RO138657A2 - Procedeu de realizare a unor biosenzori electrochimici bazaţi pe nanomateriale pentru determinarea de amine biogene - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unor biosenzori electrochimici pentru detecţia sensibilă a aminelor biogene, putresceină şi histamină. Procedeul, conform invenţiei, constă în etapele: depunerea pe suprafaţa electrodului de lucru a unui senzor serigrafiat din pastă de cărbune realizat pe suport ceramic sau PVC flexibil, a unui nanomaterial obţinut prin amestecarea unor nanotuburi de carbon cu un singur perete cu precursori ai mediatorului redox Albastru de Prusia, ferocianură de potasiu şi clorură ferică, în volume egale, preparate în acid clorhidric, uscarea senzorului rezultat, depunerea pe suprafaţa senzorului a unui amestec de diamin oxidază (DAO) cu o matrice sol-gel, respectiv, a unui amestec de enzimă monoamin oxidază (MAO) cu o matrice polimerică de chitosan, rezultând un biosenzor amperometric pentru analize de probe complexe de soluţie de sol, băuturi sau produse alimentare.

Description

PROCEDEU DE REALIZARE A UNOR BIOSENZORI ELECTROCHIMICI BAZA ȚI PE NANOMA TERIALE PENTRU DETERMINAREA DE AMINE BIOGENE

Invenția se referă la un procedeu de realizare a unor biosenzori electrochimici miniaturizați bazați pe nanomateriale conductive pentru detecția sensibilă a aminelor biogene, putresceină și histamină.

Determinarea concentrațiilor de amine biogene din probe de mediu și/sau din alimente prezintă o importanță deosebitădatorită influenței pe care acestea o manifestă asupra proceselor biologice din plante și animale. Aminele biogene au un potențial benefic atunci când sunt produse endogen de către un organism, dar pot avea și efect toxic atunci când rezultă în urma unor procese de degradare chimică, biochimică sau microbiană, prezența lor în alimentația umană fiind periculoasă pentru sănătate, putând determina chiar modifcări genetice.. Aminele biogene (sau poliaminele) sunt compuși chimici ce rezultă din procesele de degradare biochimică a aminoacizilor, prezenți în toate celulele eucariote, incluzând celulele sistemului nervos.

Pentru plante, aminele biogene au un rol foarte important în reglarea metabolismului și reprezintă molecule de semnalizare pentru mecanismele ce ajută planta să facă față stresului, acestea stimulând diviziunea celulară, germinarea, polenizarea, precum și dezvoltarea florilor și a fructelor. Modificarea concentrației aminelor biogene la nivelul rădăcinilor plantelor poate avea loc atunci când acestea sunt atacate de agenți patogeni, dar s-a constatat în același timp că și microorganismele benefice din sol dezvoltă mecanisme specifice pentru a induce creșterea nivelului de amine biogene la nivelul plantelor. Poliamine precum putresceină sunt secretate de rizobacterii (Azospirillum sp., B. subtilis, B. megaterium, B. mycoides, Pseudomonas sp., Streptomyces sp), care pot induce o creștere a nivelului de poliamine celulare ale plantelor gazdă, îmbunătățind în acest fel rezistența acestora la secetă. De aceea, determinarea nivelul de amine biogene din solurile utilizate pentru creșterea plantele este importantă pentru monitorizarea gradului de stres al acestora.

Pentru animale și oameni, poliaminele provenite din surse endogene îndeplinesc funcții biologice importante, cum ar fi reglarea temperaturii, tensiunii arteriale și a răspunsului imun, și pot avea rolul de neurotransmițători. Poliaminele precum putresceină, cadaverina, spermina și spermidina, joacă un rol important în proliferarea, diferențierea și transformarea celuleor fiziologice și neoplaste. Histamina, putresceină, cadaverina, agmatina, spermidina și spermina sunt considerate indicatori chimici utili pentru estimarea alterării bacteriene a produselor alimentare, în special pește, produse din pește, fructe de mare, brânză, came și alimente fermentate, fiind generate prin decarboxilarea bacteriană a aminoacizilor liberi.

OAQUL DE STAT PENTRU INVENȚII Șl MARC»

Cerere de brevet de Invenție oc 2^2_5 „

I Data depozit........

