RU1828095C - 5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами - Google Patents
5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами Download PDFInfo
- Publication number
- RU1828095C RU1828095C SU4816587A RU1828095C RU 1828095 C RU1828095 C RU 1828095C SU 4816587 A SU4816587 A SU 4816587A RU 1828095 C RU1828095 C RU 1828095C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- mmol
- vacuo
- pyridoxylic
- ether
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Назначение: в иммунологии как соединени , обладающие хемотаксическими свойствами. Сущность изобретени : 5 -пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов общей формулы 1 Form-Met-Leu-Phe-A-OPyr, где la A - св зь, Руг, Руг -СН -С-С(СН ОН)С(ОН) ; 16 А 2 II2i СН - N С(СН ) Lys НВг, Руг НВг. Реагент 1: 4-3-0- изоп- ропилиденпиридоксин. Реагент 2а Bos -Phe-OH или 26. Bos-Lys- (Z) - Он, а процесс ведут в хлороформе в присутствии пиридина, к полученному пиридоксиловому эфиру аминокислоты присоедин ют с использованием методов пептидной химии аминокислоты в последовательности, соответствующей целевому n-формилпетиду (1) а С N Н OS, мол.м 588,7, тл 163 - 165°L 29 4 40 7 af2-18,4; 16: С N Н OS, ммас 917,75, -,пл 1 JD38 в 55 в 171 - 173°С |а + 8,5. Пептиды формулы 1 хорошо растворимы в воде. 4 табл
Description
Предлагаются новые соединения, в частности 5'-пиридоксиловые эфиры N-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами, которые могут найти применение в иммунологии.
Цель изобретения поиск в ряду пептидов новых производных, водорастворимых и обладающих хемотаксической активностью.
Поставленная цель достигается описываемыми 5'-пиридоксиловыми эфирами формилпептидов общей формулы 1
Form-Met-Leu-Phe-A-O-Pyr где, если A связь, Рyr CH (Ia),
если A Lys˙HBr, Pyr CH (Iб), обладающие хемотаксическими свойствами.
Form-Met-Leu-Phe-A-O-Pyr где, если A связь, Рyr CH (Ia),
если A Lys˙HBr, Pyr CH (Iб), обладающие хемотаксическими свойствами.
Описываемые пептиды получают ступенчатым наращиванием пептидной цепи методом активированных эфиров.
В работе использованы аминокислоты ряд производных аминокислот фирм "Serva" (ФРГ) и "Fluka" (Швейцария).
Температуры плавления определяли на столике Кофлера. Углы удельного оптического вращения определяли на приборе: "Shimadzu" (Япония). УФ-спектры снимали на приборе "Ultraspes" (ЛКБ, Швеция).
Индивидуальность полученных соединений подтверждали элементным анализом и ТСХ на пластинах "Kleselgel F 254" (Мерк, ФРГ) в системах растворителей:
этилацетат (А);
этилацетат гексан, 7:3 (Б);
этилацетат метанол уксусная кислота 10:1:0,1 (В);
н-бутанол уксусная кислота вода, 3:1:1 (Г);
1,4-диоксан ацетон 25%-ный раствор аммиака, 9:9:2 (Д).
этилацетат (А);
этилацетат гексан, 7:3 (Б);
этилацетат метанол уксусная кислота 10:1:0,1 (В);
н-бутанол уксусная кислота вода, 3:1:1 (Г);
1,4-диоксан ацетон 25%-ный раствор аммиака, 9:9:2 (Д).
Пятна на пластинках детектировали в УФ-свете (254 и 366 нм), нингидрином, реактивом Гиббса и раствором хлорного железа.
Гидролиз пептидов проводили в 6 н. НСl при 155оС 50 мин и при 110оС 2 ч или 48 ч.
Используемые сокращения:
Form формил,
Вос трет-бутилоксикарбонил,
Z бензилоксикарбонил,
Рyr 5'-пиридоксил,
i-Pyr 5'-(4'-3-0-изопропилиден) пиридоксил,
Еt этил,
NSU N-гидроксисукцинимидный эфир,
ВOC2O ди-трет-бутилдикарбонат,
Ас ацетил,
ДМФА N,N-диметилформамид,
ДМСО диметилсульфоксид,
ЭА этилацетат,
Меt метионил,
Leu лейцил,
Рhе фенилаланил,
Lys лизил,
ГК гексан.
