RU122890U1

RU122890U1 - INCUBATION SYSTEM FOR MICROSCOPIC RESEARCHES OF TRANSMITTING Slices

Info

Publication number: RU122890U1
Application number: RU2012126447/15U
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Германович Семенов; Александр Витальевич Беляков
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2012-12-20

Abstract

1. Инкубационная система для исследования переживающих препаратов, содержащая рабочий резервуар, внутри которого фиксируются с помощью узла фиксации исследуемые препараты, и размещенную под ним водяную баню, при этом рабочий резервуар через трубки притока и оттока инкубационной среды и перистальтический насос соединен соответственно с выходами и входами резервуара с инкубационной средой, а через трубку подачи газа - с резервуаром аэрации, в свою очередь рабочий резервуар установлен под объективом микроскопа с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости, отличающаяся тем, что рабочий резервуар разделен непроницаемой перегородкой на две одинаковых секции, при этом каждая секция снабжена отдельными трубками притока и оттока инкубационного раствора и подачи газа.2. Инкубационная система по п.1, отличающаяся тем, что содержит дополнительный резервуар с инкубационной средой, соединенный соответственно со второй секцией рабочего резервуара.3. Инкубационная система по п.1, отличающаяся тем, что рабочий резервуар выполнен из светопоглощающего, химически инертного материала.4. Инкубационная система по п.1, отличающаяся тем, что узел фиксации в каждой из двух секций выполнен в виде прижимной рамки с сеткой, на которую нанесены реперные отметки.5. Инкубационная система по п.1, отличающаяся тем, что она выполнена с возможностью обеспечения скорости протока инкубационной жидкости в пределах 1,4-1,6 мл/мин при объеме рабочего резервуара 1,9-2,1 мл.1. An incubation system for the study of surviving preparations, containing a working reservoir, inside of which the studied preparations are fixed by means of a fixation unit, and a water bath placed under it, while the working reservoir is connected through the tubes of the inflow and outflow of the incubation medium and the peristaltic pump, respectively, to the outputs and inputs reservoir with the incubation medium, and through the gas supply tube - with the aeration reservoir, in turn, the working reservoir is installed under the microscope objective with the ability to move in the horizontal plane, characterized in that the working reservoir is divided by an impermeable partition into two identical sections, while each section is equipped with separate tubes for the inflow and outflow of the incubation solution and the gas supply. 2. The incubation system according to claim 1, characterized in that it contains an additional reservoir with the incubation medium, respectively connected to the second section of the working reservoir. An incubation system according to claim 1, characterized in that the working tank is made of light-absorbing, chemically inert material. The incubation system according to claim 1, characterized in that the fixation unit in each of the two sections is made in the form of a clamping frame with a grid on which reference marks are applied. The incubation system according to claim 1, characterized in that it is configured to provide a flow rate of the incubation fluid in the range of 1.4-1.6 ml / min with a working reservoir volume of 1.9-2.1 ml.

Description

Предлагаемая полезная модель относится к медицинской технике, а именно к устройствам, обеспечивающим поддержание жизнеспособности переживающих срезов биологических объектов при проведении их исследований. Система была разработана сотрудниками ФГБУ науки Института физиологии им. И.П.Павлова РАН при фотометрической оценке реакций переживающих срезов мозга лабораторных животных.The proposed utility model relates to medical equipment, namely to devices that ensure the sustainability of surviving slices of biological objects during their research. The system was developed by employees of the FSBI of Science of the Institute of Physiology. I.P. Pavlova of the Russian Academy of Sciences during photometric assessment of reactions of surviving brain sections of laboratory animals.

При изучении свойств биообъектов используют методы морфологической диагностики состояния срезов тканей этих объектов, базирующиеся на сопоставлении контрольного и опытного образцов, находящихся в одинаковых условиях, или сопоставлении одинаковых образцов, находящихся в различных условиях. Одним из важных условий получения достоверной информации о состоянии объектов является проведение исследований в конкретный период онтогенеза, при котором необходимо одновременное изучение свойств сопоставляемых препаратов.When studying the properties of biological objects, methods of morphological diagnostics of the state of tissue sections of these objects are used, based on a comparison of the control and experimental samples under the same conditions, or a comparison of the same samples under different conditions. One of the important conditions for obtaining reliable information about the state of objects is to conduct research in a specific period of ontogenesis, in which it is necessary to simultaneously study the properties of the drugs being compared.

