RO137195A2 - Procedeu de obţinere cipuri cu film senzitiv pentru detecţie continuă de glucoză din saliva umană - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unor cipuri utilizate pentru detecţia rapidă şi continuă a glucozei din salivă. Procedeul conform invenţiei are etapele: a. realizarea designului cipului pe o plachetă de ceramică prin litografierea cu laser de mare rezoluţie, b. realizarea a 55 de cipuri pe suport de ceramică care conţin 3 electrozi, unul de lucru din Pt, electrodul de referinţă din Ag şi contraelectrodul din Pt, c. tăierea cipurilor la dimensiuni de 20 x 4,1...5 mm, d. sinteza a 25 mL soluţie S1 care conţine 140 μ m anilină în acid sulfuric 0,5 M, între 0,009...0,014% SWCNT în apă deionizată şi 0,1% PSS, e. omogenizarea soluţiei S1 prin ultrasonare puternică, f. introducerea a 4 cipuri într-o casetă special realizată, compatibilă cu un minipotenţiostat, g. pipetarea a 30 μ L de S1 pe electrodul de lucru al fiecărui cip şi electrodepunerea a 10 cicluri prin CV a soluţiei S1, h. formarea unui film compozit cu structură poroasă şi nanotubulară de PANI/SWCNT pe platina cu grosimi cuprinse între 324,2...332 nm, g. prepararea a 6 mL de soluţie S2formată din 15 mg/mL de GOX în PBS cu Ph = 7,1, i. adăugarea peste soluţia S2 a 1 mL de 150 mM clorură de 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida şi a 1 mL de 150 mM N-hidroxisuccinimidă NHS rezultând soluţia S3, j. incubarea S3 la temperatura camerei timp de 30 minute, k. sinteza soluţiei S4 formată din amestec volumic egal de CS de 0,5...1% în 50 mM acid acetic şi 15 mM de 1,2-Dimetilferocen în etanol, l. sinteza soluţiei S5 formată prin amestecarea soluţiilor S3 şi S4 în volume egale, m. incubarea soluţiei S5 la 4°C pentru 16...18 ore, n. pipetarea de trei ori a soluţiei S5 pe electrozii de lucru în volume repetate de câte 15 μ L cu uscare, între pipetări la frigider la 4°C, o. verificarea prezenţeiferocenului în film, p. adăugare a câte 10 μ L din fiecare şapte concentraţii standard de glucoză, s. formarea unui gel pe electrodul de lucru şi t. după uscare se păstrarează la 4°C.

Description

PROCEDEU DE OBȚINERE CIPURI CU FILM SENZITIV PENTRU

DETECȚIE CONTINUA DE GLUCOZA DIN SALIVA UMANA brciUL Di STAT PSiMU Ι,ίΛ'φ Și MĂBCi I Cerere ce brevet de invenție

DESCRIEREA INVENȚIEI j Nr. .3...^.2(...96...:.9.9..:.'

Invenția se refera la procedeul de obținere a unui cip de dimensiuni mici ce conține un film senzitiv pentru detecția rapida, continua, cronoamperometrică a glucozei din saliva umană. Cipul este format dintr-un suport de ceramica pe care au fost configurati prin tehnica litografica 3 electrozi contraelectrodul din platina, electrodul de referință din argint si electrodul de lucru, din platina. Electrodul de lucru este acoperit de un film sensibil subțire pentru determinarea rapida a glucozei din probe de saliva, format din nanotuburi de carbon cu un singur perete ( SWCNT) si polianilina (PANI) depuse prin 10 cicluri de electropolimerizare vs Ag/AgCl pe care s-a imobilizat prin imersie enzima glucooxidaza (GOx) si un mediatorul chimic incorporat in chitosan.

Federația Internațională pentru Diabet estimează o creștere de 55% a numărului de persoane cu diabet până în 2035 [1],

Monitorizarea nivelului glicemiei (prin determinarea glucozei) este în prezent singura metodă recunoscută și utilizată pe scară largă pentru diagnosticul și controlul diabetului. Diagnostic rapid, tratamentul la timp și monitorizarea continuă sunt deosebit de importante pentru calitatea vieții pacienților și pentru a evita complicații care pot apărea precum probleme circulatorii, insuficiență renală, boli de inimă, accident vascular cerebral și orbire [2,3]. Exista numeroase teste pe piața, unele cu testare minim invaziva sau invazive :

• glucometrele care utilizează probe de sânge din deget de mai multe ori pe zi pentru pacientii diabetici (Accu-Check, compania Roche );

• dispozitiv portabil care masoara glucoza extrasa electroosmotic din piele (GlucoWatch)[4] • detecția glucozei printr-o metoda optica numita”Spectroscopia de ocluzie”(OrSense NBM furnizat de OrSense Ltd.)[5]

Fiecare din aceste dispozitive prezintă dezavantaje prin disconfortul pe care le provoacă, mai ales in cazul senzorilor care necesita prelevare de sânge prin înțepare periodica. Alte dezavantaje sunt legate de partea tehnica, de exemplu cel care masoara glucoza cu ajutorul electroosmozei prezintă dificultate in utilizare datorita procesului de colectare a transpirației la locul senzorului ceea ce a dus la un nivel de precizie scăzut. Totodată, senzorii subcutanati de glucoza trebuie indepartati după trei pana la șapte zile pentru a preveni inflamatia si încapsularea ulterioara a unor impurități pune in pericol fiabilitatea senzorului. Metodele care îmbunătățesc transportul analitului (glucoză, oxigen) către senzorii interiori ar putea permite senzorilor să măsoare în mod fiabil concentrațiile de glucoză interstițială timp de câteva săptămâni, spre deosebire de zile [6]. Astfel, senzorul de glucoză implantabil de la GlySens este un implant pe termen lung care durează 1 an sau mai mult și nu necesită calibrări continue. Implantul constă dintr-un senzor de glucoză integrat cu circuite de condiționare a semnalului, un circuit de telemetrie iară fir și o baterie cu o durată de viață de 1 an, toate adăpostite într-o carcasă de titan închisă ermetic. Legătura fără frecvență radio (RF) comunică cu un receptor extern care asigură monitorizarea continuă a glucozei [6],

Cercetările in domeniu si studiile clinice au demonstrat ca noile Sisteme de Monitorizare Continuă a Glicemiei (Continuous Glucose Monitoring - CGM) reprezintă candidatul ideal pentru următoarea generație de dispozitive care vor înlocui clasicele Glucometre portabile utilizate pe scara larga în prezent [7]. Ele au revoluționat efectiv monitorizarea bolnavilor de diabet prin funcțiile pe care le au si ușurința utilizării in ambulatoriu [8]. In prezent, pe piața exista următoarele produse reprezentative: Medtronic Minimed 5 3 OG, 640G [https://www.medtronicdiabetes.com/home}', Dexcom G4, G5 \https://www.dexcom.com/%,6cgm-system]: Freestyle Navigator II [https://freestylediabetes.co.uk}.

