RO134998A2 - Set of two primers and one probe for detection and dosing of mutant npm1 gene - Google Patents
Set of two primers and one probe for detection and dosing of mutant npm1 gene Download PDFInfo
- Publication number
- RO134998A2 RO134998A2 RO201900719A RO201900719A RO134998A2 RO 134998 A2 RO134998 A2 RO 134998A2 RO 201900719 A RO201900719 A RO 201900719A RO 201900719 A RO201900719 A RO 201900719A RO 134998 A2 RO134998 A2 RO 134998A2
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- npm1
- primers
- probe
- primer
- pcr
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
SET DE DOI PRIMERI Șl O SONDĂ PENTRU DETECȚIA Șl DOZAREA EXPRESIEI GENEI NPM1 MUTANTĂSET OF TWO FIRSTS AND A PROBE FOR DETECTING AND DOSING THE MUTANT NPM1 GENE EXPRESSION
b) Domeniul tehnic si definirea termenilor tehnicib) Technical field and definition of technical terms
Invenția se înscrie în domeniul biologiei moleculare și al analizei genetice a leucemie! mieloide acute sau a altor patologii asociate cu mutații în exonul 12 al genei NPM1. Leucemia mieloidă acută, ca orice alt tip de cancer, este consecința acumulării în celule a unor mutații genetice. Mutațiile genetice pot apare oricând pe durata vieții unei celule. O parte sunt corectate de către mecanismele de reparare, iar altele persistă în celulă și se pot transmite descendenților celulari (dacă celula respectivă este un progenitor hematopoietic care se multiplică). Mjoritatea mutațiilor genetice determină ca unele dintre mecanismele celulare să se desfășoare anormal. Acumularea unui set de astfel de mutații în genomul aceleiași celule, crește numărul de mecanisme celulare afectate și, în final, determină celula respectivă să devină tumorală. O paletă foarte largă de mutații genetice, deși diferite ca natură și locație în genom, pot conduce în final la apariția cancerului. Consecința acestui fenomen este aceea că leucemia mieloidă acută diferă ca manifestare patogenă, al tratamentului, al gradului de severitate, al prognosticului și al speranței de viața a pacientului în funcție de natura mutațiilor. Prin urmare, identificarea mutațiilor oferă informatii esențiale medicului pentru a stabili un diagnostic precis, un tratament cât mai potrivit și un prognostic realist.The invention is in the field of molecular biology and genetic analysis of leukemia! acute myeloids or other pathologies associated with mutations in exon 12 of the NPM1 gene. Acute myeloid leukemia, like any other type of cancer, is the consequence of the accumulation of genetic mutations in cells. Genetic mutations can occur at any time during the life of a cell. Some are corrected by repair mechanisms, and others persist in the cell and can be passed on to cellular offspring (if that cell is a hematopoietic progenitor that multiplies). Most genetic mutations cause some of the cellular mechanisms to unfold abnormally. The accumulation of a set of such mutations in the genome of the same cell increases the number of affected cellular mechanisms and ultimately causes the cell to become a tumor. A very wide range of genetic mutations, although different in nature and location in the genome, can eventually lead to cancer. The consequence of this phenomenon is that acute myeloid leukemia differs in pathogenic manifestation, treatment, severity, prognosis and life expectancy of the patient depending on the nature of the mutations. Therefore, the identification of mutations provides essential information to the doctor to establish an accurate diagnosis, the most appropriate treatment and a realistic prognosis.
Ca urmare a dezvoltării tehnologiei de secvențiere, au fost descoperite foarte multe mutații asociate cu leucemia mieloidă acută. Pentru câteva dintre ele, s-a dovedit că apar foarte frecvent în leucemia mieloidă acută și, în același timp, au valoare prognostică (evoluția probabilă a pacientului după tratament). în această categorie se află și mutațiile care se petrec la nivelul genei NPM1. Gena codifică o proteină, care are rol în multiple mecanisme celulare, cele mai relevante pentru patogeneza leucemiei mieloide acută fiind proliferarea (multiplicarea) celulară și diferențierea.As a result of the development of sequencing technology, many mutations associated with acute myeloid leukemia have been discovered. For some of them, they have been shown to occur very frequently in acute myeloid leukemia and, at the same time, have a prognostic value (the probable evolution of the patient after treatment). In this category are also the mutations that occur in the NPM1 gene. The gene encodes a protein, which has a role in multiple cellular mechanisms, the most relevant for the pathogenesis of acute myeloid leukemia being cell proliferation (multiplication) and differentiation.
Mutațiile NPM1 întâlnite în leucemia mieloidă acută sunt variabile ca secvență, dar toate reprezintă inserția succesiva a patru sau mai multe nucleotide într-o regiune localizată în exonul 12. Indiferent de mărimea și secvența fragmentului ADN $NPM1 mutations encountered in acute myeloid leukemia are variable in sequence, but all represent the successive insertion of four or more nucleotides into a region located in exon 12. Regardless of the size and sequence of the $ DNA fragment
inserat, consecința patologică este aceeași: mutația determină modificarea proteinei NPM1 la capătul terminal în asa fel încât proteina nu mai este localizată în nucleu și este abundentă în citoplasmă celulelor (prin comparație cu celulele normale).inserted, the pathological consequence is the same: the mutation causes the modification of the NPM1 protein at the terminal end so that the protein is no longer located in the nucleus and is abundant in the cytoplasm of cells (compared to normal cells).
Unul dintre obiectivele studiilor clinice in domeniul oncologiei este acela de a stabili metode de prognostic privind evoluția ulterioară a pacienților. Acest obiectiv este in mod special important in cazul leucemiei mieloide acute, deoarece rata de recidivă este ridicata. Pentru a evalua riscul de recidivă este necesară monitorizarea și cuantificarea prezenței celulelor leucemice în preparatele biologice prelevate de la pacienții respectivi. în practică, detecția celulelor leucemice se realizează la nivel de ADN sau ARN, prin testarea prezenței mutațiilor specifice pacientului respectiv. Metodele de analiză moleculară cele mai utilizate se bazează pe procedura POR, deoarece aceste metode sunt cele mai specifice și pot detecta cantități foarte mici ale tintei.One of the objectives of clinical trials in the field of oncology is to establish prognostic methods for the further evolution of patients. This goal is especially important in acute myeloid leukemia because the recurrence rate is high. In order to assess the risk of recurrence, it is necessary to monitor and quantify the presence of leukemia cells in the biological preparations taken from the respective patients. In practice, the detection of leukemic cells is performed at the level of DNA or RNA, by testing the presence of mutations specific to that patient. The most widely used molecular analysis methods are based on the ROP procedure, as these methods are the most specific and can detect very small amounts of the target.
