RU144458U1

RU144458U1 - DEVICE FOR CONVECTION POLYMERASE CHAIN REACTION

Info

Publication number: RU144458U1
Application number: RU2013154623/10U
Authority: RU
Inventors: Максим Геннадьевич Куцев; Михаил Викторович Скапцов; Всеволод Владиславович Щербинин
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "МВМ-Диагностик"
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2014-08-20

Abstract

Полезная модель относится к биотехнологии. Предложено устройство для проведения конвекционной полимеразной цепной реакции. Устройство состоит из реакционной ячейки, с возможностью охлаждения воздухом в верхней части, и нижнего нагревающего элемента. Нижний нагревающий элемент имеет сквозное отверстие, образующее канал для размещения в нем реакционной ячейки. Высота нагревающего элемента составляет не более 1/2 высоты реакционной ячейки, а соотношение диаметра реакционной ячейки к её высоте составляет от 3:1 до 1:7. Предложенная полезная модель позволяет ускорить формирование конвекционных потоков и их упорядочивания, обеспечить протекание полимеразной цепной реакции с сохранением высокой специфичности и скорости протекания реакции по всему объёму реакционной смеси. 1 н. и 1 з.п.ф-лы, 2 ил. The utility model relates to biotechnology. A device for convection polymerase chain reaction. The device consists of a reaction cell, with the possibility of air cooling in the upper part, and a lower heating element. The lower heating element has a through hole forming a channel for accommodating a reaction cell therein. The height of the heating element is not more than 1/2 the height of the reaction cell, and the ratio of the diameter of the reaction cell to its height is from 3: 1 to 1: 7. The proposed utility model makes it possible to accelerate the formation of convection flows and their ordering, to ensure the occurrence of the polymerase chain reaction while maintaining high specificity and the rate of the reaction throughout the entire volume of the reaction mixture. 1 n and 1 C.p. f-ls, 2 ill.

Description

Полезная модель относится к области молекулярной биологии и биотехнологиям и предназначена для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а именно конвекционной ПЦР. Устройство может быть использовано при проведении ДНК-диагностики, в том числе в полевых условиях, в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья и т.д.The utility model relates to the field of molecular biology and biotechnology and is intended for polymerase chain reaction (PCR), namely convection PCR. The device can be used during DNA diagnostics, including in the field, in medicine, veterinary medicine, sanitary and epidemiological studies to detect pathogens of dangerous infections, including possible bioterrorist attacks, in forensics to identify criminals, in the food industry when identifying food from genetically modified organisms, determining the quality of raw materials, etc.

