RU2001117497A - Варианты липолитических ферментов - Google Patents
Варианты липолитических ферментовInfo
- Publication number
- RU2001117497A RU2001117497A RU2001117497/13A RU2001117497A RU2001117497A RU 2001117497 A RU2001117497 A RU 2001117497A RU 2001117497/13 A RU2001117497/13 A RU 2001117497/13A RU 2001117497 A RU2001117497 A RU 2001117497A RU 2001117497 A RU2001117497 A RU 2001117497A
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lipolytic enzyme
- amino acid
- variant
- lipase
- paragraphs
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims 110
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims 110
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 claims 109
- 230000002366 lipolytic Effects 0.000 claims 102
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 37
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 31
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims 31
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 26
- 229940040461 Lipase Drugs 0.000 claims 25
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims 25
- 102000004882 lipase Human genes 0.000 claims 25
- 108090001060 lipase Proteins 0.000 claims 25
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims 25
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 claims 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 21
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims 17
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 claims 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 15
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims 12
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims 12
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims 12
- 241000223198 Humicola Species 0.000 claims 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 8
- FROLUYNBHPUZQU-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-6-[3-[3-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxypropoxy]propoxy]oxane-3,4,5-triol Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCCCOCCCOC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 FROLUYNBHPUZQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims 7
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 7
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims 5
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 claims 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 3
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 claims 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims 3
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 claims 3
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 claims 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims 3
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M (E)-Ferulic acid Natural products COC1=CC(\C=C\C([O-])=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M 0.000 claims 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims 2
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N Ferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 claims 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims 2
- -1 L264A Inorganic materials 0.000 claims 2
- 102100004188 LIPC Human genes 0.000 claims 2
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 claims 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 claims 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229940114124 ferulic acid Drugs 0.000 claims 2
- 235000001785 ferulic acid Nutrition 0.000 claims 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 claims 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims 2
- 102220271537 rs200383861 Human genes 0.000 claims 2
- 102220056652 rs397514616 Human genes 0.000 claims 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 2
- YJISHJVIRFPGGN-UHFFFAOYSA-N 5-[5-[3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-methoxyoxan-2-yl]oxy-6-[[3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-methoxyoxan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)-2-methyloxane-3,4-diol Chemical compound O1C(CO)C(OC)C(O)C(O)C1OCC1C(OC2C(C(O)C(OC)C(CO)O2)O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(C)C(O)C2O)CO)O1 YJISHJVIRFPGGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims 1
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 claims 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims 1
- 241000228232 Aspergillus tubingensis Species 0.000 claims 1
- 102200057215 B3GNT4 S83T Human genes 0.000 claims 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims 1
- 102200113123 CLTC K98E Human genes 0.000 claims 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 claims 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims 1
- 102200006976 HTD2 D62A Human genes 0.000 claims 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 claims 1
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 claims 1
- 108010058868 Phospholipases A1 Proteins 0.000 claims 1
- 229940100445 WHEAT STARCH Drugs 0.000 claims 1
- 102200051477 ZNF695 R84K Human genes 0.000 claims 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims 1
- 102220358508 c.297A>T Human genes 0.000 claims 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 claims 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 125000004437 phosphorous atoms Chemical group 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 102220259319 rs1553651734 Human genes 0.000 claims 1
- 102220011160 rs730880501 Human genes 0.000 claims 1
- 102220056648 rs730881059 Human genes 0.000 claims 1
- 102220080275 rs797045512 Human genes 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 claims 1
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 claims 1
- 230000035943 smell Effects 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims 1
Claims (64)
1. Способ получения варианта липолитического фермента, включающий а) выбор исходного липолитического фермента, имеющего спирт-связывающий сайт, содержащий глицериновую часть в положении sn2, b) выбор в исходном липолитическом ферменте, по крайней мере, одного аминокислотного остатка, который включает, по крайней мере, один атом в пределах 10 
от С-атома в положении sn2 глицериновой части триглицеридного субстрата в трехмерной структуре исходного липолитического фермента и субстрата; с) создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка, d) необязательно, создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях, отличающихся от положений, указанных в b), e) получение варианта со стадий а)-d), f) тестирование варианта на специфичность к субстрату, g) отбор варианта, обладающего модифицированной специфичностью к субстрату; и h) продуцирование выбранного варианта.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что исходный липолитический фермент является нативным по отношению к эукариотам, предпочтительно, грибам, а наиболее предпочтительно принадлежит к семейству Humicola или к семейству Zygomycetes.