Однако, как показали результаты патентного поиска в исследуемой области, к настоящему времени созданы устройства указанного назначения, позволяющие проводить только последовательное исследование свойств препаратов. Основными элементами известных устройств являются узлы, обеспечивающие размещение и фиксацию исследуемого препарата в инкубационной среде; регулирование уровня инкубационной жидкости; стабильность заданной температуры раствора; насыщение раствора кислородом (или карбогеном).However, as the results of a patent search in the study area have shown, to date, devices of this purpose have been created that allow only a sequential study of the properties of drugs. The main elements of the known devices are nodes that ensure the placement and fixation of the test drug in the incubation medium; regulation of the level of incubation fluid; stability of a given solution temperature; saturation of the solution with oxygen (or carbogen).

Известна, например, камера для инкубирования переживающих срезов мозга (см. а.с. SU №1602538, МКИ A61M 1/00, опубл. 30.10.1990), содержащая: рабочий и теплообменный резервуары, подающие трубки, сточную емкость, оптические стекла, подставочную сетку, зажимные цилиндрические кольца, распределитель-регулятор, термостат, источник и распылители газовой смеси.A well-known, for example, a chamber for incubating surviving sections of the brain (see AS SU No. 1602538, MKI A61M 1/00, publ. 10/30/1990), containing: working and heat exchange tanks, feed tubes, waste tank, optical glasses, stand grid, clamping cylindrical rings, distributor-regulator, thermostat, source and gas mixture sprayers.

Известна также инкубационная система по пат. RU на полезную модель №81199, МПК C12M 1/00, опубл. 10.03.2009, содержащая односекционную инкубационную камеру, трубку для подачи в нее физраствора и отводящую трубку для отработанного физраствора, узел подачи в камеру кислорода, водяную баню, крышку с отверстием над рабочей зоной камеры, а также узлы контроля в камере температуры, уровня жидкости и кислорода.Also known incubation system according to US Pat. RU for utility model No. 81199, IPC C12M 1/00, publ. 03/10/2009, containing a single-section incubation chamber, a tube for supplying saline into it and a discharge tube for spent saline, an oxygen supply unit to the chamber, a water bath, a cover with an opening above the chamber working area, as well as control units in the chamber for temperature, liquid level, and oxygen.

В качестве прототипа предлагаемого решения выбрана стандартная инкубационная система с камерой, рассчитанной на инкубацию одного среза мозга. Система описана в кн. Митюшова М.И. «Переживающий срез мозга как объект нейрофизиологического и нейрохимического исследования». - Л.: Наука, 1986, С.40-43.As a prototype of the proposed solution, a standard incubation system with a camera designed for incubation of one section of the brain was selected. The system is described in book. Mityushova M.I. "The surviving section of the brain as an object of neurophysiological and neurochemical research." - L .: Nauka, 1986, S. 40-43.

Известная инкубационная система содержит односекционную рабочую камеру (резервуар), внутри которой фиксируется с помощью нейлоновой сетки исследуемый препарат. Через трубки подачи и откачивания инкубационной среды, камера соединяется соответственно с резервуаром с инкубационным раствором и сборным резервуаром. Под камерой размещена водяная баня с термоэлементом и осветительный прибор. Для изготовления камеры и водяной бани могут быть использованы органическое стекло, полиэтилен, фторопласт или другие пластические материалы. Это связано с тем, что они не обладают токсичностью, легко обрабатываются и прозрачны для светового потока. Объем рабочей камеры описываемого вида выбирается опытным путем от 1 до 10 мл в зависимости от задачи исследования и размеров срезов.The known incubation system contains a single-section working chamber (reservoir), inside which the studied drug is fixed using a nylon mesh. Through the supply and pumping tubes of the incubation medium, the chamber is connected respectively to the reservoir with the incubation solution and the collection tank. Under the camera there is a water bath with a thermocouple and a lighting device. For the manufacture of a chamber and a water bath, organic glass, polyethylene, fluoroplastic or other plastic materials can be used. This is due to the fact that they do not have toxicity, are easily processed and transparent to the light flux. The volume of the working chamber of the described type is selected empirically from 1 to 10 ml, depending on the research task and the size of the slices.

