Claims (26)
1. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, при том, что упомянутый способ включает: (а) получение популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц, причем каждая из упомянутых матриц включает кодирующую последовательность и функционально присоединенную промоторную последовательность; (b) гибридизацию с упомянутой популяцией одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц смеси по существу комплементарных одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот, причем упомянутые фрагменты по длине короче упомянутых нуклеиновых кислот-матриц; (c) контактирование каждого продукта гибридизации стадии (b) и с ДНК-полимеразой, утратившей активность по замещению цепи, и с ДНК-лигазой в условиях, при которых упомянутые фрагменты действуют как затравки для формирования вторых цепей нуклеиновой кислоты, которые по существу комплементарны упомянутым нуклеиновым кислотам-матрицам; и (d) контактирование продуктов стадии (с) с РНК-полимеразой с получением библиотеки РНК, причем упомянутую библиотеку транскрибируют с упомянутых вторых цепей нуклеиновой кислоты.1. A method for producing a nucleic acid library, wherein said method comprises: (a) obtaining a population of single-stranded nucleic acid matrices, each of which is a coding sequence and a functionally linked promoter sequence; (b) hybridizing with said population of single stranded nucleic acid matrices of a mixture of substantially complementary single stranded nucleic acid fragments, said fragments being shorter in length than said nucleic acid matrices; (c) contacting each hybridization product of step (b) with both a DNA polymerase that has lost chain substitution activity and a DNA ligase under conditions in which said fragments act as seeds to form second nucleic acid chains that are substantially complementary to said matrix nucleic acids; and (d) contacting the products of step (c) with an RNA polymerase to obtain an RNA library, said library being transcribed from said second nucleic acid chains.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый способ используют для внесения одной или большего числа мутаций в упомянутую библиотеку. 2. The method according to p. 1, characterized in that said method is used to introduce one or more mutations into said library.
3. Способ снижения изменчивости последовательности в популяции молекул нуклеиновой кислоты, при том, что упомянутый способ включает: (a) получение первой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц с изменяющейся последовательностью, причем каждая из по существу всех упомянутых матриц включает кодирующую последовательность и функционально присоединенную промоторную последовательность; (b) гибридизацию членов упомянутой первой популяции со второй или другими популяциями фрагментов одноцепочечных нуклеиновых кислот, причем упомянутые фрагменты по длине короче упомянутых нуклеиновых кислот-матрицы и упомянутые фрагменты по существу комплементарны упомянутым нуклеиновым кислотам-матрицам, причем субпопуляция упомянутых второй или других популяций включает по существу идентичную последовательность и гибридизует с областью изменяющейся последовательности; (c) контактирование продуктов гибридизации стадии (b) и с ДНК-полимеразой, утратившей активность по замещению цепи, и с ДНК-лигазой в условиях, при которых упомянутые фрагменты действуют как затравки для формирования вторых цепей нуклеиновой кислоты, которые по существу комплементарны упомянутым нуклеиновым кислотам-матрицам; и (d) контактирование продуктов стадии (с) с РНК-полимеразой с получением третьей популяции молекул РНК, при том, что упомянутая третья популяция молекул РНК транскрибируется с упомянутых вторых цепей нуклеиновой кислоты и характеризуется сниженной изменчивостью последовательностей по сравнению с упомянутой первой популяцией одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц. 3. A method of reducing sequence variability in a population of nucleic acid molecules, wherein said method comprises: (a) obtaining a first population of single-stranded nucleic acid matrices with a variable sequence, each of essentially all of the aforementioned matrices comprising a coding sequence and a functionally linked promoter sequence; (b) hybridizing members of said first population with a second or other populations of single-stranded nucleic acid fragments, said fragments being shorter in length than said nucleic acid matrices and said fragments are substantially complementary to said nucleic acid matrices, wherein a subset of said second or other populations comprises essentially identical sequence and hybridizes to the region of the changing sequence; (c) contacting the products of the hybridization of step (b) with both a DNA polymerase that has lost chain substitution activity and a DNA ligase under conditions in which said fragments act as seeds to form second nucleic acid chains that are substantially complementary to said nucleic matrix acids; and (d) contacting the products of step (c) with an RNA polymerase to produce a third population of RNA molecules, wherein said third population of RNA molecules is transcribed from said second nucleic acid chains and is characterized by reduced sequence variability compared to said first single-stranded nucleic acid population acid matrices.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что упомянутый способ используют для удаления одной или большего числа мутаций из упомянутой первой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц. 4. The method according to p. 3, characterized in that said method is used to remove one or more mutations from said first population of single-stranded nucleic acid matrices.
5. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что упомянутую смесь по существу комплементарных одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот формируют путем расщепления молекул двухцепочечной нуклеиновой кислоты или путем синтеза случайных олигонуклеотидов. 5. The method according to p. 1 or 3, characterized in that the said mixture of essentially complementary single-stranded nucleic acid fragments is formed by splitting double-stranded nucleic acid molecules or by synthesis of random oligonucleotides.
6. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что упомянутая смесь по существу комплементарных одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот включает, по крайней мере, около 100 различных видов фрагментов нуклеиновых кислот. 6. The method according to p. 1 or 3, characterized in that the said mixture of essentially complementary single-stranded fragments of nucleic acids includes at least about 100 different types of fragments of nucleic acids.
7. Способ по п. 1 или 3, далее включающий формирование комплементарных цепей из упомянутых вторых цепей нуклеиновой кислоты, получение упомянутых комплементарных цепей, как и первой упомянутой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц, и повторение стадий (b) и (с) один или более раз, и затем повторение стадии (d). 7. The method according to claim 1 or 3, further comprising forming complementary chains from said second nucleic acid chains, obtaining said complementary chains, like the first mentioned population of single-stranded nucleic acid matrices, and repeating steps (b) and (c) one or more times, and then repeating step (d).
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает получение одного или большего числа одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот, которые образуют гомодуплекс с упомянутой одноцепочечной нуклеиновой кислотой-матрицей, и осуществление стадии (b) в присутствие упомянутых фрагментов, образующих гомодуплекс. 8. The method according to p. 1, characterized in that said method further comprises obtaining one or more single-stranded nucleic acid fragments that form a homoduplex with said single-stranded nucleic acid matrix, and performing step (b) in the presence of said homoduplex-forming fragments .
9. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что упомянутым промотором является промотор Т7. 9. The method according to p. 1 or 3, characterized in that the said promoter is a T7 promoter.
10. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что упомянутой ДНК-полимеразой является ДНК-полимераза Т4. 10. The method according to p. 1 or 3, characterized in that the said DNA polymerase is T4 DNA polymerase.
11. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает амплификацию упомянутого продукта стадии (с) перед проведением упомянутой стадии контактирования (d). 11. The method according to p. 1 or 3, characterized in that said method further comprises amplifying said product of step (c) before carrying out said contacting step (d).
12. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает стадию (е) трансляция упомянутой библиотеки РНК с получением библиотеки белков. 12. The method according to p. 1 or 3, characterized in that the said method further includes a step (e) translation of the aforementioned RNA library with obtaining a library of proteins.
13. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает следующую стадию: 2 (е) присоединение к 3'-концу упомянутой кодирующей последовательности каждого из по существу всех членов упомянутой библиотеки РНК молекулы-акцептора аминокислот; и, необязательно (f) трансляция упомянутой библиотеки РНК с получением библиотеки РНК-белковых химер. 13. The method according to p. 1 or 3, characterized in that said method further comprises the following step: 2 (e) attaching to the 3'-end of said coding sequence of each of essentially all members of said RNA library of an amino acid acceptor molecule; and optionally (f) translating said RNA library to obtain a library of RNA protein chimeras.
