RU1829938C

RU1829938C - Method of purification of gamma-globulin used for intravenous administration

Info

Publication number: RU1829938C
Application number: SU874028870A
Authority: RU
Inventors: Макюла Жак Льото Мари-Франс
Original assignee: Энститю Мерье
Priority date: 1986-05-30
Filing date: 1987-01-29
Publication date: 1993-07-23

Abstract

Изобретение относитс к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности . Осветл ют обогащенную гамма-глобулинами фракцию II технической 6,9 по Кону или технической фракции 6,9 по Кону, модифицированной по Тейлору, инкубируют ее с человеческим фибринолизином, или пепсином, или папаином при определенных услови х и затем целевой продукт выдел ют осаждением ПЭГ, дальнейшем осаждением при рН 8. Концентрируют продукт ультрафильтрацией, удал ют ПЭГ из концентрата повышают содержание протеина до 50 г/л и лиофильно высушивают. Положительный эффект заключаетс в уменьшении в продукте веществ, обладающих антикомплементарной и гипотензивной активностью, в уменьшении содержани прекалликреинового активатора и снижении содержани агрегатов и ди- меров. 4 з.п.ф-лы.The invention relates to medicine, namely to the pharmaceutical industry. The Cohn fraction of technical II, enriched with gamma-globulins, of technical Cohn 6.9 or Tayor-modified Cohn technical 6.9, is incubated with human fibrinolysin, or pepsin, or papain under certain conditions, and then the target product is isolated by PEG precipitation , further precipitation at pH 8. The product is concentrated by ultrafiltration, the PEG removed from the concentrate, the protein content is increased to 50 g / l and freeze-dried. The positive effect consists in a decrease in the product of substances having anti-complementary and antihypertensive activity, in a decrease in the content of precallicrein activator and in a decrease in the content of aggregates and dimers. 4 C.p.

Description

Изобретение относитс к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности .The invention relates to medicine, namely to the pharmaceutical industry.

Цель изобретени - повышение качества препарата, создание препаратов гамма-глобулинов, вводимых внутривенно , одновременно не имеющих агрегатов и димеров, без антикомплементарного свойства, калликреина и активатора пре- калликреина и с профилем подкласса, сравнимым с профилем нормальной Serum Humain (сыворотка человека), а также создание способа, применимого к препаратам гамма-глобулинов, полученных фракционированием небольшими количествами ПЭГ или аналогичных веществ, который улучшает эти препараты, в частности, уменьша антикомплементарную способность, содержание калликреина и активатора прекал- ликрена, а также остаточной ПЭГ.The purpose of the invention is to improve the quality of the drug, the creation of gamma globulin preparations administered intravenously, simultaneously without aggregates and dimers, without anticomplementary properties, kallikrein and prekallikrein activator and with a subclass profile comparable to that of normal Serum Humain (human serum), and also the creation of a method applicable to gamma globulin preparations obtained by fractionation with small amounts of PEG or similar substances, which improves these drugs, in particular, reducing anticomplement polar capacity content and kallikrein activator prekal- Lycra and residual PEG.

Предлагаемый способ включает в себ этап фракционировани полиэтиленглико- лем или подобными веществами и этап умеренной обработки энзима, при котором величина рН зависит от типа используемого энзима, добавл емого предпочтительно в ничтожном количестве, при этом обработка производитс во избежание значительного протеолиза.The proposed method includes a fractionation step with polyethylene glycol or the like, and a moderate processing step for the enzyme, wherein the pH depends on the type of enzyme used, preferably added in negligible amounts, the treatment being carried out to avoid significant proteolysis.

Используемый энзим выбирают из группы , образованной пепсинами, фибриноли- зинами (плазминами) и папаинами.The enzyme used is selected from the group formed by pepsins, fibrinolysins (plasmins) and papain.

Исходным материалом служит фракци сывороточного происхождени с большим содержанием гамма-глобулинов, например фракци II техническа Кона 6,9, известна The starting material is a fraction of serum origin with a high content of gamma globulins, for example, fraction II of technical Con 6.9, known

0000

ю ю о со соyoo

соwith

тем, что она дает продукты, свободные от гепатита, или фракци плацентарного происхождени , например фракци техническа 6,9 Кона, модифицированна по Тейлору. Эта фракци имеет чистоту 1gG, равную 90% или большую. Она может содержать переменное количество альбумина (до 10%).in that it produces hepatitis free products or a fraction of placental origin, for example, the Taylor-modified technical 6.9 Kona fraction. This fraction has a purity of 1gG equal to 90% or greater. It may contain a variable amount of albumin (up to 10%).