Majoritatea biosenzorilor pentru glucoză comerciali sunt de tip electrochimie, cu detecție amperometrica datorită sensibilității și reproductibilității lor dovedite, întreținerii ușoare, precum și a costului redus al acestora. Gama de probe studiate pentru a efectua o măsurare neinvazivă este, de asemenea, foarte larga. Detectarea nivelului de glucoză la nivelul pielii sau al vaselor de sânge sunt cele mai cercetate. Dar recent tehnicile care permit o detectare la nivelul ochiului sau din saliva sunt, de asemenea, luate în considerare atunci când se urmărește dezvoltarea unui senzor neinvaziv de monitorizare a glucozei. Printre firmele care dețin patente amintim : Abbott, Animas Technologies, Bayer Healthcare, Cercacor, Cygnus, Futrex, Google, Hitachi, InLight Solutions, Integrity Applications, Masimo Laboratories, Olympus, Omron, OptiScan, OrSense, Panasonic, Philips, Roche Diagnostic, Samsung Electronics, Sensys Medical.

Este cunoscut primul exemplu de senzor subcutanat realizat in patentul US005593852 (A) in care s-a validat detecția glucozei din tesut subcutanat cu ajutorul unui senzor amperometric enzimatic care este bazat pe un fir de aur pe care se pun 3 sau 4 (opțional), doua dintre straturi cu rol de eliminare a interferențelor si unul format dintr-un hydrogel in care se afla GOx. Stratul de detectare a glucozei a fost realizat prin reticulare si este format din glucoză oxidază modificată genetic (rGOX) (35% puritate, Chiron Corp., Emeryviile, California) împreuna cu un polimer derivat din poli (vinilimidazol) (PVI) legat de complexul de osmiu (PVI-Os).

In ceea ce privește senzorii neinvazivi, este cunoscut patentul mai recent US 2017 / 0325724 (Al) in care autorii au dezvoltat un senzor pentru detecția glucozei care se ataseaza pe piele. Stratul senzitiv conține GOx stabilizata in BSA si chitosan pentru protecția stratului enzimatic si este depus pe electrozi iontoforetici. Aceștia provoacă transpirația si o data cu ea analitii specifici precum, acidul lactic si glucoza. Glucoza poate fi detectata selectiv cu GOx iar acidul lactic cu o alta enzima lactaza.

Este cunoscut si patentul US 2010/0288633 Al care a realizat un electrod (sau optod) sensibil pentru detecția glucozei acoperit cu membrane polianionice saau policationice pentru a înlătură eventualele interferențe din proba(urati, ascorbat si paracetamol) depuse prin tehnica layer-bylayer (LbL). Scopul acestor membrane este de a previni fluxul de current interferent datorata unor conoscuti compuși care ar putea interfera cum este vitamina C sau paracetamolul. De asemenea este cunoscut si patentul chinez CN102920465A care utilizează membrane exterioare biocompatibile de încapsulare pentru senzorii enzimatici subcutanati care pot preveni formarea țesutului fibros care s-ar forma in jurul electrodului de lucru si astfel măresc durata de viata a senzorului cu monitorizare continua.

Au existat mai multe încercări de către diverse companii de a realiza senzori cat mai putini invazivi, încercări care au dus la comercializarea unor astfel de dispositive. Astfel, in 2019 WaveForm Technologies Inc. si A. Menarini Diagnostics au făcut un parteneriat pentru a comercializa un sensor amperometric transdermic bazat pe GOx care comparat cu senzorul Dexcom G5 CGM a demonstrat o medie a deviației relative absolute (MARD) de 11% https://www.menarinidiagnostics.com/Portals/20/immagini contenuti/News/WaveForm Men arini agreement PR O 1 April2019.pdf _f

Din punctul de vedere al principiului de detecție al glucozei, de la senzorul enzimatic amperometric, comercializat de Yellow Spring Instrument Inc. (YSI Inc.), au fost dezvoltate mai multe generatii de senzori in care performanta lor a fost mult îmbunătățită mai ales datorita utilizării mediatorilor si nanomaterialelor care au ajutat la transferul electronilor la substrat după reacția GOx cu glucoza. Utilizarea glucozei oxidazei a devenit standardul de aur pentru detectarea glucozei [9,10]. Biosenzorii de glucoză de primă generație se bazează pe utilizarea cosubstratul natural de oxigen și generarea peroxidului de hidrogen care poate fi detectat asa cum se poate vedea in ecuația (1-3). Reacția biocatalitică implică reducerea grupului flavină (FAD) în enzimă prin reacție cu glucoză pentru a da forma redusă a enzimei (FADH2)

GO_X(FAD) + glucoza -> GO_X(FADH₂) + gluconolactona (1) GO_X(FADH₂) + O₂ -> GO_X(FAD) + H₂O₂ (2) H₂O₂ -> 2H⁺ + O₂ + 2e~

Peroxidul de hidrogen este oxidat la electrodul de platina (anod) care recunoaște numărul de electroni transferati după reacția cu enzima a glucozei iar fluxul de electroni transferati este proporțional cu numărul de molecule de glucoza prezente in sânge

In general, aceasta reacție se poate măsură pe un electrod de platina la +0.6 V (vs Ag/AgCI) ceea ce poate duce la citirea interferențelor din probe precum acidul citric, uric si anumite medicamente care prezintă activitate electrochimica in aceasta regiune. Totuși marele dezavantaj a fost ca masurarea amperometrica a formarii peroxidului necesita potențiale crescute de operare pentru a obține o selectivitate înalta.

