RU1713265C

RU1713265C - Method of alkaline phosphatase preparation

Info

Publication number: RU1713265C
Authority: RU
Inventors: И.Ю. Сахаров; И.Е. Степанова
Original assignee: Научно-исследовательска лаборатори биологически активных веществ гидробионтов
Priority date: 1990-01-30
Filing date: 1990-01-30
Publication date: 1993-12-15

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии. Цель - повышение удельной активности фермента, упрощение способа и увеличение выхода. Ферментный препарат щелочной фосфатазы получают гомогенизацией тонкого кищечнмка тюлен экстракцией н-бутанолом, осаждением этанолом при конечной концентрации 55 - 65 об.% и хроматографичей<им разделением на иммобилизованных моноклональ- ных антителах против щелочной фосфатазы тюлен , продуцируемых и аммом гибридных культивируемых клеток АРР.1.ВКК(П) 377. причем элюирова- ние провод т растворами с рН 9,5 - 11.5. Удельна активность щелочной фосфатазы равна 19000 - 20800 ед/мг белка Выход по активноаи равен 90 -94%.The invention relates to biotechnology. The goal is to increase the specific activity of the enzyme, simplifying the method and increasing the yield. An alkaline phosphatase enzyme preparation is obtained by homogenization of a small intestine seal with n-butanol extraction, ethanol precipitation at a final concentration of 55-65 vol.% And chromatography <lt; them separation on immobilized monoclonal antibodies against alkaline phosphatase seals produced by amma hybrid cultured APP cells.1 . VKK (P) 377. moreover, the elution is carried out with solutions with a pH of 9.5 - 11.5. The specific activity of alkaline phosphatase is 19000 - 20800 units / mg of protein. The active yield is 90 -94%.