14. Способ формирования библиотеки нуклеиновых кислот, при том, что упомянутый способ включает: (a) получение первой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц, причем каждая из упомянутых матриц включает кодирующую последовательность; (b) получение второй популяции молекул одноцепочечных нуклеиновых кислот с изменяющейся последовательностью, при том, что упомянутая первая популяция одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц и упомянутая вторая популяция молекул одноцепочечных нуклеиновых кислот с изменяющейся последовательностью по существу комплементарны; (c) гибридизацию упомянутой первой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц с упомянутой второй популяцией молекул одноцепочечных нуклеиновых кислот с изменяющейся последовательностью в условиях, эффективных для образования дуплексов; и (d) контактирование упомянутых дуплексов с одним или несколькими ферментами вырезания/репарации в условиях, которые позволяют упомянутым ферментам исправлять ошибочные пары нуклеотидов в упомянутых дуплексах. 14. A method of forming a nucleic acid library, wherein said method comprises: (a) obtaining a first population of single-stranded nucleic acid matrices, each of said matrices comprising a coding sequence; (b) obtaining a second population of variable-sequence single-stranded nucleic acid molecules, wherein said first population of single-stranded nucleic acid matrices and said second population of variable-sequence single-stranded nucleic acid molecules are substantially complementary; (c) hybridizing said first population of single-stranded nucleic acid matrices with said second population of variable-stranded single-stranded nucleic acid molecules under conditions effective for the formation of duplexes; and (d) contacting said duplexes with one or more excision / repair enzymes under conditions that allow said enzymes to correct erroneous nucleotide pairs in said duplexes.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает после стадии (d) получение новой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц, включающий кодирующую последовательность, причем упомянутые матрицы являются производными от продукта стадии (d), замещение упомянутой новой популяции матриц на упомянутую первую популяцию матриц и повторение стадий (c) и (d) один или более раз. 15. The method according to p. 14, characterized in that said method further comprises, after step (d), obtaining a new population of single-stranded nucleic acid matrices, comprising a coding sequence, said matrices being derived from the product of step (d), replacing said new population matrices to said first matrix population and repeating steps (c) and (d) one or more times.
16. Способ формирования библиотеки нуклеиновых кислот, при том, что упомянутый способ включает: (a) получение популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц, причем каждая из матриц включает кодирующую последовательность; (b) гибридизацию упомянутой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц со смесью по существу комплементарных одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот, причем упомянутые фрагменты по длине короче упомянутых нуклеиновых кислот-матриц; (c) контактирование каждого из продуктов гибридизации стадии (b) и с ДНК-полимеразой, утратившей активность по замещению цепи, и с ДНК-лигазой в условиях, в которых упомянутые фрагменты действуют как затравки для образования второй цепи нуклеиновой кислоты, которая в существенной степени комплементарна упомянутым нуклеиновым кислотам-матрицам; и (d) контактирование продуктов стадии (с) с одним или несколькими ферментами вырезания/репарации в условиях, которые позволяют упомянутым ферментам исправлять ошибочные пары нуклеотидов в упомянутых продуктах. 16. A method of forming a nucleic acid library, wherein said method comprises: (a) obtaining a population of single-stranded nucleic acid matrices, each of the matrices comprising a coding sequence; (b) hybridizing said population of single-stranded nucleic acid matrices with a mixture of substantially complementary single-stranded nucleic acid fragments, said fragments being shorter in length than said nucleic acid matrices; (c) contacting each of the hybridization products of step (b) with both a DNA polymerase that has lost chain substitution activity and a DNA ligase under conditions in which said fragments act as seeds to form a second nucleic acid chain, which is substantially complementary to said nucleic acid matrices; and (d) contacting the products of step (c) with one or more excision / repair enzymes under conditions that allow said enzymes to correct erroneous nucleotide pairs in said products.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает стадию получения новой популяции одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц, включающих кодирующую последовательность, и производных от продукта стадии (d), замещение упомянутой новой популяции матриц на упомянутую популяцию одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц и повторение стадий (b)-(d) один или более раз. 17. The method according to p. 16, characterized in that the said method further includes the step of obtaining a new population of single-stranded nucleic acid matrices comprising a coding sequence and derived from the product of stage (d), replacing said new population of matrices with said population of single-stranded nucleic acids matrices and repeating steps (b) to (d) one or more times.
