RU2000570C1 - Способ определени свободной воды в биологических ткан х - Google Patents

Abstract

Использование: в области медицины, в частности к гистологии. Сущность изобретени : образец исследуемой биологической ткани погружают в 96° этанол и термостати- руют в течение часа, затем регистрируют изменение объема системы ткань-этанол (AV) через каждые 10 минут до момента его стабилизации, измер ют плотность воды (р). Весь процесс ведут в изотермических услови х , а расчет массы свободной воды (т) в исследуемом образце осуществл ют по формуле m ( Способ прост в использовании и позвол ет определить свободную воду в плотном образце биологической ткани . 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к области техники гистологических и гистохимических исследований и может найти применение дл  количественного определени  свободной воды в кусочках органов и тканевых образовани х одновременно с окончанием их фиксации в этаноле.

Известен способ определени  свободной воды в различных ткан х организма, который основан на измерении объема воды при замораживании. Известно, что св занна  вода вымерзает при температуре ниже -20°С. Это позвол ет выморозить при более высокой температуре интерстициэльную и внутриклеточную свободную воду. Определение свободной воды провод т при помощи дил тометра Елекоева, состо щего из двух частей: сосудика емкостью 2,5-3 мл и манометра, изготовленного из микропипетки емкостью 0.1-0,2 мл. Исследуемую плотную ткань помещают в сосудик и заливают толуолом При кристаллизации свободной воды ее объем увеличитс  примерно на 10%.

Указателем изменений объема служит толуол , помещенный в манометр над исследуемой тканью. Вымораживание свободной воды провод т в двух ваннах с температурой -7 и -17°С, одновременно ставитс  контроль с толуолом. После вымораживани  свободной воды определ ют уровень толуола в манометрах и по специальной методике по этим данным рассчитывают количество свободной воды в исследуемом образце.

Недостатком этого способа  вл етс  сложность его осуществлени , он не может быть применен в практике гистологических и гистохимических исследований, так как в процессе определени  свободной годы в изучаемом образце происход т необратимые нарушени  целостности клеток, что  вл етс  неприемлемым.

Цель изобретени  - упрощение процесса определени  количества свободной воды в плотных кусочках биологических тканей без их предварительного механического разрушени .-

N3 О О

о ел

VI

о

о

Цель достигаетс  тем, что в способе определени  свободной воды в биологических ткан х согласно изобретению при изотермических услови х при 20-23°С образец погружают в 96° этанол и термостатируют, регистрируют изменение объема системы ткань - этанол AV от времени до момента его стабилизации, определ ют плотность р воды при температуре фиксации, а.расчет массы m свободной воды в исследуемом об- рэзце осуществл ют по формуле I

m AV -/э/0,0771 .

Сущность предлагаемого способа заключаетс  в следующем.

Известно устройство дл  фиксации биологической ткани, содержащее сосуд с герметичной крышкой, узел подачи фиксирующего раствора, св занный с сосудом , и отводной патрубок со шкалой,размещенный в зоне горловины. Это устройство позвол ет определить вр.ем  окончани  процесса фиксации образца биологической ткани в этаноле по динамике уменьшени  объема системы ткань - этанол в изотермических услови х.

Устройство дл  фиксации биологической ткани (самопроизвольна  утечка этанола из устройства после его зар дки не должна превышать 0,002 см3/сут), приспособлени  дл  зар дки устройства (хлорвиниловые трубки, шприц Жане), этанол (96°), исследуемый образец биологической ткани объемом не менее 0,1 см3 и не более 0,5 см3 (при объеме образца менее 0,1 см способ не работает из-за малой величины AV, а при объеме образца более 0,5 см3 удлин етс  врем  определени  свободной воды свыше А ч помещают в термостат (ультратермостат) с погрешностью регулировки температуры не более ±0,1 °С и термостатируют их в течение 1 ч дл  выравнивани  температур компонентов системы и устройства, лри этом температура устанавливаетс  равной температуре исследуемого образца биологической ткани (обычно 20-23°С). Образец биологической ткани укладывают на дно сосуда устройства и последнее герметично закрывают .

После выравнивани  температур производ т зар дку устройства этанолом до средней части шкалы отводного патрубка. Шакала патрубка должна иметь цену делени  не более 0,002 см3, а сам патрубок должен представл ть из себ  капилл р.

