессию эндогенного гена,(d) screening a cell for overexpression of an endogenous gene,
(д) выращивание клетки в условиях, при которых вектор и эндогенный ген амплифицируются в этой клетке,(e) growing a cell under conditions in which a vector and an endogenous gene are amplified in that cell,
(е) выращивание клетки в условиях, способствующих образованию продукта экспрессии эндогенного гена этой клеткой.(e) growing a cell under conditions conducive to the formation of an endogenous gene expression product by that cell.
61. Способ по п.60, дополнительно включающий выделение продукта экспрессии.61. The method of claim 60, further comprising isolating the expression product.
62. Способ по п.60, в котором вектор дополнительно содержит донорский сайт сплайсинга, функционально связанный с транскрипционной регуляторной последовательностью.62. The method of claim 60, wherein the vector further comprises a splicing donor site operably linked to a transcriptional regulatory sequence.
63. Способ по п.60 или 62, в котором эндогенный ген или часть его кодируют белок, выбранный из группы белков, состоящей из эритропоетина, инсулина, гормона роста, глюкоцереброзидазы, тканевого активатора плазминогена, колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоцитов/ макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), α-интерферона, β-интерферона, γ-интерферона, интерлейкина-2, интерлейкина-3, интерлейкина-4, интерлейкина-6, интерлейкина-8, интерлейкина-10, интерлейкина-11, интерлейкина-12, интерлейкина-13, интерлейкина-14, TGF-β, фактора свертывания крови V, фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови VIII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови X, TSH-β, фактора роста костной ткани-2, фактора роста костной ткани-7, фактора некроза опухолей, α1-антитрипсина, антитромбина III, ингибирующего лейкемию фактора, глюкагона, белка С, протеинкиназы С, фактора стволовых клеток, фолликулостимулирующего гормона-β, урокиназы, фактора роста нервов, инсулиноподобного фактора роста, инсулинотропина, паратиреоидного гормона, лактоферрина, ингибитора комплемента, фактора роста из тромбоцитов, фактора роста кератиноцитов, фактора роста гепатоцитов, фактора роста эндотелиальных клеток, нейротропина-3, тромбопоетина, хорионического гонадотропина, тромбомодулина, α-глюкозидазы, фактора роста эпидермиса, фактора роста фибробластов, поверхностного рецептора клетки, трансмембранного ионного канала, рецептора холестерина, рецептора липопротеина, интегрина, цитоскелетного якорного белка, рецептора иммуноглобулина и антигена CD.63. The method of claim 60 or 62, wherein the endogenous gene or a portion thereof encodes a protein selected from the group of proteins consisting of erythropoietin, insulin, growth hormone, glucocerebrosidase, tissue plasminogen activator, colony stimulating granulocyte factor (G-CSF), colony stimulating granulocyte / macrophage factor (GM-CSF), colony-stimulating macrophage factor (M-CSF), α-interferon, β-interferon, γ-interferon, interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-8 , interleukin-10, interleukin-11, interleukin-12, int erleukin-13, interleukin-14, TGF-β, coagulation factor V, coagulation factor VII, coagulation factor VIII, coagulation factor IX, coagulation factor X, TSH-β, bone growth factor-2, growth factor bone tissue-7, tumor necrosis factor, α1-antitrypsin, antithrombin III, leukemia inhibiting factor, glucagon, protein C, protein kinase C, stem cell factor, follicle-stimulating hormone-β, urokinase, nerve growth factor, insulin-like growth factor, insulinotropin, para hormone varnish oferrin, complement inhibitor, platelet growth factor, keratinocyte growth factor, hepatocyte growth factor, endothelial cell growth factor, neurotropin-3, thrombopoietin, chorionic gonadotropin, thrombomodulin, α-glucosidase, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, cell surface fibroblast growth factor transmembrane ion channel, cholesterol receptor, lipoprotein receptor, integrin, cytoskeletal anchor protein, immunoglobulin receptor and CD antigen.
64. Способ по п.60 или 62, в котором эндогенный ген или часть его кодирует белок эритропоетина.64. The method of claim 60 or 62, wherein the endogenous gene or part thereof encodes an erythropoietin protein.
65. Способ по п.60 или 62, в котором эндогенный ген или часть его кодирует белок гормона роста.65. The method of claim 60 or 62, wherein the endogenous gene or part thereof encodes a growth hormone protein.
66. Способ по п.60 или 62, в котором эндогенный ген или часть его кодирует белок G-CSF.66. The method of claim 60 or 62, wherein the endogenous gene or part thereof encodes a G-CSF protein.
67. Продукт экспрессии гена, полученный способом по п.60 или 62, которым является белок, выбранный из группы, состоящей из эритропоетина, инсулина, гормона роста, глюкоцереброзидазы, тканевого активатора плазминогена, колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоцитов/ макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), α-интерферона, β-интерферона, γ-интерферона, интерлейкина-2, интерлейкина-3, интерлейкина-4, интерлейкина-6, интерлейкина-8, интерлейкина-10, интерлейкина-11, интерлейкина-12, интерлейкина-13, интерлейкина-14, TGF-β, фактора свертывания крови V, фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови VIII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови X, TSH-β, фактора роста костной ткани-2, фактора роста костной ткани-7, фактора некроза опухолей, α1-антитрипсина, антитромбина III, ингибирующего лейкемию фактора, глюкагона, белка С, протеинкиназы С, фактора стволовых клеток, фолликулостимулирующего гормона-β, урокиназы, фактора роста нервов, инсулиноподобного фактора роста, инсулинотропина, паратиреоидного гормона, лактоферрина, ингибитора комплемента, фактора роста из тромбоцитов, фактора роста кератиноцитов, фактора роста гепатоцитов, фактора роста эндотелиальных клеток, нейротропина-3, тромбопоетина, хорионического гонадотропина, тромбомодулина, α-глюкозидазы, фактора роста эпидермиса и фактора роста фибробластов, поверхностного рецептора клетки, трансмембранного ионного канала, рецептора холестерина, рецептора липопротеида, интегрина, цитоскелетного якорного белка, рецептора иммуноглобулина и антигена CD.67. The gene expression product obtained by the method of claim 60 or 62, which is a protein selected from the group consisting of erythropoietin, insulin, growth hormone, glucocerebrosidase, tissue plasminogen activator, colony granulocyte stimulating factor (G-CSF), granulocyte colony stimulating factor / macrophage (GM-CSF), colony-stimulating macrophage factor (M-CSF), α-interferon, β-interferon, γ-interferon, interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-8, interleukin -10, interleukin-11, interleukin-12, in terleukin-13, interleukin-14, TGF-β, coagulation factor V, coagulation factor VII, coagulation factor VIII, coagulation factor IX, coagulation factor X, TSH-β, bone growth factor-2, growth factor bone tissue-7, tumor necrosis factor, α1-antitrypsin, antithrombin III, leukemia inhibiting factor, glucagon, protein C, protein kinase C, stem cell factor, follicle-stimulating hormone-β, urokinase, nerve growth factor, insulin-like growth factor, insulinotropin, para hormone la toferrin, complement inhibitor, platelet growth factor, keratinocyte growth factor, hepatocyte growth factor, endothelial cell growth factor, neurotropin-3, thrombopoietin, chorionic gonadotropin, thrombomodulin, α-glucosidase, epidermal growth factor and fibroblast growth factor, cell surface fibroblast growth factor, transmembrane ion channel, cholesterol receptor, lipoprotein receptor, integrin, cytoskeletal anchor protein, immunoglobulin receptor and CD antigen.
68. Продукт экспрессии гена, полученный способом по п.60 или 62, которым является белок эритропоетина.68. The gene expression product obtained by the method of claim 60 or 62, which is an erythropoietin protein.
69. Продукт экспрессии гена, полученный способом по п.60 или 62, которым является белок гормона роста.69. The gene expression product obtained by the method of claim 60 or 62, which is growth hormone protein.
70. Продукт экспрессии гена, полученный способом по п.60 или 62, которым является белок G-CSF.70. The gene expression product obtained by the method according to p. 60 or 62, which is a protein G-CSF.