Microorganismele generatoare de amine biogene în alimente se pot dezvolta fără a produce schimbări perceptibile de gust, miros sau culoare, ceea ce poate genera atingerea unor concentrații crescute de amine biogene, la un nivel periculos pentru siguranța alimentară.

Metodele convenționale de detecție a aminelor biogene se bazează pe cromatografia de lichide de înaltă performanță, spectrometria de masă, electroforeza capilară și cromatografia în strat subțire. Aceste metode sunt costisitoare, necesită personal specializat și nu sunt adecvate pentru determinări in situ, deoarece necesită echipamente complexe și scumpe, cantități crescute de probă și reactivi, precum și un timp de lucru îndelungat, cu etape succesive de prelucrare a probelor.

Deoarece majoritatea aminelor biogene nu absorb lumină în domeniul UV și nu prezintă fluorescență, sunt necesare reacții de derivatizare chimică ce formează substanțe detectabile.

O metodă validată de Comisia Europeană se bazează pe derivatizarea cu clorură de 5dimetilaminonaftalen-l-sulfonil (clorură de dansil), ce reacționează cu histamina la 60 °C, permițând detecția în UV la o lungime de undă de 254 nm, această metodă fiind utilizată pentru detecția histaminei în pește (J. Stroka, K. Bouten, C. Mischke, A. Breidbach, F. Ulberth, EUR 26605. Luxembourg (Luxembourg): Publications Office of the European Union; 2014. JRC89766). Protocolul necesită extracția histaminei din proba alimentară cu acid percloric 0,2 M și separarea pe coloană de tip CI8 folosind un amestec de apă și acetonitriL Metoda prezintă mai multe dezavantajenecesitând etape de pre-tratare, lucrul la temperaturi ridicate și faptul că reactivul de derivatizare este toxic și coroziv.

O altă metodă pentru determinarea putresceinei se bazează pe derivatizarea cu ortoftalaldehidă și acid tioglicolic, care reacționează cu putresceina la 60 °C și permite detecția spectrofotometrică a acesteia la o lungime de undă de 490 nm. (X. Qi, W.-F. Wang, J. Wang, J.-L. Yang, Y.-P. Shi, Food Chemistry, 2018, 259, 245-50). în cazul metodelor care se bazează pe reacții de derivatizare, reactivii utilizați sunt toxici și/sau corozivi,și necesită etape suplimentare de pre-tratare și temperaturi ridicate de lucru .

Brevetul CN116124770A descrie o metodă colorimetrică pentru detecția histaminei bazată pe utilizarea enzimelor peroxidază din hrean (HRP) și diamin oxidază (DAO), coimobilizate pe microsfere de sulfat de cupru, și a 3,3',5,5'-tetrametil-benzidma, un reactiv cromogenic pentru a facilita detecția spectrofotometrică a histaminei. Metoda este complexă și costisitoare prin utilizarea a două enzime, precum și a unei etape suplimentare de sinteză a materialului senzitiv bazat pe microsferele metalice, iar timpul de analiză este relativ îndelungat.

Brevetul CN108330139B descrie dezvoltarea de biosenzori pe bază de culturi celulare de tip Escherichia coli bioluminiscente, modificate cu plasmide recombinante cu un sistem de promotori ce răspund la putresceină și realizează astfel un sistem de detecție bazat pe proteină verde fluorescentă și bioluminiscență pentru determinarea putresceinei din alimente. Metoda permite determinarea calitativă și cantitativă a putresceinei și permite ajustarea domeniul liniar de răspuns prin schimbarea nivelului de expresie a mediului de cultură pentru elementul de recunoaștere al putresceinei. Sistemul este însă costisitor, necesitând etape multiple de preparare, datorită utilizării de linii celulare modificate, iar protocolul de detecție prevede o etapă de incubare de 20 de ore.

Avantajele metodelor electrochimice în detecția aminelor biogene constau în detecția rapidă și sensibilă a analiților de interes, utilizând volume mici de reactivi sau probă și permit adaptarea la sisteme de detecție portabile ce pot fi utilizate în teren. în literatură sunt prezentate metode de determinare electrochimică a aminelor biogene din probe alimenatare (R. Torre, E. Costa-Rama, H.P.A. Nouws, C. Delerue-Matos, Journal of Analytical Science and Technology, 2020. 11, 5; C. Kațar, P.E. Erden, B. Dalkiran, E.K. înal, E. Kiliț, 2020, 412, 1933-46; H.-q. Xia, Y. Kitazumi, O. Shirai, H. Ohta, S. Kurihara, K. Kano, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2017, 804, 128-32;) utilizând electrozi modificați cu diferite nanomateriale compozite și enzime precumdiamin oxidază (DAO), monoamin oxidază (MAO), putrescein oxidază și peroxidaza din hrean (HRP).