Description

Изобретение относитс к получению очищенной щелочной фосфатазы животного происхождени , котора находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе. Известна хроматографическа очистка щелочной фосфатазы на ионообменниках, несущих диэтиламиноэтильные и фосфатные группировки. Однако получаемый продукт piBnaflaeT низкой активностью, что сужает область его иёпользовани . Более перспектйбным, методом очистки вл етс аффинна хроматографи . Одним из примеров аффинной хроматографии вл етс иммуносорбци на иммобилизованных антителах против щелочной хроматографии на нерастворимых лектинах. Использу тот факт, что щелочна фосфатаза животного происхождени вл етс гликопротеидом, дл очистки щелочной фосфатазы был применен иммобилизованный конканавалин А. Хот последние два способа имеют очевидные преимущества перед остальными, удельна активность целевого продукта недостаточно высока и не превь1шает 20003000 единиц на 1 мг балка. Разумным сочетанием известных приемов можно повысить эту величину. В качестве прототипа выбран способ получени щелочной фосфатазы, который позвол ет получить наиболее высокую удельную активность целевого продукта. Данный способ включает следующие операции: печень быка отмьшали от крови 0,9%-ным раствором NaCI и гомогенизировали в 100 мРЛ трис-НС1, рН 7,6, содержащем 1мМ CaCIa, 1 MMMgCla, 0,02 мМ ZnS04 и 1 мМ MnCla. К гомoreнату добавл ли равный объем охлажденного до -20°С н-бутанола при посто нном перемешивании. По прошествии 40 мин смесь центрифугировали , к водному раствору добавл ли ацетон () до его конечной концентрации 30%. После центрифугировани осадок отбрасывали , а концентрацию ацетона в растворе повышали до 50%. Осадок раствор ли в 100 мМ трис-НС1, рН 7,6, содержащем 1 мМ , 1мМ MgGl2, 0,02 мМ ZnSO/i и 1 мМ MnCl2 и наносили на колонку с сефадексом G-150. Белок, обладающий фосфатазной активностью , очищали затем на колонке с DE Нугелем. В дальнейшем щелочную фосфатазу смешивали с конканавалин А-сефарозой 4В, а фермент злюировали с помощью а-метил-О-манопиранозида . Дальнейша очистка щелочной фосфатазы включала ионообменную хроматографию на моно О колонке (HR 5/5) и высокоэффективную обратнофазную хроматографию на дифенилкремнеземе (размер пор 50 нм). В результате получили препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью 7440 единиц на 1 мг белка; выхода 7-стадийной очистки составил 10%. Недостатком известного способа вл етс невысока удельна активность целевого продукта. Кроме того, существенным ограничением данного метода вл етс его многостадийность и низкий выход. Целью предлагаемого изобретени вл етс повышение удельной активности препарата щелочной фосфатазй, упрощение способа и увеличение выхода. Поставленна цель достигаетс тем, что ферглентный препарат получают гомогенизацией тонкого кишечника тюлен , после экстракции н-бутанолом осаждают этанолом при конечной концентрации 55-65 об.%, хроматографическое разделение осуществл ют на иммобилизованных моноклональных антителах против щелочной фосфатазы тюлен , секретируемых гибридными клетками АРР.1, причем элюирование провод т растворами с рН 9,5-11,5. В предложенном способе активность целевого препарата щелочной фосфатазы увеличиваетс до 19000-20800 единиц на 1 мг белка при одновременном сокращении числа стадий до трех и повышении выхода до 90-94%. Верхн граница конечной концентрации этанола при осаждении 65 об.% обусловлена тем, что при более высокой концентрации этанола, когда вс фосфатаза уже осаждена, происходит осаждение балластных белков, что приводит к уменьшению степени очистки. Нижн граница конечной концентрации этанола при осаждении 55 об.% обусловлена тем, что при более низкой концентрации этанола значительна часть фосфатазы остаетс в растворе, что приводит к уменьшению выхода. Верхн граница рН злюции обусловлена тем, что при рН 11,5 наблюдаетс количественна десорбци фермента с иммуносорбента, а дальнейшее повышение рН только приводит к денатурации как фермента , так и иммобилизованных антител. Нижн граница рН элюции обусловлена тем, что при рН ниже 9,5 резко понижаетс степень десорбируемости фермента с иммуносорбента, что приводит соответственно к низкому выходу очистки целевого продукта. Предлагаемый способ заключаетс в следующем: 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюлен размельчают и гомргенизируют в 25 мл 0,0.5 М трис-НС1, рНThe invention relates to the production of purified alkaline phosphatase of animal origin, which is used in genetic engineering, immunohistochemical procedures and enzyme immunoassay, research work. Chromatographic purification of alkaline phosphatase is known on ion exchangers carrying diethylaminoethyl and phosphate groups. However, the resulting piBnaflaeT product is of low activity, which narrows the scope of its use. A more promising purification method is affinity chromatography. One example of affinity chromatography is immunosorption on immobilized antibodies against alkaline chromatography on insoluble lectins. Using the fact that animal alkaline phosphatase is a glycoprotein, immobilized concanavalin A was used to purify alkaline phosphatase A. Although the last two methods have obvious advantages over the others, the specific activity of the target product is not high enough and does not exceed 20003000 units per 1 mg of beam. A reasonable combination of known techniques can increase this value. As a prototype, a method for producing alkaline phosphatase was selected, which allows to obtain the highest specific activity of the target product. This method includes the following operations: bovine liver was removed from the blood with a 0.9% NaCI solution and homogenized in 100 mRL Tris-HCl, pH 7.6, containing 1 mM CaCIa, 1 MMMgCla, 0.02 mM ZnS04 and 1 mM MnCla. An equal volume of n-butanol cooled to -20 ° C was added to the homogenate with constant stirring. After 40 minutes, the mixture was centrifuged, acetone () was added to the aqueous solution to a final concentration of 30%. After centrifugation, the precipitate was discarded, and the concentration of acetone in the solution was increased to 50%. The precipitate was dissolved in 100 mM Tris-HCl, pH 7.6, containing 1 mM, 1 mM MgGl2, 0.02 mM ZnSO / i and 1 mM MnCl2 and applied to a Sephadex G-150 column. A protein having phosphatase activity was then purified on a DE Nugel column. Subsequently, alkaline phosphatase was mixed with concanavalin A-Sepharose 4B, and the enzyme was glued with a-methyl-O-manopyranoside. Further purification of alkaline phosphatase included ion exchange chromatography on a mono O column (HR 5/5) and high performance reverse phase chromatography on diphenyl silica fume (pore size 50 nm). The result was an alkaline phosphatase preparation with a specific activity of 7440 units per 1 mg of protein; the yield of 7-stage purification was 10%. A disadvantage of the known method is the low specific activity of the target product. In addition, a significant limitation of this method is its multi-stage and low yield. The aim of the invention is to increase the specific activity of the alkaline phosphatase preparation, simplify the process and increase the yield. This goal is achieved by the fact that the fermented preparation is obtained by homogenization of the small intestine of seals, after extraction with n-butanol they precipitate with ethanol at a final concentration of 55-65 vol%, chromatographic separation is carried out on immobilized monoclonal antibodies against alkaline phosphatase of seals secreted by APP hybrid cells.1 moreover, the elution is carried out with solutions with a pH of 9.5-11.5. In the proposed method, the activity of the target alkaline phosphatase preparation is increased to 19000-20800 units per 1 mg of protein while reducing the number of stages to three and increasing the yield to 90-94%. The upper limit of the final ethanol concentration during the deposition of 65 vol.% Is due to the fact that, at a higher ethanol concentration, when all phosphatase has already been precipitated, ballast proteins are precipitated, which reduces the degree of purification. The lower limit of the final ethanol concentration during the deposition of 55 vol% is due to the fact that at a lower ethanol concentration a significant part of the phosphatase remains in solution, which leads to a decrease in yield. The upper limit of the pH of glutenia is due to the fact that at pH 11.5 a quantitative desorption of the enzyme from the immunosorbent is observed, and a further increase in pH only leads to denaturation of both the enzyme and immobilized antibodies. The lower boundary of the pH of the elution is due to the fact that at a pH below 9.5 the degree of desorption of the enzyme from the immunosorbent sharply decreases, which leads to a correspondingly low yield of purification of the target product. The proposed method is as follows: 25 g of freshly frozen small intestine of the seal is crushed and homogenized in 25 ml of 0.0.5 M Tris-HCl, pH