71. Способ суперэкспрессии эндогенного гена в клетке in vivo, включающий:71. A method of overexpressing an endogenous gene in an in vivo cell, comprising:
(а) введение в клетку вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность и один или несколько амплифицируемых маркеров,(a) introducing into the cell a vector containing a transcriptional regulatory sequence and one or more amplifiable markers,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на суперэкспрессию эндогенного гена,(d) screening a cell for overexpression of an endogenous gene,
(д) введение выделенной и клонированной клетки в организм животного в условиях, способствующих суперэкспрессии эндогенного гена этой клеткой in vivo.(e) introducing an isolated and cloned cell into the animal’s body under conditions conducive to superexpression of the endogenous gene by this cell in vivo.
72. Способ по любому из пп.56, 58-60, 62 и 71, в котором транскрипционная регуляторная последовательность представляет собой промотор.72. The method according to any one of claims 56, 58-60, 62 and 71, wherein the transcriptional regulatory sequence is a promoter.
73. Способ по п.72, в котором промотор является вирусным промотором.73. The method of claim 72, wherein the promoter is a viral promoter.
74. Способ по п.73, в котором вирусный промотор является самым ранним промотором цитомегаловируса.74. The method according to p, in which the viral promoter is the earliest promoter of the cytomegalovirus.
75. Способ по п.72, в котором промотор является невирусным промотором.75. The method of claim 72, wherein the promoter is a non-viral promoter.
76. Способ по п.72, в котором промотор является индуцибельным.76. The method of claim 72, wherein the promoter is inducible.
77. Способ по любому из пп.56, 58-60, 62 и 71, дополнительно включающий введение разрывов двойной цепи в геномную ДНК клетки перед или одновременно с интеграцией вектора.77. The method according to any one of claims 56, 58-60, 62 and 71, further comprising introducing double strand breaks into the genomic DNA of the cell before or simultaneously with vector integration.
78. Способ по п.49, дополнительно включающий введение разрывов двойной цепи в геномную ДНК клетки перед или одновременно с интеграцией вектора.78. The method of claim 49, further comprising introducing double strand breaks into the genomic DNA of the cell before or simultaneously with vector integration.
79. Способ по п.50, дополнительно включающий введение разрывов двойной цепи в геномную ДНК клетки перед или одновременно с интеграцией вектора.79. The method of claim 50, further comprising introducing double strand breaks into the genomic DNA of the cell before or simultaneously with vector integration.
80. Продукт экспрессии гена, полученный способом по любому из пп.56, 58-60, 62 и 71.80. The gene expression product obtained by the method according to any one of claims 56, 58-60, 62 and 71.
81. Способ по любому из пп.56, 58-60, 62 и 71, в котором векторная конструкция является линейной.81. The method according to any one of claims 56, 58-60, 62 and 71, wherein the vector construction is linear.
82. Способ получения продукта экспрессии эндогенного гена в клетке, включающий:82. A method of obtaining an endogenous gene expression product in a cell, comprising:
(а) введение вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность, по меньшей мере, в одну изолированную, содержащую геном клетку,(a) introducing a vector containing a transcriptional regulatory sequence into at least one isolated cell containing the genome,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на суперэкспрессию эндогенного гена,(d) screening a cell for overexpression of an endogenous gene,
(д) выращивание клетки в среде с пониженной концентрацией сыворотки.(e) growing the cell in a medium with a low concentration of serum.
83. Способ обнаружения белков, включающий:83. A method for detecting proteins, comprising:
(а) введение вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность, по меньшей мере, в одну изолированную, содержащую геном клетку,(a) introducing a vector containing a transcriptional regulatory sequence into at least one isolated cell containing the genome,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) выращивание клетки в среде с пониженной концентрацией сыворотки в условиях, позволяющих суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью, вследствие чего образуется кондиционированная среда,(c) growing a cell in a medium with a low concentration of serum under conditions that allow overexpression of an endogenous gene or part of it in the cell upon stimulation of this gene with a transcriptional regulatory sequence, resulting in a conditioned medium,
(г) скринирование кондиционированной среды на присутствие продукта экспрессии эндогенного гена или его части.(g) screening the conditioned medium for the presence of an endogenous gene expression product or part thereof.
84. Способ по п.83, дополнительно включающий концентрирование кондиционированной среды перед скринированием в подпункте (г).84. The method of claim 83, further comprising concentrating the conditioned medium prior to screening in subparagraph (d).
85. Способ по любому из пп.82-84, включающий высокопроизводительное тестирование.85. The method according to any one of paragraphs 82-84, including high-throughput testing.
86. Способ получения продукта экспрессии эндогенного клеточного гена, включающий:86. A method of obtaining an expression product of an endogenous cell gene, comprising:
(а) введение в клетку вектора, содержащего транскрипционную регуляторную последовательность,(a) introducing into the cell a vector containing a transcriptional regulatory sequence,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на суперэкспрессию эндогенного гена,(d) screening a cell for overexpression of an endogenous gene,
(д) выращивание клетки в условиях, способствующих образованию продукта экспрессии эндогенного гена этой клеткой,(e) growing a cell under conditions conducive to the formation of an endogenous gene expression product by that cell,
(е) выделение продукта экспрессии из клеток, эквивалентных по массе, по меньшей мере, 10 л клеток при плотности 104 клеток/мл.(e) isolating the expression product from cells equivalent in weight to at least 10 L of cells at a density of 10 4 cells / ml.
87. Способ по любому из пп.82-84 и 86, в котором вектор дополнительно содержит один или несколько амплифицируемых маркеров.87. The method according to any one of claims 82-84 and 86, wherein the vector further comprises one or more amplifiable markers.
88. Способ по любому из пп.82-84 и 86, в котором вектор дополнительно содержит неспаренный донорский сайт сплайсинга.88. The method according to any one of claims 82-84 and 86, wherein the vector further comprises an unpaired splicing donor site.
89. Способ усиления экспрессии эндогенного гена в клетке in situ, фенотип которого известен, не прибегая к информации о последовательности гена, включающий стадии:89. A method of enhancing the expression of an endogenous gene in a cell in situ, the phenotype of which is known without resorting to information about the gene sequence, which includes the steps of:
(а) конструирование вектора, содержащего амплифицируемый маркер, транскрипционную регуляторную последовательность и неспаренную донорскую последовательность сплайсинга,(a) constructing a vector comprising an amplifiable marker, a transcriptional regulatory sequence and an unpaired splicing donor sequence,
(б) введение копий этого вектора в большое число клеток,(b) introducing copies of this vector into a large number of cells,
(в) выращивание клеток в условиях, позволяющих негомологическую рекомбинацию между введенным вектором и геномом клеток,(c) growing cells under conditions allowing non-homologous recombination between the introduced vector and the cell genome,
(г) скринирование рекомбинантных клеток путем анализа фенотипа эндогенного гена с целью выявления клеток, у которых усилилась экспрессия этого гена,(d) screening of recombinant cells by analysis of the phenotype of the endogenous gene in order to identify cells in which the expression of this gene has increased,
(д) селекция клеток с повышенным уровнем экспрессии амплифицируемого маркера и эндогенного гена.(e) selection of cells with an increased level of expression of an amplifiable marker and endogenous gene.
90. Способ по п.89, в котором фенотип представляет собой выработку определенного белка, а анализ проводится тестированием на повышение продукции этого белка.90. The method according to p, in which the phenotype is the production of a particular protein, and the analysis is carried out by testing to increase the production of this protein.
91. Изолированная клетка, содержащая в своем геноме встроенную генетическую конструкцию, содержащую амплифицируемый маркер и транскрипционную регуляторную последовательность, в которой конструкция встроилась в ген или в 5'-участок гена и активирует экспрессию этого гена, и в которой ген и его 5'-участок не имеют гомологии по нуклеотидной последовательности с генетической конструкцией.91. An isolated cell containing in its genome an integrated genetic construct containing an amplifiable marker and a transcriptional regulatory sequence in which the construct is integrated into the gene or in the 5'-region of the gene and activates the expression of this gene, and in which the gene and its 5'-region do not have homology in the nucleotide sequence with the genetic construct.
92. Изолированная клетка по п.91, в которой генетическая конструкция дополнительно содержит экзон с неспаренной донорской последовательностью сплайсинга.92. The isolated cell of claim 91, wherein the genetic construct further comprises an exon with an unpaired splicing donor sequence.