Form формил,
Вос трет-бутилоксикарбонил,
Z бензилоксикарбонил,
Рyr 5'-пиридоксил,
i-Pyr 5'-(4'-3-0-изопропилиден) пиридоксил,
Еt этил,
NSU N-гидроксисукцинимидный эфир,
ВOC2O ди-трет-бутилдикарбонат,
Ас ацетил,
ДМФА N,N-диметилформамид,
ДМСО диметилсульфоксид,
ЭА этилацетат,
Меt метионил,
Leu лейцил,
Рhе фенилаланил,
Lys лизил,
ГК гексан.
П р и м е р 1. Получения формилметиониллейцилфенилаланиллизина 5'-эфира пиридоксина (Iб) дибромгидрата.
Получение N α-третбутилоксикарбонил Nε-карбобензоксилизина 5'-эфира-4'-3-0-изопропилиденпиридоксина Вос-Lys(Z) O-i-Pys (III)
К раствору 21,87 г (57,5 ммоль) Вос-Lys-(Z)OH и 10,46 г (50 ммоль) 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина в смеси 0,5 мл пиридина и 25 мл СНСl3 при комнатной температуре и постоянном перемешивании вносят равномерными порциями 16,4 г (75 ммоль) ВОС2О в течение 1,5-2 ч, оставляют перемешиваться на 60 ч и распределяют между этилацетатом и насыщенным раствором бикарбоната натрия.
К раствору 21,87 г (57,5 ммоль) Вос-Lys-(Z)OH и 10,46 г (50 ммоль) 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина в смеси 0,5 мл пиридина и 25 мл СНСl3 при комнатной температуре и постоянном перемешивании вносят равномерными порциями 16,4 г (75 ммоль) ВОС2О в течение 1,5-2 ч, оставляют перемешиваться на 60 ч и распределяют между этилацетатом и насыщенным раствором бикарбоната натрия.
Органический слой промывают 3%-ным раствором КНSO4, насыщенным раствором NaHCO3, водой, сушат с MgSO4, растворитель удаляют, а остаток кристаллизуют из смеси ЭА-ГК. Получают 27,44 г вещества III.
Получение трет-бутилоксикарбонилфенилаланил-Nε -карбобензоксилизина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина (Вос-Рhe-Lys(Z)O-i-Pys) (IV)
К 27,0 г (47,23 ммоль) соединения III прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС раствор (17,42 г, 47,23 ммоль) Вос-Рhe-O-NSu в 20 мл СН2Сl2. К полученной смеси при 0оC прибавляют в течение 30 мин 19,7 мл (141,7 ммоль) в 20 мл СН2Сl2 и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в ЭА и промывают последовательно насыщенным 3%-ным раствором КНSO4, насыщенным раствором NaHCO3 и водой, после чего сушат с Na2SO4. ЭА отгоняют в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 32,25 г соединения IV.
К 27,0 г (47,23 ммоль) соединения III прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС раствор (17,42 г, 47,23 ммоль) Вос-Рhe-O-NSu в 20 мл СН2Сl2. К полученной смеси при 0оC прибавляют в течение 30 мин 19,7 мл (141,7 ммоль) в 20 мл СН2Сl2 и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в ЭА и промывают последовательно насыщенным 3%-ным раствором КНSO4, насыщенным раствором NaHCO3 и водой, после чего сушат с Na2SO4. ЭА отгоняют в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 32,25 г соединения IV.
Получение трет-бутилоксикарбониллейцилфенилаланил-Nε-карбобензоксилизина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина (Вос-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (V)
К 32 г (44,52 ммоль) соединения IV прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром, прибавляют к охлажденному до 0оС раствору 14,6 г (44,52 ммоль) Вос-Leu-O-NSu в 20 мл СН2Сl2.
К 32 г (44,52 ммоль) соединения IV прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром, прибавляют к охлажденному до 0оС раствору 14,6 г (44,52 ммоль) Вос-Leu-O-NSu в 20 мл СН2Сl2.
К полученной смеси при 0оС прибавляют в течение 30 мин 18,6 мл (133,6 ммоль) Еt3N в 20 мл СН2Сl2 и составляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в ЭА, органический слой последовательно промывают насыщенным раствором NaHCO3, 3% -ным раствором КНСО3, насыщ. раствором NaHCO3 и водой, после чего сушат с Na2SO4 с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-1К, получают 34,4 г соединения V.