In cazul metodelor electrochimice, concentrația de apă oxigenată produsă în mediul de reacție este direct proporțională cu concentrația de amină biogenă, în consecință detecția sensibilă a apei oxigenate reprezintă un element important în dezvoltarea de biosenzori pentru detecția aminelor biogene. Detecția apei oxigenate cu ajutorul electrozilor nemodificați prezintă dezavantajul reducerii electrochimice a acesteia la o valoare crescută a potențialului aplicat, ceea ce conduce la interferențe din partea reducerii altor compuși prezenți în matricea probei și în special a oxigenului difuzat în soluție. Pentru a elimina aceste dezavantaje se folosesc diferite nanomateriale electroconductive care măresc suprafața activă a senzorului, intensificândprocesele cu transfer de electroni și favorizând astfel reducerea apei oxigenate la suprafața senzorului electrochimie la o valoare scăzută a potențialului aplicat.i. Exemple de nanomateriale utilizate pentru a îmbunătății caracteristicile de răspuns ale senzorilor electrochimici pentru detecția apei oxigenate sunt cele pe bază de carbon, nanoparticule metalice și mediatorii redox.t. Sisteme bi-enzimatice utilizate în realizarea biosenzorilor pentru detecția de amine biogene se bazează pe folosirea unei amin oxidaze (MAO sau DAO) împreună cu HRP, cu rol de mediator al procesului cu transfer de electroni între apa oxigenată rezultată din oxidarea aminelor biogene și suprafața senzorului. Utilizarea de enzime precum DAO și MAO împreună cu diferite nanomateriale, cum ar fi nanotuburile de carbon, nanoparticulele de aur, zinc sau platină, în realizarea senzorilor electrochimici îmbunătățește sensibilitatea detecției analitului de interes, prin utilizarea unor valori scăzute ale potențialului aplicat.

Brevetul US8551309B2 descrie determinarea histaminei din probe de pește și produse marine cu ajutorul unui biosenzor electrochimie bazat pe un electrod serigrafiat modificat cu mediatorul redox hexacianoferat de potasiu (III) și o matrice de poli(2-hidroxietil metacrilat) (PhotoHEMA) pentru imobilizarea enzimei diamin oxidazăi. Matricea și imobilizarea enzimei se realizează printr-un proces complex, într-o primă etapă se amestecă 2-hidroxietil metacrilat cu un reactiv fotoinițiator, 2'-dimetoxi-fenil acetofenonă, iar depunerea amestecului împreună cu enzima pe suprafața senzorului modificat cu mediator redox are loc prin expunere la UV, sub un curent de azot, timp de 300 de secunde. Detecția histaminei a fost efectuată amperometric la valori ale potențialului aplicat între 0,30 V și 0,50 V. Procedeul de detecție are la bază oxidarea electrochimică a imidazol-4-acetaldehidei rezultată în reacțiade oxidare enzimatică a histaminei. Metoda de prepararea a biosenzorului este laborioasă iar detecția aminei are loc la valori de potențial ridicate, putând fi influențată de alte specii interferențe din matricea analizată.

Pentru a reduce efectele speciilor interferențe este necesară realizarea unui material electrosenzitiv care să permită determinarea rapidă, sensibilă și selectivă a aminelor biogene din soluția solurilor, alimente și băuturi, prin operare la potențial scăzut.

Problema tehnică pe care o rezolvă această invenție constă în realizarea unor biosenzori sensibili și miniaturizați modificați cu un material electrosenzitiv și cu matrice de încorporare a enzimelor specifice, DAO și respectiv MAO pentru detecția aminelor biogene, putresceină din sol și histamină din alimente și băuturi pe baza detecției electrochimice.Materialul electrosenzitiv a fost obținut prin precipitarea directă a mediatorului redox Albastru de Prusia (PB) pe nanotuburi de carbon cu un singur perete (SWCNT). Acest material a fost depus pe suprafața electrodului de lucru realizat din pastă de cărbune imprimată pe suport ceramic sau PVC, permițând determinarea sensibilă a apei oxigenate.