7.4.содержащем 2.5 мМ MgSO-i. К гомогенату добавл ют 80 мл н-бутанола л провод т экстракцию при 37С в течение 1.5 ч. Буганольную фазу отбрасывают, а 45 мл водного раствора диализуют против 1 л 0.05 М триоHCI . рН 7.4. содержащего 2.5 мМ MgS04. в течение 20 ч при 4°С. Буфер замен ют свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавл ют этанол (4°С)7.4. Containing 2.5 mM MgSO-i. 80 ml of n-butanol was added to the homogenate. Extraction was carried out at 37 ° C for 1.5 hours. The bouganol phase was discarded and 45 ml of the aqueous solution was dialyzed against 1 liter of a 0.05 M HCl trio. pH 7.4. containing 2.5 mm MgS04. for 20 hours at 4 ° C. The buffer was replaced with fresh buffer after 10 hours. Ethanol (4 ° C) was added to the resulting dialysate with stirring.

до конечной концентрации 55-65 об.%, выдерживают 30 мин при 4°С и осадок центрифугируют . Полученный осадок раствор ют в 20 мл 0.02 М трис-НС1,, рН 7.4. содержащем 10 мМ MgCl2 и 0.5 М NaCI, Раствор нанос т на колонку ( мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибриднымиклетками АРР.1 (коллекци клеточных культур Института цитологии АН СССР. Ленинград, номер 377Д), предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесени фермента гель отмывают 0,02 М трис-НС1. рН 7.4. содержащим 10 мМ MgCl2 и 0.5 М NaCI. до А280, равной 0.03-0,05. Фермент элюируют растворами с рН 9,5-11,5. Активные фракции объедин ли и определ ли ферментативную активность. Данный способ позвол ет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19000-20800 ед/мг белка; выход по активности равен 9094% . .to a final concentration of 55-65 vol.%, incubated for 30 min at 4 ° C and the precipitate was centrifuged. The resulting precipitate was dissolved in 20 ml of 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4. containing 10 mM MgCl2 and 0.5 M NaCl, the solution was applied to a column (ml) with immobilized monoclonal antibodies secreted by APP.1 hybrid cells (cell culture collection of the Institute of Cytology, USSR Academy of Sciences. Leningrad, number 377D), previously balanced with the same buffer. After applying the enzyme, the gel is washed with 0.02 M Tris-HCl. pH 7.4. containing 10 mM MgCl2 and 0.5 M NaCl. up to A280, equal to 0.03-0.05. The enzyme is eluted with solutions with a pH of 9.5-11.5. Active fractions were combined and enzymatic activity was determined. This method allows the preparation of alkaline phosphatase preparations with a specific activity of 19000-20800 units / mg protein; the activity yield is 9094%. .