ПЦР представляет собой хорошо известный технологический процесс для амплификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Процесс ПЦР состоит из трех основных этапов: денатурации, отжига праймеров и элонгации (удлинения), которые проходят в реакционной смеси в пробирке при разных температурах. Требуемые температуры на стадии денатурации обычно находится в диапазоне между 90°C и 97°. Требуемые температуры для отжига праймеров зависят от структуры используемого праймера и состава реакционной смеси. Как правило, температура отжига составляет от 35°C до 65°C. Температура на стадии удлинения обычно составляет около 72°C. Для проведения ПЦР обычно необходима циклическая смена температур от 10 до 50 раз. Реакционная смесь для проведения ПЦР обычно содержит ДНК-матрицу с которой копируются фрагменты ДНК; термостабильную полимеразу; праймеры, ограничивающие амплифицируемый фрагмент; дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTPs) для построения амплифицируемых фрагментов; в качестве растворителя используется вода. Также реакционная смесь может содержать стабилизирующие вспомогательные вещества, соли для поддержания ионной силы раствора и зонды для детекции результатов полимеразной цепной реакции в реальном времени. Классическую ПЦР проводят путем циклического изменения температуры пробирки с помощью программируемого термостата (ДНК-амплификатора или термоциклера) (Европейский патент EP 0488769 A2). Недостатком данного способа является сложность устройства, определяемая необходимостью точного поддержания температуры в динамическом режиме и использования полупроводникового охладителя. Также классические амплификаторы имеют высокий уровень энергопотребления и значительную продолжительность работы из-за невозможности мгновенного изменения температуры термостатируемого блока и пробирки. Продолжительность классической полимеразной цепной реакции состоящей из 30 циклов составляет от 1 до 2-х часов. Результаты ПЦР обнаруживают путем проведения электрофореза ДНК и последующего окрашивания или в режиме реального времени - путем добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя или зондов и измерения уровня флуоресценции в ходе реакции.PCR is a well-known process for the amplification of specific nucleic acid sequences. The PCR process consists of three main stages: denaturation, annealing of primers and elongation (elongation), which take place in the reaction mixture in vitro at different temperatures. The required temperatures during the denaturation step are usually in the range between 90 ° C and 97 °. The required temperatures for annealing the primers depend on the structure of the primer used and the composition of the reaction mixture. Typically, the annealing temperature is between 35 ° C and 65 ° C. The temperature at the extension stage is usually about 72 ° C. For PCR, a cyclic change in temperature from 10 to 50 times is usually necessary. The PCR reaction mixture usually contains a DNA template from which DNA fragments are copied; thermostable polymerase; primers limiting the amplified fragment; deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) for constructing amplifiable fragments; water is used as a solvent. Also, the reaction mixture may contain stabilizing auxiliary substances, salts to maintain the ionic strength of the solution, and probes for detecting the results of the polymerase chain reaction in real time. Classical PCR is carried out by cyclically changing the temperature of the tube using a programmable thermostat (DNA amplifier or thermal cycler) (European patent EP 0488769 A2). The disadvantage of this method is the complexity of the device, determined by the need to accurately maintain the temperature in dynamic mode and the use of a semiconductor cooler. Also, classic amplifiers have a high level of energy consumption and a significant duration of operation due to the impossibility of instantaneous temperature changes in a thermostatically controlled unit and test tube. The duration of the classical polymerase chain reaction consisting of 30 cycles is from 1 to 2 hours. PCR results are detected by DNA electrophoresis and subsequent staining, or in real time — by adding an intercalating dye or probes to the reaction mixture and measuring the level of fluorescence during the reaction.

Другим способом является конвекционная ПЦР. Ее обычно проводят путем постоянного нагрева нижней части реакционного сосуда до температуры денатурации ДНК (около 95°C) и постоянного поддержания температуры верхней части реакционного сосуда на уровне, достаточном для отжига праймеров (от 35°C до 65°C). В результате этого появляются конвекционные потоки смеси из-за различной плотности охлажденной и нагретой жидкости и циклическое изменение температуры реакционной смеси, происходит при контакте со стенками пробирки с различной температурой в ходе конвекционного перемещения жидкости. Скорость изменения температур реакционной смеси в конвекционной ПЦР очень высока и продолжительность реакции обычно составляет от 5 до 60 мин. Результаты ПЦР обнаруживают путем проведения электрофореза ДНК и последующего окрашивания или в режиме реального времени - путем добавления в реакционную смесь интеркалирующего красителя или зондов и измерения уровня флуоресценции в ходе реакции (Патент США US 20130109021).Another method is convection PCR. It is usually carried out by constantly heating the lower part of the reaction vessel to a temperature of DNA denaturation (about 95 ° C) and constantly maintaining the temperature of the upper part of the reaction vessel at a level sufficient to anneal the primers (from 35 ° C to 65 ° C). As a result of this, convection flows of the mixture appear due to different densities of the cooled and heated liquids and a cyclic change in the temperature of the reaction mixture occurs upon contact with the walls of the tubes with different temperatures during convection movement of the liquid. The rate of change in temperature of the reaction mixture in convection PCR is very high and the reaction time is usually from 5 to 60 minutes. PCR results are detected by DNA electrophoresis and subsequent staining, or in real time — by adding an intercalating dye or probes to the reaction mixture and measuring the level of fluorescence during the reaction (US Patent US 20130109021).