Biosenzorii de glucoza de a doua generație utilizează pentru imbunatatirea semnalului mediatori artificiali redox (nefiziologici), acceptori de electroni, capabili de a scoate electronii din centrul redox al enzimei si sa-i trimită către suprafața electrodului. Filmul enzimatic poate împiedica acesta reacție si de aceea s-au realizat straturi conductoare electrice in care sa fie imobilizata enzima si cu ajutorul carora electronii mediatorului redox sa poata transfera electronii proveniti din reacția enzimatica către suprafața electrodului. Dar folosirea unor mediatori precum derivatii de ferocen ar putea fi toxici atunci când senzorii sunt utilizati pentru detecția in vivo. In acest sens, autorii studiului realizat de Eloîse Bihar si echipa sa in revista Nature au demonstrat ca incorporarea lor in chitosan scade toxicitate, aceștia obținând un senzor ink-jet printat pe hârtie deosebit de ieftin, cu sensibilitate buna ¹¹. Studiile următoare au acordat un efort considerabil testelor de autotestare pentru glucoza, teste care pot fi utilizate ușor acasa intr-un format prietenos, ușor de utilizat de către personae nespecializate. Asfel, primii senzori amperometrici de autotestare pentru glucoza au fost de marimea unui pix si au fost comercializati de Medisense Inc (ExacTech, 1987)[12]. Aceștia sunt bazati pe principiul senzorilor de generația a doua si detectează glucoza cu ajutorul glucometrelor iar in compoziția stratului sensibil intra glucozooxidaza si mediatori derivati de la feroceni. Din acel an au tot fost introduse pe piața si alte teste de autotestare dar majoritatea au fost comercializat de companii mari cum ar fi Life Scan, Roche Diagnostics, Abbott și Bayer. Tot majoritatea se bazeaza pe mediatori pe baza de derivati de la feroceni cu excepția dispozitivelor Abbot care se bazeaza pe polimer redox pe baza de Osmiu. în toate cazurile, pacientul diabetic înțeapă degetul, așează o picătură de sânge mică pe suprafața de depunere proba a senzorului și se obține concentrația de glucoză (pe un ecran LC) în decurs de 5-30 s.

Deși auto-testarea este considerată un progres major în monitorizarea glucozei, este limitată de numărul de teste permis pe zi deoarece pacientii pentru a fi monitorizati frecvent trebuie sa fie înțepați in deget de mai multe ori ceea ce poate crea evident un disconfort pacientului. De asemenea si folosirea senzorilor de glucoza invazivi cu inserare subcutanata (asa cum sunt sistemele CGM disponibile in prezent pe piața) creeaza disconfort pacientului. De aceea cercetările recente s-au axat pe elaborarea unor tehnici neinvazive de/nasuiare a glucozei

[13,14,15]. Exista numeroase studii clinice [16,17] care propun determinarea glucozei din saliva ca metoda neinvaziva de monitorizare a bolnavilor de diabet, unele demonstrând si existenta unei corelatii bune a nivelului de glucoza salivara cu cel al glucozei serice si capilare

[18]·

Avantajele utilizării acestui cip pentru detecția glucozei sunt legate de faptul ca atunci când se utilizează in condiții in vitro poate detecta in timp real si continuu mai multe probe de saliva pe același cip, el putând fi spalat, uscat si refolosit. Aceasta proprietate este deosebit de importanta mai ales pentru eventualitatea aplicabilității lui in detecția in vivo a glucozei din saliva. Este de mici dimensiuni, poate fi ușor de manevrat, este stabil chiar si la temperatura camerei timp de mai mult de 30 zile. Acest cip este realizat pe substrat de ceramica si acoperit cu polimeri biocompatibili, fara toxicitatate, putând fi ușor atasati de dantura pacientilor pentru a monitoriza in continuu glucoza din saliva. Chiar daca biocompatibilitatea unor polimeri conductivi precum PANI, polipirol, PEDOT poate fi buna totuși exista studii care pot demonstra o anumita citoxicitate a lor. Aceasta citotoxicitate poate proveni de la sinteza acestor polimeri in prezenta agentilor oxidanti (in cazul polianilinei adaugarea de persulfati de amoniu, permanganat). Dar tehnica depunerii acestor polimeri prin electropolimerizare indeparteaza eventuala toxicitate a acestora. Având in vedere ca senzorii dezvoltati in acest studiu vizeaza eventuala funcționare in vivo prin atașarea lui pe un dinte, materialul suport pentru depunerea stratului senzitiv a fost ceramica, un material bine cunoscut ca fiind folosit de mult timp in rețetele stomatologice pentru realizarea unor coroane dentare de exemplu Procera® AllCeram comercializat de Nobel Biocare si In-Ceram® AL (VITA Zahnfabrik) sunt doar cateva din materialele ceramice representative.

Din punct de vedere medical senzorul poate monitoriza neinvaziv, deocamdată in vitro (dar cu potențiala aplicabilitate in vivo), pe parcursul unei zile, concentrația glucozei din saliva la pacientii care trăiesc cu diabet zaharat si care poate varia semnificativ. Variația zilnica in sânge la astfel de pacienti este intre valori foarte mici (hipoglicemie) si valori foarte mari (hiperglicemie) care pot conduce la coma hipoglicemica, cetoacidoza sau coma hiperosmolara. De aceea se recomanda monitorizarea glicemiei pentru menținerea glucozei în limitele admise terapeutic prin administrarea tratamentului. Monitorizarea permanenta a glicemiei consta cel puțin in determinarea de două ori pe zi a glicemiei pentru pacienții cu T2D (diabet de tip 2) și de patru ori pe zi pentru pacienții cu TD1 (diabet de tip 2)¹⁹. Totuși, majoritatea CGMS-urilor disponibile in prezent pe piața utilizează senzori de glucoza invazivi, cu aplicare subcutanata care pe langa faptul ca provoacă disconfort si au un timp de utilizare relativ scurt (pana la 7 zile) pot produce iritarea, inflamarea țesuturilor avand chiar riscul apariției infectării la locul injectării. In cazul bolnavilor aflati in situatii speciale, cum este sarcina la femei, aceste incoveniente pot deveni chiar periculoase. Utilizarea acestui senzor chiar si “in vitro” presupune folosirea probelor de saliva si nu de sânge, probe mai ușor de prelevat si care nu provoacă niciun disconfort pacientilor.

