RU1789525C - Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоны - Google Patents
Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоныInfo
- Publication number
- RU1789525C RU1789525C SU894763976A SU4763976A RU1789525C RU 1789525 C RU1789525 C RU 1789525C SU 894763976 A SU894763976 A SU 894763976A SU 4763976 A SU4763976 A SU 4763976A RU 1789525 C RU1789525 C RU 1789525C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- inhibitor
- inhibitors
- purification
- protease inhibitors
- concentration
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
можности выделени ингибиторов более широкого спектра действи .
Поставленна цель достигаетс предложенным способом, состо щим в том, что провод т гомогенизацию морской анемо- ны Stoichactis nelianthus, экстракцию, обработкуэкстракта раствором трихлоруксусной кислоты до ее конечной концентрации 5-10%, афиинную хроматог- рафию на трипсин-сефарозе в бикарбонат- ном или трис-HCi буфере 0,01-0,05 М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0,2-0,5М и ионов Са+2 10-30 т.М, элюируют ингибитор раствором хлористого кали в концентрации 0,5-1 М с рН 1,7-2, В качестве одновалентной соли могут быть использованы различные растворимые одновалентные соли, которые служат лишь дл создани в раств орах ибнном силы, ра вной 0,2-0,5. 8 частности, такими сол ми могут быть дешевые, доступные и стабильные реагенты . Наиболее часто примен емые в аффинной хроматографи .-г, СГ,- ШОз, KB г, NH4N03, NH4CI. NaCI. NaBr. NaF, NaNOa.
Отличием предлагаемого способа вл - етс использование в качестве исходного сырь дл получени ингибиторов протеаз морской анемоны Stoichactis nslianthus. обработка экстракта раствором трихлоруксусной кислоты в конечной концентрации 5-10%, осуществление аффинной хроматог- рафии на трипсин-сефарозе в бикарбонат- ном или трис-НСГ буфере 0,01-0,05М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0,2-0,5М и ионов 10-30 тМ, элюирование ингибитора раствором кали в концентрации 0.5-1М с рН 1,7-2.
Использование в качестве исходного сырь морской анемоны Stoichactis melianthus обеспечивает получение инги- битеров протеаз широкого спектра действи , способных ингибировать три основных типа протеаз: сериновые (трипсин), цистеи- новые (бромелаин) и аспартильные (пепсин )..Предлагаема строга последовательность стадии очистки: обработка трихлоруксусной кислотой в конечной концентрации 5-10%, аффинна хромчтографи на трипсин-сефарозе в би- карбонатном или трис-HCI буфере 0,01- 0.05М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0.2-0,5М и ионов 10730 .тМ, элюирование ингибитора раствором хлористого кали в концентрации 0,5-Ш с рН 1,7-2, обеспечивают повышение выхода ингибиторов до 150-200% и получение высокой степени очистки, более 90% активного ингибитора от веса препарата. Проведение элюировани ингибитора рас- твор ом КСГс ,7 пр йвЬ д т;1г сГнйжё нйю
0
0 5 0
5 5
0 5 0 5
активности ингибитора из-за его нестабиль-- ности в сильно кислой среде, а использовав ние раствора с приводит к уменьшению выхода.
Эта последовательность стадий обеспечивает разрушение комплексов ингибиторов с протеазами на начальном этапе, что дает выход, превышающий 100%, и благо-,, при тствует эффективному взаимодействию ингибиторов с трипсином при проведении аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе. При аффинной хроматографии осуществл ют удаление всех других белков, включа токсины,, содержащихс в экстракте морской анемоны , и получение ингибиторов в виде одного- пика. В некоторых случа х эта смесь инги-- « биторов может быть непосредственно использована . ИспЫ ьзаван й е на стадии системы равновесной элюции, котора сочетает в себе бикарбонатный буфер или трис-HCI от 0,01 до 0,05 М в присутствии,.-,; одновалентной соли и ионов Са от 10 до 30 тМ при рН 8, с последующей заменой элю- ирующего буфера на кислый раствор с рН 1,7-2, содержащий хлористый калий в концентрации 0,5-1 М, позвол ет получить выход свыше 100%, содержание активных ингибиторов в препарате 50-70% (коммер- . ческий уровень).