Основной проблемой при проектировании устройств для проведения конвекционной ПЦР является организация одновременного поддержания различных температур в реакционном сосуде. При этом должно обеспечиваться достаточное для протекания реакции время нахождения молекул ДНК в разных температурных зонах.The main problem in the design of devices for convection PCR is the organization of the simultaneous maintenance of various temperatures in the reaction vessel. In this case, sufficient time for the course of the reaction of the presence of DNA molecules in different temperature zones should be provided.

Известно устройство для выполнения изотермической ПЦР (патент US 20050074782; МПК C12M 1/34, C12P 19/34, C12M 1/38, C12Q 1/68, C12M 1/02, C12M 1/36; опубл. 07.04.2005), содержащее пробирку с раствором биомолекул, плоский источник тепла, находящийся в нижней части сосуда, и источник охлаждения, находящийся в верхней части сосуда. Недостатком, обусловленным конструкцией данного устройства, является сплошное нагревание нижней части реакционного сосуда, что усложняет формирование конвекционных потоков и приводит к затруднению перемешивания жидкости и нарушению протекания реакции во всем объеме.A device for performing isothermal PCR is known (patent US 20050074782; IPC C12M 1/34, C12P 19/34, C12M 1/38, C12Q 1/68, C12M 1/02, C12M 1/36; publ. 07.04.2005), containing a test tube with a solution of biomolecules, a flat heat source located in the lower part of the vessel, and a cooling source located in the upper part of the vessel. The disadvantage due to the design of this device is the continuous heating of the lower part of the reaction vessel, which complicates the formation of convection flows and makes it difficult to mix the liquid and disrupt the reaction in the whole volume.

Наиболее близким к заявляемому по технической сути является устройство для выполнения изотермической ПЦР (патент US 2013019021; МПК B01L 7/00; опубл. 02.05.2013), содержащее пробирку с реакционной смесью, верхний и нижний элементы, которые могут нагревать или охлаждать, при этом сквозное отверстие верхнего и глухое отверстие нижнего элемента образуют канал, в который вставляется реакционный сосуд. Недостатком данного устройства является то, что классическая ячейка Бенара, используемая в данном техническом решении, характеризуется "турбулентным хаосом" и наличием "мертвых зон", что затрудняет перемещение жидкости и не обеспечивает достаточное для протекания реакции время нахождения молекул ДНК в разных температурных зонах, что нарушает равномерность протекания процесса.Closest to the claimed technical essence is a device for performing isothermal PCR (patent US 2013019021; IPC B01L 7/00; publ. 05/02/2013) containing a tube with the reaction mixture, the upper and lower elements that can heat or cool, while the through hole of the upper and the blind hole of the lower element form a channel into which the reaction vessel is inserted. The disadvantage of this device is that the classical Benard cell used in this technical solution is characterized by "turbulent chaos" and the presence of "dead zones", which makes it difficult to move the liquid and does not provide enough time for the DNA molecules to stay in different temperature zones, which violates the uniformity of the process.

Задачей заявляемой полезной модели является создание устройства для проведения конвекционной ПЦР, способного поддерживать различные температурные режимы в различных зонах реакционной ячейки с одновременным обеспечением перемещения реагента через эти зоны со скоростью, необходимой для протекания реакции в каждой из них.The objective of the claimed utility model is to create a device for convection PCR, capable of supporting various temperature conditions in different zones of the reaction cell while ensuring the movement of the reagent through these zones at a speed necessary for the reaction to occur in each of them.

Технический результат полезной модели состоит в формировании упорядоченных конвекционных потоков, обеспечивающих протекание ПЦР с сохранением высокой специфичности реакции.The technical result of the utility model consists in the formation of ordered convection flows that ensure the occurrence of PCR while maintaining a high specificity of the reaction.