Пример 1.Example 1

1.Осаждение с использованием ПЭГ.1. Precipitation using PEG.

Исходный материал готов т путем растворени осадка II Technigue 6-9 de Conn и осветлени этого раствора.The starting material is prepared by dissolving precipitate II Technigue 6-9 de Conn and clarifying this solution.

Концентрацию белков устанавливают 10 г/л, а альбумина - 0,5 г/л.The protein concentration is set to 10 g / l, and albumin - 0.5 g / l.

Осаж/ )ние осуществл ют путем добавлени полиэтиленгликол (ПЭГ) с мол.м. 4000 с целью получени концентрации ПЭГ в 5% (мол,/об). Величину рН регулируют с величины до 5,8 с помощью сол ной кислоты 0,1 н,а температуру поддерживают между 0 до 4°С. Ионна сила очень мала, пор дка 0,02,Precipitation was carried out by adding polyethylene glycol (PEG) with a mol. 4000 in order to obtain a PEG concentration of 5% (mol / vol). The pH is adjusted to 5.8 with 0.1 N hydrochloric acid, and the temperature is maintained between 0 and 4 ° C. The ion power is very small, on the order of 0.02,

Получают осадок, содержащий агрегаты , которые отдел ют затем от раствора простым отстаиванием, фильтрованием или центрифугированием. Осадок удал ют.A precipitate is obtained containing aggregates, which are then separated from the solution by simple settling, filtration or centrifugation. The precipitate was removed.

Использу полученное таким образом всплывшее вещество, осуществл ют новое осаждение без дополнительного добавлени ПЭГ, при той же самой температуре, но с увеличением ионной силы до 0,05 путем добавлени NaCI и доведением рН до 8.Using the supernatant thus obtained, a new precipitation is carried out without additional addition of PEG, at the same temperature, but with an increase in ionic strength to 0.05 by adding NaCI and adjusting the pH to 8.

В этом случае гамма-глобулины осаждают и образованный таким образом осадок отдел ют от жидкой фазы отстаиванием или центрифугированием.In this case, gamma globulins are precipitated and the precipitate thus formed is separated from the liquid phase by settling or centrifugation.

Этот осадок включает гамма-глобулины, не содержащие агрегатов с высокой молекул рной массой, однако способные еще содержать пропорцию около 10% димеризованных белков. Электрофоретиче- ска чистота этого продукта близка к 90%. Антикомплементарна активность очень мала. Процентное содержание калликреина и активатора предкалликреина мало, но они могут присутствовать в переменных количествах , в зависимости от содержани используемого исходного вещества.This precipitate includes gamma globulins that do not contain aggregates with a high molecular weight, but are still capable of containing a proportion of about 10% of dimerized proteins. The electrophoretic purity of this product is close to 90%. Anti-complementary activity is very small. The percentages of kallikrein and the predcallikrein activator are small, but they may be present in varying amounts, depending on the content of the starting material used.

2.Ферментна обработка.2. Enzymatic processing.

Осадок гамма-глобулинов раствор ют в апирогенной воде так, чтобы получить концентрацию 20 г/л по белкам. Добавл ют 50 г/л сахарозы и 0,25 М.Ед. пепсина на миллиграмм белка. При доведении температуры до 37°С и при ее поддержании, с установленным рН 4,1, инкубируют в течение 15ч, После обработки, рН довод т до нейтрального.The precipitate of gamma globulins is dissolved in pyrogen-free water so as to obtain a concentration of 20 g / l protein. 50 g / L sucrose and 0.25 M are added. pepsin per milligram of protein. When the temperature was brought to 37 ° C and while maintaining it, with a adjusted pH of 4.1, they were incubated for 15 hours. After processing, the pH was adjusted to neutral.

3.Последующа обработка.3. Subsequent processing.

Осуществл ют ультрафильтрацию так, чтобы довести концентрацию раствора гамма-глобулина до 70 г/л.Ultrafiltration was carried out so as to bring the concentration of gamma globulin solution to 70 g / l.