Система работает следующим образом.The system operates as follows.

Из резервуара с инкубационной жидкостью по трубке подачи жидкость втекает в рабочую камеру. При этом она нагревается до необходимой температуры и насыщается карбогеном с помощью узлов термостабилизации и аэрации соответственно. Омывая срез, расположенный на нейлоновой сетке, жидкость через трубку откачивания перистальтическим насосом подается в сборный резервуар.From the reservoir with the incubation liquid, the liquid flows into the working chamber through the feed pipe. At the same time, it is heated to the required temperature and saturated with carbogen using thermostabilization and aeration units, respectively. By washing the slice located on the nylon mesh, the fluid is pumped through the pumping tube to the collection tank through a peristaltic pump.

Общим недостатком известных аналогов, в том числе и прототипа, является невозможность проведения с их помощью одновременного исследования контрольных и интактных пар микроскопируемых препаратов в одной или как минимум в 2-х различных средах. Во всех приведенных системах для исследования сопоставляемых препаратов поступают следующим образом: измеряют необходимые характеристики на группе объектов, затем меняют инкубационную среду и опять измеряют те же самые характеристики. В фармакологических экспериментах на инкубируемых срезах мозга различие во времени, и связанные с ним инертность диффузионных процессов в камере, многофазность реагирования объекта на вещество и многие другие факторы могут существенно исказить окончательный результат.A common drawback of known analogues, including the prototype, is the impossibility of carrying out with their help a simultaneous study of control and intact pairs of microscopic preparations in one or at least 2 different environments. In all of the above systems, for the study of comparable drugs, they proceed as follows: measure the necessary characteristics on a group of objects, then change the incubation medium and again measure the same characteristics. In pharmacological experiments on incubated sections of the brain, the time difference and the associated inertness of diffusion processes in the chamber, the multiphase response of the object to the substance, and many other factors can significantly distort the final result.

Заявляемое устройство позволяет получить новый по сравнению с прототипом технический результат, заключающийся в повышении достоверности проводимых исследований за счет обеспечения возможности одновременного исследования нескольких пар микроскопируемых препаратов в одинаковых или различных условиях. Для достижения указанного технического результата при проведении исследований препаратов в одинаковой среде в инкубационной системе для микроскопических исследований переживающих срезов, (содержащей, так же как и прототип, рабочий резервуар, внутри которого фиксируются с помощью узла фиксации исследуемые препараты, и размещенную под ним водяную баню, при этом рабочий резервуар через трубки притока и оттока инкубационной среды и перистальтический насос соединен соответственно с выходами и входами резервуара с инкубационной средой, а через трубку подачи газа - с резервуаром аэрации, в свою очередь рабочий резервуар установлен под объективом микроскопа с возможностью перемещения в горизонтальной плоскости), в отличие от прототипа рабочий резервуар разделен непроницаемой перегородкой на две одинаковых секции, при этом каждая секция снабжена отдельными трубками притока и оттока инкубационного раствора и подачи газа. Для обеспечения возможности проведении исследований препаратов в различных средах инкубационная система содержит дополнительный резервуар с инкубационной средой, соединенный соответственно со второй секцией рабочего резервуара. Для предотвращения распространения света вглубь инкубационной среды рабочий резервуар выполнен из светопоглощающего химически инертного материала. Для обеспечения возможности визуального или автоматизированного позиционирования исследуемой зоны под объективом микроскопа узел фиксации в каждой из двух секций выполнен в виде прижимной рамки с сеткой, на которую нанесены реперные отметки. Для создания оптимальных условий проведения исследований система выполнена с возможностью обеспечения скорости протока инкубационной жидкости в пределах 1,4-1,6 мл/мин при объеме рабочего резервуара 1,9-2,1 мл.The inventive device allows to obtain a new technical result compared to the prototype, which consists in increasing the reliability of the research by providing the possibility of simultaneous research of several pairs of microscopic preparations in the same or different conditions. To achieve the specified technical result when conducting studies of drugs in the same environment in an incubation system for microscopic studies of surviving sections (containing, like the prototype, a working reservoir, inside which the studied drugs are fixed using the fixation unit, and a water bath placed under it, wherein the working reservoir is connected through the tubes of the inflow and outflow of the incubation medium and the peristaltic pump to the outlets and inlets of the reservoir with the incubation medium, respectively, and through the gas supply tube - with an aeration tank, in turn, the working tank is mounted under the microscope lens with the possibility of moving in a horizontal plane), unlike the prototype, the working tank is divided by an impenetrable partition into two identical sections, with each section having separate inflow and outflow tubes incubation solution and gas supply. To enable the study of drugs in various environments, the incubation system contains an additional reservoir with an incubation medium, connected respectively to the second section of the working reservoir. To prevent light from spreading deep into the incubation medium, the working tank is made of light-absorbing chemically inert material. To enable visual or automated positioning of the studied area under the microscope objective, the fixation unit in each of the two sections is made in the form of a clamping frame with a grid on which reference marks are applied. To create optimal conditions for research, the system is configured to provide a flow rate of incubation fluid in the range 1.4-1.6 ml / min with a working reservoir volume of 1.9-2.1 ml.