Definitii fDefinitions f
ADN = acid dezoxiribonucleic = polimer format prin legarea covalentă a două sau mai multor dezoxiribonucleotide; există patru tipuri de dezoxiribonucleotide: adenină (A sau a), citozină (C sau c), guanină (G sau g), timină (T sau t);DNA = deoxyribonucleic acid = polymer formed by covalent bonding of two or more deoxyribonucleotides; there are four types of deoxyribonucleotides: adenine (A or a), cytosine (C or c), guanine (G or g), thymine (T or t);
Secvența ADN = ordinea în care cele patru tipuri de dezoxiribonucleotide se succed într-o moleculă ADN; prin convenție orice secvență scrisă are capătul 5 în stânga și capătul 3 în dreapta;DNA sequence = the order in which the four types of deoxyribonucleotides succeed each other in a DNA molecule; by convention any written sequence has end 5 on the left and end 3 on the right;
ADN dublucatenar = format din două catene complementare una față de cealaltă, care stau împreună la temperaturi de sub 45 grade Celsius, prin interacții de tip punți de Hidrogen; fiecare catenă este un fragment de ADN;Double-stranded DNA = consisting of two complementary strands to each other, which stand together at temperatures below 45 degrees Celsius, through hydrogen bridge interactions; each strand is a DNA fragment;
ADN țintă = molecule ADN dublucatenar care vor fi detectate și multiplicate prin desfășurarea unei reacții PCR;Target DNA = double-stranded DNA molecules that will be detected and multiplied by a PCR reaction;
ADN polimeraza = proteină cu activitate enzimatică, care se leagă de structuri ADN dublucatenare formate dintr-o catenă a ADN-ului țintă (catenă cu rol de matriță) și primer-ul complementar; după atașarea la capătul 3 al primerului, enzima are capacitatea de lungi primerul prin adăugarea succesivă de dezoxiribonucleotide (polimerizare), pe care le leagă covalent, una câte una, de capătul 3 al secvenței în creștere; tipul de dezoxiribonucleotidă (A, C, G sauT) selectată de enzimă precum și ordinea lor de atașare la fragmentul ADN în creștere sunt astfel alese încât secvența noului ADN să fie perfect complementară cu catena matriță, atașată de primer;DNA polymerase = protein with enzymatic activity, which binds to double-stranded DNA structures formed by a strand of target DNA (strand as a template) and the complementary primer; after attachment to the end 3 of the primer, the enzyme has the ability to lengthen the primer by successively adding deoxyribonucleotides (polymerization), which it covalently binds, one by one, to the end 3 of the growing sequence; the type of deoxyribonucleotide (A, C, G or T) selected by the enzyme as well as their order of attachment to the growing DNA fragment are chosen so that the sequence of the new DNA is perfectly complementary to the template strand, attached to the primer;
Primeri = fragmente monocatenare scurte de ADN (în general formate din mai puțin de 35 dezoxiribonucleotide) a căror secvențe sunt complementare cu ADN-ul țintă și care au rolul de a amorsa activitatea enzimatică a ADN polimerazei; totdeauna se folosesc cel puțin doi primeri, fiecare fiind complementar cu una din cele două catene.Primers = short single-stranded DNA fragments (generally consisting of less than 35 deoxyribonucleotides) whose sequences are complementary to the target DNA and which have the role of initiating the enzymatic activity of DNA polymerase; at least two primers are always used, each complementary to one of the two chains.
Sonde = fragmente monocatenare scurte de ADN (în general formate din mai puțin de 35 dezoxiribonucleotide) ale căror secvențe sunt complementare cu ADN-ul țintă. Sonda are la capătul 5 o substanță cu proprietăți fluorescente, iar la capătul 3 o substanță cu rolul de a bloca fluorescența substanței de la capătul opus (capătul 5). Substanța cu proprietăți fluorescente nu poate emite nici un semnal semnal fluorescent atâta timp cât este legată de sondă, pentru că se află în apropierea compusului cu rol de a bloca fluorescența. Fiecare sondă funcționează doar împreună cu un primer, ambele fiind complementare cu aceeași catenă a ADN-ului țintă, adică catena matriță. în raport cu catena matriță, sonda este concepută astfel încât să fie complementară cu o regiune a matriței situată în amonte față de secvența complementară cu primerul. Astfel, în timpul etapei de polimerizare (vezi definiția PCR), pe măsură ce adaugă dezoxinucleotide la catena nascentă, ADN polimeraza se deplasează de-a lungul catenei matriță până întâlnește sonda legată de matrița respectivă. în acel moment, enzima desfășoară activitatea de degradare a capătului 5 al sondei și eliberarea în soluție a compusului cu proprietăți fluorescente.Probes = short single-stranded DNA fragments (usually consisting of less than 35 deoxyribonucleotides) whose sequences are complementary to the target DNA. The probe has at the end 5 a substance with fluorescent properties, and at the end 3 a substance with the role of blocking the fluorescence of the substance at the opposite end (end 5). The substance with fluorescent properties cannot emit any fluorescent signal as long as it is bound to the probe, because it is close to the compound with the role of blocking fluorescence. Each probe works only together with a primer, both being complementary to the same strand of the target DNA, ie the template strand. in relation to the die chain, the probe is designed to be complementary to a region of the die located upstream of the sequence complementary to the primer. Thus, during the polymerization step (see PCR definition), as it adds deoxynucleotides to the parent strand, the DNA polymerase moves along the template strand until it meets the probe bound to that template. At that time, the enzyme carries out the degradation activity of the probe end 5 and the release into solution of the compound with fluorescent properties.
Substanța eliberată poate să emită semnalul fluorescent caracteristic, iar intensitatea semnalului este proporțională cu numărul de sonde degradate. Deoarece raportul stoechiometric dintre numărul de sonde degradate și numărul de molecule ADN țintă este 1:1, intensitatea semnalului fluorescent reprezintă o cale de a doza ADN-ul țintă. Proprietate fluorescentă = capacitatea unui compus chimic de a emite un semnal cu o anumită lungime de undă numai atunci când este stimulat printr-un alt semnal, cu o altă lungime de undă;The released substance may emit the characteristic fluorescent signal and the signal strength is proportional to the number of degraded probes. Because the stoichiometric ratio between the number of degraded probes and the number of target DNA molecules is 1: 1, the intensity of the fluorescent signal is a way to dose the target DNA. Fluorescent property = the ability of a chemical compound to emit a signal with a certain wavelength only when stimulated by another signal with another wavelength;
FAM, HEX = compuși chimici care au proprietăți fluorescente; fiecare emite un semnal cu lungime de undă distinctă;FAM, HEX = chemical compounds that have fluorescent properties; each emits a signal with a distinct wavelength;
lABkFQ = compus chimic cu rolul de a bloca emisia de fluorescență a compușilor atasati de sonde >lABkFQ = chemical compound intended to block the fluorescence emission of compounds attached to probes>
TaqMan PCR (denumirea originală este „TaqMan polymerase chain reaction”) = metoda enzimatică ciclică prin care ADN-ul țintă este detectat cu mare specificitate și multiplicat. Amestecul de reacție pentru PCR conține minim următoarele tipuri de ingrediente: enzima DNA polimeraza (enzimă termorezistentă); primeri; sonde fluorescente; molecule ADN țintă; dezoxiribonucleotide din cele 4 categorii precizate mai sus; subtanțe anorganice cu rolul de a asigura tăria ionică și pH-ul soluției de reacție, optime pentru funcționarea enzimei. Fiecare ciclu al PCR este format din 3 etape: etapa de desfacere a catenelor ADN; etapa de legare a primerilor și sondelor; etapa de polimerizare. în prima etapa, care corespunde unor temperaturi de peste 95 grade Celsius, interațiile necovalente dintre catene dispar, iar ADN-ul țintă devine monocatenar. în a doua etapă, când temperatura scade la 60 grade Celsius, primerii și sondele se leagă de zonele complementare existente pe cafenele ADN-ului țintă, în etapa a treia are loc polimerizarea primerilor atașați de catena matriță și generarea unei noi catene ADN (detalii la definiția ADN polimerazei). în general, temperatura etapei trei este de 72 grade Celsius; frecvent, etapele doi și trei coincid și se desfășoară la temperatura la care primerii și sondele se leagă de catena matriță (cel mai des, 60 grade Celsius). La sfârșitul etapei trei al unui ciclu, ca urmare a polimerizării, apare cate o catenă nouă pentru fiecare catenă matriță, astfel că după fiecare ciclu, numărul total de molecule ADN țintă se dublează. în paralel cu multiplicarea ADN țintă, în etapa a treia are loc și degradarea sondelor fluorescente și eliberarea compușilor cu proprietăți fluorescente (detalii la definiția sondelor). Semnalul fluorescent masurat al compușii eliberați din sonde, este proporțional cu numărul de molecule ADN țintă (detalii la definiția sondelor). Deoarece ciclurile se repetă, în timpul desfășurării PCR are loc creșterea cantității de ADN țintă, iar din acest punct de vedere, numărul moleculelor sondă degradate, precum și intensitatea fluorescenței, cresc exponențial.TaqMan PCR (original name is 'TaqMan polymerase chain reaction') = cyclic enzymatic method by which target DNA is detected with high specificity and multiplied. The reaction mixture for PCR contains at least the following types of ingredients: DNA polymerase enzyme (heat-resistant enzyme); primers; fluorescent probes; target DNA molecules; deoxyribonucleotides from the 4 categories mentioned above; inorganic substances with the role of ensuring the ionic strength and pH of the reaction solution, optimal for the functioning of the enzyme. Each PCR cycle consists of 3 steps: the strand of the DNA strands; the stage of binding the primers and probes; polymerization step. In the first stage, which corresponds to temperatures above 95 degrees Celsius, the non-covalent interactions between the chains disappear and the target DNA becomes single-stranded. in the second stage, when the temperature drops to 60 degrees Celsius, the primers and probes bind to the complementary areas existing on the target DNA coffees, in the third stage the polymerization of the primers attached to the template strand takes place and the generation of a new DNA strand (details at definition of DNA polymerase). In general, the temperature of step three is 72 degrees Celsius; frequently, steps two and three coincide and take place at the temperature at which the primers and probes bind to the die chain (most often, 60 degrees Celsius). At the end of stage three of a cycle, as a result of the polymerization, a new strand appears for each template strand, so that after each cycle, the total number of target DNA molecules doubles. In parallel with the multiplication of the target DNA, in the third stage there is also the degradation of fluorescent probes and the release of compounds with fluorescent properties (details on the definition of probes). The measured fluorescent signal of the compounds released from the probes is proportional to the number of target DNA molecules (details of the probe definition). As the cycles are repeated, the amount of target DNA increases during PCR, and from this point of view, the number of degraded probe molecules, as well as the intensity of fluorescence, increase exponentially.