Получение трет-бутилоксикарбонилметиониллейцилфенилаланил-Nε-карбобензокси- лизина 5'-эфира 4у'-3-0-изопропилиденпиридоксина
(Вос-Меt-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (VI)
К 34 г (40, 9 ммоль) соединения V прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2-Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС раствор 14,16 г (40,9 ммоль) Вос-Меt-O-NSu в 20 мл СН2Сl2. К полученной смеси при 0оС прибавляют 17,1 мл (122,6 ммоль) Еt3N в 20 мл СН2Сl2 и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и растворяют в ЭА, затем органический слой последовательно промывают насыщенным раствором NaHCO3, 3%-ным раствором KHSO4, насыщенным раствором NaHCO3 и водой, после чего сушат с Na2SO4 с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 36,9 г соединения VI.
(Вос-Меt-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (VI)
К 34 г (40, 9 ммоль) соединения V прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2-Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС раствор 14,16 г (40,9 ммоль) Вос-Меt-O-NSu в 20 мл СН2Сl2. К полученной смеси при 0оС прибавляют 17,1 мл (122,6 ммоль) Еt3N в 20 мл СН2Сl2 и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и растворяют в ЭА, затем органический слой последовательно промывают насыщенным раствором NaHCO3, 3%-ным раствором KHSO4, насыщенным раствором NaHCO3 и водой, после чего сушат с Na2SO4 с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 36,9 г соединения VI.
Получение формилметиониллейцилфенилаланил-Nε-карбобензоксилизина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина
(Form-Met-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (VII)
К 30 г (31,15 ммоль) соединения VI прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденный до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре и упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0о предварительно приготовленный раствор 8,47 г (124,6 ммоль) НСОО-Na+ в 11,75 мл (311,5 ммоль) 98%-ной НСООН т 14,7 мл 155,7 ммоль) Ас2О. Смесь выдерживают при 0оС в течение 45 мин и при комнатной температуре 45 мин, после чего выливают в 250 мл сушеного с NaOH эфира. Образовавшийся кристаллический осадок промывают на стеклянном фильтре минимальным количеством охлажденного до 10оС насыщенного раствора КНСО3 и охлажденной водой и высушивают под вакуумом, получают 25 г соединения VII.
(Form-Met-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (VII)
К 30 г (31,15 ммоль) соединения VI прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденный до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре и упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0о предварительно приготовленный раствор 8,47 г (124,6 ммоль) НСОО-Na+ в 11,75 мл (311,5 ммоль) 98%-ной НСООН т 14,7 мл 155,7 ммоль) Ас2О. Смесь выдерживают при 0оС в течение 45 мин и при комнатной температуре 45 мин, после чего выливают в 250 мл сушеного с NaOH эфира. Образовавшийся кристаллический осадок промывают на стеклянном фильтре минимальным количеством охлажденного до 10оС насыщенного раствора КНСО3 и охлажденной водой и высушивают под вакуумом, получают 25 г соединения VII.
Получение формилметиониллейцилфенилaланиллизина 5'-эфира пиридоксина (Iб) дибромгидрата.
В раствор 5 г (5,61 ммоль) соединения VII в смеси 20 мл СНСl3 и 2 мл безводного ацетона при 0оС пропускают НВr-газ в течение 40 мин, растворитель удаляют в вакууме, остаток промывают 150 мл сушеного с NaOH эфира. Эфирный слой декантируют, остаток высушивают в вакууме. Полученный продукт растворяют в 50 мл 10%-ного НСООН, раствор упаривают в вакууме досуха, остаток промывают сушеным диэтиловым эфиром, высушивают от эфира в вакууме и получают целевой продукт с количественным выходом в виде соли (бромистоводородной).
П р и м е р 2. Получение N-формилметиониллейцилфенилаланина 5'-пиридоксилового эфира (1a).