Сущность предлагаемой полезной модели заключается в возможности создания двух изолированных друг от друга проточных инкубационных сред одинакового или различного химического состава для двух групп переживающих срезов, причем обе группы доступны для сканирования контактным световым микроскопом. Такое решение позволяет разместить попарно-симметрично, поверхностями общего среза, обращенными к объективу микроскопа до 6-ти пар последовательно изготовленных на микротоме срезов. При этом срезы, расположенные в одной секции могут служить контролем для соответствующих срезов второй секции, имеющей иные (экспериментальные) условия инкубации.The essence of the proposed utility model lies in the possibility of creating two isolated from each other flowing incubation media of the same or different chemical composition for two groups of surviving sections, both groups being accessible for scanning by a contact light microscope. This solution allows you to place in pairs-symmetrically, with the surfaces of the General slice facing the microscope objective up to 6 pairs of slices sequentially made on the microtome. In this case, the slices located in one section can serve as a control for the corresponding slices of the second section, which has other (experimental) incubation conditions.

Таким образом, двухкамерная инкубационная система для нескольких пар срезов, наряду с обеспечением возможности их оптимальной для эксперимента укладки позволяет, во-первых, повысить продуктивность эксперимента и, во-вторых, одновременно анализировать и контрольную и экспериментальную группы идентичных срезов в одном эксперименте, что обеспечивает наилучшие условия для выделения сигнала из шума.Thus, the two-chamber incubation system for several pairs of sections, along with the possibility of their optimal laying for the experiment, allows, firstly, to increase the productivity of the experiment and, secondly, to simultaneously analyze both the control and experimental groups of identical sections in one experiment, which ensures the best conditions for isolating a signal from noise.

Сопоставление предлагаемого устройства с прототипом показало, что поставленная задача - повышение достоверности проводимых исследований за счет обеспечения возможности одновременного исследования нескольких пар микроскопируемых препаратов в одинаковых или различных условиях решается в результате новой совокупности признаков, что доказывает соответствие заявляемой полезной модели критерию «новизна».Comparison of the proposed device with the prototype showed that the task is to increase the reliability of the research by providing the possibility of simultaneous research of several pairs of microscopic preparations under the same or different conditions is solved as a result of a new set of features, which proves the compliance of the claimed utility model with the criterion of "novelty".

Сущность технического решения поясняется чертежом, где на фиг.1 дано схематическое изображение предлагаемой системы.The essence of the technical solution is illustrated by the drawing, where figure 1 is a schematic representation of the proposed system.

