RU117150U1

RU117150U1 - DIAGNOSTIC TEST SYSTEM BASED ON APTAMERS

Info

Publication number: RU117150U1
Application number: RU2011146565/10U
Authority: RU
Inventors: Анна Сергеевна Замай; Татьяна Николаевна Замай; Максим Валентинович Березовский; Алла Борисовна Салмина; Ольга Сергеевна Замай; Галина Сергеевна Замай
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-06-20

Abstract

1. Диагностическая тест-система на основе аптамеров, содержащая n-луночный планшет, лунки которого содержат молекулы веществ, обладающие детекцией к молекулам-мишеням, отличающаяся тем, что лунки планшета покрыты слоем немеченых аптамеров, специфичных к заданной биологической мишени, связанных непосредственно с пластиком планшета. ! 2. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что все лунки планшета покрыты слоем аптамеров, специфичных к одной заданной биологической мишени (одному диагностируемому заболеванию). ! 3. Диагностичекая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что все лунки планшета разделены на группы, при этом лунки разных групп покрыты слоем аптамеров, специфичных к разным заданным биологическим мишеням (разным диагностируемым заболеваниям). ! 4. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что содержит контрольные лунки, при этом в лунках с отрицательным контролем нижний слой представлен немечеными аптамерами, (немеченой библиотекой аптамеров), а в лунках с положительным контролем нижний слой представлен биотинилированными аптамерами, специфичными к мишени. ! 5. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что содержит планшетный спектрофлуориметр. 1. A diagnostic test system based on aptamers, containing an n-well plate, the wells of which contain molecules of substances with detection to target molecules, characterized in that the wells of the plate are covered with a layer of unlabeled aptamers specific to a given biological target, bound directly to the plastic tablet. ! 2. The diagnostic test system according to claim 1, characterized in that all wells of the plate are covered with a layer of aptamers specific to one given biological target (one diagnosed disease). ! 3. Diagnostic test system according to claim 1, characterized in that all wells of the plate are divided into groups, while the wells of different groups are covered with a layer of aptamers specific to different predetermined biological targets (different diagnosed diseases). ! 4. The diagnostic test system according to claim 1, characterized in that it contains control wells, while in the wells with a negative control, the lower layer is represented by unlabeled aptamers (unlabeled aptamer library), and in the wells with a positive control, the lower layer is represented by biotinylated aptamers, specific to the target. ! 5. The diagnostic test system according to claim 1, characterized in that it contains a flatbed spectrofluorimeter.

Description

Полезная модель относится к области биотехнологии и медицины, а именно к оборудованию (приспособлениям) для проведения лабораторного анализа, с целью диагностики заболеваний.The utility model relates to the field of biotechnology and medicine, namely to equipment (devices) for laboratory analysis, in order to diagnose diseases.

В настоящее время для диагностики заболеваний в большинстве случаев применяют диагностические тест-системы на основе моноклональных антител.At present, in most cases, diagnostic test systems based on monoclonal antibodies are used to diagnose diseases.

Известна тест-система для иммуноферментной диагностики (RU 79337 U1, G01N 15/00, 25.06.2008) на основе определения гамма-интерферона, содержащая планшет, в лунках которого сорбированы моноклональные антитела к гамма-интерферону, флаконы, содержащие раствор рекомбинантного интерферона и растворы конъюгатов, хромагена и стоп-реагента, растворы для разведения образцов и конъюгатов, а также буферные растворы, стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой, содержащие белки ESAT-6, CFP-10, туберкулин PPD и контрольный физиологический раствор с растворами антигенов.Known test system for enzyme immunoassay (RU 79337 U1, G01N 15/00, 06/25/2008) based on the determination of gamma interferon, containing a plate in the wells of which monoclonal antibodies to gamma interferon are adsorbed, bottles containing a solution of recombinant interferon and solutions conjugates, chromogen and stop reagent, solutions for diluting samples and conjugates, as well as buffer solutions, sterile screw cap tubes containing ESAT-6, CFP-10 proteins, tuberculin PPD and physiological saline with antigen solutions in.

Недостатком данной тест-системы является ее недостаточная чувствительность и специфичность к разного рода биологическим мишеням.The disadvantage of this test system is its lack of sensitivity and specificity for various biological targets.

