Claims (24)
1. Способ получения эргостерола и его промежуточных продуктов, отличающийся тем, что а) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают несколько соответствующих генов пути метаболизма эргостерола, или б) сначала конструируют плазмиды, в каждую из которых встраивают один из генов пути метаболизма эргостерола, в) созданными таким путем плазмидами трансформируют микроорганизмы, причем микроорганизмы трансформируют одной плазмидой, указанной в подпункте а), или трансформируют одновременно или последовательно несколькими плазмидами, указанными в подпункте б), г) с использованием созданных таким путем микроорганизмов осуществляют ферментацию с получением эргостерола, д) после ферментации эргостерол и его промежуточные продукты экстрагируют из клеток и анализируют и в завершение е) полученный в результате эргостерол и его промежуточные продукты очищают и выделяют с помощью хроматографии на колонках.1. A method for producing ergosterol and its intermediates, characterized in that a) first, a plasmid is constructed in which several corresponding genes of the ergosterol metabolism pathway are inserted, or b) plasmids are first constructed, each of which embeds one of the genes of the ergosterol metabolism pathway, ) microorganisms created in this way by plasmids are transformed, and microorganisms are transformed with one plasmid specified in subparagraph a), or they are transformed simultaneously or sequentially with several plasmids, as indicated in subparagraph b), d) using microorganisms created in this way, fermentation is carried out to obtain ergosterol, e) after fermentation, ergosterol and its intermediates are extracted from the cells and analyzed and finally e) the resulting ergosterol and its intermediates are purified and isolated using column chromatography.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что а-I) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают следующие гены: I) ген HMG-Co-A-редуктазы (t-HMG), II) ген скваленсинтетазы (ERG9), (III) ген ацил-СоА: стеролацилтрансферазы (SAT1) и (IV) ген скваленэпоксидазы (ERG1), или а-II) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают следующие гены: I) ген HMG-CoA-редуктазы (t-HMG) и II) ген скваленсинтетазы (ERG9), или а-III) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают следующие гены: I) ген HMG-Co-A-редуктазы (t-HMG) и (III) ген ацил-СоА: стеролацилтрансферазы (SAT1), или a-IV) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают следующие гены: I) ген HMG-Co-A-редуктазы (t-HMG) и (IV) ген скваленэпоксидазы (ERG1), или a-V) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают следующие гены: II) ген скваленсинтетазы (ERG9) и (III) ген ацил-СоА: стеролацилтрансферазы (SAT1), или a-VI) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают следующие гены: II) ген скваленсинтетазы (ERG9) и (IV) ген скваленэпоксидазы (ERG1), или a-VII) сначала конструируют плазмиду, в которую встраивают следующие гены: (III) ген ацил-СоА: стеролацилтрансферазы (SAT1) и (IV) ген скваленэпоксидазы (ERG1), или б) сначала конструируют плазмиды, в каждую из которых встраивают один из генов, перечисленных в подпункте а-I), и в) созданными таким путем плазмидами трансформируют микроорганизмы, причем микроорганизмы трансформируют одной плазмидой, указанной в подпунктах с а-I) по a-VII), или трансформируют одновременно или последовательно несколькими плазмидами, указанными в подпункте б), г) с использованием созданных таким путем микроорганизмов осуществляют ферментацию с получением эргостерола, д) после ферментации эргостерол и его промежуточные продукты экстрагируют из клеток и анализируют и в завершение е) полученный в результате эргостерол и его промежуточные продукты очищают и выделяют с помощью хроматографии на колонках. 2. The method according to p. 1, characterized in that a-I) first construct a plasmid into which the following genes are inserted: I) the HMG-Co-A reductase gene (t-HMG), II) the squalene synthetase gene (ERG9), (III) acyl-CoA gene: sterolacyl transferase (SAT1) and (IV) squalene epoxidase gene (ERG1), or a-II) first construct a plasmid into which the following genes are inserted: I) HMG-CoA reductase gene (t-HMG) and II) the squalene synthetase gene (ERG9), or a-III), first construct a plasmid into which the following genes are inserted: I) the HMG-Co-A reductase gene (t-HMG) and (III) the acyl-CoA gene: sterolacyl transferase ( SAT1), or a-IV) is first constructed a plasmid into which the following genes are inserted: I) an HMG-Co-A reductase