3. Способ получения варианта липолитического фермента, предусматривающий а) выбор исходного липолитического фермента из семейства Humicola или семейства Zygomycetes, b) выбор, по крайней мере, одного аминокислотного остатка, соответствующего любой из аминокислот 20-25, 56-64, 81-85 и 255-269 в липазе Humicola lanuginosa, с) создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка, d) необязательно, создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях, отличающихся от положений, указанных в с), e) получение варианта со стадий а)-d), f) тестирование варианта на специфичность к субстрату, и g) отбор варианта, обладающего модифицированной специфичностью к субстрату.
4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что исходным липолитическим ферментом является липаза штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что модифицифированная специфичность к субстрату представляет собой более низкое отношение активности, направленной на C4-C8 ацильную связь в триглицериде, к активности, направленной на C16-C20 ацильную связь в триглицериде.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что исходный липолитический фермент принадлежит к семейству Humicola или к семейству Zygomycetes, а предпочтительно, является липазой штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa, а указанные выбранные аминокислотные остатки соответствуют аминокислотам Y21, Е56, D57, V60, G61, D62, R81, S83, R84, L259, Y261 или G266 в липазе Humicola lanuginosa.
7. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что модифицифированная специфичность к субстрату представляет собой более низкое отношение активности, направленной на C16-C20 ацильную связь в триглицериде, к активности, направленной на C4-C8 ацильную связь в триглицериде.
8. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что модифицифированная специфичность к субстрату представляет собой более высокую фосфолипазную активность.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что исходный липолитический фермент обладает фосфолипазной активностью ниже 50 PHLU/мг и/или имеет отношение фосфолипазной активности к липазной активности ниже 0,1 PHLU/LU.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что исходный липолитический фермент принадлежит к семейству Humicola или к семейству Zygomycetes, а предпочтительно, является липазой штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa, а указанные выбранные аминокислотные остатки включают аминокислоты R81, R84, S85 или 263-267 (например, G266 или Т267) в липазе Humicola lanuginosa.
11. Способ по любому из пп. 8-10, отличающийся тем, что указанные модификации включают вставку пепдидного удлинения в С-конце, предпочтительно, содержащую 1-5 аминокислотных остатков, где первым, предпочтительно, является А, Р или D, вторым (если присутствует), предпочтительно, является V, G или R, третьим (если присутствует), предпочтительно, является V, G или R, четвертым (если присутствует), предпочтительно, является F, и пятым (если присутствует) предпочтительно, является S.
12. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что модифицированная активность выше гидролитической активности по отношению к дигалактозилдиглицериду.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный исходный липолитический фермент принадлежит к семейству Humicola или к семейству Zygomycetes, а предпочтительно, является липазой штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa, а выбранные аминокислотные остатки соответствуют аминокислотным остаткам 21, 23, 26, 57, 62, 81, 83, 84, 85, 266, 267 или 269 в липазе Humicola lanuginosa.
14. Липолитический фермент, который представляет собой исходный липолитический фермент, имеющий спирт-связывающий сайт, содержащий глицериновую часть в положении sn2, где указанный вариант a) включает 1-20 модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делению или замену аминокислотного остатка в положении, которое, в трехмерной структуре исходного липолитического фермента и субстрата, находится в пределах 10 
от С-атома в положении sn2 глицериновой части триглицерида субстрата, b) необязательно включает вплоть до 10 других аминокислотных модификаций, и c) имеет модифицированную специфичность к субстрату.
15. Липолитический фермент по п.14, отличающийся тем, что исходный липолитический фермент является нативным по отношению к эукариотам, предпочтительно, грибам, а наиболее предпочтительно, нативный фермент принадлежит к семейству Zygomycetes.