Смесь ингибиторов может быть эффективно разделена при однократной гель- фильтрации на сефадексе G-50. При этом получают каждый ингибитор в отдельности и используют, если того требует применение , препарат более высокой ингибирую- щей способности. Использование 5-10 % уксусной кислоты в качестве элюэнтдпри хроматографии на сефадексе G-50 вли ет на стабильность, эффективное разделение трех ингибиторов и позвол ет - проводить пр мую лиофилизацию ингибиторов. Выход на этой стадии составл ет 90-100%. Основной ингибиторный пик имеет мол.мае. 9000- 10.000, содержит 93% активного ингибитора от веса препарата, (коммерческий уровень),
Предложенный способ иллюстрируетс следующими примерами,
Пример 1. Цельные тела морской анемоны Stoichactis helianthus разрезают на маленькие кусочки, гомогенизируют в собственной жидкости, при этом происходит экстракци ингибитора, центрифугируют . Супернатанты можно хранить до их последующего использовани либо замороженными при -20° С, либо в лиофилизозан- ном виде.
Полученный экстракт обрабатывают трихлору ксусной кислотой ) до ее конечной концентрации э смеси, равной 5%. Осадки, полученные после центрифугировани , промывают ТХУ. Обьединенные супер- натанты диализуют s течение 24 ч против буфера, использующегос при аффинной хромэтографии, причем в начале диализа замену буфера производ т через каждый час. Эта обработка позвол ет получить выход по ингибирующей активности от 100 до 150% по отношению к начальному экстрак-
ту.
Аффинную хроматографию на трипсин- сефарозе, содержащей 5-3 мг трипсина на 1 мл гел сефэрозы, осуществл ют в бикар- бонатном или трис-Н CI буфере 0,01М з при- сутствии одновалентной соли 0.2М и ионов Сз+2 10 тМ при рН 7,3-8. После элюирова- ни первой белковой фракции провод т за- .мену элюирующего буфера на кислый растзор, с рН 1,7, содержащий хлористый калий в концентрации 0.5М. Это дает выход 150% по отношению к начальному этапу. Фракции, содержащие ингибиторную активность , диализуют против 5% уксусной кислоты, а затем лисфилизуют. Лиофилизо- ванный препарат, содержащий 50% активного ингибитора, раствор ют в 5%-нсм растворе уксусной кислоты и подвергают гельхроматографии на сефадексе G-50, уравновешенном уксусной кислотой 5%. Гельхромзтографи позвол ет осуществить разделение трех изоингибиторов различного молекул рного аеса. Основной ингиби- тбрный пик с молекул рной массой 9000 получаетс с выходом 90% от общей инги- бирующей зктиэности и уровнем активности 93%. Его аминокислотный состав указан в табл. 1.
П р и м е р 2. Выделение и очистка ингибитора из морской анемоны проведены
с такой же последовательностью стадии, как и в примере 1, с той лишь разницей, что в качестве одновалентной соли использовали растворО.ЗБМ КС). Выход ингибитора 150%. После проведени гельхроматогрзфии на сефадексе G-50 препарат с м.м. 9000 содержит 93% активного ингибитора от веса препарата . Остальные примеры проведены с такой же последовательностью стадии, что описаны в примере 1.
Результаты примеров приведены в табл.2.
Ингибиторы протеаз, полученные этим способом, имеют функциональные свойства , не описанные ранее в специализированной литературе, т.е. каждый ингибитор в отдельности может ингибироззть широкий спектр протеолитических ферментов. Из трех очищенных ингибиторов, фракци с мол. массой 9000 и изоэлектричесхой точкой 8,4, вл етс основной из-за своей высокой ингибирующей активности против трех ранее упом нутых протеолитичесхмх ферментов . Тщательное исследование этого ингибитора показывает следующие его свойства: очень высока ингибирующа активность по отношению к трипсину и плаз- мину (+++), высока ингибирующа активность по отношению к химотрипсину, папаину и бромелаину (++), ингибирующа активность средней силы по отношению к пепсину, химозину и кислой протеазе из Mucor miehei (+}. слабое ингибирование зла- стазы гранулоцитоа ().
Таким образом, предложенный способ по сравнению с прототипом позвол ет получить ингибиторы протеаз с широкой специфичностью с повышением выхода до 150% и содержанием активного вещества около 90%.