Procedeul de realizare a materialului electrosensibil a constat în amestecarea unei cantități de 0,2....10 mg SWCNT cu o soluție de mediator redox Albastru de Prusia obținută prin amestecarea unor volume egale de 10.....500 pL fericianură de potasiu și respectiv clorură ferică, preparate în soluție de acid clorhidric 2....20 mM. Acest amestec a fost omogenizat prin vortexare și ultrasonare într-o baie de ultrasunete, timp de 1.....60 minute și un volum de 2....50 pL amestec a fost depus pe suprafața electrodului de lucru din pasta de cărbune. Senzorul astfel modificat a fost uscat timp de 30...250 minute în etuvă, la o temperatură de 30....100 °C.

Matricea sol-gel pentru imobilizarea enzimei DAO a fost obținută prin amestecarea a: 0,5....50 pL tetraetoxisilan, 0,5...50 pL metil trietoxisilan, 5...100 pL HC1 1 mM, 5...100 pL apă distilată și 1....50 pL polietilenglicol cu grad de reticulare de 250...750. Amestecul rezultat a fost omogenizat și sonicat pentru 5.......60 minute pentru a permite hidroliza monomerului, după care “sol”-ul a fost menținut pentru 2...10 ore la temperatură de 0....10 °C pentru a permite formarea gelului.

Matricea polimericâ pentru imobilizarea enzimei MAO a fost obținută prin prepararea unei soluții de chitosan de masă moleculară mică, de concentrație 0,01...10% realizată în acid acetic de concentrație 1...10%.

Biosenzorul specific pentru putresceină a fost obținut prin imobilizarea pe suprafața senzorului modificat cu acest material electrosenzitiv a enzimei DAO prin încorporare în matricea de sol-gel. Matricea de sol-gel a fost amestecată cu 1....50 mg enzimă DAO în raport volumetric egal, și un volum de 2...25 pL din acest amestec se depune pe suprafața senzorului modificat cu material electrosenzitiv.

Biosenzorul specific pentru histaminâ a fost obținut prin imobilizarea pe suprafața senzorului modificat cu materialul electrosenzitiv a enzimei MAO, folosind matricea polimerică de chitosan. Soluția de chitosan a fost amestecată cu 1......50 pL soluție MAO, în raport volumetric egal, și un volum de 2...20 pL din acest amestec a fost depus pe suprafața senzorului modificat cu material electrosenzitiv SWCNT-PB.

Metoda de determinare a aminelor biogene din soluția solului și alimente conform invenției constă în utilizarea platformelor bio-electrosenzitive, procesul de reducere a apei oxigenate care rezultă prin oxidarea enzimaticâ a aminelor biogene la suprafața biosenzorilor, fiind monitorizat direct prin detecție electrochimică.

Principiul general de determinare a aminelor biogene se bazează în general pe determinarea concentrației de apă oxigenată care se formează, conform următoarei secvențe de reacții (Ecuațiile 1 și 2):

H₂N. H₂N.

TT o DAO/MAO

Ț ^nh2+H₂O + O₂ -----------► Ț ° + NHj + H₂O₂ (1)

R R

H2O2 + 2e' -► 2 OH' (2)

Transferul direct de electroni la flavoenzime este foarte dificil de realizat, întrucât unitatea FAD este adânc înrădăcinată într-un înveliș protector al enzimei. Astfel, nanotuburile de carbon cu un singur perete și mediatorul redox Albastru de Prusia (PB) au arătat o comunicare electrochimică foarte bună cu proteinele având un centru redox apropiat de suprafața acestora.

Ecuațiile 3 și 4 prezintă reacțiile implicate în procesul de reducere electrochimică a apei oxigenate mediate de Albastrul de Prusia.

PB_rcd + 2H₂O₂ -* PB_0X + 4K⁺ + 4ΟΙΓ (3)

PBox + 4e «-> PBred (4)

Detecția electrochimică a aminelor biogene este realizată amperometric prin măsurarea curentului rezultat în urma reacției de reducere a apei oxigenate care se formează în urma reacției enzimaticela suprafața biosenzorului, la un potențial aplicat de -0,3 V....+0,3 V, în tampon fosfat pH 6....9.