93. Изолированная клетка по п.91 или 92, в которой ген кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из эритропоетина, инсулина, гормона роста, глюкоцереброзидазы, тканевого активатора плазминогена, колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), α-интерферона, β-интерферона, γ-интерферона, интерлейкина-2, интерлейкина-3, интерлейкина-4, интерлейкина-6, интерлейкина-8, интерлейкина-10, интерлейкина-11, интерлейкина-12, интерлейкина-13, интерлейкина-14, TGF-P, фактора свертывания крови V, фактора свертывания крови VII, фактора свертывания крови VIII, фактора свертывания крови IX, фактора свертывания крови X, TSH-β, фактора роста костной ткани-2, фактора роста костной ткани-7, фактора некроза опухолей, α1-антитрипсина, антитромбина III, ингибирующего лейкемию фактора, глюкагона, белка С, протеинкиназы С, фактора стволовых клеток, фолликулостимулирующего гормона-(β, урокиназы, фактора роста нервов, инсулино-подобного фактора роста, инсулинотропина, паратиреоидного гормона, лактоферрина, ингибитора комплемента, фактора роста из тромбоцитов, фактора роста кератиноцитов, фактора роста гепатоцитов, фактора роста эндотелиальных клеток, нейротропина-3, тромбопоетина, хорионического гонадотропина, тромбомодулина, α-глюкозидазы, фактора роста эпидермиса и фактора роста фибробластов, поверхностного рецептора клетки, трансмембранного ионного канала, рецептора холестерина, рецептора липопротеида, интегрина, цитоскелетного якорного белка, рецептора иммуноглобулина и антигена CD.93. The isolated cell of claim 91 or 92, wherein the gene encodes a protein selected from the group consisting of erythropoietin, insulin, growth hormone, glucocerebrosidase, tissue plasminogen activator, colony stimulating granulocyte factor (G-CSF), colony stimulating granulocyte / macrophage factor (GM-CSF), macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), α-interferon, β-interferon, γ-interferon, interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-10 , interleukin-11, interleukin-12, interleukin-13, inter leukin-14, TGF-P, coagulation factor V, coagulation factor VII, coagulation factor VIII, coagulation factor IX, coagulation factor X, TSH-β, bone growth factor-2, bone growth factor-7 , tumor necrosis factor, α1-antitrypsin, antithrombin III, leukemia inhibiting factor, glucagon, protein C, protein kinase C, stem cell factor, follicle-stimulating hormone- (β, urokinase, nerve growth factor, insulin-like growth factor, insulinotropin, parathyroidoid , lactoferrin, inhibi ora of complement, platelet growth factor, keratinocyte growth factor, hepatocyte growth factor, endothelial cell growth factor, neurotropin-3, thrombopoietin, chorionic gonadotropin, thrombomodulin, α-glucosidase, epidermal growth factor and fibroblast growth factor, transmembrane surface ion receptor, channel, cholesterol receptor, lipoprotein receptor, integrin, cytoskeletal anchor protein, immunoglobulin receptor and CD antigen.
94. Изолированная клетка по п.91 или 92, в которой ген кодирует белок эритропоетина.94. The isolated cell of claim 91 or 92, wherein the gene encodes an erythropoietin protein.
95. Изолированная клетка по п.91 или 92, в которой ген кодирует белок гормона роста.95. The isolated cell of claim 91 or 92, wherein the gene encodes a growth hormone protein.
96. Изолированная клетка по п.91 или 92, в которой ген кодирует белок G-CSF.96. The isolated cell of claim 91 or 92, wherein the gene encodes a G-CSF protein.
97. Способ усиления экспрессии гена, включающий:97. A method of enhancing gene expression, including:
(а) введение в геном клетки вектора, содержащего последовательность энхансера и один или несколько амплифицируемых маркеров, причем этот вектор не содержит геноспецифических гомологических последовательностей,(a) introducing into the cell genome a vector containing an enhancer sequence and one or more amplifiable markers, this vector not containing gene-specific homologous sequences,
(б) скринирование клетки на экспрессию эндогенного гена,(b) screening a cell for expression of an endogenous gene,
(в) селекцию клеток с повышенным уровнем экспрессии амплифицируемого маркера и эндогенного гена.(c) selection of cells with an increased level of expression of the amplifiable marker and endogenous gene.
98. Способ по п.97, дополнительно включающий выделение клетки, у которой повысилась экспрессия эндогенного гена.98. The method of claim 97, further comprising isolating a cell that has increased expression of the endogenous gene.
99. Способ усиления экспрессии гена в клетке, включающий:99. A method of enhancing gene expression in a cell, comprising:
(а) встраивание вектора в клетку путем негомологической рекомбинации, причем этот вектор содержит последовательность энхансера и один или несколько амплифицируемых маркеров,(a) embedding a vector in a cell by non-homologous recombination, wherein the vector contains an enhancer sequence and one or more amplifiable markers,
(б) скринирование на присутствие негомологических рекомбинантных клеток, экспрессирующих эндогенный ген, причем этот ген и его 5'- и 3'-участки, на которые действует последовательность энхансера, не гомологичны этому вектору,(b) screening for the presence of non-homologous recombinant cells expressing the endogenous gene, and this gene and its 5'- and 3'-sites that are affected by the enhancer sequence are not homologous to this vector,
(в) селекцию клеток с повышенным уровнем экспрессии амплифицируемого маркера и эндогенного гена.(c) selection of cells with an increased level of expression of the amplifiable marker and endogenous gene.
100. Изолированная клетка, содержащая в своем геноме встроенную искусственную генетическую конструкцию, содержащую один или несколько амплифицируемых маркеров и энхансер, способный усиливать экспрессию гена в этой клетке, причем эта генетическая конструкция встроена в ген или в 5'- или 3'-участок гена, причем этот ген и участки, на которые действует последовательность энхансера, не гомологичны этой генетической конструкции.100. An isolated cell containing in its genome an integrated artificial genetic construct containing one or more amplifiable markers and an enhancer capable of enhancing gene expression in this cell, the genetic construct being integrated into the gene or into the 5 ′ or 3 ′ region of the gene, moreover, this gene and regions affected by the enhancer sequence are not homologous to this genetic construct.
101. Способ по любому из пп.53, 56, 58-60, 62, 71, 82-84 и 86, в котором эндогенный ген кодирует трансмембранный белок.101. The method according to any one of paragraphs 53, 56, 58-60, 62, 71, 82-84 and 86, in which the endogenous gene encodes a transmembrane protein.
102. Способ по любому из пп.89, 97 и 99, в котором ген кодирует клеточный трансмембранный белок.102. The method according to any one of claims 89, 97 and 99, wherein the gene encodes a cell transmembrane protein.
103. Способ по любому из пп.58, 59, 62 и 71, дополнительно включающий выделение клетки и культивирование перед введением ее в организм животного.103. The method according to any one of paragraphs.58, 59, 62 and 71, further comprising isolating the cell and culturing before introducing it into the body of the animal.
104. Способ по любому из пп.58, 59, 62 и 71, в котором животное является млекопитающим.104. The method according to any one of claims 58, 59, 62 and 71, wherein the animal is a mammal.
105. Способ по п.104, в котором млекопитающее является человеком.105. The method of claim 104, wherein the mammal is a human.
106. Способ идентификации клетки, экспрессирующей эндогенный ген, кодирующий интегральный мембранный белок, который включает:106. A method for identifying a cell expressing an endogenous gene encoding an integral membrane protein, which includes:
(а) введение в клетку вектора, содержащего:(a) introducing into the cell a vector containing:
(i) транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с экзонной последовательностью, содержащей стартовый кодон,(i) a transcriptional regulatory sequence operably linked to an exon sequence comprising a start codon,
(ii) сигнальную последовательность,(ii) a signal sequence,
(iii) эпитопную метку, за которой следует неспаренный донорский сайт сплайсинга,(iii) an epitope tag followed by an unpaired splicing donor site,
(б) встраивание вектора в геном клетки путем негомологической рекомбинации,(b) embedding a vector in the genome of a cell by non-homologous recombination,
(в) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(c) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(г) скринирование клетки на экспрессию эпитопной метки на ее поверхности.(d) screening a cell for the expression of an epitope tag on its surface.