П р и М е р 1. 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюлен размельчали и гомогенизировали в 25 мл 0.05 М трис-НС1, рН 7.4, содержащем 2.5 мМ MgSO. К гомогенату добавл ли ВО мл н-бутанола и проводили экстракцию при 37°С. в течение 1.5 ч. Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водного раствора диализовали против 1 л 0.05 М трис-НС1, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ MgS04, в течение 20 ч при 4°С. Буфер замен ли свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавл ли этанол (4°С) до конечной концентрации 55 об.%, выдерживали 30 мин при 4С и осадок центрифугировали. Полученный осадок раствор ли в 20 мл 0,02 М трис-НС1, рН 7.4, содержащем 10 мМ MgCl2 и 0.5 М MaCI. Раствор наносили на колонку ( мл) с иммобилизованными моноклональными антителами , секретируемыми гибридными клетками АРР.1 (коллекци клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград , номер 377 Д). предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесени фермента гель отмывали 0,02 М трис-НС1, рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCl2 и 0.5 М NaCI, до А280. равной 0.03-0.05. Фермент элюировали 0,05 М триэтиламином, рНPRI me R 1. 25 g of freshly frozen small intestine of the seal was crushed and homogenized in 25 ml of 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4, containing 2.5 mm MgSO. BO ml of n-butanol was added to the homogenate and extraction was carried out at 37 ° C. within 1.5 hours, the butanol phase was discarded, and 45 ml of the aqueous solution was dialyzed against 1 liter of 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4, containing 2.5 mM MgS04, for 20 hours at 4 ° C. The buffer was replaced with fresh buffer after 10 hours. Ethanol (4 ° C) was added to the resulting dialysate with stirring to a final concentration of 55 vol%, held for 30 min at 4 ° C and the precipitate was centrifuged. The resulting precipitate was dissolved in 20 ml of 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4, containing 10 mM MgCl2 and 0.5 M MaCl. The solution was applied to a column (ml) of immobilized monoclonal antibodies secreted by APP.1 hybrid cells (cell culture collection of the Institute of Cytology, USSR Academy of Sciences, Leningrad, No. 377 D). pre-balanced with the same buffer. After applying the enzyme, the gel was washed with 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4, containing 10 mM MgCl2 and 0.5 M NaCl, to A280. equal to 0.03-0.05. The enzyme was suirable 0.05 M triethylamine, pH

9.5.Активные фракции объедин ли и определ ли ферментативную активность по отношению к п-нитрофенилфосфату и концентрацию белка по Лоури. Данный способ позвол ет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19000 ед/мг белка, выход по активности равен 90%.9.5. The active fractions were combined and the enzymatic activity with respect to p-nitrophenyl phosphate and the Lowry protein concentration were determined. This method allows the production of alkaline phosphatase preparations with a specific activity of 19,000 units / mg of protein; the activity yield is 90%.