gene (t-HMG) and (IV) a squalene epoxidase gene (ERG1), or aV), a plasmid is inserted into which the following genes are inserted: II) a squalene synthetase gene (ERG9) and (III) acyl-CoA gene: sterolacyl transferase (SAT1), or a-VI) first construct a plasmid into which the following genes are inserted: II) squalene synthetase gene (ERG9) and (IV) squalene epoxidase gene (ERG1), or a-VII) first construct a plasmid into which the following genes are inserted: (III) acyl-CoA gene: sterolacyl transferase (SAT1) and (IV) squalene epoxidase gene (ERG1), or b) first, plasmids are constructed, in each of which one of the genes listed in subparagraph a-I) is inserted, and c) microorganisms are transformed with plasmids created in this way, and microorganisms are transformed with one plasmid specified in subparagraphs a-I) to a-VII) or are transformed simultaneously or sequentially with several plasmids specified in subparagraph b), d) using microorganisms created in this way, fermentation is carried out to obtain ergosterol, e) after fermentation, ergosterol and its intermediates s is extracted from the cells and analyzed, and finally f) the resulting ergosterol and intermediate products are purified and isolated by column chromatography.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в плазмиду, указанную в подпунктах a-II), a-III) и a-V), дополнительно встраивают ген скваленэпоксидазы (ERG1), а в плазмиду, указанную в подпункте a-II), дополнительно встраивают ген ацил-СоА: стеролацилтрансферазы (SAT1). 3. The method according to p. 2, characterized in that in the plasmid specified in subparagraphs a-II), a-III) and aV), the squalene epoxidase gene (ERG1) is additionally inserted, and in the plasmid specified in subparagraph a-II) additionally integrate the acyl-CoA gene: sterolacyl transferase (SAT1).
4. Способ получения эргостерола и его промежуточных продуктов, отличающийся тем, что указанные в п. 1, подпункт а), в п. 2, подпункты с а-I) по а-VII) и в п. 3, подпункты a-II), a-III) и a-V) гены, сначала встраивают с помощью плазмид независимо друг от друга в микроорганизмы одного и того же вида и с их помощью проводят общую ферментацию с получением эргостерола, полученный таким образом эргостерол экстрагируют из клеток, анализируют и очищают и выделяют с помощью хроматографии на колонках. 4. A method of producing ergosterol and its intermediates, characterized in that those specified in paragraph 1, subparagraph a), in paragraph 2, subparagraphs a-I) to a-VII) and in paragraph 3, subparagraphs a-II ), a-III) and aV) genes are first inserted using plasmids independently of one another into microorganisms of the same species and they are used to carry out general fermentation to obtain ergosterol, thus obtained ergosterol is extracted from cells, analyzed and purified and isolated by column chromatography.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что промежуточными продуктами являются сквален, фарнезол, гераниол, ланостерол, зимостерол, 4,4-диметилзимостерол, 4-метилзимостерол, эргост-7-енол и эргоста-5,7-диенол. 5. The method according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that the intermediate products are squalene, farnesol, geraniol, lanosterol, zimosterol, 4,4-dimethylzimosterol, 4-methylzimosterol, ergost-7-enol and ergosta-5,7-dienol.
6. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что промежуточным продуктом является стерол с 5,7-диеновой структурой. 6. The method according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that the intermediate product is sterol with a 5,7-diene structure.
7. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что плазмидами являются плазмиды YEpH2 (фиг. 1), YDpUHK3 (фиг. 2) и pADL-SAT1 (фиг. 3). 7. The method according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that the plasmids are plasmids YEpH2 (Fig. 1), YDpUHK3 (Fig. 2) and pADL-SAT1 (Fig. 3).
8. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что микроорганизмами являются дрожжи. 8. The method according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that the microorganisms are yeast.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что микроорганизм представляет собой вид S. cerevisiae. 9. The method according to p. 8, characterized in that the microorganism is a species of S. cerevisiae.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что микроорганизм представляет собой штамм S. cerevisiae AH22. 10. The method according to p. 9, characterized in that the microorganism is a strain of S. cerevisiae AH22.