За этим этапом ультрафильтрации сле- дует диафильтраци , предназначенна дл удалени ПЭГ. Эту же диафильтрацию провод т с помощью раствора NaCI 4,5 г/л. Объем используемого диафильтрационного раствора зависит от содержани ПЭГ, под- лежащего удалению. Обычно объем, соответствующей 8-кратному объему раствора IgG, позвол ет удалить свыше 90% ПЭГ, содержащегос вначале в растворе, и перейти, таким образом, от содержани в 1,5 г/л до 5 0,10 г/л.This ultrafiltration step is followed by diafiltration designed to remove PEG. The same diafiltration was carried out with a 4.5 g / L NaCl solution. The volume of diafiltration solution used depends on the content of PEG to be removed. Typically, a volume corresponding to an 8-fold volume of an IgG solution allows the removal of over 90% of the PEG initially contained in the solution and thus a transition from a content of 1.5 g / l to 5.10 g / l.

Затем довод т полученный раствор до содержани 50 г/л белка, 50 г/л сахарозы, 4,5 г/л хлористого натри , при рН 7,0.Then, the resulting solution was adjusted to a content of 50 g / l of protein, 50 g / l of sucrose, 4.5 g / l of sodium chloride, at pH 7.0.

Распредел ют это вещество во флаконы 0 по 0,5-2,5 или 5 г гамма-глобулинов, затем осуществл ют лиофилизацию.This substance is dispensed into vials 0 of 0.5-2.5 or 5 g of gamma globulins, then lyophilization is carried out.

Пример 2.Example 2

1.Осаждение с помощью ПЭГ привод т аналогично примеру 1.1. PEG precipitation is carried out analogously to Example 1.

5 2. Ферментную обработку, осуществл - ютаналогично примеру 1, с использованием пепсина в растворе в несолибизированном виде на традиционных носител х. Продолжительность инкубировани 24 ч.5 2. Enzyme treatment is carried out analogously to Example 1, using pepsin in solution in a non-solubilized form on traditional carriers. Duration of incubation 24 hours

0 ПримерЗ. Исходный материал готов т растворением плазматического осадка II Technigue 6-9 Cohn и осветлением этого раствора. Содержание белков довод т до 120 г/л, альбумина - до б г/л.0 Example Z. The starting material was prepared by dissolving the II Technigue 6-9 Cohn plasma precipitate and clarifying this solution. The protein content is adjusted to 120 g / l, albumin to b g / l.

5 1. Ферментна обработка.5 1. Enzyme treatment.

Провод т слабую обработку фибрино- лизина человека. Концентраци фибриноли- зина человека 4 М.Ед./г белка, рН 7,4.A weak treatment of human fibrinolysin is carried out. The concentration of human fibrinolysin is 4 M.U./g protein, pH 7.4.

Продолжительность инкубировани 4Duration of incubation 4

0 дн при температуре 4°С дл достижени отсутстви гипотензивных факторов, подтвержденных испытанием на давление у крыс.0 days at 4 ° C to achieve the absence of antihypertensive factors confirmed by the rat pressure test.

2.Осаждение с помощью ПЭГ.2. Precipitation using PEG.

5 Провод т этап осаждени белкового раствора, разбавленного до 10 г/л белков путем добавлени ПЭГ с мол.м. 4000, с тем, чтобы получить концентрацию ПЭГ 5%. Величину рН регулируют до 5,8 с помощью HCI5 The step of precipitating a protein solution diluted to 10 g / l of proteins is carried out by adding PEG with a mol.m. 4000 in order to obtain a PEG concentration of 5%. The pH is adjusted to 5.8 using HCI

0 0,1 н. и поддерживают температуру между О и 4°С. Ионна сила очень мала, пор дка 0,02.0 0.1 n and maintain the temperature between 0 and 4 ° C. The ionic strength is very small, on the order of 0.02.