Ф о р м у л а и з о б р е т е н и
Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоны, предусматривающий го- -могениззцию тела животного, экстракцию ингибиторов, хроматографию и гель-хрома- тографию на сефадексе С-50, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода ингибиторов и обеспечени возможности выделени ингибиторов более широкого спектра действи , используют морскую анемону
mpafraarpZfii-. и
r-- -vryrrv
вида Stoichactis helianthus, полученный экстракт обрабатывают раствором трихлорук- сусной кислоты до ее конечной концентрации 5-10%, осуществл ют аффинную хромзтографию на трипсинсефаро- зе в 0,01-0,05 М бикарбонатном или трис-HCl буфере з присутствии одновалентной соли в концентрации 0,2-0,5 М и ионов Сат2 в концентрации 10-30 мМ и элюируют ингибитор раствором хлористого кали в концентрации 00.5-1 М с рН 1,7-2.
Аминокислотный состав ингибитора протеаз (м.м 9 кД)
Вли ние услови обработки и проведени аффинной хроматографии экстракта на результаты очистки
Таблица 1
Таблица2
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CU1988200A CU22054A1 (es) | 1988-12-12 | 1988-12-12 | Matodo de purificacion de inhibidores de proteasas de anamona marina staichactis heliantus y el producto asi obtenido |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1789525C true RU1789525C (ru) | 1993-01-23 |
Family
ID=5459533
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU894763976A RU1789525C (ru) | 1988-12-12 | 1989-11-28 | Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоны |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CU (1) | CU22054A1 (ru) |
RU (1) | RU1789525C (ru) |
-
1988
- 1988-12-12 CU CU1988200A patent/CU22054A1/es unknown
-
1989
- 1989-11-28 RU SU894763976A patent/RU1789525C/ru active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CU22054A1 (es) | 1993-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gutiérrez et al. | Isolation and characterization of a metalloproteinase with weak hemorrhagic activity from the venom of the snake Bothrops asper (terciopelo) | |
Barrett | Human cathepsin B1. Purification and some properties of the enzyme | |
Rindler-Ludwig et al. | Cationic proteins from human neutrophil granulocytes evidence for their chymotrypsin-like properties | |
Blombäck | Fibrinogen to fibrin transformation | |
Kincaid et al. | Differential expression of calmodulin-binding proteins in B, T lymphocytes and thymocytes | |
US5270176A (en) | Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin | |
Jahngen et al. | Aging and cellular maturation cause changes in ubiquitin-eye lens protein conjugates | |
Baba et al. | Activation of boar proacrosin is effected by processing at both N‐and C‐terminal portions of the zymogen molecule | |
McLay | Activities of cathepsins A and D in cod muscle | |
Barrabin et al. | Isolation and characterization of gyroxin from Crotalus durissus terrificus venom | |
Geiger et al. | The inhibition of human gingival collagenase by an inhibitor extracted from human teeth | |
RU1789525C (ru) | Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоны | |
De Haen et al. | Isolation and amino-terminal sequence analysis of a new pancreatic trypsinogen of the African lungfish Protopterus aethiopicus | |
Takahashi et al. | Distribution of proteinase inhibitors in snake venoms | |
Green et al. | The purification and properties of a single chicken pepsinogen fraction and the pepsin derived from it | |
AU618035B2 (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
牧之段保夫 et al. | Studies on fish muscle protease. VI. Separation of carp muscle cathepsins A and D, and some properties of carp muscle cathepsin A. | |
JEANNERET et al. | Carboxypeptidase N from pig serum | |
Nakar et al. | Isolation and characterization of a proteolytic factor from the venom of Vipera palaestinae | |
Fritz et al. | Trypsin-plasmin inhibitors from leeches: Isolation, amino acid composition, inhibitory characteristics | |
Ward | Properties of the major carboxypeptidase in the larvae of the webbing clothes moth, Tineola bisselliella | |
Cotter et al. | Purification and characterisation of an ‘elastase-like’enzyme from rabbit polymorphonuclear leucocytes | |
Srivastava | Characterization of a highly purified membrane proteinase from bovine lens | |
Nagasawa et al. | A simple method for purification of bovine plasminogen | |
Moroz-Perlmutter et al. | Biochemical and antigenic properties of a purified neurotoxin of Vipera palestinae venom |