Получение трет-бутилоксикарбонилфенилаланина 4I-3-0-изопропилиден-5I-пиридоксилового эфира (Вос-Рhe-O-i-Pys) (VIII)
Соединение VIII получено аналогично соединению III, выход 92%
Получение трет-бутилоксикарбониллейцилфенилаланина 4'-3-0-изопропилиден-5'-пиридоксилового эфира (Вос-Leu-Phe-O-i-Pyr) (IX)
К 2,28 г (5,0 ммоль) соединения VIII прибавляют 20 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2CH2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС раствор 1,14 г (5,0 моль) Вос-Leu-O-NSu в 10 мл СН2Сl2. К полученной смеси при 0оС прибавляют в течение 30 мин 2,09 мл (15 ммоль) Еt3N в СН2Сl2 и оставляют перемешиваться ≈16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и распределяют в смеси насыщенный раствор NaHCO3 ЭА, органический слой промывают последовательно 3%-ным раствором, насыщенным раствором NaHCO3 и водой, после чего высушивают с МgSO4 с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 2,71 г соединения IX.
Соединение VIII получено аналогично соединению III, выход 92%
Получение трет-бутилоксикарбониллейцилфенилаланина 4'-3-0-изопропилиден-5'-пиридоксилового эфира (Вос-Leu-Phe-O-i-Pyr) (IX)
К 2,28 г (5,0 ммоль) соединения VIII прибавляют 20 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2CH2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС раствор 1,14 г (5,0 моль) Вос-Leu-O-NSu в 10 мл СН2Сl2. К полученной смеси при 0оС прибавляют в течение 30 мин 2,09 мл (15 ммоль) Еt3N в СН2Сl2 и оставляют перемешиваться ≈16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и распределяют в смеси насыщенный раствор NaHCO3 ЭА, органический слой промывают последовательно 3%-ным раствором, насыщенным раствором NaHCO3 и водой, после чего высушивают с МgSO4 с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 2,71 г соединения IX.
Получение трет-бутилоксикарбонилметиониллейцилфенилаланина 4'-3-0-изопропилиден-5'-пиридоксилового эфира.
К 2,71 г (4,8 ммоль) соединения IX прибавляют 20 мл смеси 1:1:0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают сушеным с NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС раствор 1,66 г (4,8 ммоль) Вос-Меt-O-NSu в 5 мл СН2Сl2. К полученной смеси при 0оС прибавляют 2 мл (14,4 ммоль) ЕtN в СН2Сl2 и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и растворяют в ЭА, органический слой промывают последовательно насыщенным раствором NaHCO3, 3% -ным раствором КНSO4, NaHCO3, насыщенным раствором и водой, после чего высушивают с МgSO4 с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 3,20 г соединения Х.
Получение формилметиониллейцилфенилаланина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина.
К 3,2 г (4,6 ммоль) соединения Х прибавляют 20 мл смеси 1: 1: 0,1 CF3COOH-CH2Cl2 ацетон, охлажденной до 0оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме, досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0оС предварительно приготовленный раствор 7,28 г (80 ммоль) НСООNa в 7,55 мл (200 ммоль) 98%-ной НСООН и 9,43 мл Ac2О. Смесь выдерживают при 0о в течение 45 мин и при комнатной температуре 45 мин, после чего выливают в 100 мл высушенного над NaОН эфира. Образовавшийся кристаллический осадок промывают на стеклянном фильтре минимальным количеством охлажденного до 10оС, насыщенного раствора КНСО3, охлажденной водой и высушивают под вакуумом, получают 2,75 г продукта ХI, который растворяют в 50 мл 10%-ной НСООН, раствор упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным с NaОН диэтиловым эфиром, высушивают от эфира в вакууме и получают целевой продукт (Ia) с количественным выходом.
Физико-химические характеристики целевых и промежуточных продуктов представлены в табл. 1-4.
Следующие примеры иллюстрируют биологическую активность предложенных соединений.
П р и м е р 3. Проведение анализа хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови.
Во флаконы сцинтилляционного счета добавляют по 2 мл раствора Хенкса без фенолового красного, содержащего 0,05% ЧСА, 2 мм НЕРЕS (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфокислоты) и 1 ˙ 10-6 М раствор люминола. Затем во флаконы вносят суспензию нейтрофилов так, чтобы конечная концентрация составляла 0,5 ˙ 10-6 на 1 мл. Перемешивают содержимое флаконов, помещают их в счетчик и проводят измерение хемилюминесценции при 37оС в 0,1-минутные интервалы на протяжении 90-120 мин. Разливание среды во флаконы, разведение и добавление клеток выполняют в красном свете.
