RU1814065C

RU1814065C - Method of sulfide concentration determination in physical media

Info

Publication number: RU1814065C
Authority: RU
Inventors: Даце Юльевна Балцере; Беата Андреевна Гринберг; Андрей Петрович Гринберг; Елена Борисовна Никольская; Марина Михайловна Дианова
Original assignee: Научно-производственное объединение "Биолар"; Латвийский Государственный Университет Им.П.Стучки; Институт Микробиологии Им.А.Кирхенштейна
Priority date: 1989-05-03
Filing date: 1989-05-03
Publication date: 1993-05-07

Abstract

Изобретение относитс к ферментному анализу и может примен тьс в химическом анализе, химико-технологическом анализе, дл контрол загр знени природных вод, почвы и атмосферы. Целью изобретени вл етс повышение точности определени . В экспериментальную чейку внос т биокатализатор с моноаминооксидаэной активностью , растворенный в буфере с рН 7-9, добавл ют тирамин или серотонин, выдерживают полученную смесь, определ ют активность фермента, внос т анализируемую пробу в смесь и повторно определ ют активность фермента. После этого рассчитывают соотношение полученных величин активностей фермента и определ ют концентрацию сульфидов в пробе по калибровочному графику . ел с Поставленна цель достигаетс тем, что в качестве ферментного препарата используют бмокатализатор с моноаминоксидаз- ной активностью, рН буферного раствора составл ет от 7 до 9, а в качестве субстрата используют тирамин или серотоник. Повышение точности определени предложенным способом оказалось воз00 I о ел The invention relates to enzyme analysis and can be used in chemical analysis, chemical technology analysis, to control pollution of natural waters, soil and atmosphere. The aim of the invention is to increase the accuracy of determination. A biocatalyst with monoamine oxidase activity dissolved in a pH 7-9 buffer is added to the experimental cell, tyramine or serotonin is added, the resulting mixture is kept, the enzyme activity is determined, the analyzed sample is added to the mixture and the enzyme activity is re-determined. After that, the ratio of the obtained enzyme activity values is calculated and the concentration of sulfides in the sample is determined according to the calibration curve. Achieving this goal is achieved by the fact that a biocatalyst with monoamine oxidase activity is used as an enzyme preparation, the pH of the buffer solution is from 7 to 9, and tyramine or serotonic is used as a substrate. Improving the accuracy of determination by the proposed method turned out to be

Description

можным с применением биокатализатора с МАО активностью. Ингибирующее действие сульфидов на МАО оказалось сильнее, чем на другие ферменты, в том числе на перок- сидазу. Уже при концентрации HzS и сульфидов 1 -КГ5 М их ингибирующее действие вызывает заметное изменение ферментативной активности МАО. Применение фермента в иммобилизованной форме позвол ет определить ферментативную активность препарата при повышенной температуре, обеспечивающей про влени наименьших изменений ферментативной активности.possible using a biocatalyst with MAO activity. The inhibitory effect of sulfides on MAO was stronger than on other enzymes, including peroxidase. Even at a concentration of HzS and 1-KG5 M sulfides, their inhibitory effect causes a noticeable change in the enzymatic activity of MAO. The use of the enzyme in immobilized form allows one to determine the enzymatic activity of the drug at an elevated temperature, which provides the manifestation of the smallest changes in the enzymatic activity.

Среда буфера с рН 7,0-9,0 оказалась- оптимальной дл взаимодействи сульфидов с МАО. Данна область рН также обеспечивает смещение равновеси в процессе диссоциации Й25 в сторону образовани ибна сульфида. Последний вл етс ингиби- р.дрм фермента МАО. Степень ингибирова- нЙ1 МАО зависит от концентраций иона сульфида, следовательн.о, и от концентрации сероводорода. О степени инги- бировани МАО суд т по изменению ферментативной активности в реакции окислительного дезаминироёани моноаминов , например шрамина, серЬтонйна.A buffer medium with a pH of 7.0-9.0 was found to be optimal for the interaction of sulfides with MAO. This pH range also provides an equilibrium shift during the dissociation of Y25 towards the formation of ibn sulfide. The latter is an inhibitor of DMA of the MAO enzyme. The degree of inhibition of MAO1 depends on the concentration of sulfide ion, consequently, and on the concentration of hydrogen sulfide. The degree of MAO inhibition is judged by the change in the enzymatic activity in the oxidative deamination of monoamines, for example, scramine, serum ton.