Problema tehnica pe care o rezolva invenția de fata este realizarea unui cip stabil, biocompatibil si un strat sensibil care sa poata fi utilizat pentru detecția in vitro a glucozei din saliva. Acesta poate fi utilizat si in mod continuu, pe o perioada de timp, glucoza din saliva umana. Rezultatele pe probele testate de pacienti au prezentat corelare buna, pozitiva cu metoda alternativa ELISA de detecția a glucozei din saliva umana. Avantajul tehnic al metodei amperometrice de detecție (utilizând senzorul dezvoltat) vs ELISA este rapiditatea si detectarea directa a glucozei fara utilizarea unor reactivi adiacenti de detecție (anticorpi primari, secundari marcati) si a unor timpi lungi de incubare asa cum se intampla in cazul metodei comerciale ELISA. Acest senzor ar putea avea aplicabilitate in vivo prin atașarea lui de dintele pacientului si cu un sistem de transmitere We-fi sa poata trimite datele direct pe telefon. După folosire, se poate clăti cu apa deionizata si se poate refolosi. Domeniul de concentratii pe carele determina este foarte larg putând determina concentratii in saliva mici <10 μΜ/L dar si/concentratii mari

3?

de pana la 10 mM. Un alt avantaj al acestui senzor este ca detectează glucoza din probele de saliva ale pacientilor diabetici (sau nondiabetici) si nu din probe de sânge avantaj care duce la înlăturarea disconfortului pacientului cauzat de înțeparea repetata in degete (si limitata la maxim 7 ori pe zi) pentru determinarea glucozei din sângele capilar. Studiile recente au demonstrat ca utilizarea senzorilor sau metodelor invazive de determinare a glucozei din sânge duce si la creșterea de 2,85 ori a riscului de infectare cu COVID-19 al pacientilor diabetici [20]. Realizarea de metode non-invazive pentru detecția glucozei a persoanelor cu diabet ar putea înlătură sau minimiza acest risc.

Procedeul conform invenției, consta in realizarea design-ului cipului pe placheta de ceramica (conform exemplului 1, Fig.la) cu cei trei electrozi utilizând litografia cu laser de mare rezoluție care realizează masca unei plachete de ceramica cu 55 cipuri conform exemplului 1 (Fig.lb) si apoi urmeaza procedeul tehnologic de fabricare prin litografie (conform exemplului 2, Fig.la) a 55 cipuri, taierea in cipuri de dimensiuni de 20 mm X 4.1mm ... 5 mm conform exemplului 2, Fig.2 (a b,c) si procedeul de sinteza a filmului compozit folosit pentru detecția glucozei care consta in sinteza a 25 mL de Soluție 1 (SI) ce conține 140 μΕ anilina in acid sulfuric 0.5 M la care se adauga intre 0.009 %... 0.014% SWCNT in apa deionizata (Figura 3 a, soluția A) urmeaza apoi adaugarea de 0.1 % PSS si soluția se omogenizează (conform exemplului 3, Fig.3 a, soluția B), urmata de introducerea cipului in caseta special realizata a platformei formata din cipuri, caseta si minipotentiostat (exemplul 4, Figura 3b- A, B, C) apoi pipetarea SI in volum de 30gL pe electrodul de lucru al cipului si electrodepunerea a 10 cicluri prin voltametrie ciclica (CV) a soluției SI (exemplul 4, Figura 4-A) urmata de formarea unui film compozit de culoare verde închis PANI/SWCNT (exemplul 4, Figura4-B) pe platina cu grosimea cuprinsa intre 324.2 nm......332nm cu structura poroasa si nanotubulara verificata prin tehnica SEM (conform exemplului 4, Figura 5) după care prepararea a 6 mL de soluție SI formata din 15mg/mL de GOx in PBS cu pH=7.1 si apoi adaugarea a ImL de 150 mM clorura de l-Etill-3-(3dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) si a 1 mL de 150 mM N-hidroxisuccinimida ( NHS) urmata de incubarea pentru 30 de minute la temperatura camerei si apoi prepararea unei soluții S2 formata din amestec volumetric egal intre CS de 0.5%....1% in 50mM acid acetic si 15mM de 1,2Dimetilferocen (Fc) in etanol urmata de sinteza soluției S3 formata prin amestecarea soluției SI si soluției S2 (v:v), conform exemplului 5 apoi incubarea soluției S3 la 4°C pentru 16-18h urmata de pipetarea soluției S3 pe electrodul de lucru a cipului in volume repetate de cate 15gL, pipetate de 3 ori, cu uscare, intre pipetari la frigider la 4°C si mai departe, după uscare (Figura 6, exemplul 5), verificarea prezentei ferocenului in film demonstrata prin procesul redox aparut in voltametria ciclica (CV) versus curbe voltametrie ciclica ale electrodului de lucru înainte de imobilizarea ferocenului înregistrata prin baleierea potențialului intre....vs Ag/AgCl in apa deionizata (exemplul 5, Figura 7), apoi verificare funcționalității filmului pentru a detecta glucoza in concentratii cunoscute, in apa deionizata, (conform exemplului 6, Figura 8 ) demonstrata prin creșterea rapida a curentului senzorului la contactul cu concentrațiile standard de glucoza in apa deionizata puse fiecare pe senzor in volum de 10gL in ordine crescătoare, creștere de curent detectata cu minipotentiostatul MultiEmSteA³, prin înregistrarea continua a secvenței “Multi Step Amperometry” timp total de 600s...800 s (exemplul 6, Figura 8a), iar după un număr de șapte determinări consecutive de concentratii de glucoza (exemplul 6) are loc formarea unui gel pe electrodul de lucru (exemplul 6, Figura 8b) care după uscare si păstrare la frigider la 4°C urmeaza refolosirea lui pentru detecta din nou glucoza din apa pana la concentrația de lOmM când are loc saturarea (exemplul 6, Figura 8c), urmeaza apoi trasarea curbelor de calibrare utilizând concentratii de glucoza standard realizate in apa deionizata in domeniul 0 -1000μΜ si 1000μΜ- 10000μΜ (conform exemplului 7, Figuri 9 a, b) urmata de detecția glucozei utilizând 80 de probe de saliva de pacienti testate cu metoda amperometrica (exemplul 8) si cu metoda standard ELISA (exemplul 8) după care verificarea existentei unei corelări a rezultatelor standardelor obținute prin cele doua metode utilizând probele de saliva recoltate de la pacienti si apoi verificarea existentei unei corelări intre valorile de glucoza obținute pe probele de saliva/ probele de sânge venos si probe de sânge capilar (exemplul 9).