Aparatul PCR = dispozitiv dedicat reacțiilor PCR, care determină și controlează cu mare precizie temperatura amestecului de reacție;PCR device = device dedicated to PCR reactions, which determines and controls with high precision the temperature of the reaction mixture;
Genom = totalitatea ADN dublucatenar din interiorul unui nucleu organizat sub formă de cromozomi;Genome = the totality of double-stranded DNA inside an organized nucleus in the form of chromosomes;
Genă codificatoare = parte a genomului care codifică o proteină, adică prin transcripția genei se generează un ARN mesager, care, la rândul lui, este convertit în proteină prin translație.Coding gene = part of the genome that encodes a protein, ie through the transcription of the gene a messenger RNA is generated, which, in turn, is converted into protein by translation.
Exon = regiune ADN dintr-o genă, care conține o parte din informația necesară sintezei proteinei coficate de gena respectivă; o genă poate avea un exon sau mai mulți, iar totalitatea exonilor unei gene se convertesc în ARN mesager și codifică întreaga proteină;Exon = region of DNA in a gene, which contains some of the information needed to synthesize the protein encoded by that gene; a gene can have one or more exons, and all the exons in a gene are converted to messenger RNA and encode the entire protein;
RO 134998 Α2RO 134998 Α2
Mutatie genetică = orice modificare a genomului, în sensul că succesiunea de dezoxiribonucleotide dintr-o regiune oarecare a ADN-ului este diferită față de succesiunea normală;Genetic mutation = any change in the genome, in the sense that the sequence of deoxyribonucleotides in any region of DNA is different from the normal sequence;
Leucemia mieloidă acută = patologie a sistemului hematopoietic uman, caracterizată prin existența în corpul pacientului a unor celule tumorale provenite din celule precursoare mieloide și care, datoită unor mutații genetice, au căpătat capacitatea de a se multiplica necontrolat; celulele precursoare mieloide sunt celulele imature din măduva oaselor care, în mod normal, se transformă în monocite, neutrofile sau ale celule albe ale sîngelui din categoria celulelor mieloide;Acute myeloid leukemia = pathology of the human hematopoietic system, characterized by the existence in the patient's body of tumor cells from myeloid precursor cells and which, due to genetic mutations, have acquired the ability to multiply uncontrollably; myeloid precursor cells are immature cells in the bone marrow that normally turn into monocytes, neutrophils or white blood cells in the category of myeloid cells;
Diagnostic molecular = orice procedură tehnică moleculară prin care se detectează prezența unei mutații genetice, cu scopul de a caracteriza genetic patologia investigată și de a ajuta medicul să stabilească un prognostic privind evoluția ulterioară a pacientului;Molecular diagnosis = any molecular technical procedure by which the presence of a genetic mutation is detected, in order to genetically characterize the investigated pathology and to help the doctor to establish a prognosis regarding the subsequent evolution of the patient;
Mutații NPM1 = mutații la nivelul genei NPM1, reprezentate de inserția aleatoare în anumite locuri ale exonul 12 a unor fragmente ADN cu secvențe și mărimi variabile;NPM1 mutations = mutations in the NPM1 gene, represented by the random insertion in certain places of exon 12 of DNA fragments with variable sequences and sizes;
c) Stadiul tehnologieic) The state of technology
Invenția se referă la o procedură de detecție și dozare a mutațiilor de tip inserție care pot apare în gena NPM1. Studiile clinice publicate în ultimii 10 ani au dovedit că acest tip de mutație este frecvent asociat cu leucemia mieloidă de tip acut: frecvența mutațiilor NPM1 este cel puțin 20% din totalul cazurilor de leucemie mieloidă acută. în plus, monitorizarea mutațiilor NPM1 în celulele din sângele periferic recoltate de la pacienți, în timpul și după tratament, oferă informații esențiale cu privire la eficacitatea tratamentului, precum și informații cu valoare prognostică despre evoluția ulterioară probabilă a pacientului.The invention relates to a procedure for detecting and dosing insertion-type mutations that may occur in the NPM1 gene. Clinical studies published in the last 10 years have shown that this type of mutation is frequently associated with acute myeloid leukemia: the frequency of NPM1 mutations is at least 20% of all cases of acute myeloid leukemia. In addition, monitoring of NPM1 mutations in peripheral blood cells harvested from patients, during and after treatment, provides essential information on the efficacy of treatment, as well as prognostic information on the likely follow-up of the patient.