16. Липолитический фермент по п.15, отличающийся тем, что исходный фермент принадлежит к семейству Humicola или к семейству Zygomycetes, а предпочтительно, является липазой штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa.
17. Липолитический фермент, который a) имеет аминокислотную последовательность, которая, по крайней мере, на 80% гомологична аминокислотной последовательности известного липолитического фермента семейства Humicola или семейства Zygomycetes: b) имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности известного липолитического фермента, где такие отличия включают (i) замену, делецию или инсерцию аминокислоты в положении, соответствующем А20, Y21, G23, К24, N25, V63, R81, G82, R84, А257, W260, Y261, F262 или G266 в липазе штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa; (ii) замену аминокислоты, соответствующей С268 или L269 в липазе штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa; (iii) замену, соответствующую V60G, D62E, L93K, L97Q, K98E,F, E99D, Р256А, G263E,Q,R,F,N, L264A,C,P,F,G,V,I, I265L,N,F, или T267A,Q,P,S,V,E в липазе штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa; iv) вставку, соответствующую T267GS или T267GL в липазе штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa; v) пептидное удлинение у С-конца, которое представляет собой: А, P, MD, СР, AG, DG, PG, AGG, PVGF, AGRF, PRGF, AGGF или AGGFS; vi) пептидное удлинение у С-конца из 40-50 аминокислот; или vii) усечение в 1, 2, 3, 4, 5 или б аминокислот у С-конца; и с) имеет специфичность к субстрату, отличающуюся от специфичности известного липолитического фермента.
18. Липолитический фермент по п.17, отличающийся тем, что аминокислотная замена соответствует R84K, L, W, W260H, Q, C, G266A, C, D, N, L, I, S, T, P, V, F, W, E, K, R, Y или L269N, I, S.
19. Липолитический фермент по п.17 или 18, который дополнительно включает, по крайней мере, одно аминокислотное различие, представляющее собой замену, делению или инсерцию, соответствующее любому из положений 22, 56-59, 61, 64, 83, 85, 91, 94, 249, 255 или 259, предпочтительно, S83T, G91A, N94D, D96S, W, F, G, Q249R или L259N, R, S, M, Q.
20. Липолитический фермент по любому из пп. 17-19, который дополнительно включает замену, соответствующую D62A,G,V, K98D, Е99К, Р256Т, G263A и/или I265T, G, V.
21. Липолитический фермент по любому из пп. 17-20, который включает пептидное удлинение у N-конца по сравнению с липолитическим ферментом.
22. Липолитический фермент по любому из пп. 17-21, отличающийся тем, что известным липолитическим ферментом является липаза от Humicola lanuginosa.
23. Липолитический фермент по любому из пп. 17-21, отличающийся тем, что известным липолитическим ферментом является липаза от Rhizomucor miehei.
24. Липолитический фермент по любому из пп. 17-21, отличающийся тем, что известным липолитическим ферментом является липаза от Fusarium oxysporum.
25. Липолитический фермент по любому из пп. 14-24, отличающийся тем, что модифицифированная специфичность к субстрату представляет собой более низкое отношение активности, направленной на С4-С8 ацильную связь в триглицериде, к активности, направленной на C16-C20 ацильную связь в триглицериде.
26. Липолитический фермент по п.25, который включает аминокислотную модификацию в положении, соответствующем Y21, Е56, D57, V60, G61, D62, R81, S83, R84, L259, Y261 или G266 в липазе Humicola lanuginosa.
27. Липолитический фермент по любому из пп. 14-24, отличающийся тем, что модифицированная специфичность к субстрату представляет собой более низкое отношение активности, направленной на C16-C20 ацильную связь в триглицериде, к активности, направленной на C4-C8 ацильную связь в триглицериде.
28. Липолитический фермент по любому из пп. 14-24, отличающийся тем, что модифицированная специфичность к субстрату представляет собой более высокую фосфолипазную активность.