В результате получают осадок, содержащий агрегаты, которые затем отдел ют отThe result is a precipitate containing aggregates, which are then separated from

5 раствора простым отстаиванием, фильтрованием или центрифугированием. Осадок удал ют,5 solution by simple sedimentation, filtration or centrifugation. The precipitate is removed

Использу полученное всплывшее вещество , провод т новое осаждение, без нового добавлени ПЭГ, при той же самойUsing the resulting supernatant, a new precipitation is carried out, without a new addition of PEG, at the same

температуре, но с увеличением ионной силы до 0,05 путем добавлени NaCI от 0,05 до 0,2% и доведени рН от 7 до 8,5, предпочтительно до 8,0.temperature, but with an increase in ionic strength to 0.05 by adding NaCl from 0.05 to 0.2% and adjusting the pH from 7 to 8.5, preferably to 8.0.

В этом случае гамма-глобулины осаждают и отдел ют от жидкой фазы полученный таким образом осадок путем отстаивани или центрифугировани .In this case, gamma globulins are precipitated and the precipitate thus obtained is separated from the liquid phase by settling or centrifugation.

3. Последующа обработка.3. Subsequent processing.

Провод т ультрафильтрацию с тем, чтобы довести концентрацию раствора гамма- глобулинов до 70 г/л.Ultrafiltration is carried out in order to bring the concentration of the gamma globulin solution to 70 g / l.

За этим этапом ультрафильтрации следует диафильтраци , предназначенна дл удалени ПЭГ. Эта диафильтраци проводитс с помощью раствора NaCI 4,5 г/л. Объем примен емого раствора дл диа- фильтрации зависит от подлежащего удале- нию содержани ПЭГ. Обычно объем, соответствующий 8-кратному объему раствора , позвол ет удалить свыше 90% ПЭГ, содержащегос первоначально в растворе, и довести, таким образом, содержание до 1,5 г/л до 0,10 г/л.This ultrafiltration step is followed by diafiltration designed to remove PEG. This diafiltration is carried out with a 4.5 g / L NaCl solution. The volume of solution used for diafiltration depends on the PEG content to be removed. Typically, a volume corresponding to an 8-fold volume of the solution allows the removal of over 90% of the PEG initially contained in the solution, and thus brings the content to 1.5 g / L to 0.10 g / L.

Затем осуществл ют регулирование полученного раствора до содержани 50 г/л, белков, 50 г/л сахарозы, 4,5 г/л хлористого натри при рН 7,0.The resulting solution is then adjusted to a content of 50 g / l, proteins, 50 g / l sucrose, 4.5 g / l sodium chloride at pH 7.0.

После этого распредел ют вещество по флаконам по 0,5-2,5 или 5 г гамма-глобулинов , затем осуществл ют лиофилизацию.After that, the substance is distributed into vials of 0.5-2.5 or 5 g of gamma globulins, then lyophilization is carried out.

Пример 4. Исходный материал готов т растворением плазматического осадка II Technigue 6-9 de Cohn и осветлением этого раствора. Чистота по глобулинам близка к 100%. Содержание белков довод т до 120 г/л.Example 4. The starting material was prepared by dissolving a plasma precipitate of II Technigue 6-9 de Cohn and clarifying this solution. Globulin purity is close to 100%. The protein content is adjusted to 120 g / l.

1,Ферментную обработку провод т аналогично примеру 3, кроме концентрации фибринолизина человека в 2 М.Ед./г.1, The enzymatic treatment is carried out analogously to example 3, except for the concentration of human fibrinolysin in 2 M.U./g.

Врем инкубировани составл ет 10 дней при 4°С.The incubation time is 10 days at 4 ° C.

2.Осаждение с помощью ПЭГ провод т аналогично примеру 3.2. PEG precipitation was carried out analogously to Example 3.

Пример 5. Исходный материал готов т растворением плазматического осадка I Technigue 6-9 de Cohn и осветлением этого раствора. Содержание белка затем довод т до 120 г/л, альбумина - до 6 г/л,Example 5. The starting material was prepared by dissolving a plasma precipitate of I Technigue 6-9 de Cohn and clarifying this solution. The protein content is then adjusted to 120 g / l, albumin to 6 g / l,

1.Ферментную обработку провод т аналогично примеру 4.1. The enzyme treatment is carried out analogously to example 4.

2.Осаждение с помощью ПЭГ, осуществл ют аналогично примеру 3, но этап осаждени с помощью ПЭГ проводитс при содержании 40 г/л белков.2. PEG precipitation is carried out analogously to Example 3, but the PEG precipitation step is carried out at a content of 40 g / l of proteins.