П р и М е р 2. 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюлен размельчали и гомогенизировали в 25 мл 0.05 М трис-НС1, рН 7.4, содержащем 2,5 мМ MgSO. К гомогенату добавл ли 80 мл н-бутанола и проводили экстракцию при 37°С в течение 1,5 ч. Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водного раствора диализовали против 1 л 0,05 М трис-НСГ. рН 7,4, содержащего 2,5 мМ MgSO-q, в течение 20 ч при 4°С. Буфер замен ли свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавл ли этанол (4°С) до конечной концентрации 65 об. %, выдерживали 30 мин при 4°С и осадок центрифугировали. Полученный осадок раствор ли в 20 мл 0,02 М трис-HCI. рН 7,4. содержащем 10 мМ MgClz и 0,5 М NaCI. Раствор наносили на колонку (v 10 мл) с иммобилизованными моноклональными антителами, секретируемыми гибридными клетками АРР.1 (коллекци клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград , номер 377Д), предварительно уравновешенны.ми тем же буфером. После нанесени фермента гель отмывали 0,02 М трис-НС1. рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCl2 и 0,5 М NaCI, до А280, равной 0,03-0,05. Фермент элюировали 0,5 М триэтиламином, рН 11.5. Активные фракции объедин ли и определ ли ферментативную активность по отношению к п-нитрофенилфосфату vi концентрацию белка по Лоури. Данный способ позвол ет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной активностью, равной 19460 ед/мг белка; выход по активности .равен 91%.PRI me R 2. 25 g of freshly frozen small intestine of the seal was crushed and homogenized in 25 ml of 0.05 M Tris-HC1, pH 7.4, containing 2.5 mm MgSO. 80 ml of n-butanol was added to the homogenate and extraction was carried out at 37 ° C for 1.5 hours. The butanol phase was discarded and 45 ml of the aqueous solution was dialyzed against 1 L of 0.05 M Tris-NSH. pH 7.4 containing 2.5 mM MgSO-q for 20 hours at 4 ° C. The buffer was replaced with fresh buffer after 10 hours. Ethanol (4 ° C) was added to the resulting dialysate with stirring to a final concentration of 65 vol. %, kept for 30 min at 4 ° C and the precipitate was centrifuged. The resulting precipitate was dissolved in 20 ml of 0.02 M Tris-HCI. pH 7.4. containing 10 mM MgClz and 0.5 M NaCl. The solution was applied to a column (v 10 ml) with immobilized monoclonal antibodies secreted by APP.1 hybrid cells (cell culture collection of the Institute of Cytology, USSR Academy of Sciences, Leningrad, number 377D), previously balanced with the same buffer. After applying the enzyme, the gel was washed with 0.02 M Tris-HCl. pH 7.4, containing 10 mM MgCl2 and 0.5 M NaCl, to A280 equal to 0.03-0.05. The enzyme was eluted with 0.5 M triethylamine, pH 11.5. The active fractions were combined and the enzyme activity for p-nitrophenylphosphate vi protein concentration was determined according to Lowry. This method allows the preparation of alkaline phosphatase preparations with a specific activity of 19,460 units / mg protein; the activity yield is 91%.

П р и М е р 3. 25 г свежезамороженного тонкого кишечника тюлен размельчали и гомогенизировали в 25 мл 0,05 М трис-HCI, рН 7.4. содержащем 2,5 мМ MgS04. К гомогенату добавл ли 80 мл н-бутанола и проводили экстракцию при 37°С в течение 1,5 ч. Бутанольную фазу отбрасывали, а 45 мл водного раствора диализовали против 1 л 0.05 М трис-HCI. рН 7.4, содержащего 2,5 мМ MgS04. в течение 20 ч при . Буфер замен ли свежим через 10 ч. К полученному диализату при перемешивании добавл ли этанол (4°С) до конечной концентрации 60 об.% выдерживали 30 мин при 4°С и осадок центрифугировали. Полученный осадок раствор лй в 20 мл 0,02 М трис-НС1, рН 7,4, содержащем 10 мМ MgCIa и 0,5 М NaCI. Раствор наносили на колонку (v 10 мл) с иммобилизованными моноклональными антителами , секретируемыми гибридными клетками АРР.1 (коллекци клеточных культур Института цитологии АН СССР, Ленинград , номер, 377 Д), предварительно уравновешенными тем же буфером. После нанесени фермента иммуносорбент отмывали 0,02 М трис-НС1, рН 7,4, содержащим 10 мМ MgCl2 и 0,5 М NaCi, до А280, равной 0.03-0,05. Фермент элюировали 0,05 М триэтйламином рН 10.3. Активные фракции объедин ли и определ ли ферментативную активность по отношению к п-нитрофенилфосфату и концентрацию белка по Лоури. Данный способ позвол ет получать препараты щелочной фосфатазы с удельной акФормула изобретени PRI me R 3. 25 g of freshly frozen small intestine of the seal was crushed and homogenized in 25 ml of 0.05 M Tris-HCI, pH 7.4. containing 2.5 mm MgS04. 80 ml of n-butanol was added to the homogenate and extraction was carried out at 37 ° C for 1.5 hours. The butanol phase was discarded and 45 ml of the aqueous solution was dialyzed against 1 L of 0.05 M Tris-HCI. pH 7.4 containing 2.5 mM MgS04. within 20 hours at. The buffer was replaced with fresh buffer after 10 hours. Ethanol (4 ° C) was added to the resulting dialysate with stirring, to a final concentration of 60 vol%, it was held for 30 min at 4 ° C and the precipitate was centrifuged. The resulting precipitate was dissolved in 20 ml of 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4, containing 10 mM MgCIa and 0.5 M NaCl. The solution was applied to a column (v 10 ml) with immobilized monoclonal antibodies secreted by APP.1 hybrid cells (cell culture collection of the Institute of Cytology, USSR Academy of Sciences, Leningrad, number, 377 D), previously equilibrated with the same buffer. After application of the enzyme, the immunosorbent was washed with 0.02 M Tris-HCl, pH 7.4, containing 10 mM MgCl2 and 0.5 M NaCi, to A280 of 0.03-0.05. The enzyme was eluted with 0.05 M triethylamine pH 10.3. The active fractions were combined and the enzymatic activity with respect to p-nitrophenylphosphate and the Lowry protein concentration were determined. This method allows to obtain alkaline phosphatase preparations with specific acFormula of the invention