29. Липолитический фермент по п.28, который включает аминокислотную модификацию в положении, соответствующем R81, R84, S85, G263, L264, 1265, G266, Т267 или L269 в липазе Humicola lanuginosa, предпочтительно замену, соответствующую G263A, E, Q, R; L264A, C, P, Q; I265L,N,T; G266A, С, D, N, L, I, S, Т, P, V или T267A, Q или L269N.
30. Липолитический фермент по п.28 или 29, который обладает фосфолипазной активностью, составляющей более 0,1 нмоль/мин в анализе с использованием монослоя при рН 5, описанного здесь, и/или фосфолипазной активностью более 100 PHLU/мг (предпочтительно, более 500 PHLU/мг), и/или отношение фосфолипазной активности к липазной активности более 0,1 PHLU/LU (предпочтительно, более 0,5 PHLU/LU).
31. Липолитический фермент по любому из пп. 28-30, отличающийся тем, что исходный липолитический фермент обладает фосфолипазной активностью менее 50 PHLU/мг, и/или имеет отношение фосфолипазной активности к липазной активности менее 0,1 PHLU/LU.
32. Липолитический фермент по любому из пп. 28-31, который включает пептидное удлинение в С-конце, предпочтительно, содержащее 1-5 аминокислотных остатков, где первым, предпочтительно, является А, Р или D, вторым (если присутствует), предпочтительно, является V, G или R, третьим (если присутствует), предпочтительно, является V, G или R, четвертым (если присутствует), предпочтительно, является F, и пятым (если присутствует) предпочтительно, является S.
33. Липолитический фермент по любому из пп. 28-32, который включает делецию аминокислотных остатков в положениях, соответствующих положениям С268 и L269 в липазе штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa.
34. Липолитический фермент по любому из пп. 14-24, отличающийся тем, что модифицированная специфичность к субстрату представляет собой повышенную гидролитическую активность по отношению к дигалактозилдиглицериду.
35. Липолитический фермент по п.34, который включает аминокислотную модификацию в положении, соответствующем Y21, G23, N26, 057, 062, R81, S83, R84, S85, G266, Т267 или L269 в липазе Humicola lanuginosa, предпочтительно, включающий две или более таких модификаций, наиболее предпочтительно, дополнительно включающий, по крайней мере, одну модификацию в области "крышки".
36. Липолитический фермент по любому из пп.1 4-35, который включает модификацию в области "крышки", которая представляет собой замену отрицательно заряженного аминокислотного остатка нейтральным аминокислотным остатком или положительно заряженным аминокислотным остатком или замену нейтрального аминокислотного остатка положительно заряженным аминокислотным остатком.
37. Липолитический фермент по п.36, который включает модификацию в области "крышки" в положении, соответствующем положению G91, D96 и/или Е99 в липазе Humicola lanuginosa, a предпочтительно, замену, которая представляет собой G91A, D96S,W,F или Е99К.
38. Последовательность ДНК, кодирующая липолитический фермент по любому из пп. 14-37.
39. Вектор, включающий последовательность ДНК по п.38.
40. Трансформированная клетка-хозяин, несущая последовательность ДНК по п.38 или вектор по п.39.
41. Способ получения липолитического фермента по любому из пп. 14-37, предусматривающий a) культивирование клетки-хозяина по п.40 в условиях, способствующих экспрессии, и, предпочтительно, секреции липолитического фермента, и b) выделение липолитического фермента.
42. Способ приготовления теста или испеченного продукта, приготовленного из теста, включающий добавление липолитического фермента по любому из пп. 14-37 в тесто, где липолитический фермент, предпочтительно, обладает фосфолипазной активностью и/или дигалактозилдиглицеридной активностью.
43. Способ по п.42, который дополнительно предусматривает добавление в тесто эндоамилазы и/или фосфолипида.
44. Способ по п.42 или 43, отличающийся тем, что эндоамилаза происходит от Bacillus, и, предпочтительно, представляет собой мальтозообразующую амилазу от В. stearothermophilus.
45. Способ снижения содержания фосфолипида в пищевом масле, включающий обработку масла липолитическим ферментом по любому из пп. 28-33, так, чтобы осуществлялся гидролиз большей части фосфолипида, и отделение водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла.