Известна экспериментальная тест-система для исследования клеток, представляющая собой стандартный иммунологический планшет (например, 96 луночный планшет для ИФА производитель - «Coming-Costar Co», США) в лунках которого иммобилизованы антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток. (См. А.В.Шишкин «Иммунологические биочипы для исследования клеток. Собственный опыт разработки. Некоторые новые подходы к проведению анализа» LAP Lambert Academic Publishing & Co. KG-2010 - с.81-87). Данная тест-система принята за прототип.A well-known experimental test system for cell research is a standard immunological plate (for example, a 96-well ELISA plate manufacturer - "Coming-Costar Co", USA) in the wells of which antibodies specific for cell surface antigens are immobilized. (See A.V. Shishkin “Immunological biochips for cell research. Own development experience. Some new approaches to analysis” LAP Lambert Academic Publishing & Co. KG-2010 - p.81-87). This test system is taken as a prototype.

Недостатком известной диагностической тест-системы также является ее недостаточно высокая чувствительность и специфичность к биологическим мишеням, короткий срок годности, дорогое производство, вследствие использования материалов животного происхождения для получения моноклональных антител.A disadvantage of the known diagnostic test system is also its insufficiently high sensitivity and specificity for biological targets, short shelf life, expensive production, due to the use of animal materials to obtain monoclonal antibodies.

Задачей заявленной полезной модели является создание тест-системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, имеющей больший срок годности; удешевление производства тест-систем по сравнению с тест-системами на основе моноклональных антител.The objective of the claimed utility model is to create a test system with high sensitivity and specificity, with a longer shelf life; cheaper production of test systems compared to test systems based on monoclonal antibodies.

Поставленная задача решается за счет того, что диагностическая тест-система, содержащая n-луночный планшет, лунки которого содержат молекулы веществ, обладающие детекцией к молекулам-мишеням, согласно полезной модели, содержит лунки покрытые слоем немеченых аптамеров, специфичных к заданной биологической мишени, связанных непосредственно с пластиком планшета.The problem is solved due to the fact that a diagnostic test system containing an n-hole plate, the wells of which contain molecules of substances that are detectable to target molecules, according to a utility model, contains wells coated with a layer of unlabeled aptamers specific for a given biological target, connected directly with the plastic of the tablet.

В тест-системе все лунки планшета могут быть покрыты слоем аптамеров, специфичных к одной заданной биологической мишени (одному диагностируемому заболеванию).In the test system, all wells of the plate can be coated with a layer of aptamers specific to one given biological target (one diagnosed disease).

В тест-системе все лунки планшета могут быть разделены на группы, при этом лунки разных групп покрыты слоем аптамеров, специфичных к разным заданным биологическим мишеням (разным диагностируемым заболеваниям).In the test system, all the wells of the tablet can be divided into groups, while the wells of different groups are covered with a layer of aptamers specific to different given biological targets (different diagnosed diseases).

Тест-система может содержать контрольные лунки, при этом в лунках с отрицательным контролем нижний слой представлен немечеными аптамерами, (немеченой библиотекой аптамеров), а в лунках с положительным контролем нижний слой представлен биотинилированными аптамерами, специфичными к мишени.The test system may contain control wells, while in the wells with negative control, the lower layer is represented by unlabeled aptamers (unlabeled aptamers library), and in wells with a positive control, the lower layer is represented by biotinylated aptamers specific to the target.

Тест система может содержать планшетный спектрофлуориметр.The test system may include a plate spectrofluorimeter.

Новизна предлагаемого решения состоит в применении искусственных антител-аптамеров для создания диагностических тест-систем нового поколения. С помощью технологии SELEX удается подобрать высокоспецифичные искусственные антитела-аптамеры практически к любой мишени (от маленьких неорганических ионов до интактных клеток). Благодаря высокой чувствительности аптамеров можно обнаружить наличие возбудителей заболевания или продуктов распада опухоли в биологических жидкостях на начальной стадии развития болезни. Поэтому аптамеры можно использовать как основу для диагностических тест-систем.The novelty of the proposed solution is the use of artificial aptamer antibodies to create a new generation of diagnostic test systems. Using SELEX technology, it is possible to select highly specific artificial aptamer antibodies to almost any target (from small inorganic ions to intact cells). Due to the high sensitivity of the aptamers, it is possible to detect the presence of pathogens or tumor decay products in biological fluids at the initial stage of the development of the disease. Therefore, aptamers can be used as the basis for diagnostic test systems.

Технический результат выражается в повышении точности и удешевлении диагностики заболеваний и достигается за счет того, что аптамеры, используемые для покрытия лунок планшета, обладают высокой специфичностью к заданным мишеням, имеют более низкую стоимость, чем моноклональные антитела.The technical result is expressed in improving the accuracy and cost of diagnosing diseases and is achieved due to the fact that the aptamers used to cover the wells of the tablet have high specificity for given targets and have a lower cost than monoclonal antibodies.

Заявляемая полезная модель поясняется чертежами.The inventive utility model is illustrated by drawings.