în continuare, se dau exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1...16, care reprezintă:

- fig. l.a, design cip format conform cu exemplul 1 din : A. contraelectrod, B. electrodul (sau aria) de lucru din platina, C. electrod de referința din argint, D. păduri conectare aparat de măsură din aur, E. substrat de ceramica, F. dimensiune cip întreg« Lx 1 = 5mm x 20mm; b. placheta configurata cu 55 de cipuri;

- fig. 2.a, shema formare straturi cipuri după litografie (conform cu exemplul 2, procedeu tehnologic de fabricare cipuri) in care: 1.strat argint, 2. strat platina; 3.strat crom; 4. placheta ceramica; b. placheta cu 55 cipuri pe suport de ceramica; c.cip final taiat din placheta

- fig. 3.a, soluția SI după sinteza conform exemplului 3 : a. aspect soluție cu SWCNT-COOH nedispersate in apa fara PSS (A) si cu PSS (B). aspect soluție SI după adaugarea de PSS (B, omogena); b. platforma senzori, caseta si aparat: minipotentiostat multi-Chanel „Multi EmStat³”(A); caseta adaptata senzorilor pentru a fi conectati la Minipotentiostat (B); senzori cu soluția SI pregătiți pentru electrodepunere introduși in caseta (C).

- fig. 4a. curbe de voltametria ciclică (CV) in timpul electropolimerizarii anilinei si formarii materialului compozit format din polianilina si SWCNT fucntionalizate cu grupe carboxil (PANI/SWCNT), număr de cicluri 10, viteza de scanare 50mV/sec, baleiere potențial intre -0, 2V si 0,9V vs Ag/AgCl; b. material compozit PANI/SWCNTdepus pe electrodul de platina după electropolimerizare in soluția S1 (exemplul 4)

- fig. 5.a, imaginea SEM cu filmul compozit format din PANI si SWCNT functionalizate cu grupe carboxil (SWCNT-COOH) după electropolimerizare; b imagine SEM in transversala a suprafeței cu filmul compozit cu grosimea cuprinsa intre 324.2 nm......332nm

- fig. 6., Cip după pipetarea si uscarea a 15x3 pL din S3 depusa pe electrodul de lucru conform exemplului...

- fig. 7, curbe de voltametria ciclică (CV) pentru verificarea prezentei Fc pe electrodul de lucru Pt/PANI/SWCNT/GOx/CS/Fc in apa (A) si Pt/PANI/SWCNT/GOx/CS in apa (B); (a) direcția procesului de oxidare la electrod vs Ag/AgCl; (b) direcția procesului de reducere la electrod vs Ag/AgCl

- fig. 8.a, răspunsul cronoamperometric al senzorului pentru detecția glucoza utilizând următoarele standarde de la OpM la 3000 pM realizate in apa deionizată; (b) senzorul cu gel pe electrodul de lucru după utilizare; (c) răspunsul cronoamperometric al senzorului reutilizat pentru detecția glucozei utilizând următoarele standarde de la OpM la 10000 pM realizate in apa deionizată;

- fig. 9.a, curbe semnal curent sensor amperometric in domeniul de concentratii mari 0lOOOOpM si b. curba calibrare in domeniul de concentratii mici 0 pM -lOOOpM;

- fig. 10.a, curba calibrare standarde pe metoda ELISA (A) vs metoda cronoamperometrica (B) si determinarea existentei unei ecuații de corelare intre cele doua mărimi măsurate prin cele doua metode; b. curba calibrare sensor pentru detecția glucozei din apa pentru concentratii mari 1000 pM -10000 pM; c.grafic corelare semnal optic prin ELISA versus semnal current (sensor) utilizând standard in domeniul 0-1000pM;

- fig. 11, valori glucoza determinate cu metoda amperometrica (verde) versus metoda ELISA (roșu) pe 80 de probe de saliva de la pacienti

- fig. 12,

Exemplul 1

Aceste masti au fost obținute cu ajutorul echipamentului DWL 66fs. Acesta este un sistem de litografie cu laser de mare rezoluție, economic, ce poate realiza prin scriere directa a unui volum redus de masti si plachete.

Procesul de obținere a măștilor de lucru are la baza procesul de realizare a layout-ului dorit a fi obtinut. Layout-ul in cazul proiectului MIMOSA s-a realizat cu ajutorul unui program de design dedicat, si anume CleWin. In cadrul programului s-a construit un fișier cu extensia “ *.cif ” in care au fost definite dimensiunile si ariile senzorului nostru. Layout-ul obtinut pentru sensor si placheta cu senzori, realizat in programul CleWin, a fost prezentat in Figura la si b.