46. Способ улучшения фильтруемости водного раствора или суспензии углеводного источника, содержащего фосфолипид, причем способ включает обработку раствора или суспензии липолитическим ферментом по любому из пп. 28-33, где раствор или суспензия, предпочтительно, содержит гидролизат крахмала, а в частности, гидролизат пшеничного крахмала.
47. Композиция моющего средства, включающая поверхностно-активное вещество и липолитический фермент по любому из пп. 14-37, где липолитический фермент, предпочтительно, обладает специфичностью по отношению к длинноцепочечным жирным кислотам, соответствующей отношению SLU/LU, превышающему 3.
48. Способ усиления запаха пищевого продукта, содержащего молочный жир, включающий обработку пищевого продукта липолитическим ферментом по любому из пп. 27-52 для высвобождения свободных жирных кислот, где липолитический фермент, предпочтительно, обладает специфичностью по отношению к короткоцепочечным жирным кислотам, соответствующей отношению SLU/LU ниже 0,5, более предпочтительно, ниже 0,2, например, ниже 0,1.
49. Способ получения варианта липолитического фермента, включающий a) выбор исходного липолитического фермента, имеющего структуру, содержащую каталитическую триаду, состоящую из активного остатка Ser, активного остатка Asp и активного остатка His, b) выбор в указанном исходном липолитическом ферменте, по крайней мере, одного аминокислотного остатка, содержащего, по крайней мере, один атом, принадлежащий к серии Е, определенной в нижеследующих стадиях: i) сопоставления структуры липолитического фермента со структурой липазы 4TGL Rhizomucor miehei, содержащей каталитическую триаду и атом фосфора ингибитора (4TGL-inhP), для минимизации суммы квадратов отклонения между атомами каталитических триад двух структур, ii) определения набора А, состоящего из атомов липолитического фермента внутри сферы радиусом 18 
с центром в 4TGL-inhP, iii) формирования первой плоскости, определенной 4TGL-inhP, атомом Сα активного остатка Ser исходного липолитического фермента и атомом Сα активного остатка Asp исходного липолитического фермента, и определения набора В как поднабора набора А, состоящего из атомов на той же самой стороне первой плоскости, на которой расположен атом Сα активного остатка His исходного липолитического фермента, iv) формирования второй плоскости, определенной 4TGL-inhP, атомом Сα активного остатка Ser исходного липолитического фермента и атомом Сα активного остатка His исходного липолитического фермента, и определения набора С как поднабора набора А, состоящего из атомов на противоположной стороне второй плоскости, на которой расположен атом Сα активного остатка Asp исходного липолитического фермента, v) формирования набора D, состоящего из атомов, принадлежащих к объединенным наборам В и С, и имеющего доступность к растворителю 15 или выше, и vi) формирования набора Е, состоящего из аминокислотных остатков в структуре, которая содержит атом, принадлежащий к набору D, или атом, принадлежащий к объединенным наборам В и С и расположенный на расстоянии, менее, чем 3,5 
от атома, принадлежащего к набору D, c) создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену выбранного аминокислотного остатка, d) необязательно, создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях, отличающихся от положений, указанных в с), e) получение варианта со стадий а)-d), и f) тестирование варианта на специфичность к субстрату, g) отбор варианта, обладающего модифицированной специфичностью к субстрату, и h) продуцирование выбранного варианта.
50. Способ получения варианта липолитического фермента, включающий a) выбор исходного липолитического фермента, имеющего активный сайт, содержащий активный остаток His, b) в аминокислотной последовательности исходного липолитического фермента, выбор, по крайней мере, одного аминокислотного остатка со стороны С-конца от активного остатка His, c) создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делению или замену аминокислотного остатка, d) необязательно, создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях, отличающихся от положений, указанных в b), e) получение варианта со стадий а)-d), f) тестирование варианта на специфичность к субстрату, g) отбор варианта, обладающего модифицированной специфичностью к субстрату, и h) продуцирование выбранного варианта.