Через равные промежутки времени (10- 20 мин) регистрируют по шкале патрубка уровень фиксатора и отмечают его значение

на графике зависимости уровн  фиксатора от времени. Регистрацию уровн  фиксатора продолжают до тех пор. пока на графике не по витс  плато, т.е. пр ма , параллельна 

оси времени.

По графику определ ют величину AV, равную разности начального и конечного уровней фиксатора в устройстве.

По справочным таблицам определ ют

плотность воды/о при температуре системы ткань - этанол и по формуле I рассчитывают количество свободной воды в исследуемом образце.

Предложенный способ определени 

свободной воды в биологических ткан х основываетс  на следующих известных данных .

Вода в биологических ткан х подраздел етс  на следующие типы: а) первый гидратационный слой воды; б) эторой гидратационный слой, структура воды в котором несколько разупор дочена по сравнению с обычной водой: в) псевдожидка  вода, имеюща  структуру обычной воды. Типы воды б) и в) важны дл  транспорта солей в мембранах, дл  диффузии красителей в волокнах и дл  процессов жизнеде тельности клеток растительных и животных тканей (классификаци  Лука).

Под слоем а) понимают св занную воду, под сло ми б) и в) - свободную воду. Между св занной и свободной водой отсутствует резка  граница, поэтому различные методы измерений, основанные на регистрации

разных физических  влений, дают различные соотношени  в ткан х между свободной и св занной водой.

В процессе фиксации биологической ткани в этаноле происходит взаимна  диффузи  воды из ткани в этанол и этанола в ткань.

Принцип действи  этанола на биологическую ткань как фиксатора основан на отн тии воды и осаждении белков.

Химическое строение белков нарушаетс  этанолом минимально. Создаютс  новые стериохимические конфигурации белковых функциональных групп, так как происходит сжатие белковых молекул, потер вших сольватные оболочки.

Гистологические и гистохимические данные свидетельствуют о том, что после удалени  из ткани этанола большинство молекул белков восстанавливает свое строение (обратимые реакции осаждени  белков), хот  многие энзимы (дегидрогеназы) не восстанавливаютс ; при фиксации в этаноле происходит сильное сморщивание цитоплазмы клеток и менее выраженное сморщивание  дра клеток; отмечен парадоксальный факт: чем выше концентраци  этанола, тем менее выражено сморщивание биологической ткани, минимальное сморщивание наступает при фиксации в абсолютном спирте; при длительном выдерживании биологической ткани в этаноле в ней происход т необратимые изменени : измен етс  пластичность, что про вл етс  в ухудшении резки, резко ухудшаетс  способность ткани окрашиватьс .

Восстановление строени  белков после отн ти  этанола, неравномерное сморщивание компонентов клетки при фиксации в этаноле, необратимые химические и физи- ко-химические изменени  ткани при длительном нахождении в этаноле могут быть объ снены тем, что при фиксации в этаноле (в течение оптимального времени фиксации) из биологической ткани уходит в этанол только свободна  вода, а при передержке в этаноле постепенно за счет диффузии вымываетс  оставша с  св занна  вода, что приводит к необратимым изменени м в биохимических структурах тканей. Описанный парадоксальный факт объ сн етс  тем, что, во-первых, диффузи  этанола в ткань реально существует: во-вторых, что диффузи  зависит от концентрации этанола: чем она выше, тем больше этанола проникает в ткань.

Таким образом, по косвенным гистологическим и гистохимическим данным можно сделать вывод, что из биологической ткани при фиксации в этаноле в течение оптималь- ного времени фиксации, которое равно времени от начала фиксации до того момента, как на графике, отражающем динамику уменьшени  объема системы ткань - этанол , по вл етс  плато, выходит только свободна  вода.

Изменение обьема системы ткань - этанол в процессе фиксации объ сн етс  физико-химическим феноменом неаддитивности объемов воды и этанола, с одной стороны, и их смеси - с другой.

В процессе фиксации биологической ткани в этаноле при изотермических услови х происход т объемные изменени  в системе ткань - этанол, которые можно количественно описать уравнени ми 2-5 аддитивности объемов:

AV AV - AVM + AV

in

(5)

где Vi - объем свободной воды в ткани

V - объем св занной воды в ткани;

Va - обьем сухого вещества в ткани;

- обьем этанола в системе,

Vs - обьем этанола, перешедшего в ткань,

AV, AV1. AV11. AV1 - дополнени  до аддитивности объема системы,

{ } - объем смеси.