Пример 6. Исходное сырье представл ет собой фракцию II Technigue 69 de Cohn с чистотой по гамма-глобулинам 95%. Его довод т до 5% по альбумину.Example 6. The feed was fraction II of Technigue 69 de Cohn with a gamma globulin purity of 95%. It is adjusted to 5% for albumin.

Этот раствор довод т до содержани 20 г/л по белкам.This solution was adjusted to a protein content of 20 g / L.

1. Ферментна обработка. Папаин добавл ют в пропорции 6 М.Ед./г белка.1. Enzymatic processing. Papain was added in a proportion of 6 M.U./g protein.

Величину рН регулируют на 7,0. Врем инкубировани менее 24 ч (18 ч) при 37°С. Аналогично примеру 3. Пример 7. Идентичен примеру 6, 0 кроме пропорции папаина (12 М.Ед. на г белка).The pH is adjusted to 7.0. Incubation time less than 24 hours (18 hours) at 37 ° C. Analogously to example 3. Example 7. Identical to example 6, 0 except the proportion of papain (12 M.U. per g protein).

Длительность инкубировани 5 ч при 37°С.Duration of incubation for 5 hours at 37 ° C.

П р и м е р 6. Исходное сырье представ- 5 л ет собой техническую фракцию II 6-9 по Кону с чистотой по гамма-глобулинам 95%. Ее довод т до 5% по альбумину.EXAMPLE 6. The feedstock 5 is Cohn technical fraction II 6–9 with 95% gamma globulin purity. It was adjusted to 5% for albumin.

Этот раствор довод т до содержани 20 г/л по белкам. 0 1. Умеренна обработка энзимами.This solution was adjusted to a protein content of 20 g / L. 0 1. Moderate processing by enzymes.

Папаин добавл ют в пропорции 5 М.Ед./г белка.Papain was added in a proportion of 5 M.U./g protein.

Величину рН регулируют на 7,0. Врем инкубировани -менее 24 ч(18ч) при 37°С 5 2. Осаждение с помощью ПЭГ.The pH is adjusted to 7.0. Incubation time is less than 24 hours (18 hours) at 37 ° C 5 2. PEG precipitation.

Осуществл ют этап осаждени протеинового раствора, разбавленного до концентрации 10 г/л протеинов, путем добавлени полиэтиленгликол (ПЭГ) с мол;м, 4000 до 0 получени 5%-ной концентрации ПЭГ. Ве- личину рН довод т до, 5,8 с помощью 1 н. сол ной кислоты и поддерживают температуру в интервале 0-4°С. Ионна сила очень низка , пор дка 0,02.The step of precipitating a protein solution diluted to a concentration of 10 g / l of proteins is carried out by adding polyethylene glycol (PEG) with a mol; m, 4000 to 0 to obtain a 5% concentration of PEG. The pH was adjusted to 5.8 with 1N. hydrochloric acid and maintain a temperature in the range of 0-4 ° C. The ionic strength is very low, on the order of 0.02.

5 Таким образом получают осадок, который содержит агрегаты, отдел емые от раствора простым отстаиванием, фильтрацией или центрифугированием. Осадок удал ют. Полученную недостаточную жидкость 0 затем снова подвергают осаждению без добавлени ПЭГ при той же температуре, но увеличивают ионную силу до 0,05 путем добавлени 0,05%-0,2% NaCI и довод т величину рН до 7-8,5, предпочтительно 8,0. 5 Гамма-глобулины выпадают в осадок; образовавшийс таким образом осадок отдел ют от жидкой фазы путем отстаивани или центрифугировани .5 A precipitate is thus obtained which contains aggregates which are separated from the solution by simple settling, filtration or centrifugation. The precipitate was removed. The resulting insufficient liquid 0 is then again precipitated without adding PEG at the same temperature, but the ionic strength is increased to 0.05 by adding 0.05% -0.2% NaCI and the pH is adjusted to 7-8.5, preferably 8 , 0. 5 Gamma globulins precipitate; The precipitate thus formed is separated from the liquid phase by settling or centrifugation.

3. Последующа обработка. 0Производ т ультрафильтрацию, довод т концентрацию раствора гамма-глобулинов до 70 г/л.3. Subsequent processing. Ultrafiltration is carried out, the concentration of the gamma globulin solution is adjusted to 70 g / l.