Заявляемый технический результат достигается за счет того, что устройство для проведения конвекционной полимеразной цепной реакции, состоит из реакционной ячейки и нижнего нагревающего элемента, при этом нижний нагревающий элемент имеет сквозное отверстие, образующее канал, в который вставляется реакционная ячейка, а соотношение диаметра реакционной ячейки и ее высоты составляет 3:1 до 1:7 и толщина нагревательного элемента по крайней мере равна или меньше ½ высоты реакционной ячейки.The claimed technical result is achieved due to the fact that the device for convection polymerase chain reaction consists of a reaction cell and a lower heating element, while the lower heating element has a through hole forming a channel into which the reaction cell is inserted, and the ratio of the diameter of the reaction cell and its height is 3: 1 to 1: 7 and the thickness of the heating element is at least equal to or less than ½ the height of the reaction cell.

Техническая сущность предлагаемой полезной модели поясняется чертежом, на котором схематично приведен вид устройства сбоку (фиг. 1). Устройство содержит реакционную ячейку 1 для реакционной смеси, нижний нагревающий элемент 2.The technical essence of the proposed utility model is illustrated by the drawing, which schematically shows a side view of the device (Fig. 1). The device contains a reaction cell 1 for the reaction mixture, the lower heating element 2.

Заявляемое устройство работает следующим образом. В реакционную ячейку 1 помещают реакционную смесь, при этом осуществляют кольцевой нагрев нижней части с помощью нагревающего элемента 2 до температуры денатурации ДНК, верхняя же часть ячейки охлаждается при помощи потока воздуха. При этом в реакционной ячейки появляются тороидальные конвекционные потоки, обеспечивающие необходимую смену температур реакционной смеси. Для установления тороидальных конвекционных потоков соотношение диаметра реакционной ячейки и ее высоты от 3:1 до 1:7. Нагревающий элемент представляет из себя пластину с отверстием, изготовленную из материала с высокой теплопроводностью (например, металла), постоянная температура которого поддерживается посредством температурного контроллера и электрического нагревателя (например, пленочного, полупроводникового, графитового, керамического или проволочного). Температура нагревающего элемента поддерживается постоянной на уровне необходимом для денатурации ДНК.The inventive device operates as follows. The reaction mixture is placed in the reaction cell 1, and the lower part is heated annularly with the help of the heating element 2 to the DNA denaturation temperature, while the upper part of the cell is cooled by an air stream. In this case, toroidal convection flows appear in the reaction cell, providing the necessary change in temperature of the reaction mixture. To establish toroidal convection flows, the ratio of the diameter of the reaction cell and its height is from 3: 1 to 1: 7. The heating element is a plate with a hole made of a material with high thermal conductivity (for example, metal), whose constant temperature is maintained by means of a temperature controller and an electric heater (for example, film, semiconductor, graphite, ceramic or wire). The temperature of the heating element is kept constant at the level necessary for DNA denaturation.

Также данное устройство может быть дополнено верхним охлаждающим элементом (фиг. 2). В данном случае устройство содержит реакционную ячейку 1 для реакционной смеси, верхний охлаждающий элемент 2, нижний нагревающий элемент 3 и теплоизолирующую вставку 4. Нагревающий элемент представляет из себя пластину с отверстием, изготовленную из материала с высокой теплопроводностью (например, металла). Таким образом увеличивается теплоотдача верхней части реакционной ячейки за счет лучшего теплоотвода.Also, this device can be supplemented with an upper cooling element (Fig. 2). In this case, the device comprises a reaction cell 1 for the reaction mixture, an upper cooling element 2, a lower heating element 3, and a heat insulating insert 4. The heating element is a plate with an aperture made of a material with high thermal conductivity (for example, metal). Thus, the heat transfer of the upper part of the reaction cell is increased due to better heat removal.