O serie de laboratoare au dezvoltat tehnici PCR pentru analiza mutațiilor genei NPM1 mutant, dar in majoritatea cazurilor tehnicile se aplică doar local, cu poceduri stabilite ”in house”. Astfel majoritatea studiilor publicate de către aceste laboratoare se bazează pe metoda TaqMan, în care detecția și dozarea se realizează cu seturi de primeri cuplate cu o sondă. Deoarece mutațiile NPM1 sunt variabile ca secvență, analiza se realizează cu mai multe seturi de primeri, cate unul pentru fiecare mutație. Mai recent, s-a încercat simplificarea procedurii prin utilizarea unor primeri degenerați, adică primeri care sunt doar parțial complementari cu mutațiile respective. în acest fel se pot detecta mai multe tipuri de secvențe mutante cu un număr mai mic de primeri. Un alt grup a testat un PCR multiplex, adică oA number of laboratories have developed PCR techniques to analyze mutations in the mutant NPM1 gene, but in most cases the techniques are applied only locally, with established "in-house" procedures. Thus, most studies published by these laboratories are based on the TaqMan method, in which detection and dosing are performed with sets of primers coupled with a probe. Because NPM1 mutations are variable in sequence, the analysis is performed with several sets of primers, one for each mutation. More recently, an attempt has been made to simplify the procedure by using degenerate primers, ie primers that are only partially complementary to those mutations. In this way several types of mutant sequences with a lower number of primers can be detected. Another group tested a multiplex PCR, i.e. a
RO 134998 Α2 reacție de amplificare în care sunt amestecați mai multi primeri, fiecare cu secvență complementară pentru căte una din mutațiile NPM1 cunoscute. încercări de quantificare a NPM1 mutant s-au realizat și în cazul PCR digital, o metodă în care rezultatul reacției se analizează la sfârșit. Au fost publicate două variante ale metodei: distincția între forma normală si forma mutantă s-a realizat la nivelul primerilor (ca si în cazurile qPCR de mai sus); identificarea formelor mutant sau normal s-a realizat la nivelul sondei, în funcție de secvențe. în cele mai recente teste publicate, PCR-ul digital a fost utilizat împreună cu PCR-ul multiplex. Toate aceste metode s-au dovedit eficiente în analiza NPM1, dar fiecare a prezentat și anumite limite tehnologice în situațiile când cantitatea de NPM1 mutant este redusă.EN 134998 Α2 amplification reaction in which several primers are mixed, each with a complementary sequence for one of the known NPM1 mutations. Attempts to quantify the mutant NPM1 were also performed in the case of digital PCR, a method in which the result of the reaction is analyzed at the end. Two variants of the method were published: the distinction between the normal form and the mutant form was made at the level of primers (as in the above qPCR cases); the identification of mutant or normal forms was performed at the probe, depending on the sequences. In the most recently published tests, digital PCR has been used in conjunction with multiplex PCR. All these methods have proved effective in the analysis of NPM1, but each has presented certain technological limitations in situations when the amount of mutant NPM1 is low.
Alternativa la metodele bazate pe PCR o reprezintă secvențierea și identificarea mutației specifice fiecărui pacient. Deși această alternativă se utilizează in cercetarea medicală, ea nu este implementată clinic datorită unor dezavantaje: schema de lucru este complexă și foarte costisitoare; procedurile pot fi aplicate doar de către specialiști cu foarte bună expertiză în biologia moleculară și bioinformatică; metoda trebuie aplicată diferit pentru fiecare pacient.The alternative to PCR-based methods is sequencing and identifying the specific mutation of each patient. Although this alternative is used in medical research, it is not clinically implemented due to some disadvantages: the work schedule is complex and very expensive; the procedures can be applied only by specialists with very good expertise in molecular biology and bioinformatics; the method must be applied differently for each patient.
Invenția se referă la o procedură de detecție și dozare a mutațiilor genei NPM1 prin aplicarea unei proceduri de PCR modificată, denumită generic PCR dependent de endonucleasa H2. Principiul de funcționare al metodei PCR a rămas neschimbat de la inventarea metodei (1983, dr. Kary Mullis - utilizarea primerilor; 1986, dr. Randall Saiki - utilizarea polimerazelor termorezistente). Totuși tehnologia bazată pe PCR a evoluat semnificativ în ultimii 20 ani, prin adăugarea de noi elemente funcționale. O astfel de modificare este utilizarea endonucleazei H2, o enzimă capabilă de a desface o secvență de acizi nucleici care are o singură riboză flancată de minim 4 dezoxiribonucleotide pe ambele părți. Enzima desface legăturile covalente dintre riboză și dezoxiriboze dacă fragmentul respectiv este dublu-catenar. Procedura PCR dependentă de endonucleaza h2 este descrisă schematic în figura 1. în această metodă, primerii sunt modificați astfel: (i) conțin o riboză (figura 1 triunghiul negru cu vârful în sus), poziționată cu 5 baze înainte de capătul 3'; (ii) la capătul 3' au o modificare (figura 1 - steaua neagra) care împiedică ADN polimeraza să polimerizeze și să extindă fragmentul ADN - astfel reacția de PCR este blocată. în acest context, reacția de amplificare PCR se va produce doar după ce primerii se vor activa: endonucleaza H2 termorezistentă (figura 1 - semicercul punctat) recunoaște doar primerii Pmut care sunt legați perfect la gena țintă (figura 1 - Pmut dispusThe invention relates to a procedure for detecting and dosing NPM1 gene mutations by applying a modified PCR procedure, generically called H2 endonuclease-dependent PCR. The principle of operation of the PCR method has remained unchanged since the invention of the method (1983, Dr. Kary Mullis - use of primers; 1986, Dr. Randall Saiki - use of heat-resistant polymers). However, PCR-based technology has evolved significantly over the last 20 years, with the addition of new functional elements. One such change is the use of H2 endonuclease, an enzyme capable of cleaving a nucleic acid sequence that has a single flanked ribose of at least 4 deoxyribonucleotides on both sides. The enzyme breaks down the covalent bonds between ribose and deoxyribose if the fragment is double-stranded. The h2 endonuclease-dependent PCR procedure is schematically described in Figure 1. In this method, the primers are modified as follows: (i) they contain a ribose (figure 1 black triangle with the tip up), positioned 5 bases before the 3 'end; (ii) at the 3 'end they have a modification (figure 1 - black star) that prevents DNA polymerase from polymerizing and expanding the DNA fragment - thus the PCR reaction is blocked. In this context, the PCR amplification reaction will occur only after the primers are activated: heat-resistant H2 endonuclease (Figure 1 - dotted semicircle) recognizes only Pmut primers that are perfectly linked to the target gene (Figure 1 - Pmut disposed
R0 134998 Α2 ΛΖ paralel cu ținta), desface legăturile covalente dintre riboză și dezxiribozele învecinate (flancuri) și elimină astfel modificarea de la capătul 3*. Eliminarea inhibitorului din capătul 3' determină activarea primerului (figura 1 - Pmut activat), care în această formă poate fi extins prin polimerizarea coordonată de către ADN polimeraza (figura 1 - săgețile orizontale cu linie întreruptă). Polimerizarea determină degradarea sondei (figura 1 - S) și astfel particula fluorescentă (figura 1 - cercul gol) se separă de inhibitorul fluorescenței (figura 1 - cercul negru). Semnalul fluorescent înregistrat în timp (figura 1 - graficul din dreapta, jos) este proporțional cu numărul de molecule țintă (figura 1 - NPM1 mutant).R0 134998 Α2 ΛΖ parallel to the target), loosens the covalent bonds between the ribose and the neighboring dexiriboses (flanks) and thus eliminates the change at the 3 * end. Removal of the inhibitor from the 3 'end causes activation of the primer (figure 1 - activated Pmut), which in this form can be extended by coordinated polymerization by DNA polymerase (figure 1 - horizontal dashes with dashed line). The polymerization causes the probe to degrade (figure 1 - S) and thus the fluorescent particle (figure 1 - empty circle) separates from the fluorescence inhibitor (figure 1 - black circle). The fluorescent signal recorded over time (figure 1 - graph on the right, bottom) is proportional to the number of target molecules (figure 1 - mutant NPM1).
d) Problemele tehnologiei actualed) The problems of current technology
Diagnosticul molecular pentru detecția și caracterizarea mutațiilor genetice se bazează în marea majoritate a cazurilor pe tehnologia PCR. Deoarece primerii și sondele sunt proiectate în funcție de secvența nucleotidelor regiunii ADN care cuprinde mutația analizată, tehnologia PCR se poate aplica doar dacă mutația analizată este bine cunoscută. Astfel, în cazurile în care regiunea mutantă a unei gene poate avea secvențe variabile, diferite între pacienți, este necesară stabilirea unui set de primeri pentru fiecare variantă de secvență. în această categorie este inclusă și mutația genei NPM1. Se cunosc peste 24 de variante ale genei mutante NPM1, dintre care 6 sunt mai frecvente. Diagnosticul molecular prin utilizarea PCR standard ar presupune realizarea a 24 reacții PCR separate pentru fiecare proba biologică.Molecular diagnosis for the detection and characterization of genetic mutations is based in the vast majority of cases on PCR technology. Because primers and probes are designed based on the nucleotide sequence of the DNA region comprising the analyzed mutation, PCR technology can only be applied if the analyzed mutation is well known. Thus, in cases where the mutant region of a gene may have variable sequences, different between patients, it is necessary to establish a set of primers for each variant variant. The NPM1 gene mutation is also included in this category. More than 24 variants of the NPM1 mutant gene are known, of which 6 are more common. Molecular diagnosis using standard PCR would involve performing 24 separate PCR reactions for each biological sample.