На фиг.1 чертежа схематично представлена диагностическая тест-система;Figure 1 of the drawing schematically shows a diagnostic test system;

на фиг.2 схема работы тест-системы (на примере аптамеров с флуоресцентной меткой).figure 2 diagram of the test system (for example, aptamers with a fluorescent label).

Тест система содержит планшет 1 с лунками 2, покрытыми слоем 3 немеченых аптамеров, специфичных к биологической мишени, контрольными лунками 4. Возможно использование иммунологических 96 или 384 - луночных иммунологических планшетов.The test system contains a plate 1 with wells 2 coated with a layer of 3 unlabeled aptamers specific for a biological target, control wells 4. It is possible to use immunological 96 or 384-well immunological plates.

Диагностическую тест-систему на основе аптамеров получают следующим образом. При проведении селекции аптамеров выбирают аптамеры из раунда, обладающего наибольшей специфичностью связывания с клетками-мишенями. В каждую из лунок 2 планшета 1 помещают раствор немеченых аптамеров, специфичных к биологической мишени в фосфатном буфере, содержащем Ca²⁺ и Mg²⁺. Для создания диагностической тест-системы при проведении селекции аптамеров выбирают аптамеры из раунда, обладающего наибольшей специфичностью связывания с клетками-мишенями. Объем раствора зависит от размера лунки, необходимо, чтобы было покрыто все дно. Раствор равномерно распределяют по поверхности лунки. Буфер должен быть близким по составу или таким же, который использовался при селекции аптамеров. Фосфатный буфер с магнием и кальцием содержит все необходимые соли и ионы для формирования третичной структуры, способной к специфичному связыванию.The diagnostic test system based on aptamers is obtained as follows. When aptamers are selected, aptamers are selected from the round that has the highest specificity for binding to target cells. A solution of unlabeled aptamers specific for a biological target in a phosphate buffer containing Ca ²⁺ and Mg ^{2+ is} placed in each of wells 2 of tablet 1. To create a diagnostic test system during the selection of aptamers, aptamers are selected from the round with the highest specificity of binding to target cells. The volume of the solution depends on the size of the hole, it is necessary that the entire bottom is covered. The solution is evenly distributed over the surface of the well. The buffer should be close in composition or the same as that used when selecting aptamers. The phosphate buffer with magnesium and calcium contains all the necessary salts and ions to form a tertiary structure capable of specific binding.

Готовят контрольные лунки. Лунки отрицательного контроля (в 2-х повторностях) содержат нижний слой немеченных аптамеров, подготовленный описанным выше способом. В лунках положительного контроля (в 2-х повторностях) нижний слой содержит биотинилированные аптамеры, специфичные к мишени.Prepare control wells. The negative control wells (in 2 replicates) contain the lower layer of unlabeled aptamers prepared as described above. In the wells of the positive control (in 2 replicates), the lower layer contains biotinylated aptamers specific to the target.

Для прикрепления аптамеров к планшету его оставляют не менее, чем на 10 часов при температуре 4°C, при такой температуре аптамеры не деградируют, но такой температуры достаточно, чтобы аптамеры прикрепились к планшету.To attach the aptamers to the tablet, it is left for at least 10 hours at 4 ° C, at this temperature the aptamers do not degrade, but such a temperature is sufficient that the aptamers attach to the tablet.

Затем буфер с несвязавшимися аптамерами удаляют.Then, the buffer with unbound aptamers is removed.

Лунки промывают дважды 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере, содержащем Ca²⁺ и Mg²⁺. Бычий сывороточный альбумин неспецифически связывается со стенками лунки и экранирует неспецифические сайты связывания, т.е. ни образцы, ни мишени не будут связываться со стенками лунки. Альбумин можно заменить экстрактом дрожжевой РНК, или skrembled salmon sperm DNA.Wells are washed twice with 1% bovine serum albumin in phosphate buffer containing Ca ²⁺ and Mg ²⁺ . Bovine serum albumin binds non-specifically to the walls of the well and screens non-specific binding sites, i.e. neither samples nor targets will bind to the walls of the well. Albumin can be replaced with yeast RNA extract, or skrembled salmon sperm DNA.

Тест-система работает следующим образом (на примере аптамеров с флуоресцентной меткой).The test system works as follows (using the example of aptamers with a fluorescent label).

После удаления промывочного буфера в лунку вносят равное по объему количество двукратного фосфатного буфера с Mg²⁺ и Ca²⁺ и исследуемого образца. Контрольные лунки с отрицательным контролем заполняют в следующей последовательности:After removing the wash buffer, an equal volume of twice the phosphate buffer with Mg ²⁺ and Ca ²⁺ and the test sample are added to the well. Control wells with negative control are filled in the following sequence:

средний слой - исследуемый образец;middle layer - the test sample;

верхний слой - меченую библиотеку аптамеров.the top layer is a labeled aptamer library.