Exemplul 2. Etapele tehnologice de fabricare a senzorului pe suport de ceramica sunt:

Plachete ceramica rotunde: dimensiuni 100 mm, 4” (Figura 2a, 4)

Curățire inițiala: FLSO^FbCE, 10 minute, spalare apa DI, 10 minute, uscare 5 minute

Etalare FR: 2500 rpm HPR

Tratament plita: 90° C, 1 min

Fotolitografie Ml (Pt)

Depunere Cr/Pt: 20/200 nm (strat 2,3, Figura 2a )

Lift-off

Curățire chimica: acetona

Tratament etuva : 150° C, 30 min

Etalare FR: 2500 rpm HPR

Tratament plita: 90° C, 1 min

Fotolitografie M2 (Au)

Depunere Ti/Au : 20/200 nm

Lift-off

Curățire chimica: acetona

Tratament etuva : 150° C, 30 min

Etalare FR: 2500 rpm HPR

Tratament plita: 90° C, 1 min

Fotolitografie M3 (Ag)

Depunere Cr/Ag : 20/200 nm (strat 1, Figura 2a)

Lift-off

Curățire chimica: acetona

Control dimensional, de aliniere si de defecte

Separare cipuri pentru taiere li.

Formare 55 de cipuri/placheta (Figura 2b)

Taiere in cipuri individuale (Figura 2c)

Exemplul 3

Sinteza soluție SI: 140 pL anilina in acid sulfuric 0.5 M la care se adauga intre 0.009 %... 0.014% SWCNT in 25 mL apa deionizata (Figura 3a) urmeaza apoi adaugarea de 0.1 % PSS si soluția se omogenizează prin ultrasonicare timp de 3-4 ore la temperatura camerei obtinandu-se soluția prezentata in Figura 3b.

Exemplul 4

Se introduc cipurile in minipotentiostat (A) prin intermediul unei casete B adaptata pentru conectarea cu acesta. Pe suprafața cipului se adauga aproximativ 30 pL/cip din soluția SI si se baleiaza potențialul intre -0.2V si 0.9 V, viteza de scanare 50mV/secunda, 10 cicluri si se pornesc secvențele pentru electropolimerizare iar după electropolimerizare se obțin voltamogramele din Figura 4 care confirma prezenta a 3 picuri de oxidare si 3 de reducere conform Figurii 4 iar in Figura 4b se observa si formarea unui strat compozit de culoare verde închis pe electrodul de lucru al senzorului. Picurile redox au fost indicate din literatura astfel: primul pic cvasi-reversibil, la aproximativ +0,15 V, indica oxidarea a formei polianilinei de leucoemeraldina la emeraldina protonată iar ultimul pic care este reversibil situat la aproximativ+ 0,6 V rezulta din oxidarea emeraldinei si deprotonarea polimerului. Introducerea de SWCNT in strat duce la o creștere a curentului in momentul depunerii polianilinei iar prezenta acestora după unii autori pot fi atribuite picului mic de oxidare de la aproximativ 0.3 V situat intre cele doua picuri de oxidare ale polianilinei. Aceste pic mic poate fi datorat formarii structurii ramificate, poroase si nanotubulare PANLPSS/SWCNT-COOH conforme si cu datele din literature, prezentata in Figura 5a. Stratul masurat de nanocompozit a fost cuprins intre 324.2 nm......332nm (Fig.5b).

Exemplul 5.

Sinteza stratului senzitiv pentru detecția glucozei presupune următoarele etape:

soluție SI: 6 mL soluție formata din 15mg/mL de GOx in PBS cu pH=7.1 peste care se adauga ImL de 150 mM clorura de 1 -Etill-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) si a 1 mL de 150 mM N-hidroxisuccinimida ( NHS) urmata de incubarea pentru 30 de minute la temperatura camerei;

soluția S2: amestec volumetric egal intre CS de 0.5%....1% in 50mM acid acetic si 15mM de 1,2Dimetilferocen (Fc) in etanol;

soluția S3: formata prin amestecarea soluției SI si soluției S2 (v:v) si incubarea la 4°C pentru 16-18h.

Pentru aplicație se pipeteaza soluția S3 pe electrodul de lucru a cipului in volume repetate de cate 15pL, pipetate de 3 ori, cu uscare, intre pipetari la frigider la 4°C si se usucă (conform Figurii 6). Cipurile au fost introduse in potentiostatul din Figura 3 si peste cipurile cu material compozit format din Pt/PANI/SWCNT/GOx/CS/Fc si Pt/PANI/SWCNT/GOx/CS fara Fc si s-a pipetat 10 pL de apa deionizata. S-a dat drumul la secvența de măsurare prin CV formata din baleirea potențialului -0.3V0.9V cu viteza de scanare lOOmV/s , număr de cicluri 3-5. Se poate vedea din figura 7 formarea picului de oxidare reversibil datorate activitatii redox caracteristice prezentei Fc in materialul compozit in cazul materialului compozit Pt/PANI/SWCNT/GOx/CS/Fc.

Exemplul 6.

Senzorii după uscare sunt folositi pentru construcția curbei de calibrare astfel:

se prepara următoarele standarde de glucoza in apa deionizata ΟμΜ (I), 10μΜ(Π), 90μΜ(ΙΙΙ), 300μΜ(ΐν),500μΜ (V), ΙΟΟΟμΜ (VI) si 3000 μΜ;

se pipeteaza pe sensor in mod crescător cate 10 pL din fiecare standard si se înregistrează secvența de cronoamperometrie (Figura 8a, B) pe perioada a 80s... 100 s (Figura 8a, A);

după înregistrarea tuturor standardelor stratul se hidrateaza si are loc formarea unui gel pe electrodul de lucru (Figura 8b);

intre pipetari electrodul de lucru nu se spala ci doar se extrag cei 10 pL de standard anterior si se adauga următorul standard;

după prima folosire gelul se usucă si cipul se poate refolosi iar la o noua determinare de glucoza după adugarea a 10000 pM are loc saturarea, adica scăderea curentului (Figura 8c, senzorul după refolosire);

Exemplul 7.