A fost testată și varianta utilizării primerilor degenerați (un primer se poate atașa de mai multe variante de secvență) sau varianta în care mai mulți primeri sunt amestecați intr-o singură reacție PCR (PCR multiplex). Principala problemă în astfel de cazuri este scăderea gradului de precizie al metodei și creșterea riscului de a obține rezultate false. Majoritatea metodelor sunt performante pentru testele de diagnostic, atunci când cantitățile de NPM1 mutant sunt sporite. în situația monitorizării evoluției leucemiei la pacienții sub tratament sau după tratament, atunci cînd cantitatea de NPM1 mutant este redusă substanțial în probele recoltate, toate aceste metode prezintă limite.The variant of using degenerate primers (a primer can be attached to several sequence variants) or the variant in which several primers are mixed in a single PCR reaction (multiplex PCR) was also tested. The main problem in such cases is the decrease in the accuracy of the method and the increased risk of obtaining false results. Most methods are effective for diagnostic tests, when the amounts of mutant NPM1 are increased. In the case of monitoring the evolution of leukemia in patients under treatment or after treatment, when the amount of mutant NPM1 is substantially reduced in the samples collected, all these methods have limits.
Alternativa tehnologică este reprezentată de secvențierea ADN a pacienților pentru identificarea secvenței mutantă, urmată de monitorizare prin PCR cu primeri specifici pentru secvența repectiva. Această procedură este costisitioare și deocamdată se aplică doar în cercetarea medicală.The technological alternative is represented by the DNA sequencing of the patients to identify the mutant sequence, followed by PCR monitoring with specific primers for the respective sequence. This procedure is expensive and currently only applies in medical research.
e) Expunerea invențieie) Disclosure of the invention
Invenția prezintă o soluție tehnologică pentru detecția și dozarea celor mai frecvente mutații NPM1, variabile ca secvență, printr-o singură reacție PCR. Spre deosebire de metodele publicate în literatură, în acest caz, precizia metodei este mult crescută prin utilizarea primerilor activabili de către endonucleaza H2 termorezistentă.The invention presents a technological solution for the detection and dosing of the most frequent NPM1 mutations, variable in sequence, by a single PCR reaction. Unlike the methods published in the literature, in this case, the accuracy of the method is much increased by the use of primers that can be activated by heat-resistant H2 endonuclease.
Invenția reprezință un set de doi primeri (figura 1 - primerul P1 si primerul Pmut) și o sondă (figura 1 - sonda S). Primerul P1 este complementar cu o zonă din exonul 11, care nu este afectată de apariția mutațiilor. Primerul P1 este necesar pentru amplificarea NPM1 și creșterea exponențială a cantității de produs.The invention represents a set of two primers (figure 1 - primer P1 and primer Pmut) and a probe (figure 1 - probe S). Primer P1 is complementary to an area of exon 11, which is not affected by mutations. Primer P1 is required for amplification of NPM1 and exponentially increasing the amount of product.
Primerul Pmut este complementar cu regiunea din exonul 12 susceptibilă pentru apariția mutațiilor patogene (figura 1 - zona susceptibilă la mutații este marcată cu o linie verticală în exonul 12 al NPM1, iar zona care include efectiv o mutație este hașurată cu linii verticale in exonul 12 al NPM1 mutant). Acest primer este cel care asigură specificitatea reacției, în sensul că fie permite amplificarea PCR dacă există ținte mutante în proba analizată, fie blochează reacția PCR daca toate moleculele NPM1 sunt normale. în cazul interactiei dintre molecula NPM1 normală si * » primerul Pmut blocat, zona hașurată vertical a primerului (figura 1) nu are corespondent de secvență în țintă (deoarece lipsește mutația), astfel că zona respectivă cât și porțiunea 3' (cu riboza) nu se leagă la țintă. Deoarece zona cu riboză nu interactionează cu NPM1 normal si nu realizează structuri dublucatenare, endonucleaza H2 (figura 1 - arcul de cerc punctat) nu este capabilă de a elimina inhibitorul de PCR din capătul (figura 1 - steaua marcată în negru) și astfel primerul nu poate fi extins prin PCR (figura 1 - marcajul X). în acest fel se asigură precizia metodei: daca nici una dintre moleculele NPM1 din proba analizată nu este mutantă atunci reacția nu are loc. JThe Pmut primer is complementary to the region of exon 12 susceptible to pathogenic mutations (figure 1 - the area susceptible to mutations is marked with a vertical line in exon 12 of NPM1, and the area that actually includes a mutation is shaded with vertical lines in exon 12 of Mutant NPM1). This primer is the one that ensures the specificity of the reaction, in the sense that it either allows PCR amplification if there are mutant targets in the analyzed sample, or blocks the PCR reaction if all NPM1 molecules are normal. in the case of the interaction between the normal NPM1 molecule and the * »blocked Pmut primer, the vertically hatched area of the primer (figure 1) has no target sequence correspondent (because the mutation is missing), so that the area and the 3 'portion (with ribose) do not binds to the target. Because the ribose area does not interact with normal NPM1 and does not make double-stranded structures, endonuclease H2 (figure 1 - dotted arc) is not able to remove the PCR inhibitor from the end (figure 1 - star marked in black) and thus the primer does not can be extended by PCR (figure 1 - X marking). in this way the accuracy of the method is ensured: if none of the NPM1 molecules in the analyzed sample is mutant then the reaction does not take place. J
Când primerul Pmut (figura 1 - primerul Pmut-blocat) interacționează cu NPM1 mutant, acesta se aliniază pe întreaga sa lungime cu molecula țintă cu formarea unei structuri dublucatenare, inclusiv regiunea cu riboză. în această situație, endonucleaza H2 termorezistentă recunoaște structura dublucatenară dintre Pmut și NPM1 mutant, digeră legăturile dintre riboza și dezoxiribozele învecinate și elimină capătul 3' al primerului. în acest mod, primerul Pmut este convertit din forma blocată în forma activă. Primerul Pmut activat induce activitatea ADN polimerazei conform săgeții (figura 1 - săgeata orizontală cu linie întreruptă), iar când enzimaWhen the Pmut primer (Figure 1 - Pmut-blocked primer) interacts with the mutant NPM1, it aligns along its entire length with the target molecule to form a double-stranded structure, including the ribose region. In this situation, the heat-resistant H2 endonuclease recognizes the double-stranded structure between Pmut and the mutant NPM1, digests the bonds between the ribose and the neighboring deoxyriboses and removes the 3 'end of the primer. In this way, the primer Pmut is converted from the blocked form to the active form. The activated Pmut primer induces DNA polymerase activity according to the arrow (figure 1 - horizontal arrow with dashed line), and when the enzyme
R0 134998 Α2 întâlnește sonda S determină degradarea acesteia. în urma degradării sondei, realizată de către ADN polimerază, compusul fluorescent este eliberat și va emite semnalul fluorescent caracteristic. Intensitatea semnalului fluorescent este o măsură a numărului de molecule NPM1 mutante.R0 134998 Α2 meets probe S causes its degradation. Upon degradation of the probe, performed by DNA polymerase, the fluorescent compound is released and will emit the characteristic fluorescent signal. The intensity of the fluorescent signal is a measure of the number of mutant NPM1 molecules.