Acești biosenzori miniaturizați oferă avantaje precum utilizarea unor cantități reduse de nanomateriale și enzime, sunt ieftini, pot fi adaptați cu ușurință pentru detecția rapidă, sensibilă și selectivă a diferitelor amine biogene și asigură detecția analitului de interes în volume mici de probă.

Procedeul de obținere a biosenzorilor și metoda de analiză pot fi utilizate pentru determinarea concentrației de amine biogene din probe lichide, din mediu și alimente/băuturi, cu pH-ul 6.....9. Pentru aplicarea metodei de analiză este necesară trasarea graficului de calibrare pentru fiecare amină biogenă de interes, la pH-ul optim enzimei utilizate în realizarea biosenzorului.

Dreapta de calibrare pentru amina biogenă se realizează prin plasarea biosenzorului electrochimie modificat conform invenției într-o celulă electrochimică ce conține tampon fosfat cu pH 6,....9, înregistrându-se semnalul de bază al senzorului pentru valori ale potențialului aplicat de la -0,3 V....+0,3 V față de electrodul de referință din Ag. După stabilizarea semnalului de bază, se efectuează adiții succesive a unor soluții de amină biogenă de concentrații diferite și se înregistrează semnalul analitic corespunzător fiecărei concentrații adăugate.Dreapta de calibrare se obține prin reprezentarea grafică a diferenței dintre semnalul analitic înregistrat pentru fiecare concentrație de amină biogenă (Iba) și semnalul electrochimie înregistrat pentru linia de bază (Ibiank), anume ΙβΑ-Ibiank, în funcție de concentrația de amină biogenă standard utilizată, obținându-se o ecuație cu 2 parametrii.

Analiza unei probe de soluție a solului ce conține o cantitate necunoscută de amină biogenă se realizează prin înregistrarea semnalului de bază, notat cu Ibiank, prin polarizarea biosenzorului specific la o valoare de potențial de -0,3 V....+0,3 V după ce se plasează pe suprafața acestuia un volum de 50....500 pL soluție tampon fosfat, pH 6...9. După înregistrarea semnalului de bază, suprafața biosenzorului se spală cu apă distilată și biosenzorul este introdus în soluția solului, înregistrându-se semnalul corespunzător concentrației de amină biogenă aflată în proba analizată, semnal notat cu Iba. Concentrația de amină este calculată prin interpolarea diferenței ΙβΑ-Ibiank pe graficul de calibrare corespunzător aminei biogene de interes.

Analiza unei probe de băutură sau soluția extrasă a alimentului ce conține o cantitate necunoscută de amină biogenă se realizează prin înregistrarea semnalului de bază, notat cu Ibiank, prin polarizarea biosenzorului specific la o valoare de potențial de -0,3 V....+0,3 V după ce se plasează pe suprafața acestuia un volum de 50....500 pL soluție tampon fosfat pH 6...9. După înregistrarea semnalului de bază, se adaugă un volum de 50....500 pL din soluția de probă alimentară, înregistrându-se semnalul corespunzător concentrației de amină biogenă aflată în proba analizată, semnal notat cu Iba- Concentrația de amină este calculată prin interpolarea diferenței IBA-Ibiank pe graficul de calibrare corespunzător aminei biogene de interes.

Avantajele acestei invenții sunt următoarele:

Procedeul de realizare a platformei electrosenzitive este simplu și rapid, prin faptul că nanomaterialul bazat pe nanotuburi de carbon cu un singur perete (SWCNT) și mediatorul redox, Albastru de Prusia, se depune facil pe suprafața activă a unui electrod de lucru serigrafiat din pastă de cărbune;

Procedeele de obținere a matricilor de sol-gel și chitosan pentru încorporarea enzimelor diamin și respectiv monoamin oxidaze sunt simple, reproductibile și ieftine;

Metoda de detecție a apei oxigenate cu ajutorul platformei electrosenzitive dezvoltate conform invenției este sensibilă și precisă, se realizează la potențial de operare scăzut, fără a fi afectată de alte specii interferențe și fără să necesite barbotare de argon sau azot pentru a elimina oxigenul din probă;

Procedeul de realizare a biosenzorilor specifici pentru amine biogene folosind platforma electrosenzitivă dezvoltată conform invenției este simplu, reproductibil și specific, nu necesită utilizarea unei a doua enzime precum peroxidaza din hrean pentru a realiza detecția amperometrică a apei oxigenate care se formează în reacția oxidării enzimatice a poliaminelor, și pot fi reutilizați;

Metoda de determinare a putresceinei și histaminei utilizând biosenzorii specifici dezvoltați conform invențieicu nanomaterialul electrosenzitiv SWCNT-PB este sensibilă, selectivă, rapidă și precisă.

