RU128761U1

RU128761U1 - LAYOUT OF PHYSIOLOGICAL MICROSENSOR SYSTEM BASED ON NERVOUS CELLS

Info

Publication number: RU128761U1
Application number: RU2012143842/14U
Authority: RU
Inventors: Константин Владимирович Анохин; Ася Магомедовна Азиева; Михаил Сергеевич Бурцев; Илья Иванович Киселев; Ольга Александровна Минеева; Анна Львовна Суханова
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2012-10-15
Publication date: 2013-05-27

Abstract

Полезная модель относится к лабораторному оборудованию для проведения исследований в области медицины и физиологии. Заявлена микросенсорная система, служащая для регистрации активности нейрональных культур. Система содержит микроскоп с помещенной в него матрицей с культурой нервных клеток, блок регистрации генерируемой нервными клетками электрической активности и генератор стимулирующих импульсов. Микроскоп выполнен с возможностью фотографической цифровой регистрации флуоресцентного свечения нервных клеток, а матрица с культурой нервных клеток связана с упомянутым блоком регистрации и генератором стимулирующих импульсов. The utility model relates to laboratory equipment for research in the field of medicine and physiology. A microsensory system is claimed, which is used to register the activity of neuronal cultures. The system contains a microscope with a matrix of nerve cell culture placed in it, a unit for recording electrical activity generated by nerve cells, and a stimulating pulse generator. The microscope is made with the possibility of photographic digital registration of the fluorescence of the nerve cells, and the matrix with the culture of nerve cells is connected with the aforementioned registration unit and a stimulating pulse generator.

Description

Полезная модель относится к лабораторному оборудованию для проведения исследований в области медицины и физиологии.The utility model relates to laboratory equipment for research in the field of medicine and physiology.

Развитие и совершенствование подходов к диагностике и лечению заболеваний нервной системы определяется перспективными методами исследования электрической и биохимической активности мозга. Сегодня, для эффективного поиска новых подходов к лечению заболеваний нервной системы, кроме таких традиционных методов, как, например, электроэнцефалография (ЭЭГ) необходимы методы, позволяющие максимально детально и полно исследовать нормальную и патологическую функциональную активность нейронов на микроуровне. В последние годы для решения этой задачи широко используются монослойные культуры нейронов in vitro.The development and improvement of approaches to the diagnosis and treatment of diseases of the nervous system is determined by promising methods for studying the electrical and biochemical activity of the brain. Today, in order to effectively search for new approaches to the treatment of diseases of the nervous system, in addition to traditional methods such as electroencephalography (EEG), methods are needed that allow the most detailed and complete investigation of the normal and pathological functional activity of neurons at the micro level. In recent years, in vitro monolayer cultures of neurons have been widely used to solve this problem.

В нейрональных культурах диссоциированные клетки, выращиваемые на плоской подложке, способны выпускать отростки, формировать синапсы и создавать нервные сети. Монослойные нейрональные культуры in vitro все чаще рассматриваются как инструмент для исследования функционального ответа нервных сетей на аппликацию активных веществ, позволяющий закрыть разрыв между высокопроизводительными подходами геномики и протеомики с одной стороны и животными моделями с другой.In neuronal cultures, dissociated cells grown on a flat substrate are able to release processes, form synapses and create nerve networks. In vitro monolayer neuronal cultures are increasingly viewed as a tool for studying the functional response of nerve networks to the application of active substances, which allows closing the gap between high-performance approaches of genomics and proteomics on the one hand and animal models on the other.

Нейрональные культуры достаточно компактны, и как следствие, полностью доступны для детальных исследований всем арсеналом методов современной клеточной биологии. При этом они достаточно сложны, что обеспечивает их высокую физиологическую адекватность как модели нервной ткани. Подбор условий культивирования позволяет сохранить тканеспецифичность и поддержать гистотипический состав рецепторов родительской ткани. Это дает возможность исследовать in vitro вещества, действующие на возбуждающие, тормозные и модуляторные рецепторные системы в физиологически релевантных моделях. Современные подходы к исследованию культур нейронов in vitro делятся на две группы. К первой группе относятся многочисленные методы флуоресцентной микроскопии, а ко второй - методы многоканальной регистрации на планарных мультиэлектродных матрицах. Обе группы методов обычно используются по отдельности, хотя их комбинация позволяет получить качественно новую информацию о соотношении электрической активности нейронов с внутриклеточными процессами.Neuronal cultures are quite compact, and as a result, are fully accessible for detailed research by the whole arsenal of methods of modern cell biology. Moreover, they are quite complex, which ensures their high physiological adequacy as a model of nervous tissue. The selection of cultivation conditions allows preserving tissue specificity and supporting the histotypic composition of the parent tissue receptors. This makes it possible to study in vitro substances acting on excitatory, inhibitory and modulatory receptor systems in physiologically relevant models. Modern approaches to the study of cultures of neurons in vitro are divided into two groups. The first group includes numerous methods of fluorescence microscopy, and the second - methods of multichannel registration on planar multi-electrode arrays. Both groups of methods are usually used separately, although their combination allows to obtain qualitatively new information on the ratio of the electrical activity of neurons with intracellular processes.