Инкубационная система (фиг.1) состоит из рабочего резервуара 1, разделенного непроницаемой перегородкой 2 на две равных секции; подводов притока инкубационной жидкости 3 и аэрации 4; выводов оттока 5; узла поддержки и фиксации 6 (подложки и прижимной сетки с системой реперов); водяной бани 7; изоляции водяной бани 8; нагревающего элемента 9 (элемента Пельтье); термометра 10, соединенного с термореле 11 и нагревателем 9; индикатора нагрева 12; полости 13 для радиатора и отвода холода от Пельтье; препаратоводителя 14; узла фиксации рабочего резервуара с водяной баней 15; контактного микроскопа 16; узла питания системы термостабилизации водяной бани 17; перистальтического насоса 18 для подачи инкубационного раствора; резервуаров с инкубационными растворами 19; узла аэрации с баллоном и редуктором 20.The incubation system (figure 1) consists of a working reservoir 1, divided by an impenetrable partition 2 into two equal sections; inlets of the incubation fluid 3 and aeration 4; outflow conclusions 5; support and fixation unit 6 (substrate and pressure grid with a frame system); water bath 7; water bath insulation 8; heating element 9 (Peltier element); a thermometer 10 connected to a thermal relay 11 and a heater 9; heating indicator 12; cavity 13 for the radiator and the removal of cold from Peltier; drug provider 14; node fixing the working tank with a water bath 15; contact microscope 16; the power node of the system of thermal stabilization of the water bath 17; a peristaltic pump 18 for feeding the incubation solution; tanks with incubation solutions 19; aeration unit with a cylinder and gear 20.

Систему монтируют следующим образом. Резервуар 1 объемом 1,9-2,1 мл устанавливают в герметичной алюминиевой термостабилизирующей камере - в бане 7, заполненной водой и оснащенной узлами 8-12, которые обеспечивают поддержание равных температурных условий инкубации всех срезов на уровне 37 град С. Собранный узел с помощью винтовой фиксации устанавливают на столике-препаратоводителе 14 микроскопа. Узел притока и оттока инкубационных растворов и аэрирующего газа, состоящий из системы капилляров, соединенных входными просветами с системой многоканального перистальтического насоса 18, а выходными с ячейками рабочего резервуара 1, обеспечивает непрерывную циркуляцию инкубационной жидкости. Объем секций рабочего резервуара 1, диаметр и длина капилляров и производительность перистальтического насоса 18 подобраны таким образом, чтобы создать ламинарный поток раствора со скоростью 1,4-1,6 мл/мин и затратить минимум времени на его проведение по системе капилляров. Полная высота инкубационной камеры вместе с устройством позиционирования оптимизирована, исходя из ограничений на величину подъема объектива контактного микроскопа. Узел поддержки и фиксации срезов в секциях рабочего резервуара выполнен в виде вкладываемых в них рамок, толщиной 0,5 мм, на каждой из которых по продольной оси закреплены две параллельные капроновые нити толщиной 80 мкм, делящие площадь между боковыми гранями рамки на 3 равные части и предназначенные для «поджатия» срезов и ограничения их возможных смещений. На нитях с интервалом 2 мм нанесены контрастные реперные точки, что обеспечивает возможность визуального или автоматизированного позиционирования исследуемой зоны при двухкоординатном перемещении камеры в фокальной плоскости объектива микроскопа. В качестве материала для изготовления рабочего резервуара может быть использован светопоглощающий, химически инертный и теплопроводный материал, например, черный поликарбонат, препятствующий нежелательному распространению света за пределы резервуара и между его ячейками.The system is mounted as follows. The reservoir 1 with a volume of 1.9-2.1 ml is installed in a sealed aluminum thermostabilizing chamber - in a bath 7, filled with water and equipped with units 8-12, which ensure that the incubation temperature of all sections is equal to the temperature of 37 degrees C. The assembled unit using screw fixation is mounted on the preparation table of the microscope 14. The unit of inflow and outflow of incubation solutions and aerating gas, consisting of a system of capillaries connected by inlet lumens to the system of a multi-channel peristaltic pump 18, and outlet with cells of the working reservoir 1, provides continuous circulation of the incubation liquid. The volume of the sections of the working tank 1, the diameter and length of the capillaries and the performance of the peristaltic pump 18 are selected in such a way as to create a laminar flow of the solution at a speed of 1.4-1.6 ml / min and spend a minimum of time on it through the capillary system. The full height of the incubation chamber together with the positioning device is optimized based on the limitations on the magnification of the contact microscope objective. The support and fixation unit for sections in the sections of the working tank is made in the form of frames embedded in them, 0.5 mm thick, on each of which two parallel nylon threads 80 μm thick are fixed along the longitudinal axis, dividing the area between the side faces of the frame into 3 equal parts and designed to “preload” slices and limit their possible displacements. Contrast fixed points are applied on the threads with an interval of 2 mm, which provides the possibility of visual or automated positioning of the studied area with two-coordinate movement of the camera in the focal plane of the microscope objective. Light-absorbing, chemically inert and heat-conducting material, for example, black polycarbonate, which prevents the undesirable propagation of light outside the tank and between its cells, can be used as a material for the manufacture of a working tank.