107. Способ идентификации клетки, экспрессирующей эндогенный ген, кодирующий интегральный мембранный белок, который включает:107. A method for identifying a cell expressing an endogenous gene encoding an integral membrane protein, which includes:
(а) выделение геномной ДНК из эукариотической клетки-хозяина,(a) isolation of genomic DNA from a eukaryotic host cell,
(б) соединение выделенной геномной ДНК с вектором, при котором образуется комплекс геномная ДНК-вектор, причем этот вектор содержит:(b) combining the isolated genomic DNA with a vector in which a genomic DNA-vector complex is formed, the vector comprising:
(i) транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с экзонной последовательностью, содержащей стартовый кодон,(i) a transcriptional regulatory sequence operably linked to an exon sequence comprising a start codon,
(ii) сигнальную последовательность,(ii) a signal sequence,
(iii) эпитопную метку, за которой следует неспаренный донорский сайт сплайсинга,(iii) an epitope tag followed by an unpaired splicing donor site,
(в) введение комплекса геномная ДНК-вектор в эукариотическую клетку-хозяина,(c) introducing a genomic DNA-vector complex into a eukaryotic host cell,
(г) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(g) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(д) скринирование клетки на экспрессию эпитопной метки на ее поверхности.(e) screening a cell for the expression of an epitope tag on its surface.
108. Способ идентификации клетки, экспрессирующей эндогенный ген, кодирующий интегральный мембранный белок, который включает:108. A method for identifying a cell expressing an endogenous gene encoding an integral membrane protein, which includes:
(а) получение кДНК из эукариотической клетки-хозяина,(a) obtaining cDNA from a eukaryotic host cell,
(б) соединение выделенной кДНК с вектором, при котором образуется комплекс кДНК-вектор, причем этот вектор содержит:(b) combining the isolated cDNA with a vector in which a cDNA vector complex is formed, the vector comprising:
(i) транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с экзонной последовательностью, содержащей стартовый кодон,(i) a transcriptional regulatory sequence operably linked to an exon sequence comprising a start codon,
(ii) сигнальную последовательность,(ii) a signal sequence,
(iii) эпитопную метку, за которой следует неспаренный донорский сайт сплайсинга,(iii) an epitope tag followed by an unpaired splicing donor site,
(в) введение комплекса кДНК-вектор в эукариотическую клетку-хозяина,(c) introducing a cDNA-vector complex into a eukaryotic host cell,
(г) суперэкспрессию эндогенного гена или его части в клетке при стимуляции этого гена транскрипционной регуляторной последовательностью,(g) superexpression of an endogenous gene or part thereof in a cell upon stimulation of this gene by a transcriptional regulatory sequence,
(д) скринирование клетки на экспрессию эпитопной метки на ее поверхности.(e) screening a cell for the expression of an epitope tag on its surface.
109. Способ по любому из пп.106-108, дополнительно включающий выделение клетки, экспрессирующей эпитопную метку.109. The method according to any one of claims 106-108, further comprising isolating a cell expressing an epitope tag.
110. Способ по п.109, дополнительно включающий выделение суперэкспрессируемого эндогенного гена из выделенной клетки.110. The method of claim 109, further comprising isolating the superexpressed endogenous gene from the isolated cell.
111. Вектор, содержащий:111. A vector containing:
(а) первый промотор, функционально связанный с экзоном и неспаренным донорским сайтом сплайсинга,(a) a first promoter operably linked to an exon and an unpaired splicing donor site,
(б) второй промотор, функционально связанный с селекционным маркером, не имеющим сигнала полиаденилирования.(b) a second promoter operably linked to a selection marker lacking a polyadenylation signal.
112. Вектор по п.111, в котором первый и второй промоторы находятся в одинаковой ориентации.112. The vector according to p. 111, in which the first and second promoters are in the same orientation.
113. Вектор по п.112, который является линейным и в котором селекционный маркер находится по 3'-сторону от первого промотора.113. The vector according to p. 112, which is linear and in which the selection marker is located on the 3'-side of the first promoter.
114. Вектор по п.112, который является линейным и в котором второй промотор находится по 5'-сторону от неспаренного донорского сайта сплайсинга.114. The vector according to p. 112, which is linear and in which the second promoter is located on the 5'-side of the unpaired splicing donor site.
115. Вектор по п.111, в экзоне которого отсутствует кодон инициации трансляции.115. The vector according to p. 111, in the exon of which there is no translation initiation codon.
116. Вектор по п.111, в экзоне которого имеется кодон инициации трансляции.116. The vector according to p. 111, in the exon of which there is a translation initiation codon.
117. Вектор по п.111, в экзоне которого имеется кодон инициации трансляции и сигнальная последовательность секреции.117. The vector according to p. 111, in the exon of which there is a translation initiation codon and a secretion signal sequence.
118. Векторная конструкция, содержащая:118. Vector construction containing:
(а) первый промотор,(a) a first promoter,
(б) положительный селекционный маркер,(b) a positive selection marker,
(в) отрицательный селекционный маркер,(c) a negative selection marker,
(г) неспаренный донорский сайт сплайсинга,(d) an unpaired donor splicing site,
в которой положительный и отрицательный селекционные маркеры и донорский сайт сплайсинга находятся в такой ориентации, что, когда векторная конструкция встраивается в геном эукариотической клетки-хозяина таким образом, что происходит сплайсинг между донорским сайтом
сплайсинга вектора и акцепторным сайтом сплайсинга генома, то положительный селекционный маркер экспрессируется в активной форме, а отрицательный селекционный маркер либо не экспрессируется, либо экспрессируется в неактивной форме.in which the positive and negative selection markers and the donor splicing site are in such an orientation that when the vector construct is inserted into the genome of the eukaryotic host cell in such a way that splicing occurs between the donor site
splicing of the vector and the acceptor site of splicing the genome, the positive selection marker is expressed in active form, and the negative selection marker is either not expressed or expressed in inactive form.
119. Вектор по п.118, в котором положительный и отрицательный селекционные маркеры находятся в виде слитого гена.119. The vector according p, in which the positive and negative selection markers are in the form of a fused gene.
120. Вектор по п.118, в котором положительный селекционный маркер, отрицательный селекционный маркер или оба маркера не имеют сайта полиаденилирования.120. The vector of claim 118, wherein the positive selection marker, negative selection marker, or both markers do not have a polyadenylation site.
121. Вектор по п.118, дополнительно содержащий второй промотор, функционально связанный со вторым неспаренным донорским сайтом сплайсинга.121. The vector of Claim 118, further comprising a second promoter operably linked to a second unpaired splicing donor site.
122. Вектор, содержащий первый промотор и второй промотор, которые ориентированы в одинаковом направлении, в котором:122. A vector containing the first promoter and the second promoter, which are oriented in the same direction, in which:
(а) первый промотор, но не второй промотор, функционально связан с неспаренным донорским сайтом сплайсинга,(a) a first promoter, but not a second promoter, is operably linked to an unpaired splicing donor site,
(б) вектор не содержит сигналов полиаденилирования после первого промотора или второго промотора.(b) the vector does not contain polyadenylation signals after the first promoter or second promoter.
123. Вектор по п.122, который является линейньм и в котором второй промотор находится по 3'-сторону от первого промотора.123. The vector according to p. 122, which is linear and in which the second promoter is located on the 3'-side of the first promoter.
124. Вектор, содержащий:124. A vector containing:
(а) первый промотор, функционально связанный с первым селекционным маркером, содержащим неспаренный донорский сайт сплайсинга,(a) a first promoter operably linked to a first selection marker containing an unpaired splicing donor site,
(б) второй промотор, функционально связанный со вторым селекционным маркером,(b) a second promoter operably linked to a second selection marker,
в котором ни первый селекционный маркер, ни второй селекционный маркер не содержит сигнала полиаденилирования.in which neither the first selection marker nor the second selection marker contains a polyadenylation signal.
125. Вектор по п.124, в котором первый и второй селекционные маркеры являются положительными селекционными маркерами.125. The vector according p, in which the first and second selection markers are positive selection markers.
126. Вектор по п.124, в котором первый селекционный маркер находится перед вторым селекционным маркером.126. The vector according p, in which the first selection marker is in front of the second selection marker.