Metoda de determinare a aminelor biogene bazată pe detecția amperometrică utilizând biosenzorii electrochimici miniaturizați realizați conform invenției poate fi utilizată pentru probe complexe de soluție de sol, băuturi sau produse alimentare.

în continuare, în legătură cu Figurile 1......7 este prezentat modul de aplicare a invenției pentru determinarea aminelor biogene, putresceină și histamină din soluții de sol și alimente:

Figura 1 prezintă voltamogramele ciclice înregistrate pentru senzorul electrochimie bazat pe SWCNT-PB dezvoltat conform invenției, introdus în soluție de tampon fosfat de concentrație 0,1 M, pH 7,5, în absența și în prezența apei oxigenate de concentrații în domeniul 1.... 5 mM Se observă creșterea în intensitate a picurilor catodice, concomitent cu scăderea celor anodice, ceea ce demonstrează comportamentul electrocatalitic excelent al nanomaterialului în reducerea apei oxigenate.

Pentru determinarea aminelor biogene din probe lichide prin intermediul biosenzorilor electrochimici specifici, este necesară o optimizare a pH-ului și a potențialului aplicat în amperometrie.

Figura 2 prezintă voltamogramele ciclice înregistrate pentru optimizarea valorii de pH a soluției de tampon care va fi utilizată pentru detecția de amine biogene. Senzorul electrochimie bazat pe SWCNT-PB dezvoltat conform invenției a fost introdus în soluții de tampon acetat 0,1 M,pH 5, și în tampon fosfat O,1M, pH6.....9, în prezență unei concentrații de 1 mM apă oxigenată.

Folosind valorile de potențial optime cuprinse între - 0.3....+0.3 V vs Ag/AgCl a fost realizată calibrarea senzorului redată în Figura 3 și au fost obținute dreptele de calibrare pentru apă oxigenată din Figura 4, utilizând senzorul electrochimie miniaturizat realizat conform invenției și detecția amperometrică pentru diferite valori de pH. Astfel, determinarea apei oxigenate se poate realiza într-un domeniu de concentrații cuprins între 0,01.....2,5 mM, cu o sensibilitate specifică de 100.....250 mAM'cm^-2 și o limită de detecție de 2...10 μΜ analit. Limita de cuantificare a apei oxigenate utilizând senzorul realizat conform invenției este de 7...30 μΜ apă oxigenată.

Figura 5 prezintă stabilitatea senzorului electrochimie bazat pe nanomaterialul SWCNTPB dezvoltat conform invenției, determinată prin înregistrarea răspunsului amperometrie într-o soluție de tampon fosfat 0,1 M, pH 7,5, conținând apă oxigenată de concentrație 0,5 mM, și un potențial de polarizare cuprins între -0,3.....+0,3 V vs Ag/AgCl. Se observă că senzorul electrochimie dezvoltat conform invenției prezintă un răspuns stabil pentru cel puțin 20 de adiții succesive de apă oxigenată, deviația relativă standard a răspunsului fiind de 2...6%.

Figura 6 prezintă dreapta de calibrare pentru putresceină, înregistrată utilizând biosenzorul amperometrie pe bază de DAO realizat conform invenției, pentru adiții succesive de putresceină în tampon fosfat 0,1 M, pH 6....8. Determinarea putresceinei se poate realiza într-un domeniu de concentrație cuprins între 0,02......1 mM, cu o sensibilitate specifică de 50.....200 mA M ' cm'² și o limită de detecție de 2...10 μΜ. Limita de cuantificare a putresceinei utilizând biosensorul bazat pe DAO realizat conform invenției este de 10...40 μΜ.