Контрольные лунки с положительным контролем в последовательности:Control wells with positive control in sequence:

средний слой - стрептавидин;the middle layer is streptavidin;

верхний слой - аптамеры, меченые с одной стороны биотином, с другой стороны - флуоресцентной меткой.the top layer is aptamers labeled with biotin on one side and a fluorescent label on the other.

Через 30 минут исследуемые образцы удаляют и лунки дважды промывают фосфатным буфером, этого времени достаточно, чтобы мишени связались с аптамерами. В зависимости от аптамеров можно удалять образцы через меньшее время. Увеличение времени инкубации, не должно влиять на связывание.After 30 minutes, the test samples are removed and the wells are washed twice with phosphate buffer, this time is enough for the targets to bind to the aptamers. Depending on the aptamers, samples can be removed after less time. An increase in incubation time should not affect binding.

В лунки добавляют аптамеры с флуоресцентной меткой и выдерживают их там при комнатной температуре (температура может быть изменена в зависимости от типа аптамеров) для связывания со своей мишенью 30 мин. Несвязавшиеся с биологической мишенью аптамеры с флуоресцентной меткой удаляют и лунки промывают фосфатным буфером.Aptamers with a fluorescent label are added to the wells and kept there at room temperature (the temperature may vary depending on the type of aptamers) to bind to their target for 30 minutes. Fluorescently labeled aptamers that did not bind to the biological target are removed and the wells washed with phosphate buffer.

С помощью планшетного спектрофлуориметра определяют уровень флуоресценции. Уровень флуоресценции будет зависеть от количества связавшихся с биологической мишенью аптамеров с флуоресцентной меткой. При наличии мишени уровень флуоресценции должен быть выше, чем в отрицательном контроле, а также может быть выше, чем в положительном.Using a plate spectrofluorimeter determine the level of fluorescence. The level of fluorescence will depend on the number of fluorescently labeled aptamers bound to the biological target. In the presence of a target, the fluorescence level should be higher than in the negative control, and may also be higher than in the positive.

Диагностические тест-системы на основе аптамеров (искусственных антител) обладают большей чувствительностью и специфичностью, чем тест-системы на основе моноклональных антител и имеют больший срок годности. Кроме того, искусственные антитела дешевле в производстве, поскольку синтезируются химически, а не требуют для своего получения использования тканей животных.Diagnostic test systems based on aptamers (artificial antibodies) have greater sensitivity and specificity than test systems based on monoclonal antibodies and have a longer shelf life. In addition, artificial antibodies are cheaper to manufacture because they are chemically synthesized and do not require the use of animal tissues for their production.

В предлагаемой тест-системе аптамер не биотинилирован, и связывается не со стрептавидиновым покрытием планшета (такой метод используется в некоторых видах тест-систем), а с пластиком планшета, что удешевляет проведение диагностических исследований.In the proposed test system, the aptamer is not biotinylated, and does not bind to the streptavidin coating of the tablet (this method is used in some types of test systems), but to the plastic of the tablet, which reduces the cost of diagnostic tests.

С помощью тест-систем на основе аптамеров, можно быстро и точно диагностировать практически любое заболевание при наличии аптамеров к определенной мишени (биомаркеру заболевания). Возможно определение очень низких количеств биологических веществ в исследуемых препаратах, вследствие высокой специфичности аптамеров.Using test systems based on aptamers, you can quickly and accurately diagnose virtually any disease in the presence of aptamers to a specific target (disease biomarker). It is possible to determine very low amounts of biological substances in the studied drugs, due to the high specificity of aptamers.

Claims

1. Aptamer-based diagnostic test system containing an n-well plate, the wells of which contain molecules of substances having detection to target molecules, characterized in that the plate wells are coated with a layer of unlabeled aptamers specific for a given biological target, connected directly to plastic tablet.

2. The diagnostic test system according to claim 1, characterized in that all the wells of the tablet are coated with a layer of aptamers specific to one given biological target (one diagnosed disease).

3. The diagnostic test system according to claim 1, characterized in that all the wells of the tablet are divided into groups, while the wells of different groups are covered with a layer of aptamers specific to different given biological targets (different diagnosed diseases).

4. The diagnostic test system according to claim 1, characterized in that it contains control wells, while in the wells with negative control, the lower layer is represented by unlabeled aptamers, (unlabeled aptamers library), and in the wells with positive control, the lower layer is represented by biotinylated aptamers, specific to the target.

5. The diagnostic test system according to claim 1, characterized in that it contains a tablet spectrofluorimeter.