Sonda este complementară cu secvența formată prin alipirea exonului 11 la exonul 12, iar cei doi primeri sunt complementari cu exoni diferiți (figura 1 - primerul P1 este complementar cu secvența din exonul 11, iar primerul Pmut este complementar cu secvența existentă la nivelul exonului 12). în acest fel se evaluează expresia NPM1 mutant, prin dozarea ARN mesager transcris din gena NPM1. Datorită specificității de secvență a primerilorși a sondei, testul nu cuantifică NPM1 la nivelul genomului astfel că rezultatele reflectă cu mare precizie nivelul de expresie a genei.The probe is complementary to the sequence formed by attaching exon 11 to exon 12, and the two primers are complementary with different exons (figure 1 - primer P1 is complementary to the sequence from exon 11, and primer Pmut is complementary to the existing sequence at exon 12) . In this way the expression of the mutant NPM1 is evaluated by dosing the messenger RNA transcribed from the NPM1 gene. Due to the sequence specificity of the primers and probe, the test does not quantify NPM1 at the genome level so the results accurately reflect the level of gene expression.
Secvențele primerilor și sondelor sunt:The sequences of primers and probes are:
(primer P1) 5'-CAATTATGTGAAGAATTGCTTCCGGATGAC -3' (primer Pmut blocat) 5'TACCACATTACACCACACACGAGAGACTTCCTCCACTGCCAGGCAGAGaTCTTC( C3) -3' (primer Pmut activat) 5'TACCACATTACACCACACACGAGAGACTTCCTCCACTGCCAGGCAGAG-3' (sonda S) /56-FAM/TAG+C+CTCTTGGT+C+AGT/3IABkFQ/, unde: ”a” este riboza, 6-FAM” este compusul fluorescent (fluoresceină), ” lABkFQ” este inhibitorul de fluorescentă, (C3) reprezintă inhibitorul de PCR, ”+...” reprezintă nucleotide modificate LNA, iar restul sunt dezoxiribonucleotide.(first P1) 5'-CAATTATGTGAAGAATTGCTTCCGGATGAC -3 '(first Pmut blocked) 5'TACCACATTACACCACACACGAGAGACTTCCTCCACTGCCAGGCAGAGaTCTTC (C3) -3' (first Pmut activated S) + C + AGT / 3IABkFQ /, where: "a" is ribose, 6-FAM "is the fluorescent compound (fluorescein)," lABkFQ "is the fluorescence inhibitor, (C3) is the PCR inhibitor," + ... "is modified LNA nucleotides, and the rest are deoxyribonucleotides.
f) Realizarea practică a invențieif) The practical realization of the invention
Invenția a fost testată practic pentru mutațiile NPM1 A (secvența TCTG), B (secvența CATG) și D (secvența CCTG) folosindu-se setul de plasmide recomandat în clinică (denumite ”NPM1 mut A cDNA MutaQuant Stds”, nr catalog 677591, ”NPM1 mut B&D cDNA MutaQuant Stds”, nr catalog 677791, producător Ipsogen/Qiagen, Hilden, Germania). Aceste plasmide se folosesc în practica medicală pentru a permite dozarea numărului de copii NPM1 mutant, printr-o procedură recomandată de societățile europene de hematologie. Cele trei mutații testate, reprezintă aproximativ 70-89% dintre mutațiile NPM1. Testarea s-a realizat în triplicat, de către doi operatori. Testarea s-a realizat cu setul de reactivi furnizat de Thermo Fischer Scientific (TaqMan™ Universal Mașter Mix II, no UNG”, nr catalogThe invention was practically tested for NPM1 A (TCTG sequence), B (CATG sequence) and D (CCTG sequence) mutations using the clinically recommended plasmid set ("NPM1 mut A cDNA MutaQuant Stds", catalog no. 677591, " NPM1 mut B&D cDNA MutaQuant Stds ”, catalog no. 677791, manufacturer Ipsogen / Qiagen, Hilden, Germany). These plasmids are used in medical practice to allow the dosing of the number of mutant NPM1 copies, through a procedure recommended by European hematology societies. The three mutations tested represent approximately 70-89% of NPM1 mutations. The testing was performed in triplicate by two operators. The testing was performed with the set of reagents provided by Thermo Fischer Scientific (TaqMan ™ Universal Master Mix II, no UNG ”, catalog no.
RO 134998 Α2RO 134998 Α2
4440047, Statele Unite ale Americii), în acord cu indicațiile producătorului. Concentrația de primeri este de 0,3 micromolari, iar sonda este de 0,5 micromolari, într-un volum final de 20 microlitrii. Pentru fiecare mutație s-a testat un număr variabil de copii de plasmide, asa cum sunt livrate de către producător (figura 2 - valorile de pe axa orizontală, care sunt următoarele, în ordine de la stânga la dreapta, 10 copii, 100 copii, 1.000 copii, 100.000 copii, 1.000.000 copii). Pentru fiecare reacție s-au adăugat 2,3 miliunitați enzimatice de endonucleaza H2 termorezistentă (”Rnase H2”, donată din organismul termofil extrem Pyrococcus abyssi, producător Integrated DNA Technologies, Inc., nr catalog 11-03-02-02, Statele Unite ale Americii). în figura 2 sunt prezentate rezultatele calibrării cu diluțiile seriale, pentru fiecare tip de mutație analizată. în toate cazurile, chiar daca secvența mutației este diferită, precizia reacției PCR este mare (mutația A - R = 0,998; mutația B - R = 0,999, mutația D - R = 0,998). în figura 3 este prezentat profilul semnalului fluorescent înregistrat pe parcursul reacțiilor PCR care stau la baza curbei de calibrare a NPM1 mutA - cele 5 înregistrări fără săgeți. Rezultatele dovedesc că un singur set de primeri plus sondă este suficient pentru a detecta NPM1 mutant cu sevență variabilă.4440047, United States of America), in accordance with the manufacturer's instructions. The primer concentration is 0.3 micromolar, and the probe is 0.5 micromolar, in a final volume of 20 microliters. For each mutation, a variable number of copies of plasmids were tested, as delivered by the manufacturer (Figure 2 - values on the horizontal axis, which are as follows, in order from left to right, 10 copies, 100 copies, 1,000 copies , 100,000 children, 1,000,000 children). For each reaction, 2.3 million enzyme units of heat-resistant H2 endonuclease ("Rnase H2"), donated from the extremely thermophilic organism Pyrococcus abyssi, manufacturer Integrated DNA Technologies, Inc., catalog no. 11-03-02-02, United States, were added. of America). Figure 2 shows the results of calibration with serial dilutions for each type of mutation analyzed. In all cases, even if the sequence of the mutation is different, the accuracy of the PCR reaction is high (mutation A - R = 0.998; mutation B - R = 0.999, mutation D - R = 0.998). Figure 3 shows the profile of the fluorescent signal recorded during the PCR reactions underlying the NPM1 mutA calibration curve - the 5 recordings without arrows. The results prove that a single set of primers plus probe is enough to detect mutant NPM1 with variable seven.