127. Вектор, включающий:127. Vector, including:
(а) первый промотор, функционально связанный с первым экзоном и первым неспаренным донорским сайтом сплайсинга,(a) a first promoter operably linked to a first exon and a first unpaired splicing donor site,
(б) второй промотор, функционально связанный со вторым экзоном и вторым неспаренньм донорским сайтом сплайсинга,(b) a second promoter operably linked to a second exon and a second unpaired splicing donor site,
в котором нуклеотидная последовательность первого экзона отличается от нуклеотидной последовательности второго экзона.in which the nucleotide sequence of the first exon is different from the nucleotide sequence of the second exon.
128. Вектор по п.127, в котором первый и второй экзоны оба содержат кодон инициации трансляции и открытую рамку считывания, которая не оканчивается стоп-кодоном.128. The vector of claim 127, wherein the first and second exons both contain a translation initiation codon and an open reading frame that does not end with a stop codon.
129. Вектор по п.127, в котором первый экзон, второй экзон или оба не имеют кодона инициации трансляции.129. The vector according p, in which the first exon, second exon, or both do not have a translation initiation codon.
130. Векторная конструкция, содержащая:130. Vector construction containing:
(а) первый промотор, функционально связанный с положительным селекционным маркером,(a) a first promoter operably linked to a positive selection marker,
(б) второй промотор, функционально связанный с отрицательным селекционным маркером,(b) a second promoter operably linked to a negative selection marker,
(в) неспаренный донорский сайт сплайсинга,(c) an unpaired donor splicing site,
в которой положительный и отрицательный селекционные маркеры и донорский сайт сплайсинга находятся в такой ориентации, что, когда векторная конструкция встраивается в геном эукариотической клетки-хозяина таким образом, что эндогенный ген генома транскрипционно активируется, то положительный селекционный маркер экспрессируется в активной форме, а отрицательный селекционный маркер либо не экспрессируется, либо экспрессируется в неактивной форме.in which the positive and negative selection markers and the donor splicing site are in such an orientation that when the vector construct is inserted into the genome of the eukaryotic host cell in such a way that the endogenous gene of the genome is transcriptionally activated, the positive selection marker is expressed in active form, and the negative selection the marker is either not expressed or is expressed in an inactive form.
131. Векторная конструкция по п.130, дополнительно содержащая третий промотор, функционально связанный со вторым неспаренным донорским сайтом сплайсинга.131. The vector structure of claim 130, further comprising a third promoter operably linked to a second unpaired splicing donor site.
132. Вектор по любому из пп.1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131, дополнительно содержащий один или несколько сигналов транспозиции.132. The vector according to any one of claims 1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131, further comprising one or more transposition signals.
133. Вектор по любому из пп.111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131, дополнительно содержащий один или несколько амплифицируемых маркеров.133. Vector according to any one of paragraphs 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131, further comprising one or more amplifiable markers.
134. Вектор по любому из пп.1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131, дополнительно содержащий одно или несколько вирусных начал репликации.134. The vector according to any one of claims 1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131, further comprising one or more viral principles of replication.
135. Вектор по любому из пп.1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131, дополнительно содержащий один или несколько генов вирусных факторов репликации.135. The vector according to any one of claims 1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131, further comprising one or more genes of viral replication factors.
136. Вектор по п.133, в котором амплифицируемый маркер выбран из группы, состоящей из дигидрофолатредуктазы, аденозиндезаминазы, аспартаткарбамилазы, дигидрооротазы и карбамилфосфатсинтетазы.136. The vector according to p, in which the amplifiable marker is selected from the group consisting of dihydrofolate reductase, adenosine deaminase, aspartate carbamylase, dihydroorotase and carbamyl phosphate synthetase.
137. Вектор по п.134, в котором вирусное начало репликации выбрано из группы, состоящей из ori P вируса Эпштейна-Барра и ori SV40.137. The vector of claim 134, wherein the viral origin of replication is selected from the group consisting of Epstein-Barr virus ori P and ori SV40.
138. Вектор по любому из пп.1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131, дополнительно содержащий геномную ДНК.138. The vector according to any one of claims 1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131, further comprising genomic DNA.
139. Клетка-хозяина, содержащая вектор по любому из пп.31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131.139. A host cell containing the vector according to any one of paragraphs.31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131.
140. Клетка-хозяина, содержащая вектор по п.132.140. A host cell containing the vector of p. 132.
141. Клетка-хозяина, содержащая вектор по п.133.141. A host cell containing the vector according to p.
142. Клетка-хозяина, содержащая вектор по п.134.142. A host cell containing the vector according p.134.
143. Клетка-хозяина, содержащая вектор по п.135.143. A host cell containing the vector of Claim 135.
144. Клетка-хозяина, содержащая вектор по п.138.144. A host cell containing the vector according to p.
145. Клетка-хозяина по п.139, которая является изолированной клеткой.145. The host cell according to p, which is an isolated cell.
146. Клетка-хозяина по любому из пп.140-144, которая является изолированной клеткой.146. A host cell according to any one of claims 140-144, which is an isolated cell.
147. Библиотека клеток, содержащих вектор по любому из пп.1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131.147. A library of cells containing the vector according to any one of claims 1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131.
148. Библиотека клеток, содержащих вектор по п.132.148. The library of cells containing the vector according p.132.
149. Библиотека клеток, содержащих вектор по п.133.149. The library of cells containing the vector according p.133.
150. Библиотека клеток, содержащих вектор по п.134.150. The library of cells containing the vector according p.134.
151. Библиотека клеток, содержащих вектор по п.135.151. The library of cells containing the vector according p.
152. Библиотека клеток, содержащих вектор по п.138.152. A library of cells containing the vector according to p.
153. Способ активации эндогенного гена в клетке, включающий:153. A method of activating an endogenous gene in a cell, comprising:
(а) трансфекцию клетки, имеющей геном, вектором по любому из пп.1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131,(a) transfection of a cell having a gene with the vector according to any one of claims 1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131,
(б) выращивание клетки в условиях, способствующих негомологическому встраиванию вектора в геном этой клетки, причем это встраивание приводит к активации эндогенного гена в геноме клетки.(b) growing the cell under conditions conducive to the non-homologous incorporation of the vector into the genome of that cell, and this embedding leads to the activation of the endogenous gene in the cell genome.
154. Способ идентификации гена, включающий:154. A method for identifying a gene, comprising:
(а) трансфекцию большого числа клеток, имеющих геном, вектором по любому из пп.1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 и 131,(a) transfection of a large number of cells having a gene with the vector according to any one of claims 1, 5-7, 8, 31, 32, 35, 111, 118, 122, 124, 127, 130 and 131,
(б) выращивание клеток в условиях, способствующих негомологическому встраиванию вектора в геном клетки-хозяина,(b) growing cells under conditions conducive to the non-homologous incorporation of the vector into the genome of the host cell,
(в) селекцию клеток, у которых вектор встроился в геном,(c) selection of cells in which the vector is integrated into the genome,
(г) выделение РНК из отобранных при селекции клеток,(d) isolation of RNA from cells selected during selection,
(д) получение кДНК от выделенной РНК,(e) obtaining cDNA from isolated RNA,
(е) идентификацию гена в кДНК путем выделения одной или нескольких молекул кДНК, содержащих одну или несколько нуклеотидных последовательностей этого вектора.(f) identifying a gene in cDNA by isolating one or more cDNA molecules containing one or more nucleotide sequences of this vector.
155. Способ по п.154, в котором идентификация в подпункте (е) осуществляется путем гибридизации кДНК с вектором.155. The method according to p, in which the identification in subparagraph (e) is carried out by hybridization of cDNA with a vector.
156. Способ по п.154, в котором идентификация в подпункте (е) осуществляется путем секвенирования кДНК и сравнения нуклеотидной последовательности кДНК с нуклеотидной последовательностью вектора.156. The method according to p, in which the identification in subparagraph (e) is carried out by sequencing the cDNA and comparing the nucleotide sequence of the cDNA with the nucleotide sequence of the vector.