Figura 7 prezintă dreapta de calibrare pentru histamină, înregistrată utilizând biosenzorul amperometrie pe bază de MAO realizat conform invenției, pentru adiții succesive de histamină în tampon fosfat 0,1 M, pH 7....9. Determinarea histaminei se poate realiza într-un domeniu de concentrație cuprins între 0,06......5 mM, cu o sensibilitate specifică de 5.....25 mA^M'^cm'² și o limită de detecție de 20...60 μΜ. Limita de cuantificare a histaminei utilizând biosensorul bazat pe MAO realizat conform invenției este de 80...250 μΜ.

în continuare sunt prezentate șase exemple de realizare a senzorului electrochimie bazat pe nanomaterial SWCNT-PB și a biosenzorilor miniaturizați amperometrici pentru detecția aminelor biogene, putresceină și histamină, conform descrierii invenției.

Exemplul 1

Un amestec de fericianură de potasiu și clorură ferică realizat în acid clorhidric 0.0IM, în raport volumetric egal, încorporând nanotuburi de carbon cu un singur perete (SWCNT) în concentrație de 2 mg/mL a fost depus pe suprafața unui electrod de lucru din pastă de cărbune depus pe suport flexibil de PVC, prin plasarea pe suprafața electroactivă a acestuia a unui volum de 10 pL amestec. Senzorul astfel modificat a fost uscat în etuvă pentru 180 minute, la o temperatură de 65°C. Sensibilitatea specifică a senzorului electrochimie bazat pe nanomaterialul SWCNT și mediatorul redox PB pentru detecția apei oxigenate este de 83,96 mA-M'¹-cnT² pentru pH 6, de 215,1 mA-M^-cm'² pentru pH 7 și respectiv de 26,26 mA-M '-cm'² pentru pH 8.

Exemplul 2

Un amestec de 200 pL fericianură de potasiu și 200 pL clorură ferică realizat în acid clorhidric 0.0IM, încorporând nanotuburi de carbon cu un singur perete (SWCNT) în concentrație de 2,5 mg/mL a fost depus pe suprafața unui electrod de lucru din pastă de cărbune depus pe suport flexibil de PVC, prin plasarea pe suprafața electroactivă a acestuia a unui volum de 5 pL amestec. Senzorul astfel modificat a fost uscat în etuvă pentru 60 minute, la o temperatură de 65°C. Sensibilitatea specifică a senzorului electrochimie bazat pe nanomaterialul SWCNT și mediatorul redox PB pentru detecția apei oxigenate este de 68,3 mA-M ’-cm^-2 pentru pH 6, de 195,46 mA'M'-cm'² pentru pH 7 și respectiv de 19,82 mA-M'^cm'² pentru pH 8.

Exemplul 3

Un amestec de matrice de sol-gel încorporând enzima diamin oxidază (DAO) în concentrație de 20 mg/mL este depus pe suprafața electrodului modificat cu nanomaterial pe bază de SWCNT și Albastru de Prusia conform Exemplului 1, prin plasarea pe suprafața electroactivă a acestuia a unui volum de 10 pL amestec sol-gel și enzimă DAO. Biosenzorul fost păstrat timp de 24 ore la o temperatură de 4°C. Sensibilitatea specifică a biosenzorului astfel realizat pentru detecția putresceinei este de 152,31 mA-M '-cm'² pentru pH 7,4.

Exemplul 4

Un amestec de matrice sol-gel încorporând enzima diamin oxidază (DAO) în concentrație de 15 mg/mL este depus pe suprafața electrodului modificat cu nanomaterial pe bază de SWCNT și Albastru de Prusia conform Exemplului 2, prin plasarea pe suprafața electroactivă a acestuia a unui volum de 5 pL amestec sol-gel și enzimă DAO. Biosenzorul fost păstrat timp de 24 ore la o temperatură de 4°C. Sensibilitatea specifică a biosenzorului astfel realizat pentru detecția putresceinei este de 90,36 ηιΑ-Μ'¹™'² pentru pH 7,4.

Exemplul 5

Un amestec de matrice polimerică de chitosan cu masă moleculară mică și concentrație 0,1% realizat în acid acetic 2%, încorporând 10 pL de enzimă monoamin oxidază (MAO) a fost depus pe suprafața electrodului modificat cu nanomaterial pe bază de SWCNT și Albastru de Prusia, conform Exemplului 1, prin plasarea pe suprafața electroactivă a acestuia a unui volum de 10 pL amestec chitosan și enzimă MAO. Biosenzorul fost păstrat timp de 24 ore la o temperatură de 4 °C. Sensibilitatea biosenzorului astfel realizat pentru detecția histaminei este de 6,29 mA-M'cm'² pentru pH 9.