Setul de primeri plus sondă a fost testat și pentru probe biologice (ARN total extras din sângele periferic și convertit in ADN complementar). Figura 3 prezintă un rezultat tipic pentru o probă leucemică cu mutație la NPM1 și pentru o probă cu NPM1 normal - doar curbele fluorescente marcate cu săgeți: săgeata orizontală indică proba mutantă, iar săgeata verticală indică proba normală. Rezultatul demonstrează că metoda este aplicabilă în domeniul medical.The primer plus probe set was also tested for biological samples (total RNA extracted from peripheral blood and converted to complementary DNA). Figure 3 shows a typical result for a leukemic sample mutated to NPM1 and for a sample with normal NPM1 - only the fluorescent curves marked with arrows: the horizontal arrow indicates the mutant sample, and the vertical arrow indicates the normal sample. The result demonstrates that the method is applicable in the medical field.
g) Avantajele invențieig) Advantages of the invention
Avantajul principal al invenției este acela că printr-o singură reacție PCR se pot detecta și doza diferite mutații NPM1, variabile ca secvență. Nu mai este necesară proiectarea, sinteza și optimizarea primerilor și sondelor pentru fiecare mutație în parte. Practic toți pacienții pot fi testați printr-o singură reacție PCR. Rezultatul obținut are relevanță clinică, deoarece valoarea prognostică a genei mutante NPM1 este aceeași indiferent de secvența mutației. » I 1The main advantage of the invention is that by a single PCR reaction different dose NPM1 mutations can be detected, variable in sequence. It is no longer necessary to design, synthesize and optimize primers and probes for each mutation. Virtually all patients can be tested by a single PCR reaction. The result obtained has clinical relevance, because the prognostic value of the mutant NPM1 gene is the same regardless of the mutation sequence. »I 1
Al doilea avantaj, este că, prin includerea etapei de activare a primerilor, prin digestia coordonată de către endonucleaza H2, precizia metodei este mult crescută. Activarea primerilor este strict dependentă de prezența secvenței mutante și astfel se elimină riscul ca testul să indice în mod eronat că proba analizată conține molecule NPM1 mutante.The second advantage is that, by including the step of activating the primers, by digestion coordinated by the H2 endonuclease, the accuracy of the method is much increased. The activation of the primers is strictly dependent on the presence of the mutant sequence and thus eliminates the risk that the test erroneously indicates that the analyzed sample contains mutant NPM1 molecules.
iome
Metoda ar permite reducerea costurilor diagnosticului NPM1 avînd în vedere că se reduce numărul de reacții PCR și consumul de materiale și reactivi. în al doilea rînd s-ar reduce costurile privind diagnosticul NPM1 prin secvențiere: s-ar putea realiza o selecție prealabilă a probelor prin testarea NPM1 cu metoda PCR expusă aici și doar probele pozitive să fie evaluate ulterior, dacă este relevant clinic, prin seventiere. »The method would reduce the cost of diagnosing NPM1 as it reduces the number of PCR reactions and the consumption of materials and reagents. secondly, the costs of diagnosing NPM1 by sequencing would be reduced: a pre-selection of samples could be made by testing NPM1 with the PCR method set out here and only positive samples would be evaluated later, if clinically relevant, by sequencing. »
h) Descrierea figurilor în figura 1 este prezentat schematic principiul de funcționare al reacției de PCR dependentă de endonucleasa H2. Astfel, primerii dependenți de activitatea endonucleazei H2 (Pmut inactiv) prezintă două trăsături specifice: la capătul 3' au o modificare structurală (marcată cu o steluță neagră) care inhibă legarea ADN polimerazei; tot in regiunea 3', dar cu 5 baze mai spre centrul secvenței, primerii au o riboză (marcată cu un triunghi negru), restul nucleotidelor fiind dezoxiriboze. Când primerul inactiv recunoaște și se leagă de secvența perfect complementară de pe molecula țintă (NPM1 mutant), se generează o structură ADN dublucatenară, care are o singură riboză în compunerea ei. Această structură și numai ea este digerată de către endonucleaza H2 termorezistentă (marcată cu semicerc punctat), proces în urma căruia riboză și capătul 3' sunt îndepărtate din componența primerului, care astfel devine activat (Pmut activ) și care este extins de către polimerază pănă la celălalt capăt al țintei. în timpul polimerizării are loc fenomenul de fragmentare a sondei S, ceea ce declanșează emiterea unui semnal fluorescent care este înregistrat în timp real de către instrument. Sonda S este un oligo ADN care are la capătul 5' un colorant fluorescent (cercul alb), iar la capătul 3' are un inhibitor de fluorescență (cercul negru). Cât timp sonda este întreagă, semnalul fluorescent este anulat de inhibitorul învecinat. în urma degradării sondei, realizată de către ADN polimerază, compusul fluorescent este eliberat și va emite semnalul fluorescent caracteristic (cercul cu raze). Intensitatea semnalului fluorescent este o măsură a numărului de molecule țintă din momentul înregistrării.h) The description of the figures in figure 1 is presented schematically the operating principle of the PCR reaction dependent on H2 endonuclease. Thus, primers dependent on H2 endonuclease activity (inactive Pmut) have two specific features: at the 3 'end they have a structural change (marked with a black star) that inhibits DNA polymerase binding; also in the 3 'region, but with 5 bases closer to the center of the sequence, the primers have a ribose (marked with a black triangle), the rest of the nucleotides being deoxyribose. When the inactive primer recognizes and binds to the perfectly complementary sequence on the target molecule (mutant NPM1), a double-stranded DNA structure is generated, which has a single ribose in its composition. This structure and only it is digested by the heat-resistant H2 endonuclease (marked with a dotted semicircle), a process after which the ribose and the 3 'end are removed from the primer, which thus becomes activated (Pmut active) and which is extended by the polymerase to at the other end of the target. During polymerization, the S-probe fragmentation phenomenon occurs, which triggers the emission of a fluorescent signal that is recorded in real time by the instrument. Probe S is an oligo DNA that has a fluorescent dye (white circle) at the 5 'end, and has a fluorescence inhibitor (black circle) at the 3' end. As long as the probe is complete, the fluorescent signal is canceled by the neighboring inhibitor. Following degradation of the probe, performed by DNA polymerase, the fluorescent compound is released and will emit the characteristic fluorescent signal (ray circle). The intensity of the fluorescent signal is a measure of the number of target molecules at the time of recording.
Dacă primerul interacționează cu o moleculă care nu are secvența caracteristică (în acest caz, NPM1 normal), atunci legarea acestuia la țintă este doar parțială (în figură, primerul nu este paralel cu ținta pe toată lungimea lui) și nu se formează structura dublucatenară care să includă si riboză. în această variantă, endonucleaza H2 termorezistentă nu poate digera primerul și nu poate elimina capătul 3', iar primerul rămâne în formă inactivă. Primerul inactiv (Pmut blocat) nuIf the primer interacts with a molecule that does not have the characteristic sequence (in this case, normal NPM1), then its binding to the target is only partial (in the figure, the primer is not parallel to the target along its entire length) and no double-stranded structure is formed. to include ribose. In this embodiment, the heat-resistant H2 endonuclease cannot digest the primer and cannot remove the 3 'end, and the primer remains inactive. Idle primer (Pmut blocked) no
R0 134998 Α2 Iq poate fi extins prin polimerizare (fenomen marcat cu X în figură) și, în consecință, nu se petrece degradarea sondei, iar semnalul fluorescent este absent.R0 134998 Α2 Iq can be extended by polymerization (X-marked phenomenon in the figure) and, consequently, no probe degradation occurs and the fluorescent signal is absent.