51. Способ получения варианта липолитического фермента, включающий a) выбор исходного липолитического фермента, b) выбор, по крайней мере, одного аминокислотного остатка из 10 аминокислотных остатков у С-конца, c) создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену выбранного аминокислотного остатка, d) необязательно, создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях, отличающихся от положений, указанных в с), e) получение варианта со стадий а)-d), f) тестирование варианта на специфичность к субстрату, g) отбор варианта, обладающего модифицированной специфичностью к субстрату, и h) продуцирование выбранного варианта.
52. Способ получения варианта липолитического фермента, включающий a) отбор исходного липолитического фермента, имеющего "крышку", b) отбор, по крайней мере, одного аминокислотного остатка в "крышке", c) создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делецию или замену выбранного аминокислотного остатка, d) необязательно, создание модификаций, каждая из которых представляет собой инсерцию, делению или замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях, отличающихся от положений, указанных в b), e) получение варианта со стадий а)-d), f) тестирование варианта на специфичность к субстрату, g) отбор варианта, обладающего модифицированной специфичностью к субстрату, и h) продуцирование выбранного варианта.
53. Способ получения варианта липолитического фермента для использования в хлебопечении, включающий a) выбор исходного липолитического фермента, b) создание, по крайней мере, одной модификации, которая представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в липолитическом ферменте с получением варианта липолитического фермента, c) скрининг на вариант липофильного фермента, который по сравнению с исходным липофильным ферментом, имеет (i) более высокое отношение селективности для ацильных групп длинноцепочечных жирных кислот, (ii) более высокую активность по отношению к дигалактозилдиглицериду, и (iii) более высокую фосфолипазную активность, и d) получение варианта липолитического фермента.
54. Способ по п.53, отличающийся тем, что исходный липолитический фермент и аминокислотные модификации выбраны так, как это было определено по любому из пп. 1-4 или 49-52.
55. Способ получения варианта липолитического фермента для использования в хлебопечении, включающий a) осуществление случайного мутагенеза последовательности ДНК, кодирующей липолитический фермент, b) экспрессию мутированной последовательности ДНК, полученной в стадии (а) в клетке-хозяине, и c) скрининг клеток-хозяев, экспрессирующих вариант липолитического фермента, который по сравнению с исходным липолитическим ферментом имеет (i) более высокое отношение селективности для ацильных групп длинноцепочечных жирных кислот, (ii) более высокую активность по отношению к дигалактозилдиглицериду, и (iii) более высокую фосфолипазную активность, и d) получение варианта липолитического фермента.
56. Липолитический фермент, который представляет собой вариант исходного липолитического фермента, имеющего "крышку", где указанный вариант a) содержит модификацию, которая представляет собой инсерцию, делецию или замену аминокислотного остатка в области "крышки", b) имеет модифицированную специфичность к субстрату.
57. Липолитический фермент, который представляет собой вариант исходного липолитического фермента, имеющего активный сайт, содержащий активный остаток His, где указанный вариант a) содержит модификацию, которая представляет собой инсерцию, делецию или замену, по крайней мере, одного аминокислотного остатка со стороны С-конца от активного остатка His, b) имеет модифицированную специфичность к субстрату.
58. Липолитический фермент, который представляет собой вариант исходного липолитического фермента, где указанный вариант a) содержит модификацию, которая представляет собой инсерцию, делецию или замену, по крайней мере, одной аминокислоты из 10 аминокислотных остатков у С-конца, b) имеет модифицированную специфичность к субстрату.
59. Липолитический фермент, который a) представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая, по крайней мере, на 80% гомологична последовательности известного фермента, являющегося лизофосфолипазой от Aspergillus foetidus, (феруловая кислота)-эстеразой от Aspergillus niger, (феруловая кислота)-эстеразой от Aspergillus tubigensis или фосфолипазой А1 от Aspergillus oryzae, b) по сравнению с указанным известным ферментом, содержит аминокислотную модификацию, которая представляет собой замену, делецию или инсерцию в положении, соответствующем 20-25, 56-64, 81-85, 91-98, 255-257 или 259-269 в липазе Humicola lanuginosa ис) имеет модифицированную специфичность к субстрату по сравнению с известным ферментом.