11. Штамм дрожжей S. cerevisiae AH22, содержащий один или несколько генов, перечисленных в способе в подпункте а-I). 11. The yeast strain S. cerevisiae AH22 containing one or more genes listed in the method in subparagraph a-I).
12. Плазмида pADL-SAT1 (фиг. 3), содержащая ген SAT1 и ген LEU2 из YEpl3. 12. Plasmid pADL-SAT1 (Fig. 3) containing the SAT1 gene and LEU2 gene from YEpl3.
13. Применение плазмиды по п. 12 для получения эргостерола. 13. The use of the plasmid according to claim 12 for the production of ergosterol.
14. Применение плазмиды по п. 12 для получения промежуточных продуктов эргостерола, а именно, сквалена, фарнезола, гераниола, ланостерола, зимостерола, 4,4-диметилзимостерола, 4-метилзимостерола, эргост-7-енола и эргоста-5,7-диенола. 14. The use of the plasmid according to claim 12 for the preparation of intermediate products of ergosterol, namely squalene, farnesol, geraniol, lanosterol, zimosterol, 4,4-dimethylzimosterol, 4-methylzimosterol, ergost-7-enol and ergost-5,7-dienol .
15. Применение плазмиды по п. 12 для получения стеролов с 5,7-диеновой структурой. 15. The use of the plasmid according to p. 12 to obtain sterols with 5,7-diene structure.
16. Кассета экспрессии, включающая средний промотор ADH, ген t-HMG, терминатор TRP и ген SAT1 со средним промотором ADH и терминатором TRP. 16. The expression cassette, including the average ADH promoter, t-HMG gene, TRP terminator and SAT1 gene with the average ADH promoter and TRP terminator.
17. Кассеты экспрессии, включающие средний промотор ADH, ген t-HMG, терминатор TRP, ген SAT1 со средним промотором ADH и терминатором TRP и ген ERG9 со средним промотором ADH и терминатором TRP. 17. Expression cassettes, including the middle ADH promoter, t-HMG gene, TRP terminator, SAT1 gene with the middle ADH promoter and TRP terminator, and ERG9 gene with the middle ADH promoter and TRP terminator.
18. Комбинация кассет экспрессии, состоящая из а) первой кассеты экспрессии, в которой локализованы промотор ADH, ген t-HMG и терминатор TRP, б) второй кассеты экспрессии, в которой локализованы промотор ADH, ген SAT1 и терминатор TRP, и в) третьей кассеты экспрессии, в которой локализованы промотор ADH, ген ERG9 и терминатор TRP. 18. The combination of expression cassettes, consisting of a) the first expression cassette in which the ADH promoter, the t-HMG gene and the TRP terminator are located, b) the second expression cassette in which the ADH promoter, the SAT1 gene, and the TRP terminator are located, and c) the third expression cassettes in which the ADH promoter, ERG9 gene, and TRP terminator are localized.
19. Применение кассет экспрессии по любому из пп. 16-18 для трансформации микроорганизмов, используемых для ферментативного получения эргостерола. 19. The use of expression cassettes according to any one of paragraphs. 16-18 for the transformation of microorganisms used for the enzymatic production of ergosterol.
20. Применение по п. 19, отличающееся тем, что микроорганизм представляет собой дрожжи. 20. The use of claim 19, wherein the microorganism is a yeast.
21. Микроорганизмы, содержащие кассеты экспрессии по любому из пп. 16-18. 21. Microorganisms containing expression cassettes according to any one of paragraphs. 16-18.
22. Микроорганизм по п. 21, отличающийся тем, что он представляет собой дрожжи. 22. The microorganism according to p. 21, characterized in that it is a yeast.
23. Применение микроорганизма по пп. 21 и 22 для ферментативного получения эргостерола. 23. The use of a microorganism according to paragraphs. 21 and 22 for the enzymatic production of ergosterol.
24. Применение микроорганизма по пп. 21 и 22 для ферментативного получения промежуточных продуктов эргостерола. 24. The use of a microorganism according to paragraphs. 21 and 22 for the enzymatic preparation of ergosterol intermediates.