157. Вектор по п.124, в котором неспаренный донорский сайт сплайсинга находится перед первым селекционным маркером или внутри него таким образом, что, когда вектор встраивается в геном эукариотической клетки-хозяина и происходит сплайсинг между этим неспаренным донорским сайтом сплайсинга и акцепторным сайтом сплайсинга генома, то первый селекционный маркер экспрессируется в неактивной форме или вообще не экспрессируется.157. The vector according to p. 124, in which the unpaired donor splicing site is located in front of or inside the first selection marker so that when the vector is inserted into the genome of the eukaryotic host cell and splicing occurs between this unpaired donor splicing site and the acceptor splicing site of the genome , then the first selection marker is expressed in an inactive form or not expressed at all.
158. Способ выделения клеток, у которых произошла активация гена с одним экзоном, включающий:158. A method for isolating cells in which a single exon gene has been activated, comprising:
(а) трансфекцию большого числа эукариотических клеток, имеющих геном, вектором по п.157,(a) transfection of a large number of eukaryotic cells having a genome with the vector according to claim 157,
(б) выращивание клеток в условиях, способствующих негомологическому встраиванию вектора в геномы этих клеток,(b) growing cells under conditions conducive to the non-homologous incorporation of the vector into the genomes of these cells,
(в) селекцию клеток, у которых первый и второй селекционные маркеры экспрессируются в активной форме.(c) selection of cells in which the first and second selection markers are expressed in active form.
159. Способ по п.158, дополнительно включающий:159. The method according to p, further comprising:
(г) выделение РНК из отобранных при селекции клеток,(d) isolation of RNA from cells selected during selection,
(д) получение кДНК от выделенной РНК,(e) obtaining cDNA from isolated RNA,
(е) выделение гена с одним экзоном из этой кДНК.(e) isolation of a single exon gene from this cDNA.
160. Способ выделения экзона I гена, включающий:160. A method for isolating exon I of a gene, comprising:
(а) трансфекцию одной или нескольких эукариотических клеток, имеющих геном, вектором по любому из пп.111, 112, 114, 122, 124 и 127,(a) transfection of one or more eukaryotic cells having a genome with a vector according to any one of paragraphs 111, 112, 114, 122, 124 and 127,
(б) выращивание клеток в условиях, способствующих негомологическому встраиванию вектора в геном этих клеток,(b) growing cells under conditions conducive to the non-homologous incorporation of a vector into the genome of these cells,
(в) селекцию клеток, у которых произошла транскрипционная активация вектором эндогенного гена, содержащего один или несколько экзонов,(c) selection of cells in which transcriptional activation by a vector of an endogenous gene containing one or more exons has occurred,
(г) выделение РНК из отобранных при селекции клеток,(d) isolation of RNA from cells selected during selection,
(д) получение кДНК от выделенной РНК,(e) obtaining cDNA from isolated RNA,
(е) выделение молекул кДНК, содержащих первый экзон вектора, сплайсированный со вторым экзоном эндогенного гена, вследствие чего образовалась одна или несколько молекул кДНК с экзоном вектора,(e) the selection of cDNA molecules containing the first exon of the vector, spliced with the second exon of the endogenous gene, resulting in the formation of one or more cDNA molecules with exon of the vector,
(ж) использование молекул кДНК с экзоном вектора для получения активированного эндогенного гена, содержащего экзон I.(g) the use of cDNA molecules with an exon vector to obtain an activated endogenous gene containing exon I.
161. Способ экспрессирования транскрипта, содержащего экзон I гена, который включает:161. A method of expressing a transcript containing exon I of a gene, which includes:
(а) трансфекцию одной или нескольких эукариотических клеток, имеющих геном, вектором по любому из пп.111, 112, 114, 122, 124 и 127,(a) transfection of one or more eukaryotic cells having a genome with a vector according to any one of paragraphs 111, 112, 114, 122, 124 and 127,
(б) выращивание клеток в условиях, способствующих негомологическому встраиванию вектора в геном этих клеток,(b) growing cells under conditions conducive to the non-homologous incorporation of a vector into the genome of these cells,
(в) выращивание клеток в условиях, способствующих экспрессии транскрипта, содержащего экзон I эндогенного гена.(c) growing cells under conditions conducive to the expression of a transcript containing exon I of the endogenous gene.
162. Способ получения продукта гена, включающий:162. A method of obtaining a gene product, including:
(а) выделение геномной ДНК, содержащей, по меньшей мере, один ген, из эукариотической клетки,(a) isolation of genomic DNA containing at least one gene from a eukaryotic cell,
(б) встраивание в выделенную геномную ДНК, путем транспозиции in vitro, вектора, содержащего один или несколько сигналов транспозиции, один или несколько промоторов, один или несколько экзонов и один или несколько неспаренных донорских сайтов сплайсинга, при котором образуется комплекс геномная ДНК-вектор,(b) incorporation into the isolated genomic DNA, by in vitro transposition, of a vector containing one or more transposition signals, one or more promoters, one or more exons and one or more unpaired splicing donor sites in which a genomic DNA vector complex is formed,
(в) введение комплекса геномная ДНК-вектор в эукариотическую клетку-хозяина,(c) introducing a genomic DNA-vector complex into a eukaryotic host cell,
(г) выращивание клетки в условиях, способствующих экспрессии гена.(g) growing the cell under conditions conducive to gene expression.
163. Способ по п.162, дополнительно включающий выделение продукта экспрессии гена.163. The method according to p, further comprising isolating the gene expression product.
164. Способ получения генного продукта, кодируемого эндогенным геном клеточного генома, включающий:164. A method of obtaining a gene product encoded by the endogenous gene of the cell genome, comprising:
(а) выделение геномной ДНК, содержащей по меньшей мере один ген, из эукариотической клетки,(a) isolation of genomic DNA containing at least one gene from a eukaryotic cell,
(б) встраивание в выделенную геномную ДНК, или соединение с нею другим образом, вектора по любому из пп.111, 112, 114, 122, 124 и 127, при котором образуется комплекс вектор-геномная ДНК,(b) embedding into the isolated genomic DNA, or combining with it in another way, the vector according to any one of paragraphs 111, 112, 114, 122, 124 and 127, in which a vector-genomic DNA complex is formed,
(в) трансфекцию комплекса вектор-геномная ДНК в подходящую эукариотическую клетку-хозяина,(c) transfection of the vector genomic DNA complex into a suitable eukaryotic host cell,
(г) выращивание клетки в условиях, способствующих транскрипции одного или нескольких генов, кодируемых вектором и содержащихся в комплексе вектор-геномная ДНК.(d) growing a cell under conditions conducive to the transcription of one or more genes encoded by a vector and contained in a vector-genomic DNA complex.
165. Способ по п.164, дополнительно включающий:165. The method according to p, further comprising:
(д) выделение РНК, образовавшейся при транскрипции в клетке-хозяина,(d) the selection of RNA formed during transcription in the host cell,
(е) получение одной или нескольких молекул кДНК от выделенной РНК,(e) obtaining one or more cDNA molecules from the isolated RNA,
(ж) выделение одной или нескольких молекул кДНК, содержащих последовательности вектора на 5'-концах этих молекул, при этом выделяется сам ген.(g) isolation of one or more cDNA molecules containing vector sequences at the 5'-ends of these molecules, and the gene itself is isolated.
166. Способ по п.164, в котором вектор дополнительно содержит один или несколько сигналов транспозиции и в котором вектор встраивается в выделенную геномную ДНК путем транспозиции in vitro.166. The method of claim 164, wherein the vector further comprises one or more transposition signals and wherein the vector is inserted into the isolated genomic DNA by in vitro transposition.
167. Способ по п.164, в котором выделенная геномная ДНК находится в клонирующем векторе.167. The method of claim 164, wherein the isolated genomic DNA is in a cloning vector.
168. Способ получения белка, включающий:168. A method of producing protein, including:
(а) выделение геномной ДНК из одной или нескольких клеток,(a) isolation of genomic DNA from one or more cells,
(б) встраивание в выделенную геномную ДНК, или соединение с нею другим образом, вектора по любому из пп.111, 112, 114, 122, 124 и 127, при котором образуется комплекс вектор-геномная ДНК,(b) embedding into the isolated genomic DNA, or combining with it in another way, the vector according to any one of paragraphs 111, 112, 114, 122, 124 and 127, in which a vector-genomic DNA complex is formed,
(в) трансфекцию комплекса вектор-геномная ДНК в подходящую клетку-хозяина,(c) transfecting the vector genomic DNA complex into a suitable host cell,
(г) выращивание клетки в условиях, способствующих экспрессии белка с геномной ДНК, находящейся в комплексе вектор-геномная ДНК.(d) growing a cell under conditions conducive to the expression of a protein with genomic DNA located in a vector-genomic DNA complex.