После ультрафильтрации производ т диафильтрацию, предназначенную дл уда- 5 лени ПЭГ. Диафильтрацию осуществл ют с помощью раствора 4,5 г/л NaCI. Объем примен емого раствора дл диафильтрации зависит от количества удал емого ПЭГ. Как правило, объем, равный 8-кратному объему раствора IgG, позвол ет удалить более 90%After ultrafiltration, diafiltration is carried out to remove PEG 5. Diafiltration was carried out using a solution of 4.5 g / L NaCl. The volume of diafiltration solution used depends on the amount of PEG removed. Typically, a volume of 8 times the volume of an IgG solution allows more than 90% to be removed.

ПЭГ, первоначально содержащегос в растворе , и довести, таким образом, его содержание до 1,5-0,10 г/л.PEG, initially contained in the solution, and thus bring its content to 1.5-0.10 g / l.

Затем полученный раствор довод т до содержани 50 г/л протеина, 50 г/л сахарозы , 4,5 г/л хлорида натри , до величины рН 7,0.Then, the resulting solution was adjusted to a content of 50 g / l of protein, 50 g / l of sucrose, 4.5 g / l of sodium chloride, to a pH of 7.0.

Затем вещество распредел ют во флаконы 0,5-2,5 или 5 г гамма-глобулина и производ т после этого лиофилизацию.The substance is then dispensed into vials of 0.5-2.5 or 5 g of gamma globulin and then lyophilized.

Анализ гамма-глобулинов, полученных согласно изобретению, вы вл ет следующие преимущества: уменьшение антикомплементарной способности при различных методиках определени ; уравновешивание подклассов; отсутствие гипотензивных факторов , подтвержденное испытанием давлени на собаке и на крысе; уменьшение количества димеризованных белков более чем на 50% по отношению к первоначальному содержанию и получение очень высокого содержани мономеров (близкое к 90%). При этом содержание фрагментов менее 7S нулевое или очень незначительное; содержание калликреина и активатора предкал ликреина нулевое (ниже предела чувствительности испытани ); остаточное содержание ПЭГ уменьшено более чем в 10 раз по сравнению с первоначальным.The analysis of gamma globulins obtained according to the invention reveals the following advantages: a decrease in anti-complementary ability with various determination methods; balancing subclasses; the absence of antihypertensive factors confirmed by pressure testing on a dog and rat; reducing the amount of dimerized proteins by more than 50% with respect to the initial content and obtaining a very high monomer content (close to 90%). Moreover, the content of fragments less than 7S is zero or very insignificant; the content of kallikrein and activator predicts lycrein is zero (below the test sensitivity limit); the residual PEG content is reduced by more than 10 times compared to the original.

Claims

The claims

1, A method for purifying gamma globulin for intravenous administration by clarification of a fraction enriched with gamma globulins, in particular, Cohn technical fraction II or Cohn technical fraction 6.9 modified by Taylor, its incubation

10

isolation with the enzyme, isolation of the lyophilization of the target product, characterized in that, in order to improve the quality, human fibrinolysin is used as an enzyme during incubation, incubation is carried out at a neutral pH for 2-10 days, or pepsin at pH 4 and the incubation time for 10-24 h, or papain at neutral pH for 18 h, and the selection is carried out by fractionation by adding PEG at pH 5.8, removing the precipitate formed, and precipitating the target product at pH 8, then the target product is concentrated by After 15 ultrafiltration, they are removed from the PEG concentrate and the protein content in the resulting solution is increased to 50 g / L.

2. The method according to claim 1, with the exception that, during incubation with pepsin, isolation is first performed and then incubation with the enzyme.

3. The method according to claim 1, characterized in that the separation by fractionation of PET is carried out to a concentration of PEG 5% at a temperature of 2-4 ° C and an ionic strength of 0.02, and the precipitation of the target product with an ionic strength of 0.05, with a protein content from 1 to 4%.

4. The method according to claim 1, characterized in that the treatment with insoluble pepsin is carried out in an amount of 0.002 g / l per solution of 20 g / l gamma globulin in the presence of sucrose.

5. The method according to claim 1, characterized in that the treatment with human fibrinolysin is carried out in an amount of 0.5-4.0 kE / g of protein.

twenty

25

thirty