В уравнени х 2-5 не учитываютс  объемные изменени , происход щие в системе ткань. - этанол при растворении органических веществ ткани в этаноле, так как. во- первых, установлено, что наибольшее значение дополнение до аддитивности из известных бинарных эквимолекул рных органических смесей имеет система вода - этанол, а все остальные бинарные смеси имеют значительно меньшее абсолютное значение дополнени  до аддитивности; во- вторых, в этаноле раствор етс  незначительное количество органического вещества ткани.

При помощи устройства дл  фиксации биологической ткани регистрируетс  суммарное значение дополнений до аддитивности в системе ткань - этанол AV.

В уравнении (2) величина AV1 по вл етс  вследствие неаддитивности объемов воды и этанола и их смеси. В уравнени х (3) и (4) величины AV11 и AV1 ввод тс  по аналогии с экспериментальными данными по гидратации сухого белка (эластина). Так как при дегидратации ткани суммарный объем свободной воды, вышедшей из ткани, и оставшейс  ткани больше, чем объем ткани до дегидратации, то величина AV11 в уравнении (3) вз та со знаком минус. В уравнении (4) суммарный объем ткани в этаноле до смешивани  больше, чем объем ткани после ее пропитывани  этанолом, поэтому величина AV имеет знак плюс.

Дл  дополнений по аддитивности в уравнени х (2) - (5) справедливы следующие соотношени :

I AV1 I; AV1 I I AV I.

(6)

(7)

Vi + V/j - V5 - {Vi + V - V5) + AV1; (2) (Vi + V2 + Va} Vi + {V2 + УЗ} - AV11; (3)

{V2 + V3} + V5 V2 + V3 + V5 + (4)

Соотношение (6) следует из гистологических данных по фиксации ткани в этаноле: при любых концентраци х этанола имеет место сморщивание ткани, т.е. ткань в процессе фиксации в этаноле никогда не возвращаетс  к исходному объему. Соотношение (7) следует из уравнени  (5),

соотношени  (6) и экспериментальных данных по регистрации суммарного значени  дополнений до аддитивности в системе ткань - этанол при помощи устройства дл  фиксации биологической ткани. Суммарное значение дополнений до аддитивности имеет знак плюс.

В уравнении (5) величины AV11 и AV1 взаимно частично гас тс . При фиксации ткани в абсолютном спирте их взаимное гашение будет максимальным, так как чем выше концентраци  этанола, тем большее значение Судет иметь Vs в уравнении (4), тем большее значение будет иметь величина AV и тем меньшее значение будет иметь разноси- I AV11 I- I AV1 I, что будет давать меньшее сморщивание ткани. Это хорошо соглл . с I патологическим парадоксальным фл.-пп приведенным выше.

Из этого можно сделать следующее заключение: бсл1.ша.ч часть значени  суммарного дополнени  по аддитивности в системе ткань - этанол приходитс  на величину AV , обусловленную оыходом свободной воды из ткани а этанол. Регистриру  величину AV при помощи угтройства дл  фиксации био- логи осхсп ткани, фактически в соответствии с уравнением (5) определ ют несколько ; u.j LJCHV1 : .начеиле AV . Априорно допу- c-jc i т- p-пно..ч. AV11 I - I при i.i- Kf i i-m . i и i3 3R° этаноле настолько мала , ч; личм т ниже чувствительности шкалы narp/rj u : , -TP°° ir:iDa тогда уравнение (5) ирг мет Еи.д

AV AV1.

(8)

Соотношение (8) вл етсл основным дл  определени  количества свободной воды в образце биологической ткани при помощи устройства дл  фиксации биологической ткани.

Дл  расчета количества свободной воды в исследуемом образце по величине AV необходимо установить характер зависимости AV(Vi). С этой целью было поставлено шесть модельных опытов в устройствах дл  фиксации биологической ткани, имеющих разный объем сосуда.