Termenul ADN complementar din figura 1 desemnează faptul că moleculele NPM1 sunt obținute din ARN prin conversia acestuia în ADN.The term complementary DNA in Figure 1 refers to the fact that NPM1 molecules are obtained from RNA by converting it to DNA.
în figura 2 sunt prezentate curbele de calibrare pentru detecția mutațiilor A (graficul din stânga), B (graficul din stânga) și D (graficul din stânga) ale NPM1. Pentru fiecare grafic, pe axa orizontală este indicată cantitatea de NPM1 (nr de copii), iar pe axa verticală sunt indicate valorile Ct produse de reacțiile de PCR. Fiecare punct este o reacție PCR corespunzătoare unei anumite cantități de țintă și unei valori Ct. Liniile reprezintă ecuația de calibrare stabilite de un soft specializat.Figure 2 shows the calibration curves for detecting mutations A (left graph), B (left graph) and D (left graph) of NPM1. For each graph, the amount of NPM1 (number of copies) is indicated on the horizontal axis, and the Ct values produced by the PCR reactions are indicated on the vertical axis. Each point is a PCR reaction corresponding to a certain amount of target and a Ct value. The lines represent the calibration equation established by a specialized software.
în figura 3 sunt prezentate profilurile fluorescente ale unor reacții de PCR.Figure 3 shows the fluorescent profiles of some PCR reactions.
Profilurile marcate cu săgeți au fost realizate cu probe biologice (săgeata verticală indică o probă fără mutații la NPM1, iar săgeata orizontală indică o probă cu mutația NPM1 mut A); celelalte racții PCR au fost realizate cu plasmidele purtătoare de mutatie NPM1 mut A existente în trusa de calibrare. Valorile Ct se determină automat de către instrument și reprezintă nr de cicluri de reacție (de pe axa orizontală) corespunzător punctului de interacție dintre curba de fluorescență și linia orizontală marcată, în acest caz, cu valoarea 0.315.Profiles marked with arrows were made with biological samples (vertical arrow indicates a sample without mutations in NPM1, and the horizontal arrow indicates a sample with mutation NPM1 mut A); the other PCR reactions were performed with the mutation-carrying plasmids NPM1 mut A existing in the calibration kit. The Ct values are determined automatically by the instrument and represent the number of reaction cycles (on the horizontal axis) corresponding to the point of interaction between the fluorescence curve and the horizontal line marked, in this case, with the value 0.315.
i) Aplicabilitatea invențieii) Applicability of the invention
Invenția este aplicabilă în diagnosticul molecular al leucemiei mieloide acute, pentru detecția și dozarea celulelor canceroase, purtătoare a mutațiilor NPM1. Testul se poate aplica pentru analiza ARN obținut din probele de sânge sau măduvă hematogenă.The invention is applicable in the molecular diagnosis of acute myeloid leukemia, for the detection and dosing of cancer cells, carriers of NPM1 mutations. The test can be applied for RNA analysis obtained from blood or hematogenous marrow samples.
Testul PCR se combină cu alte proceduri standard prin care ARN-ul este convertit în ADN complementar, etapă ce precede reacția de PCR. Alternativ, testul se poate aplica direct preparatelor ARN, în care ambele procese (conversia ARN și reacția PCR) se desfășoară într-o singură etapă.The PCR assay is combined with other standard procedures by which RNA is converted to complementary DNA, a step that precedes the PCR reaction. Alternatively, the test can be applied directly to RNA preparations, in which both processes (RNA conversion and PCR reaction) are carried out in a single step.
Deoarece procedura are o limită de detecție de minim 10 copii NPM1 mutant, invenția este aplicabilă în orice procedură medicală prin care se monitorizează prezența celulelor leucemice, la nivel rezidual, în pacienții aflați în tratament sau post-tratament.Because the procedure has a detection limit of at least 10 mutant NPM1 copies, the invention is applicable to any medical procedure that monitors the presence of residual leukemia cells in patients undergoing or post-treatment.
Testul se poate aplica într-o etapă de preselecție a probelor care să fie evaluate ulterior prin secvențiere, cu avantajul reducerii numărului de secvențieri pentru gena NPM1.The test can be applied in a pre-selection stage of the samples to be evaluated later by sequencing, with the advantage of reducing the number of sequencers for the NPM1 gene.
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RO201900719A RO134998A2 (en) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | Set of two primers and one probe for detection and dosing of mutant npm1 gene |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RO201900719A RO134998A2 (en) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | Set of two primers and one probe for detection and dosing of mutant npm1 gene |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RO134998A2 true RO134998A2 (en) | 2021-05-28 |
Family
ID=76070136
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RO201900719A RO134998A2 (en) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | Set of two primers and one probe for detection and dosing of mutant npm1 gene |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RO (1) | RO134998A2 (en) |
-
2019
- 2019-11-11 RO RO201900719A patent/RO134998A2/en unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kotoula et al. | Targeted KRAS mutation assessment on patient tumor histologic material in real time diagnostics | |
EP2885427B1 (en) | Colorectal cancer methylation marker | |
Liu et al. | Research progress in molecular biology related quantitative methods of MicroRNA | |
US20190316194A1 (en) | Method and kit for determining the genome integrity and/or the quality of a library of dna sequences obtained by deterministic restriction site whole genome amplification | |
JP2012235777A (en) | Probe for detecting mutation in exon 12 of npm1 gene and use thereof | |
EP2726629B1 (en) | Method to determine dna mismatch repair function | |
JP4968577B2 (en) | Rapid measurement method of cytokeratin 19 (CK19) mRNA, and primer and probe therefor | |
KR20170136555A (en) | LNA-based mutant enrichment next-gen sequencing assays | |
Lo et al. | MethySYBR, a novel quantitative PCR assay for the dual analysis of DNA methylation and CpG methylation density | |
Träger et al. | mRNAs of tyrosine hydroxylase and dopa decarboxylase but not of GD2 synthase are specific for neuroblastoma minimal disease and predicts outcome for children with high‐risk disease when measured at diagnosis | |
Bahloul et al. | Clinical impact of molecular diagnostics in low-grade lymphoma | |
Khor et al. | Involvement of CELSR3 hypermethylation in primary oral squamous cell carcinoma | |
KR102492149B1 (en) | MicroRNA-1246 for diagnosing of ovarian cancer and use thereof | |
CN116287129B (en) | Ultra-short chain miRNA detection method and system based on reverse-folded crRNA | |
RO134998A2 (en) | Set of two primers and one probe for detection and dosing of mutant npm1 gene | |
CN111100924A (en) | Quality control product for detecting CGG (CGG repeat number) of FMR1 gene, application thereof and kit containing quality control product | |
Hagiwara et al. | Aberrant DNA methylation of the p57KIP2 gene is a sensitive biomarker for detecting minimal residual disease in diffuse large B cell lymphoma | |
RO134326A2 (en) | Set of two primers and two probes, and a method of digital pcr in emulsion for specific detection of duplication of a region with terminal sequence gagaatatgaatatgatctca, in exon 14 of flt 3 gene | |
KR20170051256A (en) | A method for prenatal diagnosis using digital PCR | |
CA3151627A1 (en) | Use of simultaneous marker detection for assessing difuse glioma and responsiveness to treatment | |
KR101855748B1 (en) | A method of measuring the multiple signals using single fluorescence on PCR | |
AU2019375136A1 (en) | Method for diagnosing a cancer and associated kit | |
US20230194500A1 (en) | Ultrasensitive rna quantification using nanopores | |
Nagarajan et al. | 36 Mutation Detection | |
CN116926066A (en) | Primer combination product, kit for quality detection and genome quality detection method |