При исследовании состояния переживающих срезов с помощью заявляемой системы срезы определенных отделов мозга (неокортекс, гиппокамп и др.) толщиной около 400 мкм, изготовленные по стандартным методикам на микротоме, разбивают на две группы и каждую группу размещают в отдельной секции рабочего резервуара попарно-симметрично, поверхностями одинакового среза в сторону объектива микроскопа. Условия инкубации позволяют поддерживать в срезах жизнеспособность и реактивность в течение нескольких часов. С помощью прижимной рамки 6 с нитями вся серия срезов в каждой секции фиксируется на подложке, причем реперная маркировка одной из двух или обеих прижимных нитей в каждой ячейки, попадая в поле зрения микроскопа, позволяет при выборе каждого из множества анализируемых микроучастков на срезах «запомнить» его координаты относительно ближайшего репера. Это создает возможность при повторных многократных сканированиях быстро отыскивать выбранные микроучастки исследуемой ткани, которые, обладая низкой естественной контрастностью, с трудом обнаруживались бы без использования указанной системы.When examining the condition of surviving slices using the inventive system, slices of certain parts of the brain (neocortex, hippocampus, etc.) with a thickness of about 400 μm, made by standard methods on a microtome, are divided into two groups and each group is placed in a separate section of the working reservoir pairwise symmetrically, surfaces of the same cut towards the microscope objective. Incubation conditions allow maintaining slices viability and reactivity for several hours. Using the clamping frame 6 with threads, the entire series of slices in each section is fixed on the substrate, and the reference marking of one of two or both clamping threads in each cell, falling into the field of view of the microscope, allows you to "remember" when choosing each of the many analyzed microareas on the slices its coordinates relative to the nearest rapper. This makes it possible, during repeated multiple scans, to quickly find the selected microareas of the tissue under study, which, having low natural contrast, would be difficult to detect without using this system.

Как указывалось выше, заявляемая полезная модель была создана при разработке методики, позволяющей проводить фотометрическую оценку динамики уровня связанного кальция на переживающих срезах мозга лабораторных крыс в ответ на предъявление тестирующих реагентов, таких, как агонисты или антагонисты глутаматных рецепторов нервных клеток. Система была апробирована в лабораторных условиях и показала хорошие результаты, что позволяет сделать вывод о ее промышленной применимости.As indicated above, the claimed utility model was created when developing a methodology that allows photometric assessment of the dynamics of the level of bound calcium in surviving brain sections of laboratory rats in response to the presentation of test reagents, such as agonists or antagonists of glutamate receptors of nerve cells. The system was tested in laboratory conditions and showed good results, which allows us to conclude that it is industrially applicable.

Предложенная полезная модель может быть использована в физиологии и экспериментальной медицине.The proposed utility model can be used in physiology and experimental medicine.

Claims

1. An incubation system for the study of surviving drugs, containing a working reservoir, inside which the studied drugs are fixed using a fixation unit, and a water bath placed underneath, while the working reservoir is connected through the tubes of the inflow and outflow of the incubation medium and the peristaltic pump to the outlets and inlets, respectively a tank with an incubation medium, and through a gas supply tube - with an aeration tank, in turn, the working tank is installed under the microscope lens with the ability to move in a horizontal plane, characterized in that the working tank is divided by an impenetrable partition into two identical sections, with each section provided with separate tubes for the inflow and outflow of the incubation solution and gas supply.

2. The incubation system according to claim 1, characterized in that it contains an additional tank with an incubation medium, connected respectively to the second section of the working tank.

3. The incubation system according to claim 1, characterized in that the working reservoir is made of light-absorbing, chemically inert material.

4. The incubation system according to claim 1, characterized in that the fixation unit in each of the two sections is made in the form of a clamping frame with a grid on which reference marks are applied.

5. The incubation system according to claim 1, characterized in that it is configured to provide a flow rate of the incubation fluid in the range of 1.4-1.6 ml / min with a working reservoir volume of 1.9-2.1 ml.