В последние время предприняты попытки создания систем, объединяющих оптическую флуоресцентную и электрическую мультиэлектродную регистрацию. Так, Ito D. et al (Immunostaining for Identification of Neuronal-Impulse Pathway on Multielectrode Arrays // MEA Meeting 2008, c.53) использовал флуоресцентную иммуногистохимию с клеточными маркерами нейронов, что позволило идентифицировать пути передачи импульсов в сети нервных клеток, культивируемых на мультиэлектродной матрице. Комбинация электрофизиологической записи с высоким разрешением и иммунофлуоресцентной детекции дифференциированных нервных клеток с помощью антител к NeuN и МАР2 позволила Flavell, S.W. et al (Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 2008. V.31. P.563-90) выделить микро-сети нейронов с синхронной активностью.Recently, attempts have been made to create systems combining optical fluorescence and electric multi-electrode recording. So, Ito D. et al (Immunostaining for Identification of Neuronal-Impulse Pathway on Multielectrode Arrays // MEA Meeting 2008, p. 53) used fluorescence immunohistochemistry with cell markers of neurons, which made it possible to identify transmission pathways of pulses in nerve cell networks cultured on multi-electrode matrix. The combination of high resolution electrophysiological recordings and immunofluorescence detection of differentiated nerve cells using antibodies to NeuN and MAP2 allowed Flavell, S.W. et al (Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 2008. V.31. P.563-90) identify micro-networks of neurons with synchronous activity.

Однако, в указанных системах использована иммунофлуоресцентная детекция морфологического фенотипа клеток, культивируемых на мультиэлектродных матрицах, а не их функционального состояния или геномной активности. Вместе с тем, именно механизмы геномной активации нейронов при тех или иных физиологических или химических воздействиях составляют основу нейрональной пластичности, как одного их ведущих признаков функционирования нервной системы в норме и патологии. Анализ этих клеточных механизмов требует выявления процессов индуцированной внешними воздействиями экспрессии генов. В частности, показано, что молекулярным маркером, позволяющим выделить нейроны, участвующие в обучении, является активация экспрессии гена c-fos, кодирующего индуцируемый транскрипционный фактов (см., например, Анохин К.В. Молекулярные сценарии консолидации долговременной памяти //Журн. высш. нервн. деят. им. И.П.Павлова 1997. Т. 47. С.262-286; Okuno Н., Regulation and function of immediate-early genes in the brain: Beyond neuronal activity markers. // Neurosci.Res. 2011, doi: 10.1016/j.neures.2010.12.007 и др.).However, in these systems, immunofluorescence detection of the morphological phenotype of cells cultured on multi-electrode arrays, rather than their functional state or genomic activity, was used. However, it is the mechanisms of genomic activation of neurons under certain physiological or chemical influences that form the basis of neuronal plasticity, as one of the leading signs of the functioning of the nervous system in normal and pathological conditions. The analysis of these cellular mechanisms requires the identification of processes induced by external influences of gene expression. In particular, it is shown that the molecular markers, allowing to allocate neurons involved in learning, gene expression is activation of c-fos, encoding inducible transcription facts (see., E.g., K. Molecular Anohin scenario term memory consolidation // Zh. Executive Pavlov N.N. 1997. Vol. 47. S.262-286; N. Okuno, Regulation and function of immediate-early genes in the brain: Beyond neuronal activity markers. // Neurosci.Res . 2011, doi: 10.1016 / j.neures.2010.12.007, etc.).

Таким образом, задачей, решаемой в рамках настоящей заявки, является создание таких гибридных физиологических микросенсорных систем на основе нервных клеток, культивируемых на мультиэлектродных матрицах, которые способны детектировать сигналы как клеточной, так и внутриклеточной активности, при этом результат, достигаемый при решении такой задачи, состоит в расширении возможностей исследования пластичности мозга, диагностики и лечения заболеваний нервной системы, в частности, в повышении эффективности исследований физиологической активности нервных клеток в мискросенсорных системах, разработке новых тест систем для клеточной диагностики заболеваний нервной системы, разработке новых технологий скрининга кандидатных соединений для лечения заболеваний нервной системы.Thus, the task to be solved within the framework of this application is the creation of such hybrid physiological microsensor systems based on nerve cells cultured on multi-electrode arrays that are capable of detecting signals of both cellular and intracellular activity, while the result achieved by solving this problem, consists in expanding the possibilities of studying brain plasticity, diagnosing and treating diseases of the nervous system, in particular, in increasing the effectiveness of physiological studies ktivnosti nerve cells in miskrosensornyh systems, development of new test systems for cell diagnosis of diseases of the nervous system, the development of new technologies for screening candidate compounds for the treatment of diseases of the nervous system.