Обычно через 45-60 мин после начала измерения заканчивается прилипание клеток на стекло, интенсивность хемилюминесценции приближается к исходному уровню, в этот период в те же флаконы вносят 20 мкл раствора формилпептида Ia. Параллельно добавляют пептиды Iб (растворы получают разведением 1 мМ раствора формилпептида в ДМСО раствором Хенкса до концентрации 10-6 М) и снова измеряют хемилюминисценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 30 мин. Результат хемилюминесценции оценивается по максимальному значению на кинетической кривой.
П р и м е р 4. Проведение анализа хемотаксина и спонтанной миграции нейтрофилов периферической крови.
В стерильную деионизованную воду (можно бидистиллированную) добавляют агарозу в концентрации 12 мг/мл, кипятят на водяной бане до 50оС. Десятикратную среду МЕММ ("Miles"), содержащую 20% фетальной телячьей сыворотки (конечная концентрация), предварительно подогревают на водяной бане до 50оС, смешивают с агарозой (1:9) и разливают в стерильные полистироловые чашки Петри 60х15 мм. После застывания агарозного геля при комнатной температуре чашки дополнительно выдерживают 30 мин при 4оС. Далее с помощью пробойника делают в агарозе лунки диаметром 3 мм, расстояние между ними 3 мм. В качестве хемоаттрактанта применяют соединение II (Form-Met-Leu-Phe-OH) (параллельно соединения Ia, Iб), который вначале разводят до конечной концентрации 10-3 М (6 мг соединения II в 13,7 мл ДМСО), затем растворяют в растворе Хенкса без Са2+ и Мо2+ до конечной концентрации 1 ˙ 10-7 М, разливают на аликвоты по 0,5 мл или 1 мл и хранят при -70оС. Концентрацию нейтрофилов, выделенных из периферической крови на градиенте фиколла и верографина, доводят в полном растворе Хенкса (с содержанием 0,5% БСА и 2 мМ НЕРЕS) до 5 ˙ 107 на мл.
Результаты оценивают следующим образом. В центральную лунку вносят по 10 мкл клеточной суспензии, а в боковые 10 мл формилпептида Iа, Iб (1 ˙ 10-7 М) или контрольную среду. Чашки инкубируют в течение 1 ч при 37оС во влажной атмосфере (5% СО2 и 95% воздуха), затем заливают на 40 мин 2,5% глютаровым альдегидом на фосфатном буфере (рН 7,2). После такой фиксации клеток агарозу удаляют, чашки промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Миграцию клеток оценивают с помощью окулярмикрометра и увеличения микроскопа в 25 раз. Измеряют следующие параметры: А-миграцию клеток к хемоаттрактанту, В-миграцию клеток в контрольной лунке, С-спонтанную миграцию клеток; определяют хемотактическую разницу (А В).
П р и м е р 5. Проведение анализа хемилюминесценции в микрообъеме неразделенной крови.
Забирают из пальца кровь в гепаринизированные стеклянные капилляры объемом 60-75 мкл. Переносят кровь в отечественные пластиковые пробирки типа "Эппендорф" объемом на 1,5 мл, содержащие 75 мкл полного раствора Хенкса без индикатора, перемешивают и хранят до момента использования при 4оС. В другие пластиковые конические пробирки типа "Эппендорф" вносят по 50 мкл водного раствора формилпептида (Iа или Iб), добавляют из пробирки с разделенной кровью 100 мкм последней, тщательно перемешивают. Как и ранее, все процедуры выполняют при красном свете. Пробирки с суспензией клеток и соответствующим пептидом закрывают пробкой и просчитывают на счетчике (Бэта-2, СССР).
Данные по оценке биологической активности пептида Iа и Iб представлены ниже. Оба препарата практически в равной мере индуцируют хемотаксическую активность фагоцитирующих клеток, что свидетельствует о наличии у синтезированных пептидов специфической активности.