60. Липолитический фермент по п.59, отличающийся тем, что указанная модификация находится в положении, соответствующем Y21, Е56, D57, V60, G61, D62, S83, R84, G91, L93, N94, D96, L97, К98, Е99, Р256, W260, Y261, G263, L264, 1265, G266, Т267 или L269 в липазе Humicola lanuginosa.
61. Липолитический фермент по п.59 или 60, отличающийся тем, что модификацией является удлинение или усечение у С-конца, предпочтительно, на 1-5 аминокислот.
62. Липолитический фермент, который представляет собой вариант исходной липазы, полученной от штамма DSM 4109 Humicola lanuginosa, содержащий модификации E1E, D, A+ G91G, A, S, T+ N94N, D+ D96D,G,F,W+ E99E,K+ G225G,R,K+ G263Q,N+ L264L,A,V+ I265I,T,S+ G266G, A, V, S, D, E+ T267T, A, V+ L269L, I, N, Q.
63. Липолитический фермент по п.62, который дополнительно включает SPIRR в качестве пептидного удлинения у N-конца и/или AGGF или AGGFS в качестве пептидного удлинения у С-конца.
64. Способ приготовления теста или продукта, приготовленного из теста, включающий а) тестирование, по крайней мере, одного липолитического фермента на его гидролитическую активность по отношению к С4-С8 ацильной связи в триглицериде, C16-C20 ацильной связи в триглицериде, дигалактозилдиглицериде и фосфолипиде, b) выбор липолитического фермента, обладающего гидролитической активностью по отношению к дигалактозилдиглицериду и фосфолипиду, и имеющего отношение активности, направленной на С16-С20 ацильную связь, к активности, направленной на С4-C8 ацильную связь, которое соответствует отношению SLU/LU, равному, по крайней мере, 3, и c) добавление выбранного липолитического фермента в тесто.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA199801572 | 1998-11-27 | ||
| DKPA199801572 | 1998-11-27 | ||
| DKPA199900391 | 1999-03-22 | ||
| DKPA199901481 | 1999-10-15 | ||
| DKPA199901481 | 1999-10-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001117497A true RU2001117497A (ru) | 2003-07-27 |
| RU2235775C2 RU2235775C2 (ru) | 2004-09-10 |
Family
ID=33435998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001117497/13A RU2235775C2 (ru) | 1998-11-27 | 1999-11-29 | Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2235775C2 (ru) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7666618B2 (en) | 2004-07-16 | 2010-02-23 | Danisco A/S | Lipolytic enzyme: uses thereof in the food industry |
| US7718204B2 (en) | 1998-07-21 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Foodstuff |
| US7718408B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
| US7807398B2 (en) | 2003-01-17 | 2010-10-05 | Danisco A/S | Method of using lipid acyltransferase |
| US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
| US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
| US7960150B2 (en) | 2007-01-25 | 2011-06-14 | Danisco A/S | Production of a lipid acyltransferase from transformed Bacillus licheniformis cells |
| US8012732B2 (en) | 2004-03-12 | 2011-09-06 | Danisco A/S | Fungal lypolytic and amylase enzyme composition and methods using the same |
| US8030044B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-10-04 | Danisco A/S | Lipid acyltransferases |
| USRE43135E1 (en) | 2001-05-18 | 2012-01-24 | Danisco A/S | Method of improving dough and bread quality |
| USRE43341E1 (en) | 1995-06-07 | 2012-05-01 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
| US8652809B2 (en) | 2007-08-17 | 2014-02-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method for producing ultra-heat treatment milk |
| RU2518345C2 (ru) * | 2003-01-17 | 2014-06-10 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | Белки |
| RU2538144C2 (ru) * | 2004-07-16 | 2015-01-10 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | Липолитические ферменты, их применение при использовании пищевых продуктов |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX2010004668A (es) * | 2007-11-05 | 2010-05-20 | Danisco Us Inc | Variantes de alfa-amilasa de bacillus licheniformis con termoestabilidad incrementada y/o dependencia de calcio disminuida. |
| CN110129299B (zh) * | 2016-06-02 | 2021-08-03 | 天津科技大学 | 磷脂酶d及其应用 |
-
1999
- 1999-11-29 RU RU2001117497/13A patent/RU2235775C2/ru active