Для достижения поставленного результата предлагается микросенсорная система, служащая для регистрации активности нейрональных культур, содержащая микроскоп с помещенной в него матрицей с культурой нервных клеток, блок регистрации генерируемой нервными клетками электрической активности и генератор стимулирующих импульсов, при этом микроскоп выполнен с возможностью фотографической цифровой регистрации флуоресцентного свечения нервных клеток, а матрица с культурой нервных клеток связана с упомянутыми блоком регистрации и генератором стимулирующих импульсов.To achieve the result, a microsensor system is proposed, which serves to record the activity of neuronal cultures, containing a microscope with a matrix placed in it with a culture of nerve cells, a unit for recording electrical activity generated by nerve cells and a stimulating pulse generator, while the microscope is made with the possibility of photographic digital recording of fluorescence nerve cells, and the matrix with the culture of nerve cells is connected with the mentioned block registration and generator th stimulating pulses.

Ниже представлен вариант конкретного воплощения заявленной системы.Below is a variant of a specific embodiment of the claimed system.

В общем виде, предлагаемая система обеспечивает одновременную регистрацию электрической активности и экспрессии генов в нейрональной культуре. С учетом поставленных задача, основными компонентами системы являются собственно нейрональная культура, микроскоп, обеспечивающий имиджинг флуоресцентных молекулярных маркеров с клеточным разрешением и установка для многоканальной регистрации электрической активности, генерируемой нервными клетками, и стимуляции нейронов in vitro (согласно формуле полезной модели - блок регистрации и стимуляции генерируемой нервными клетками электрической активности).In general terms, the proposed system provides simultaneous registration of electrical activity and gene expression in neuronal culture. In view of the task, the main components of the system are the neuronal culture itself, a microscope that provides imaging of fluorescent molecular markers with cell resolution and an installation for multichannel recording of electrical activity generated by nerve cells and stimulation of neurons in vitro (according to the formula of the utility model, the registration and stimulation unit generated by nerve cells electrical activity).

В качестве установки может быть использована, например, установка производства компании Multichannel Systems (Германия). Установка управляется посредством рабочей станции при помощи пакета программного обеспечения, обеспечивающего регистрацию электрической активности клеток, выбор электродов и управление стимуляцией, генерацию и загрузку паттернов стимуляции, а также управление термостатом, в который помещена культура клеток. При регистрации электрической активности возможен вывод изображения расположения клеток относительно электродов поверх фотоизображения матрицы с той культурой, с которой производится эксперимент.As an installation, for example, an installation manufactured by Multichannel Systems (Germany) can be used. The installation is controlled by a workstation using a software package that records the electrical activity of cells, selects electrodes and controls stimulation, generates and loads stimulation patterns, and controls the thermostat in which the cell culture is placed. When registering electrical activity, it is possible to display an image of the location of the cells relative to the electrodes on top of the photo image of the matrix with the culture with which the experiment is performed.

В качестве микроскопа может быть использован стереомикроскоп по схеме Аббе, предназначенный для визуального наблюдения увеличенного трехмерного изображения объекта и цифровой регистрации данного изображения. Система анализа и обработки изображения микроскопа содержит цветную цифровую видео камеру высокого разрешения с охлаждением Пелтье, с возможностью получения изображений непосредственно с цифровой камеры, установленной на микроскопе и сохранение их в распространенных форматах.As a microscope, a stereo microscope can be used according to the Abbe scheme, designed for visual observation of an enlarged three-dimensional image of an object and digital recording of this image. The microscope image analysis and processing system contains a high-resolution color digital video camera with Peltier cooling, with the ability to obtain images directly from a digital camera mounted on a microscope and save them in common formats.

Обобщенный пример использования микросенсорной системы может выглядеть следующим образом. Нервные клетки извлекаются из мозга новорожденного трансгенного животного и высаживаются на мультиэлектродную матрицу. После 3-х недель в инкубаторе, необходимых для созревания нейрональной культуры, мультиэлектродная матрица, с высаженными клетками, помещается в установку. Посредством стимулятора нейроны в культуре стимулируются по заданному протоколу с одновременной регистрацией электрической активности при помощи блока регистрации и флуоресценции при помощи микроскопа. Затем в культуру добавляется исследуемое нейроактивное вещество и описанная выше процедура стимуляции и регистрации повторяется. Сравнение электрического и геномного откликов на стимуляцию до и после воздействия на культуру нейроактивным веществом позволяет сделать выводы о его эффективности.A generalized example of using a microsensor system may look as follows. Nerve cells are extracted from the brain of a newborn transgenic animal and are planted on a multi-electrode matrix. After 3 weeks in the incubator, necessary for the maturation of the neuronal culture, the multi-electrode matrix, with the cells uploaded, is placed in the unit. By means of a stimulator, neurons in the culture are stimulated according to a predetermined protocol with the simultaneous registration of electrical activity using a registration unit and fluorescence using a microscope. Then, the studied neuroactive substance is added to the culture and the procedure of stimulation and registration described above is repeated. A comparison of the electrical and genomic responses to stimulation before and after exposure to culture with a neuroactive substance allows us to draw conclusions about its effectiveness.

Claims

A microsensor system used to register the activity of neuronal cultures, containing a microscope with a matrix placed in it with a culture of nerve cells, a unit for recording electrical activity generated by nerve cells and a stimulating pulse generator, while the microscope is made with the possibility of photographic digital recording of fluorescence of nerve cells, and the matrix with a culture of nerve cells associated with the aforementioned registration unit and a stimulating pulse generator.