Проведенный хемилюминесцентный анализ на человеческих нейтрофилах показал, что оба исследуемых пептида обладают значительной активностью в данном тесте. Одновременно выявлены важные положительные свойства данных пептидов, в значительной степени отличающих их от традиционно используемых хемоаттрактантов. Вновь синтезированные пептиды оказались хорошо растворимыми в водных растворах, тогда как обычно используемые в экспериментальной и клинической практике хемотаксические пептиды растворяют в ДМСО. Эти свойства пептидов позволяют использовать их в хемилюминесцентном микротесте с использованием неразделенной крови человека. Если в случае использования стандартного хемоаттрактанта не удается зарегистрировать респираторный ответ нейтрофилов в цельной крови (это происходит за счет тушения хемолюминесценции большим количеством ДМСО, в котором растворен пептид), то в случае использования 5'-пиридоксилового эфира N-формилметиониллейцилфенилаланина или 5-пиридоксилового эфира N-формилметиониллейцилфенилаланиллизина, приготовленных на буферном растворе, регистрируется полноценный хемилюминесцентный ответ нейтрофилов, содержащихся в цельной крови.
Таким образом, синтезированные пептиды обладают высокой функциональной активностью в тестах хемотаксиса и хемилюминесценции, также как и стандартные пептиды, причем выявлены важные преимущества полученных реагентов за счет растворимости их в водных растворах. За счет этого они могут быть использованы для массового клинического анализа хемилюминесцентной активности нейтрофилов в неразделенной крови.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4816587 RU1828095C (ru) | 1990-04-23 | 1990-04-23 | 5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4816587 RU1828095C (ru) | 1990-04-23 | 1990-04-23 | 5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1828095C true RU1828095C (ru) | 1995-12-27 |
Family
ID=30441763
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4816587 RU1828095C (ru) | 1990-04-23 | 1990-04-23 | 5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU1828095C (ru) |
-
1990
- 1990-04-23 RU SU4816587 patent/RU1828095C/ru active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Richard F Freer и др. Biochern. 21, 257-263, 1982. Барсуков АЛ Скл ров ПЮ. и др Изучение биологической активности флуоресцентных хемо- таксических пептидов. Тезисы доклада на УП Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов. Таллинн, 19-23 окт бр 1987, с.153. * |
Richard F. Freer и др. Biochem. 21, 257-263, 1982. * |
Барсуков А.А., Скляров Л.Ю. и др. Изучение биологической активности флуоресцентных хемотаксических пептидов. Тезисы доклада на УП Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов. Таллинн, 19-23 октября 1987, с.153. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5198537A (en) | Digoxigenin derivatives and use thereof | |
US6630588B2 (en) | Dye labeled imidazoquinoline compounds | |
JP4083584B2 (ja) | 光誘導電子移行蛍光センサ分子 | |
EP3431480A1 (en) | Diarylamine-based fluorogenic probes for detection of peroxynitrite | |
US6262252B1 (en) | Single-step method for labeling nucleic acids with mustard or aziridine labeling reagents | |
EP0718300B1 (en) | Carbodiimide derivative | |
US6593465B1 (en) | Method for single-step attachment of a label to target molecules | |
EP0583820A1 (en) | Novel carbamazepine hapten analogues | |
EP1350108B1 (en) | Method for identifying ligands for a biological substrate | |
CA1152492A (en) | Reagents for use in binding assays to determine valproic acid | |
US20040198712A1 (en) | Method for labeling phosphorylated peptides, method for selectively adsorbing phosphorylated peptides, complex compounds used in the methods, process for producing the complex compounds, and raw material compounds for the complex compounds | |
CA1071101A (en) | Radioimmunoassay method for the determination of cardiotonic glycosides | |
US4078049A (en) | Acetylcholine assay | |
RU1828095C (ru) | 5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами | |
GB1574744A (en) | Assay for methadone | |
GB2428676A (en) | Library of compounds labelled with a radioisotope | |
EP0808829B1 (en) | Fluorescent group-containing carbodiimide compound | |
CN101988923A (zh) | 己烯雌酚残留的时间分辨免疫分析检测试剂盒及其检测方法 | |
JPH05255264A (ja) | 標識剤および標識されたリガンドの製法 | |
SU649723A1 (ru) | -Инозилцистеин (5- )-2-амино-2карбокси-этил (-5-тиоинозин), про вл ющий регенерирующее действие на живые ткани | |
US4102979A (en) | Radioimmunoassay for benzoylecgonine | |
US5099000A (en) | Derivatives and analogues of monoethylglycinexylidide and their production and use | |
EP0184630A2 (en) | Fluorescence polarization assay, reagents, and method of making reagents, for determination of digitoxin | |
EP0812823B1 (en) | Chemiluminescent group-containing carbodiimide compound | |
CN116903524B (zh) | 氟啶脲半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用 |