Применение двух субстратов позвол ет определить сульфиды при любой концентрации их в исследуемой среде. Это особенно важно дл контрол высоких содержаний анализируемого вещества, например, в промышленных сточных водах, илах и т.д. МАО активность препарата можно измер ть любым методом определени активности этого фермента (по Конвею, электродом с газовым зазором и др.).The use of two substrates makes it possible to determine sulfides at any concentration in the medium under study. This is especially important for controlling high analyte contents, for example, in industrial wastewater, sludge, etc. The MAO activity of the drug can be measured by any method for determining the activity of this enzyme (according to Conway, an electrode with a gas gap, etc.).

Использование предложенного способа не требует предварительной обработки мутных или окрашенных сточных вод. Коллоидный состав анализируемой пробы не вли ет на точность результата анализа. Отсутствие предварительной обработки анализируемой пробы исключает ошибку из-за возможного св зывани присутствующего сульфида.Using the proposed method does not require pre-treatment of turbid or colored wastewater. The colloidal composition of the analyzed sample does not affect the accuracy of the analysis result. The lack of pretreatment of the test sample eliminates the error due to the possible binding of the sulfide present.

В случае измерени активности МАО с помощью электрода с газовым зазором ошибка составл ет ± 1%, В предлагаемом способе объем анализа не вли ет на точность результата. В случае высоких концентраций HaS анализируют меньший объем исследуемой пробы. Это особенно важно при анализе воздуха в зонах очистных сооружений , при метановом брожении активного ила и в биотазах при анаэробном сбраживании сельскохоз йственных отходов , где концентраци сероводорода может достигать 1.In the case of measuring MAO activity using an electrode with a gas gap, the error is ± 1%. In the proposed method, the analysis volume does not affect the accuracy of the result. In the case of high HaS concentrations, a smaller sample volume is analyzed. This is especially important when analyzing air in treatment plant zones, in methane fermentation of activated sludge, and in biotases during anaerobic digestion of agricultural waste, where the concentration of hydrogen sulfide can reach 1.

Способ заключаетс в следующем. Определ етс МАО активность иммобилизованного препарата по субстрату тирамину или серотонину. ФерментныйThe method is as follows. The MAO activity of the immobilized preparation is determined by the substrate tyramine or serotonin. Enzymatic

препарат инкубируетс с пробой, содержащей N28 или растворенный сульфид при заданном рН 7,0-9,0 в буфере После инкубации определ етс остаточна активность иммобилизованной МАО тем же способом определени активности. Наход т соотношение ферментативных активностей Oo/Q и далее Ig вь/ft. По калибровочному графику соответствующего субстрата при данной температуре инкубации наход тthe preparation is incubated with a sample containing N28 or dissolved sulfide at a given pH of 7.0-9.0 in the buffer. After incubation, the residual activity of immobilized MAO is determined by the same method for determining activity. The ratio of the enzymatic activities of Oo / Q and then Ig b / ft is found. According to the calibration curve of the corresponding substrate at a given incubation temperature,

концентрацию сульфида в анализируемой . пробе. .:.- . V . ; .-..- .. Л ри м е р 1. Определение исходной МАО активно стй .. .;/ :/:- - . ,.. : -- :.:V;- the concentration of sulfide in the analyzed. sample. .: .-. V. ; .-..- .. LIme R 1. Determination of the initial MAO activity ...; /: /: - -. , ..: -:.: V; -

0,4 г биокатализатора с МАО актйвио- стью согласно авт. свйд.№1146322 помещают в чейку, которую на 10 мин помещают в 0,0f M фосфатный буфер с рН 7,0. Затем чейку с ферментным препаратом перенос т в тёрмбстатируемый сосуд электрода с газовым зазором. Туда же забивают реакционную смесь: 0,1 М фосфатного буфера 3 Мл (рН 7,0) и I мл субстрата - серотонина с концентрацией 4-10 М (концентраци в0.4 g of biocatalyst with MAO activity according to ed. Sverd. No. 1146322 is placed in a cell, which for 10 min is placed in 0.0f M phosphate buffer with a pH of 7.0. Then, the cell with the enzyme preparation is transferred to a thermotestable electrode vessel with a gas gap. The reaction mixture is clogged there: 0.1 M phosphate buffer 3 ml (pH 7.0) and I ml of a substrate - serotonin with a concentration of 4-10 M (concentration in