169. Способ получения белка, включающий:169. A method of producing protein, including:
(а) выделение геномной ДНК из одной или нескольких клеток,(a) isolation of genomic DNA from one or more cells,
(б) встраивание вектора, содержащего один или несколько сигналов транспозиции и транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с комплексом экзон-неспаренный донорский сайт сплайсинга, в выделенную геномную ДНК путем транспозиции, при котором образуется комплекс вектор-геномная ДНК,(b) embedding a vector containing one or more transposition signals and a transcriptional regulatory sequence operably linked to an exon-unpaired donor splicing site complex in an isolated genomic DNA by transposition, in which a vector-genomic DNA complex is formed,
(в) трансфекцию комплекса вектор-геномная ДНК в подходящую клетку хозяина,(c) transfection of the vector genomic DNA complex into a suitable host cell,
(г) выращивание клетки в условиях, способствующих экспрессии белка с геномной ДНК, находящейся в комплексе вектор-геномная ДНК.(d) growing a cell under conditions conducive to the expression of a protein with genomic DNA located in a vector-genomic DNA complex.
170. Способ экспрессирования гена, включающий:170. A method of expressing a gene, comprising:
(а) выделение геномной ДНК, содержащей один или несколько генов, из одной или нескольких эукариотических клеток,(a) isolation of genomic DNA containing one or more genes from one or more eukaryotic cells,
(б) соединение выделенной геномной ДНК с вектором, содержащим:(b) combining the isolated genomic DNA with a vector containing:
(i) селекционный маркер,(i) a selection marker,
(ii) транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с кодоном инициации транскрипции,(ii) a transcriptional regulatory sequence operably linked to a transcription initiation codon,
(iii) сигнальную последовательность секреции,(iii) a secretion signal sequence,
(iv) эпитопную метку,(iv) an epitope tag,
(v) неспаренный донорский сайт сплайсинга, при котором образуется комплекс вектор-геномная ДНК,(v) an unpaired splicing donor site at which a vector-genomic DNA complex is formed,
(в) введение комплекса вектор-геномная ДНК в клетку,(c) introducing a vector genomic DNA complex into a cell,
(г) селекции клеток, содержащих комплекс вектор-геномная ДНК,(g) selection of cells containing a complex of vector genomic DNA,
(д) выращивание клетки в условиях, способствующих экспрессии гена, находящего в комплексе вектор-геномная ДНК.(e) growing the cell under conditions conducive to the expression of a gene located in the vector genomic DNA complex.
171. Способ по п.168, в котором клетка-хозяина подвергается селекции на присутствие клетки, содержащей введенный при трансфекции комплекс вектор-геномная ДНК, до, во время или после выращивания в условиях, способствующих экспрессии белка.171. The method according to p, in which the host cell is selected for the presence of a cell containing the vector-genomic DNA complex introduced during transfection, before, during or after growth under conditions conducive to protein expression.
172. Способ по п.169, в котором вектор дополнительно содержит селекционный маркер и в котором клетка-хозяин подвергается селекции на присутствие клетки, содержащей введенный при трансфекции комплекс вектор-геномная ДНК, перед выращиванием в условиях, способствующих экспрессии белка.172. The method according to p, in which the vector further comprises a selection marker and in which the host cell is selected for the presence of a cell containing the vector-genomic DNA complex introduced during transfection before cultivation under conditions conducive to protein expression.
173. Способ по п.167, в котором клонирующий вектор выбран из группы, состоящей из векторов ВАС, YAC, РАС, космид, фагов и плазмид.173. The method according to p, in which the cloning vector is selected from the group consisting of vectors BAC, YAC, RAS, cosmids, phages and plasmids.
174. Способ по п.164, дополнительно включающий выделение белка.174. The method according to p, further comprising isolating the protein.
175. Белок, полученный способом по п.168.175. The protein obtained by the method according to p.
176. Белок, полученный способом по любому из пп.170-172.176. The protein obtained by the method according to any one of claims 170-172.
177. Белок, полученный способом по п.174.177. The protein obtained by the method according to 174.
178. Способ экспрессии белка, включающий:178. A method of expressing a protein, comprising:
(а) трансфекцию клетки-хозяина вектором, содержащим гетерологический промотор, функционально связанный с:(a) transfection of the host cell with a vector containing a heterologous promoter operably linked to:
(i) гетерологическим экзоном,(i) a heterologous exon,
(ii) гетерологическим донорским сайтом сплайсинга,(ii) a heterologous donor splicing site,
(iii) фрагментом геномной ДНК, кодирующим ген или его часть,(iii) a fragment of genomic DNA encoding a gene or part thereof,
(iv) одним или несколькими селекционными маркерами,(iv) one or more selection markers,
причем гетерологический экзон либо не имеет кодона инициации транскрипции, либо имеет кодон инициации транскрипции вместе с открытой рамкой считывания, которая не оканчивается стоп-кодоном,moreover, the heterologous exon either does not have a transcription initiation codon, or has a transcription initiation codon together with an open reading frame that does not end with a stop codon,
(б) селекцию на присутсвие клетки, содержащей введенный при трансфекции вектор,(b) selection for the presence of a cell containing a vector introduced during transfection,
(в) выращивание отобранной при селекции трансфецированной клетки в условиях, способствующих экспрессии белка с этого вектора.(c) the cultivation of the selected transfected cell under conditions conducive to the expression of protein from this vector.
179. Способ по п.178, в котором вектор дополнительно содержит вирусное начало репликации.179. The method according to p, in which the vector further comprises a viral origin of replication.
180. Способ по п.179, в котором вирусным началом репликации является ori P вируса Эпштейна-Барра.180. The method of claim 179, wherein the viral origin of replication is Epstein-Barr virus ori P.
181. Вектор, содержащий:181. A vector containing:
(а) гетерологический промотор,(a) a heterologous promoter,
(б) гетерологический экзон,(b) heterologous exon,
(в) гетерологический донорский сайт сплайсинга,(c) heterologous donor splicing site,
(г) геномный фрагмент, кодирующий ген или часть его,(d) a genomic fragment encoding a gene or part of it,
(д) один или несколько селекционных маркеров,(e) one or more selection markers,
(е) одно или несколько вирусных начал репликации,(e) one or more viral principles of replication,
в котором гетерологический экзон либо не имеет кодона инициации транскрипции, либо имеет кодон инициации транскрипции вместе с открытой рамкой считывания, которая не оканчивается стоп-кодоном, и в котором геномный фрагмент находится позади от гетерологического промотора, экзона и донорского сайта сплайсинга таким образом, что при введении вектора в клетку-хозяина происходит экспрессия белка с гена или части гена, кодируемого геномным фрагментом.in which the heterologous exon either does not have a transcription initiation codon or has a transcription initiation codon together with an open reading frame that does not end with a stop codon, and in which the genomic fragment is located behind the heterologous promoter, exon, and the splicing donor site in such a way that when the introduction of the vector into the host cell is the expression of the protein from the gene or part of the gene encoded by the genomic fragment.
182. Вектор по п.181, в котором селекционный маркер не имеет сигнала полиаденилирования.182. The vector according to p, in which the selection marker does not have a polyadenylation signal.
183. Вектор по п.181, дополнительно содержащий один или несколько генов, кодирующих один или несколько вирусных белков репликации.183. The vector of claim 181, further comprising one or more genes encoding one or more viral replication proteins.
184. Вектор по п.181, дополнительно содержащий амплифицируемый маркер.184. The vector of claim 181, further comprising an amplifiable marker.
185. Клетка, содержащая вектор по любому из пп.181-184.185. A cell containing the vector according to any one of claims 181-184.
186. Клетка по п.185, которая является изолированной клеткой.186. The cell of claim 185, which is an isolated cell.