Температура в нижней части реакционной ячейки зависит от толщины нагревателя, его температуры и теплопроводности стенок реакционной ячейки. Температура в верхней части реакционной ячейки зависит от площади контакта с охлаждающей средой (воздухом), ее температуры и теплопроводности стенок реакционного сосуда. В реакционной ячейке таким образом формируется градиент температуры от высокой в нижней части до низкой в верхней части. При этом площадь нагрева должна быть, по крайней мере, равна или меньше площади охлаждаемой части реакционной ячейки, что определяется толщиной нагревающего элемента и высотой реакционной ячейки. В противном случае происходит перегрев реакционной ячейки и в верхней ее части температура превышает необходимую для отжига праймеров, что препятствует протеканию ПЦР. В реакционной смеси, содержащей матрицу ДНК, олигонуклеотидные праймеры, зонды, dNTPs, буферный раствор для ПЦР, термостабильную полимеразу образуются конвекционные потоки за счет изменения плотности при нагреве в нижней части и охлаждения в верхней части через стенки реакционной ячейки, при этом температура реакционной смеси в нижней части достигает температуры денатурации ДНК, а в верхней части температуры отжига праймеров. Температуру в верхней части реакционной смеси можно менять (для оптимизации отжига праймеров) путем изменения взятого объема смеси. Эмпирическим путем выявлено, что соотношение геометрических размеров нагревателя и реакционной ячейки, указанные выше позволяют достичь градиента температур, необходимого для протекания реакции с разными типами матрицы и праймеров с различными температурами отжига в широких пределах.The temperature in the lower part of the reaction cell depends on the thickness of the heater, its temperature and the thermal conductivity of the walls of the reaction cell. The temperature in the upper part of the reaction cell depends on the area of contact with the cooling medium (air), its temperature and the thermal conductivity of the walls of the reaction vessel. In this way, a temperature gradient is formed in the reaction cell from high in the lower part to low in the upper part. Moreover, the heating area should be at least equal to or less than the area of the cooled part of the reaction cell, which is determined by the thickness of the heating element and the height of the reaction cell. Otherwise, the reaction cell overheats and in its upper part the temperature exceeds the temperature necessary for primer annealing, which prevents the PCR from proceeding. In a reaction mixture containing a DNA matrix, oligonucleotide primers, probes, dNTPs, a PCR buffer solution, thermostable polymerase, convection flows are formed due to a change in density during heating in the lower part and cooling in the upper part through the walls of the reaction cell, while the temperature of the reaction mixture in the lower part reaches the temperature of DNA denaturation, and in the upper part of the annealing temperature of the primers. The temperature in the upper part of the reaction mixture can be changed (to optimize the annealing of the primers) by changing the taken volume of the mixture. Empirically, it has been found that the ratio of the geometric dimensions of the heater and the reaction cell indicated above makes it possible to achieve the temperature gradient necessary for the reaction to occur with different types of matrix and primers with various annealing temperatures over a wide range.

Таким образом, в данном устройстве происходит кольцевой нагрев нижней части реакционный ячейки, что ускоряет формирование конвекционных потоков и их упорядочивание, обеспечивая протекание ПЦР с сохранением высокой специфичности и скорости протекания реакции по всему объему реакционной смеси.Thus, in this device, ring heating of the lower part of the reaction cell takes place, which accelerates the formation of convection flows and their ordering, ensuring the occurrence of PCR while maintaining high specificity and reaction rate throughout the entire volume of the reaction mixture.

Claims

1. A device for convection polymerase chain reaction, consisting of a reaction cell, with the possibility of air cooling in the upper part, and a lower heating element, characterized in that the lower heating element has a through hole forming a channel to accommodate a reaction cell in it, the height of the heating element is not more than 1/2 the height of the reaction cell, and the ratio of the diameter of the reaction cell to its height is from 3: 1 to 1: 7.

2. The device according to claim 1, characterized in that in the upper part of the reaction cell there is a cooling element, which is separated from the lower heating element by a heat insulating insert.