18. Способ по п. 14 или 16, отличающийся тем, что упомянутое контактирование с упомянутыми ферментами вырезания/репарации осуществляют in vivo или in vitro. 18. The method according to p. 14 or 16, characterized in that said contacting with said excision / repair enzymes is carried out in vivo or in vitro.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что упомянутое контактирование с упомянутыми ферментами вырезания/репарации осуществляют в бактериальной клетке. 19. The method according to p. 18, characterized in that said contacting with said excision / repair enzymes is carried out in a bacterial cell.
20. Способ по любому из пп. 1, 3, 14 или 16, отличающийся тем, что упомянутые одноцепочечные нуклеиновые кислоты-матрицы формируют с использованием фага М13, несущего упомянутые нуклеиновые кислоты-матрицы, путем расщепления одной цепи от двухцепочечных нуклеиновых кислот-матриц с использованием генной экзонуклеазы-VI или лямбда-экзонуклеазы, путем захвата биотинилированных отдельных цепей нуклеиновой кислоты с использованием стрептавидина или путем обратной транскрипции РНК. 20. The method according to any one of paragraphs. 1, 3, 14 or 16, characterized in that the said single-stranded nucleic acid matrices are formed using phage M13 carrying the aforementioned nucleic acid matrices by cleaving one strand of double-stranded nucleic acid matrices using gene exonuclease-VI or lambda- exonuclease by capturing biotinylated individual nucleic acid chains using streptavidin or by reverse transcription of RNA.
21. Способ по любому из пп. 1, 3, 14 или 16, отличающийся тем, что стадию (Ь) осуществляют с использованием от 1 до приблизительно 1000 молекул одноцепочечных нуклеиновых кислот с изменяющейся последовательностью или фрагментов одноцепочечных нуклеиновых кислот на каждую из упомянутых одноцепочечных нуклеиновых кислот-матриц. 21. The method according to any one of paragraphs. 1, 3, 14 or 16, characterized in that stage (b) is carried out using from 1 to about 1000 single-stranded nucleic acid molecules with a variable sequence or fragments of single-stranded nucleic acids for each of the aforementioned single-stranded nucleic acid matrices.
22. Способ по п. 14 или 16, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает стадию: (е) амплификация упомянутого продукта стадии (d). 22. The method according to p. 14 or 16, characterized in that said method further comprises a step: (e) amplifying said product of step (d).
23. Способ по п. 14 или 16, отличающийся тем, что каждая из упомянутых кодирующих последовательностей функционально соединена с промоторной последовательностью. 23. The method according to p. 14 or 16, characterized in that each of said coding sequences is operatively connected to a promoter sequence.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает стадию (e) транскрипция продуктов стадии (d) с формированием библиотеки РНК. 24. The method according to p. 23, characterized in that the said method further includes a step (e) transcription of the products of step (d) with the formation of an RNA library.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает стадию (f) трансляция упомянутой библиотеки РНК с формированием библиотеки белков. 25. The method according to p. 24, characterized in that the said method further includes a step (f) translation of the aforementioned RNA library with the formation of a protein library.
26. Способ по п. 24, отличающийся тем, что упомянутый способ дополнительно включает стадию: (f) присоединение к 3'-концу упомянутой кодирующей последовательности каждого из по существу всех членов упомянутой библиотеки РНК молекулы-акцептора аминокислот, и, необязательно (g) трансляция упомянутой библиотеки РНК с формированием библиотеки РНК-белковых химер. 26. The method of claim 24, wherein said method further comprises the step of: (f) attaching to the 3 ′ end of said coding sequence of each of substantially all members of said RNA library of an amino acid acceptor molecule, and optionally (g) translation of the aforementioned RNA library with the formation of a library of RNA-protein chimeras.