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE43341E1 (en) | 1995-06-07 | 2012-05-01 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
| US7718204B2 (en) | 1998-07-21 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Foodstuff |
| US7781001B2 (en) | 1998-07-21 | 2010-08-24 | Danisco A/S | Foodstuff |
| US7972638B2 (en) | 1998-07-21 | 2011-07-05 | Danisco A/S | Foodstuff |
| US8163315B2 (en) | 1998-07-21 | 2012-04-24 | Danisco A/S | Foodstuff |
| USRE43135E1 (en) | 2001-05-18 | 2012-01-24 | Danisco A/S | Method of improving dough and bread quality |
| US8278062B2 (en) | 2003-01-14 | 2012-10-02 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method of using lipid acyltransferase |
| RU2518345C2 (ru) * | 2003-01-17 | 2014-06-10 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | Белки |
| US7807398B2 (en) | 2003-01-17 | 2010-10-05 | Danisco A/S | Method of using lipid acyltransferase |
| US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
| US7955813B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco, A/S | Method of using lipid acyltransferase |
| US8003095B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-08-23 | Danisco A/S | Method of using lipid acyltransferase |
| US8030044B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-10-04 | Danisco A/S | Lipid acyltransferases |
| US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
| US8440435B2 (en) | 2003-12-24 | 2013-05-14 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method for reducing 1,2-diglyceride content of an edible oil |
| US7718408B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
| US8012732B2 (en) | 2004-03-12 | 2011-09-06 | Danisco A/S | Fungal lypolytic and amylase enzyme composition and methods using the same |
| US7666618B2 (en) | 2004-07-16 | 2010-02-23 | Danisco A/S | Lipolytic enzyme: uses thereof in the food industry |
| US8192782B2 (en) | 2004-07-16 | 2012-06-05 | Danisco A/S | Enzymatic oil-degumming method |
| US8535900B2 (en) | 2004-07-16 | 2013-09-17 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Lipolytic enzyme uses thereof in the food industry |
| US8889371B2 (en) | 2004-07-16 | 2014-11-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Lipolytic enzyme: uses thereof in the food industry |
| RU2538144C2 (ru) * | 2004-07-16 | 2015-01-10 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | Липолитические ферменты, их применение при использовании пищевых продуктов |
| US7960150B2 (en) | 2007-01-25 | 2011-06-14 | Danisco A/S | Production of a lipid acyltransferase from transformed Bacillus licheniformis cells |
| US8652809B2 (en) | 2007-08-17 | 2014-02-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method for producing ultra-heat treatment milk |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2001117497A (ru) | Варианты липолитических ферментов | |
| US7157262B2 (en) | Lipolytic enzymes | |
| CA2715829C (en) | Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same | |
| CA2353379A1 (en) | Lipolytic enzyme variants | |
| CN105296445B (zh) | 脂肪酶变体 | |
| EP0843725B1 (en) | Method for preparing polypeptide variants | |
| JP4191775B2 (ja) | 脂肪分解酵素変異体 | |
| US7226770B2 (en) | Lipolytic enzyme variant | |
| CA2467415C (en) | Lipolytic enzyme variants and method for their production | |
| Shimada et al. | Purification and characterization of a novel solvent-tolerant lipase from Fusarium heterosporum | |
| Ohnishi et al. | Purification and characterization of a novel lipolytic enzyme from Aspergillus oryzae | |
| AU2002219020A1 (en) | Thermostable lipolytic enzyme variant | |
| EP2250258A2 (en) | Lipolytic enzyme variant with improved stability and polynucleotides encoding same | |
| Secundo et al. | Activity and enantioselectivity of wildtype and lid mutated Candida rugosa lipase isoform 1 in organic solvents | |
| Gaskin et al. | Alteration of lipase chain length specificity in the hydrolysis of esters by random mutagenesis | |
| AU2011204998B2 (en) | Lipolytic enzyme variants | |
| Uppenberg | The three-dimensional structure of lipase B from Candida antarctica |