Trasarea curbelor de calibrare se realizează cu ajutorul programului ORIGINI 9.0 in care pe axa x se trec concentrațiile de standarde si pe axa y sunt trecute semnalul maxim de curent după fiecare adaugare de standard. Semnalul maxim este obtinut pentru fiecare standard in timpul a 80...100 s de la pipetarea lui pe electrodul de lucru. Realizând plotarea datelor de curent versus concentrația corespunzătoare pentru fiecare standard s-au obtinut curbe de regresie liniara cu coeficienți de liniaritate foarte buni (R²=0.980) intre 0 si ΙΟΟΟμΜ (Fig. 10a) dar si intre ΙΟΟΟμΜ si 10000 pM (Fig. 10b).

Exemplul 8.

Corelarea semnalului amperometric cu cel optic obtinut prin tehnica ELISA s-a realizat tot in ORIGINI 9.0 utilizând pe axa X , valorile de curent pentru standardele de glucoza cuprinse intre 0 si ΙΟΟΟμΜ determinate pe senzor si valorile densității optice ale acelorași standarde determinate prin ELISA. Astfel, s-a obtinut o corelație Pearson liniara intre cele doua mărimi de r² =0.991 demonstrând astfel acuratețea înalta a determinării glucozei cu ajutorul senzorului (Fig. 10 c).

Exemplul 9.

s-au recoltat 80 de probe de saliva de la paciente însărcinate (cu consimtamant informat) carora li s-au făcut testele de toleranta la glucoza, li s-a determinat glucoza din sânge venos si din sânge capilar probele de saliva s-au prelevat înainte de testare cu testul de toleranta la glucoza si apoi după administrarea la aceeași pacienta a 75g glucoza, la o ora de la administrare si după doua ore de la administrare;

intervalul normal, de atenționare si patologice de glucoza din probele de saliva a fost prezentat in Figura ll(a).

Valorile obținute pentru probele de saliva cu senzorul s-au corelat foarte bine cu cele determinate cu metoda ELISA (asa cum a fost determinat si anterior in exemplul 8 si pentru standardele de glucoza) asa cum se poate vedea in Figura 11 unde punctele cu roșu reprezintă valorile de glucoza obținute prin ELISA iar cele cu verde valorile de glucoza obținute pe senzor.

Exemplul 10.

Valorile de glucoza obținute de la probele de pacienti din sânge venos (40 de probe) s-au reprezentat in funcție de valorile de glucoza obținute cu ajutorul senzorului. S-a obtinut o corelare liniara moderata intre valorile gucoza determinate in sânge venos si in saliva cu o valoare a coeficientului Pearson de 0.4 asa cum se poate vedea din Fig. 12 a. Valorile din sângele capilar prezentate in Figura 12 a (probe prelevate odata cu probele de saliva) au aratat ca aceleași 5 probe sunt patologice (vezi punctele aflate peste linia portocalie) la fel ca si in cazul determinării glucozei cu ajutorul senzorului asa cum se poate vedea in Fig. 12 c (vezi punctele >8.77mg/dL).

'Rowley, W. R., Bezold, C., Arikan, Y., Byrne, E., & Krohe, S. (2017). Diabetes 2030: Insights from Yesterday, Today, and Future Trends. Population health management, 20(1), 6-12. https://doi.org/10.1089/pop.2015.0181 ² Pecoits-Filho, R., Abensur, FL, Betonico, C. C., Machado, A. D., Parente, E. B., Queiroz, M., Salles, J. E., Titan, S.. & Vencio, S. (2016). Interactions between kidney disease and diabetes: dangerous liaisons. Diabetology & metabolic syndrome, 8, 50. https://doi.org/10.! 186/sl 3098016-0159-z.

³ American Diabetes Association. (2013). Standards of medical care for patients with diabetes mellitus. Puerto Rico Health Sciences Journal, 20(2).

⁴ Tierney, M. J., Tamada, J. A., Potts, R. O., Eastman, R. C., Pitzer, K., Ackerman, N. R., & Fermi, S. J. (2000). The GlucoWatch® biographer: a frequent, automatic and noninvasive glucose monitor. Annals ofMedicine, 32(9), 632-641.

⁵ Lin, T., Gal, A., Mayzel, Y., Horman, K., & Bahartan, K. (2017). Non-invasive glucose monitoring: a review of challenges and recent advances. Curr. Trends Biomed. Eng. Biosci, 6(5), 1-8.

⁶ Gough, D. A., Kumosa, L. S., Routh, T. L., Lin, J. T., & Lucisano, J. Y. (2010). Function of an implanted tissue glucose sensor for more than 1 year in animals. Science Translational Medicine, 2(42), 42ra53-42ra53.

⁷ Dovc, K., Bratina, N., & Battelino, T. (2015). A new horizon for glucose monitoring. Hormone research in paediatrics, 83(3), 149-156.

⁸ Sparacino, G., Facchinetti, A., & Cobelli, C. (2010). “Smart” continuous glucose monitoring sensors: On-line signal processing issues. Sensors, 10(2), 6751-6772.

⁹ Prasad, S. N., Weerathunge, P., Karim, Μ. N., Anderson, S., Hashmi, S., Mariathomas, P. D., ... & Ramanathan, R. (2021). Non-invasive detection of glucose in human urine using a colorgenerating copper NanoZyme. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 413(5), 1279-1291.

¹⁰ Lee, I., Probst, D., Klonoff, D., & Sode, K. (2021). Continuous glucose monitoring systemsCurrent status and future perspectives of the flagship technologies in biosensor research. Biosensors and Bioelectronics, 181, 113054.

¹¹ Bihar, E., Wustoni, S., Pappa, A. M., Salama, K. N., Baran, D., & Inal, S. (2018). A fully inkjet-printed disposable glucose sensor on paper. npj Flexible Electronics, 2(1), 1-8.

¹² Clarke, S. F., & Foster, J. R. (2012). A history of blood glucose meters and their role in self-monitoring of diabetes mellitus. British journal of biomedical Science, 69(2), 83-93.

¹³ Yao, Y., Chen, J., Guo, Y., Lv, T., Chen, Z., Li, N., ... & Chen, T. (2021). Integration of interstitial fluid extraction and glucose detection in one device for wearable non-invasive blood glucose sensors. Biosensors and Bioelectronics, 179, 113078.