Опыт 1. В изотермических услови х при 23°С устройство дл  фиксации биологической ткани зар жают 96° этанолом до начальной отметки на шкале патрубка. Через узел подачи фиксирующего раствора порци ми по 0,2 см3 ввод т в устройство 2,0 см3 дистиллированной воды. Одновременно с введением каждой порции по шкале патрубка регистрирует общий объем системы. Исходный объем этанола в системе - 51.1 см . Опыт Мг 2. То же, что и в опыте № 1. но исходный обьем этанола в системе 51,8 см3. Опыт . Исходный обьем этанола 51.7

см3.

Опыт Ns 4. Исходный объем этанола 51,8 см3.

Опыт N 5. Исходный объем этанола

110,4см3.

Опыт № 6. Исходный объем этанола 109,5см3.

Результаты модельных опытов Ns 1-6 привод тс  в таблице.

Анализ результатов, модельных опытов показывает, что зависимость общего объема системы VCMCT.(VI) имеет в интервале значений 0 Vi 2,0 см3 выраженный линейный характер и поэтому ее можно аппроксимировать функцией вида VCHCT.(VI) kVi, где k Vcnci.(Vi)/Vi. Дл  каждого модельного опыта находим значени  коэффициента k. Получаем ki - 0,83; k2 0,85; ka 0.85; k4 0,85; ks 0,90; k6 - 0,88. Из опытов

следует, что величина AV при V4 {Vi + Vj + Vs} в интервале значений 0 Vi 2,0 см практически не зависит от исходного объема этанола V/j. В выражение, аппроксимирующее зависимость VCHCT.(VI), подставл ем

вместо коэффициента k его среднее значение , полученное по данным модельных опытов N; 1-6 kcp. 0,86. Получаем следующее выражение:

VcncT.(Vi) 0,86Vi.

Известно, что при смешивании 52 объемов спирта (этанола) и 48 объемов воды получаетс  96,3 объемов разбавленного спирта. При этом величина AV 3,7 объемов. Зна  эту величину и учитыва  результаты модельных опытов № 1-6, можно определить вид зависимости AV(Vi):

45

AV(Vi) AVi;

AV(Vi) 3.7 объемов ПП771, Vi ЖО объемов u-umA (Vi) 0,0771 Vi;

Vi

AV ШГ77Т (9)

По справочным таблицам определ ем плотность воды р при температуре фикса- ции. Учитыва  соотношение/9 m/V из формулы (9), получаем окончательное выражение (1) - формулу расчета массы свободной воды в исследуемом образце биологической ткани.

Так как интервал температур оптимальной фиксации находитс  в пределах 20- 23°С. V4 Vi и чувствительность устройства дл  фиксации биологической ткани невысока , то изменением вида зависимости AV(Vi) в этом температурном интервале можно пренебречь. Формула (t) может быть применена без изменений при определении количества свободной воды в образце и при других температурах фиксации этого температурного интервала.

Пример. Плотный кусочек биологической ткани объемом 0,26 см при 22°С погру- жают в устройство дл  фиксации биологической ткани и зар жают его 96° этанолом до средней части шкалы отводного патрубка. Примерно через 3 ч объем системы ткань - этанол стабилизируетс  на графике зависимости уровн  фиксации в устройстве от времени по вл етс  плато. Величина AV - 0,015 см . Плотность воды при 22°С /т 0,9978 г/см3. По формуле (1) определ ют массу свободной воды в исследуемом образце:

т- 194мг.

Предложенный способ позвол ет определ ть свободную воду в плотном образце биологической ткани, предназначенном дл 

дальнейшего гистологического, гистохимического или морфометрического исследовани , отличаетс  простотой определени  свободной воды в образце биологической

ткани; в процессе определени  свободной воды в образце биологической ткани происходит фиксаци  последней.

Эти преимущества позвол ют использовать предложенный способ в практике

Claims (1)

1. гистологических, гистохимических и патоло- гоморфологических лабораторий. Формула изобретени  Способ определени  свободной воды в биологических ткан х, включающий погр ужение образца плотной ткани в жидкую среду с последующим расчетом количества свободной воды в нем, отличающийс   тем, что, с целью упрощени  способа, образец погружают в 96 -ный этанол и термостатируют в течение 1 ч, затем регистрируют изменение объема системы ткань-этанол () через каждые 10 мин до момента его стабилизации, измер ют плотность воды (р), весь процесс ведут в изотермических услови х , а расчет массы свободной воды (т) в исследуемом образце осуществл ют по Формуле

   m (AV -p) /0.0771.