Exemplul 6

Un amestec de matrice polimerică de chitosan cu masă moleculară mică și concentrație 0,1% realizat în acid acetic 2%, încorporând 5 pL de enzimă monoamin oxidază (MAO) a fost depus pe suprafața electrodului modificat cu nanomaterial pe bază de SWCNT și Albastru de Prusia conform Exemplului 2, prin plasarea pe suprafața electroactivă a acestuia a unui volum de 5 pL amestec chitosan și enzimă MAO. Biosenzorul fost păstrat timp de 24 ore la o temperatură de 4 °C. Sensibilitatea biosenzorului astfel realizat pentru detecția histaminei este de 1,1 mA-M^-cm'² pentru pH 9.

Claims (5)

REVENDICĂRI

1. Procedeu de obținere a unui senzor electrochimie miniaturizat pentru determinarea sensibilă și selectivă a apei oxigenate bazat pe un material electrosenzitiv, caracterizat prin aceea că se amestecă o soluție de mediator redox Albastru de Prusia obținută prin amestecarea unor volume egale de 10.....500 gL fericianură de potasiu cu clorură ferică, preparate în soluție de acid clorhidric 2....20 mM, cu nano tuburi de carbon cu un singur perete (SWCNT) de concentrație 0,2....10 mg/mL până la obținerea unui amestec omogen, care se depune pe suprafața electrodului de lucru din pasta de cărbune al unui senzor serigrafiat realizat pe suport din material ceramic sau PVC, prin pipetarea a 2...50 gL, se usucă în etuvă la o temperatură de 30...100 °C, timp de 30...250 minute și este utilizat pentru depunerea pe suprafața sa a unui volum de 2...20 μΕ: (1) amestec de enzimă DAO de concentrație 1...50 mg în matrice de sol-gel, preparată prin amestecarea a 1....10 gL tetraetoxisilan, 2...25 gL metil trietoxisilan, 1....50 pL polietilenglicol cu 250...750 de monomeri și 10...100 pL HC1 1 mM; și (2) amestec de enzimă MAO de concentrație 1....50 mg în soluție de chitosan de concentrație 0,01...10% realizată în acid acetic de concentrație 1...10%, biosenzorii obținuți după ce se usucă la o temperatură de 0...40 °C, timp de 5...60 minute se păstrează la o temperatură de 0.....10 °C până la utilizare.

2. Senzor electrochimie, realizat conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, posedă o componentă electroactivă formată din matrice conținând nanotuburi de carbon cu un singur perete și mediatorul redox Albastru de Prusia precipitat pe pereții acestor nanotuburi, depusă fizic pe suprafața activă a electrodului de lucru din pastă de cărbune al unui senzor serigrafiat realizat pe suport ceramic sau PVC.

3. Biosenzori amperometrici realizați conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, posedă două componente biosenzitive formate din matrice de sol-gel ce conține enzimă DAO, și o matrice polimerică de chitosan ce conține enzimă MAO, depuse fizic pe suprafața electrosenzitivă a senzorului dezvoltat conform revendicării 2, pentru detecția de putresceină și histamină.

4. Metoda de analiză a putresceinei din soluția solului, caracterizată prin aceea că biosenzorul bazat pe DAO realizat conform revendicării 3, se plasează în soluția solului, se polarizează la un potențial în intervalul -0,3....+0,3 V vs Ag/AgCl, corespunzător pH-ului soluției solului se înregistrează valoarea curentului catodic, care se interpolează pe curba de calibrare, răspunsul amperometric al biosenzorului bazat pe DAO fiind direct proporțional cu concentrația de putresceină din proba analizată.

5. Metoda de analiză a histaminei din alimente și băuturi, caracterizată prin aceea că biosenzorul bazat pe MAO realizat conform revendicării 3, se plasează în proba alimentară

lichidă, se polarizează la un potențial în intervalul -0,3....+0,3 V vs Ag/AgCl, la pH 6....8, se înregistrează valoarea curentului catodic, care se interpolează pe curba de calibrare, răspunsul amperometric al biosenzorului bazat pe MAO fiind direct proporțional cu concentrația de histamină din proba analizată.