187. Векторная конструкция по п.8, в которой первая транскрипционная регуляторная последовательность находится в той же ориентации, что и вторая транскрипционная регуляторная последовательность.187. The vector construction of claim 8, in which the first transcriptional regulatory sequence is in the same orientation as the second transcriptional regulatory sequence.
188. Векторная конструкция по п.118 или 130, в которой положительный селекционный маркер выбран из группы, состоящей из гена неомицина, гена гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы, гена пуромицина, гена дигидрооротазы, гена глутамин-синтетазы, гена D гистидина, гена карбамилфосфатсинтетазы, гена дигидрофолатредуктазы, гена 1 множественной устойчивости к лекарственным препаратам, гена аспартаттранскарбамилазы, гена ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы и гена аденозиндезаминазы.188. The vector construct of claim 118 or 130, wherein the positive selection marker is selected from the group consisting of the neomycin gene, hypoxanthine phosphoribosyl transferase gene, puromycin gene, dihydroorotase gene, glutamine synthetase gene, histidine gene D, histidine gene D, carbamyl phosphate synthetase synthetase , multiple drug resistance gene 1, aspartate transcarbamylase gene, xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene, and adenosine deaminase gene.
189. Векторная конструкция по п.118 или 130, в которой отрицательный селекционный маркер выбран из группы, состоящей из гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, гена тимидинкиназы и гена дифтерийного токсина.189. The vector construct of claim 118 or 130, wherein the negative selection marker is selected from the group consisting of the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene, thymidine kinase gene, and diphtheria toxin gene.
190. Вектор по п.130, в котором отрицательный селекционный маркер находится перед положительным селекционным маркером.190. The vector of claim 130, wherein the negative selection marker is in front of the positive selection marker.
191. Клетка-хозяина, стабильно экспрессирующая белок, которая содержит вектор, включающий промотор, комплекс экзон-донор сплайсинга и геномный фрагмент, кодирующий этот белок или его часть, причем промотор и комплекс экзон-донор сплайсинга гетерологичны этому геномному фрагменту.191. A host cell stably expressing a protein that contains a vector comprising a promoter, an exon-splicing donor complex, and a genomic fragment encoding this protein or a part thereof, the promoter and an exon-donor splicing complex heterologous to this genomic fragment.
192. Клетка-хозяина по п.191, в которой вектор встроен в геном этой клетки.192. The host cell according to p, in which the vector is integrated into the genome of this cell.
193. Клетка-хозяина по п.191, в которой вектор дополнительно содержит вирусное начало репликации и находится в клетке в виде эписомы.193. The host cell according to p, in which the vector further comprises a viral origin of replication and is in the cell as an episoma.
194. Клетка по п.190 или 192, в которой вектор дополнительно содержит один или несколько селекционных маркеров.194. The cell of claim 190 or 192, wherein the vector further comprises one or more selection markers.
195. Клетка по п.192, в которой вирусным началом репликации является ori P вируса Эпштейна-Барра.195. The cell of claim 192, wherein the viral origin of replication is Epstein-Barr virus ori P.
196. Способ активирования экспрессии эндогенного гена, включающий:196. A method of activating the expression of an endogenous gene, comprising:
(а) введение в клетку, имеющую хромосому, вектора, пригодного для активации эндогенного гена,(a) introducing into a cell having a chromosome a vector suitable for activating an endogenous gene,
(б) обработку клетки агентом, способным вводить разрывы ДНК в хромосому клетки до или после введения вектора,(b) treating the cell with an agent capable of introducing DNA breaks into the chromosome of the cell before or after the introduction of the vector,
(в) встраивание вектора в разрывы ДНК, приводящее к образованию функциональной связи между вектором и эндогенным геном, при котором эндогенный ген активируется одной или несколькими нуклеотидными последовательностями вектора.(c) the incorporation of a vector into DNA breaks, leading to the formation of a functional relationship between the vector and the endogenous gene, in which the endogenous gene is activated by one or more nucleotide sequences of the vector.
197. Способ по п.196, в котором активация в подпункте (а) осуществляется путем выделения клетки и выращивания ее в условиях, способствующих активации эндогенного гена.197. The method according to p, in which the activation in subparagraph (a) is carried out by isolating the cell and growing it under conditions conducive to the activation of the endogenous gene.
198. Вектор, содержащий:198. A vector containing:
(а) транскрипционную регуляторную последовательность, функционально связанную с геном,(a) a transcriptional regulatory sequence operably linked to a gene,
(б) вирусное начало репликации,(b) viral origin of replication,
(в) амплифицируемый маркер.(c) an amplifiable marker.
199. Способ усиления экспрессии гена, включающий:199. A method of enhancing gene expression, including:
(а) введение вектора по п.198 в клетку-хозяина, при котором вектор находится в виде эписомы в этой клетке,(a) introducing the vector according to p.198 into the host cell, wherein the vector is in the form of an episoma in the cell,
(б) селекцию на усиленную экспрессию амплифицируемого маркера и гена.(b) selection for enhanced expression of an amplifiable marker and gene.
200. Способ расщепления молекулы кДНК, происходящей из молекулы несплайсированного клеточного транскрипта, включающий:200. A method of splitting a cDNA molecule originating from an unspliced cell transcript molecule, comprising:
(а) встраивание вектора по п.5 или 7 в геном одной или нескольких эукариотических клеток,(a) embedding a vector according to claim 5 or 7 in the genome of one or more eukaryotic cells,
(б) выращивание клетки в условиях, способствующих экспрессии из транскрипционной регуляторной последовательности,(b) growing the cell under conditions conducive to expression from a transcriptional regulatory sequence,
(в) выделение РНК из клетки,(c) isolation of RNA from the cell,
(г) получение кДНК от выделенной РНК,(g) obtaining cDNA from isolated RNA,
(д) расщепление кДНК ферментом, который расщепляет по указанному редкому сайту рестрикции.(e) cleavage of cDNA with an enzyme that cleaves at the indicated rare restriction site.
201. Способ открытия лекарственного препарата, включающий:201. A method of opening a drug, including:
(а) встраивание вектора в геном эукариотичекой клетки-хозяина, при котором вектор активирует экспрессию эндогенного гена в этой клетке,(a) embedding a vector in the genome of a eukaryotic host cell, in which the vector activates the expression of the endogenous gene in the cell,
(б) выращивание клетки в условиях, способствующих экспрессии активированного гена, при котором образуется продукт активированного гена,(b) growing the cell under conditions conducive to the expression of the activated gene, in which the product of the activated gene is formed,
(в) обработку клеток одним или несколькими соединениями, которые применяются для скрининга на лекарственную активность,(c) treating cells with one or more compounds that are used for screening for drug activity,
(г) определение способности этих соединений к взаимодействию с продуктом гена или их способности повлиять на фенотип клетки, вызванный продуктом этого гена.(g) determining the ability of these compounds to interact with a gene product or their ability to influence the phenotype of a cell caused by a product of this gene.
202. Способ обнаружения лекарственного препарата, включающий:202. A method for detecting a drug, comprising:
(а) встраивание вектора в геном эукариотичекой клетки-хозяина, при котором вектор активирует экспрессию эндогенного гена в этой клетке,(a) embedding a vector in the genome of a eukaryotic host cell, in which the vector activates the expression of the endogenous gene in the cell,
(б) выращивание клетки в среде с пониженной концентрацией сыворотки в условиях, способствующих выработке продукта, при котором образуется кондиционированная среда, содержащая продукт этого гена,(b) growing the cell in a medium with a low concentration of serum under conditions conducive to the production of a product under which a conditioned medium containing the product of this gene is formed,
(в) скринирование одного или нескольких соединений на лекарственную активность путем определения способности этих соединений взаимодействовать с продуктом гена в кондиционированной среде.(c) screening one or more compounds for drug activity by determining the ability of these compounds to interact with a gene product in an air-conditioned environment.
203. Способ по п.202, дополнительно включающий концентрирование кондиционированной среды перед скринированием в подпункте (в).203. The method according to claim 202, further comprising concentrating the conditioned medium before screening in subparagraph (c).
204. Способ по п.202, дополнительно включающий концентрирование кондиционированной среды перед скринированием в подпункте (в).204. The method according to claim 202, further comprising concentrating the conditioned medium before screening in subparagraph (c).