¹⁴ Prasad, S. N., Weerathunge, P., Karim, Μ. N., Anderson, S., Hashmi, S., Mariathomas, P, D., ... & Ramanathan, R. (2021). Non-invasive detection of glucose in

color-generating copper NanoZyme. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 413(5). 12791291.

¹⁵ Zidane, M. A., Rouane, A., Hamouda, C., & Amar, H. (2021). Hyper-sensitive microwave sensor based on split ring resonator (SRR) for glucose measurement in water. Sensors and Actuators A: Physical, 321, 112601.

¹⁶ Chen C, Zhao XL, Li ZH, Zhu ZG, Qian SH, Flewitt AJ. Current and Emerging Technology for Continuous Glucose Monitoring. Sensors (Basel). 2017 Jan 19; 17(1 ):182. doi: 10.3390/sl 7010182. PMID: 28106820; PMCID: PMC5298755.

¹⁷ Beardsall, K., Thomson, L., Guy, C., Iglesias-Platas, I., van Weissenbruch, Μ. M., Bond, S., ... & de Lange, A. (2021). Real-time continuous glucose monitoring in preterm infants (REACT): an internațional, open-label, randomised controlled trial. The Lancet Child & Adolescent Health, 5(4), 265-273.

¹⁸ Abikshyeet, P., Ramesh, V., & Oza, N. (2012). Glucose estimation in the salivary secretion of diabetes mellitus patients. Diabetes, metabolic syndrome and obesity : targets and therapy, 5, 149-154. https://doi.org/10.2147/DMSO.S32112 ¹⁹ Vigersky, R.A. The benefits, limitations, and cost-effectiveness of advanced technologies in the management of patients with diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2015, 9:320-330.

²⁰ Phan, L. Μ. T., Vo, T. A. T., Hoang, T. X., Selvam, S. P., Pham, H. L., Kim, J. Y., & Cho, S. (2021). Trending Technology of Glucose Monitoring during COVID-19 Pandemic: Challenges in Personalized Healthcare. Advanced Materials Technologies, 2100020.

Claims (1)

1. REVENDICĂRI

   1. Revendicarea se refera procedeul de obținere a unui senzor pentru detecția glucozei din saliva care consta in realizarea design-ului cipului pe placheta de ceramica cu cei trei electrozi utilizând litografia cu laser de mare rezoluție care realizează masca unei plachete de ceramica cu 55 cipuri si apoi urmeaza procedeul tehnologic de fabricare prin litografie a 55 cipuri, taierea in cipuri de dimensiuni de 20 mm X 4.1mm ...5 mm si procedeul de sinteza a filmului compozit folosit pentru detecția glucozei care consta in sinteza a 25 mL de Soluție 1 (SI) ce conține 140 pL anilina in acid sulfuric 0.5 M la care se adauga intre 0.009 %... 0.014% SWCNT in apa deionizata urmeaza apoi adaugarea de 0.1 % PSS si soluția se omogenizează urmata de introducerea cipului in caseta special realizata a platformei formata din cipuri, caseta si minipotentiostat apoi pipetarea SI in volum de 30pL pe electrodul de lucru al cipului si electrodepunerea a 10 cicluri prin voltametrie ciclica (CV) a soluției SI) urmata de formarea unui film compozit de culoare verde închis PANI/SWCNT pe platina cu grosimea cuprinsa intre 324.2 nm......332nm cu structura poroasa si nanotubulara verificata prin tehnica SEM (conform exemplului 4, Figura 5) după care prepararea a 6 mL de soluție SI formata din 15mg/mL de GOx in PBS cu pH=7.1 si apoi adaugarea a ImL de 150 mM clorura de 1 -Etill-3-(3dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) si a 1 mL de 150 mM N-hidroxisuccinimida ( NHS) urmata de incubarea pentru 30 de minute la temperatura camerei si apoi prepararea unei soluții S2 formata din amestec volumetric egal intre CS de 0.5%.... 1% in 50mM acid acetic si 15mM de 1,2-Dimetilferocen (Fc) in etanol urmata de sinteza soluției S3 formata prin amestecarea soluției SI si soluției S2 (v:v), conform exemplului 5 apoi incubarea soluției S3 la 4°C pentru 16-18h urmata de pipetarea soluției S3 pe electrodul de lucru a cipului in volume repetate de cate 15pL, pipetate de 3 ori, cu uscare, intre pipetari la frigider la 4°C si mai departe, după uscare, verificarea prezentei ferocenului in film demonstrata prin procesul redox aparut in voltametria ciclica (CV) versus curbe voltametrie ciclica ale electrodului de lucru înainte de imobilizarea ferocenului înregistrata prin baleierea potențialului intre....vs Ag/AgCI in apa deionizata, apoi verificare funcționalității filmului pentru a detecta glucoza in concentratii cunoscute, in apa deionizata, demonstrata prin creșterea rapida a curentului senzorului la contactul cu concentrațiile standard de glucoza in apa deionizata puse fiecare pe senzor in volum de 10pL in ordine crescătoare, creștere de curent detectata cu minipotentiostatul Âfw/izEmStat³, prin înregistrarea continua a secvenței “Multi Step Amperometry” timp total de 600s...800 s, iar după un număr de șapte determinări consecutive de concentratii de glucoza (exemplul 6) are loc formarea unui gel pe electrodul de lucru care după uscare si păstrare la frigider la 4°C urjneâza refblosirea lui pentru detecta din nou glucoza din apa pana la concentrația de/ί OmM când are loc saturarea urmeaza apoi trasarea curbelor de calibrare utilizând concentratii de glucoza standard realizate in apa deionizată in domeniul 0 -ΙΟΟΟμΜ si ΙΟΟΟμΜ- ΙΟΟΟΟμΜ urmata de detecția glucozei utilizând 80 de probe de saliva de pacienti testate cu metoda amperometrica si cu metoda standard ELISA după care verificarea existentei unei corelări a rezultatelor standardelor obținute prin cele doua metode utilizând probele de saliva recoltate de la pacienti si apoi verificarea existentei unei corelări intre valorile de glucoza obținute pe probele de saliva/ probele de sânge venos si probe de sânge capilar.