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ. предусматривающий гомогенизацию сырь животного происхождени , экстракцию н-бутанолом, осаждение органическим растворителем и аффинную хроматографию, отличающийс тем, что. с целью повышени удельной активности фермента, упрощени способа и увеличе5 10 15 20METHOD FOR PRODUCING ALKALINE PHOSPHATASE. comprising the homogenization of animal feed, extraction with n-butanol, precipitation with an organic solvent, and affinity chromatography, characterized in that in order to increase the specific activity of the enzyme, simplify the method and increase 5 10 15 20

ни выхода, в качестве сырь используют п(. тонкий кишечник тюлен , осаждение ведут этанолом при конечной концентрации 55 65 об.%, аффинную хроматографию осуществл ют на иммобилизованных моноклональных антителах. продуцируемых 30 штаммом гибридных культивируемых клеtoK АРР.1 ВКК (П) Д 377, а элюирование провод т раствором с рН 9.5 -11,5. тивностью, равной 20800 ед/мг белка: выход по активности равен 94%. Таким образом, технико-экономический зффект предлагаемого способа заключаетс в увеличении активности целевого продукта щелочной фосфатазы. резком сокращении стадий очистки и повышении выхода. Это позвол ет создать простой и легко масштабируемый процесс выделени и очистки щелочной фосфатазы тюлен при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырь . (56) Авторское свидетельство СССР № 1426089, кл. С 12 N9/16. 1986. Авторское свидетельство СССР № 1554377, кл. С 12 N 9/16. 1988. Ниа J.-C.,Garattlnl Е.. Pan Y.-С.Е. etal. Arch. Blochem. Blophyis., 1985. v. 241. p. 380-385 - прототип.There is no way out, p (. small intestine of seal is used as raw material, precipitation is carried out with ethanol at a final concentration of 55 65 vol.%, affinity chromatography is performed on immobilized monoclonal antibodies produced by 30 strain of cultured cletoK APP.1 VKK (P) D 377 and elution is carried out with a solution with a pH of 9.5 -11.5, activity equal to 20800 units / mg of protein: the activity yield is 94%. Thus, the technical and economic effect of the proposed method consists in increasing the activity of the target alkaline phosphatase product. shortening of the cleaning stages and increasing the yield, this allows creating a simple and easily scalable process for the isolation and purification of alkaline phosphatase of seals at low cost of materials, working and technological time and raw materials. (56) USSR Author's Certificate No. 1426089, class C 12 N9 / 16 1986. USSR author's certificate No. 1554377, class C 12 N 9/16. 1988. Nia J.-C., Garattlnl E. .. Pan Y.- C.E. etal. Arch. Blochem. Blophyis., 1985. v. 241. p. 380-385 is a prototype.