пробе 1 М). В течение 10 мин через раствор пропускают кислород при посто нном перемешивании. Далее поток перекрывают и Терметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 20°С с йнтенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодёржащую чейку вынимают, в сосуд добавл ют 1,4 г HCI, закрывают пробкой с рН стекл нным электродом, на поверхность которого помещена капл 0,2%-ногоsample 1 M). Oxygen was passed through the solution for 10 minutes with constant stirring. Then the flow is blocked and the thermally closed vessel is kept for 50 min at 20 ° С with vigorous stirring. After incubation, the enzyme-containing cell is taken out, 1.4 g of HCI is added to the vessel, and the plug is closed with a pH glass electrode, on the surface of which a drop of 0.2% is placed

раствора тритона Х-305 в. бидистиллиро- ванной воде, снова пропускают 02 без С02 и затем через капилл р ввод т в реакционную смесь 0,2 мл 1 М NaOH () дл полного освобождени аммиака. После установлени посто нного потенциала (рН) на электроде ( 20 мин) записывают показани потенциометра (рН-метра).Triton X-305 c. with double-distilled water, 02 is again passed without CO2, and then 0.2 ml of 1 M NaOH () is introduced into the reaction mixture through a capillary to completely release ammonia. After establishing a constant potential (pH) on the electrode (20 min), read the potentiometer (pH meter).

Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом и определение остаточнойThe interaction of the enzyme preparation with sulfide and determination of residual

ферментной активности.enzymatic activity.

, Ячейку с ферментным препаратом пере- нос т из буферного раствора в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора NaaS с концентрацией 4,6-10 М, The cell with the enzyme preparation was transferred from the buffer solution to the analyzed solution of the following composition: 5 ml of NaaS solution with a concentration of 4.6-10 M

и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,0. Инкубируют при перемешивании.and 5 ml of 0.01 M phosphate buffer with a pH of 7.0. Incubated with stirring.

Затем чейку с ферментом перенос т в буфер дл промывани и определ ют остаточную МАО активность.The cell with the enzyme is then transferred to the wash buffer and the residual MAO activity is determined.

Дл анализа используют тот же метод и те же услови , что дл анализа исходной МАО активности.The same method and conditions are used for analysis as for the analysis of the initial MAO activity.

Наход т соотношение показаний потенциометра при анализе исходной и оста- точной активности, что вл етс величиной во/ft, равной 1 33. Потом наход т д во/ft, равный 0,12. По калибровочной кривой в координатах Ig во/ft -l(t) с использованием серотонина в качестве субстрата наход т концентрацию сульфида (Г3 моль/л 1.0 мин, Разделением данной величины на 10 наход т концентрацию сульфида в анализируемой пробе, т.е. 2, М.The potentiometer readings are found in the analysis of the initial and residual activity, which is a w / ft value of 1 33. Then, a w / ft value of 0.12 is found. According to the calibration curve in the Ig coordinates in / ft-l (t) using serotonin as the substrate, the sulfide concentration is found (G3 mol / L 1.0 min, Dividing this value by 10 determines the sulfide concentration in the analyzed sample, i.e. 2 , M.

Пример 2.Example 2

Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1.The determination of the initial MAO activity is similar to example 1.

Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом.The interaction of the enzyme preparation with sulfide.

Ячейку с 0,4 г ферментного препарата перенос т из буферного раствора с рН 8,0 в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора сул ьфида натри с концентрацией 4, и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 8,0 Инкубируют при переме- шИвании. . ....;/;. // /,////.A cell with 0.4 g of the enzyme preparation was transferred from a pH 8.0 buffer solution to the analyzed solution of the following composition: 5 ml of sodium sulfide solution with a concentration of 4, and 5 ml of 0.01 M phosphate buffer with a pH of 8.0 Incubated at stirring. . ....; / ;. // /, ////.

Определение остаточной МАО активности аналогично исходной МАО активности. Наход т соотношение #о/$, равной 3,9, и далее Ig во/ft 0,59. The determination of residual MAO activity is similar to the initial MAO activity. The ratio # o / $ is found to be 3.9, and then Ig b / ft 0.59.

По калибровочной кривой с использованием серотонина в качестве субстрата наход т концентрацию сульфида 2, М. // .Пример 3. ... / . ;;/ From the calibration curve using serotonin as the substrate, the concentration of sulfide 2, M. // is found. // Example 3. ... /. ;; /

Определение исходной МАО активно- сти аналогично примеру 1.The determination of the initial MAO activity is similar to example 1.

Ячейку с 0,4 г ферментного препарата перенос т из буферного раствора с рН 9,0 в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора NaaS с концентрацией 4, и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 9,0. Инкубируют в пробе при перемешивании . Затем чейку с ферментным препаратом перенос т в буфер дл промывани и определ ют остаточную МАО активность аналогично определению исходной МАО активности . Наход т соотношение во/ft, рав- ное 12,1, и далее Ig во/ft, равный 1,08.A cell with 0.4 g of the enzyme preparation was transferred from a buffer solution with a pH of 9.0 to the analyzed solution of the following composition: 5 ml of a NaaS solution with a concentration of 4, and 5 ml of 0.01 M phosphate buffer with a pH of 9.0. Incubated in the sample with stirring. Then the cell with the enzyme preparation is transferred to the washing buffer and the residual MAO activity is determined similarly to the determination of the initial MAO activity. A b / ft ratio of 12.1 is found, followed by an Ig b / ft of 1.08.

По калибровочной кривой с использованием серотонина в качестве субстрата нахоAccording to the calibration curve using serotonin as a substrate,

I - - г- хд т концентрацию сульфида 2,3-10 М.I - - g- hd t sulfide concentration 2.3-10 M.

П р и м е р 4.Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1.PRI me R 4. The definition of the initial MAO activity is similar to example 1.

Ячейку с ферментсодержащим препаратом перенос т из буферного раствора с рН 9,0 в анализируемый состав: 5 мл раствора Na2$ с концентрацией 4. М и 5 мл буфера с рН 9,0. Инкубируют с ферментным препаратом при перемешивании. Определ ют остаточную МАО активность и наход т соотношение во/ft, равное 11,8, и далее определ ют д во/ft, равный 1,07. -.; iA cell with an enzyme-containing preparation was transferred from a buffer solution with a pH of 9.0 to the analyzed composition: 5 ml of a Na2 $ solution with a concentration of 4. M and 5 ml of a buffer with a pH of 9.0. Incubated with the enzyme preparation with stirring. The residual MAO activity is determined and the b / ft ratio of 11.8 is found, and then the b / ft ratio of 1.07 is determined. - .; i

По калибровочной кривой с использованием -тирамина в качестве субстрата наход т концентрацию сульфида 2 -10 М.From a calibration curve using β-tyramine, a sulfide concentration of 2-10 M is found as a substrate.

П риме р 5.Example 5.

Определение сульфидов в сточных во Determination of sulfides in wastewater

дах. .: ; ....; / ;/ Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1. ./dah. .:; ....; /; / Determination of the initial MAO activity analogously to example 1. ./

Анализируемый состав: 5 мл сточных вод, 5 мл буфера с рН 8,0. Инкубированйё с ферментным препаратом провод т при перемешивании в течение 60 мин при 20°С, Соотношение во/ft равно 1,1. Далее определ ют Ig &/$, равный 0,04,The analyzed composition: 5 ml of wastewater, 5 ml of buffer with a pH of 8.0. Incubation with the enzyme preparation is carried out with stirring for 60 minutes at 20 ° C. The ratio w / ft is 1.1. Next, Ig & / $ is determined to be 0.04.

По калибровочной кривой с использованием тирамина определ ют концентрацию сульфидов, равную М.The calibration curve using tyramine determines the concentration of sulfides equal to M.

Ф ормула изоб рете н и Formula is n e

Способ определени концентрации сульфидов в физических средах, предусматривающий отбор пробы среды, внесение ферментного препарата, растворённого в буфере в экспериментальную чейку, добавление субстрата, выдерживание получен ной смеси, определение активности ферментного препарата, последующее внесение анализируемой пробы в реакционную смесь и повторное определение активности ферментного препарата, расчет соотношени полученных величин активностей ферментного препарата и определение концентрации сульфидов по калибровочному графику, о т л и ч а ю щ ий с тем, что, с целью повышени точности определени , в качестве ферментного препарата используют биокатализатор с моноаминооксидазной активностью, рН буферного раствора составл ет от 7 до 9, а в качестве субстрата используют тирании или серотонин.A method for determining the concentration of sulfides in physical media, including sampling the medium, introducing an enzyme preparation dissolved in a buffer into an experimental cell, adding a substrate, keeping the resulting mixture, determining the activity of the enzyme preparation, then adding the analyzed sample to the reaction mixture and re-determining the activity of the enzyme preparation , the calculation of the ratio of the obtained values of the activity of the enzyme preparation and the determination of sulfide concentration by calibration a schedule, in order to increase the accuracy of determination, a biocatalyst with monoamine oxidase activity is used as an enzyme preparation, the pH of the buffer solution is from 7 to 9, and tyranny or serotonin is used as a substrate .