RO133316A0 - Preparate naturale cu acţiune antifungică şi antimicotoxigenă folosite ca agenţi de protecţie a cerealelor, şi procedeu de obţinere a acestora - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la preparate naturale tip nanoemulsii cu acţiune antifungică şi antimicotoxigenă, destinate protecţiei cerealelor, în cultură şi în depozite, cu aplicare foliară şi/sau la seminţe, cu utilizare în agricultura biologică, pe bază de uleiuri esenţiale din familiileşi, cu adaos de excipienţi organici naturali, şi la un procedeu de obţinere a acestora. Preparatele conform invenţiei sunt constituite dintr-un amestec de principii active reprezentate de uleiuri esenţiale selectate din următoarele plante exprimate în procente în greutate: mărar, oreganoşi cimbruîn proporţii de 0,3...2%, lecitină din soia în cantitate de 0,05% şi diferenţa până la 100%, apă. Procedeul conform invenţiei are următoarele faze: a. sortarea manuală a materialului vegetal alcătuit din seminţe, inflorescenţe şi plantă întreagă, prin îndepărtarea părţilor putrezite, alterate şi a impurităţilor de natură mineralăşi organică, b. uscarea materialului vegetal în spaţii aerisite şi ventilate la o temperatură de 20...25°C, până când umiditatea scade sub 8%, c. mărunţirea materialului vegetal într-o moară de laborator la o turaţie de 1000 rot/min, d. obţinerea uleiului esenţial prin antrenarea cu vapori a principiilor volatile eliberate de matricea vegetală cu un randament de extracţie cuprins între 0,5...4% în funcţie de specie, e. obţinerea preparatelor naturale cu acţiune antifungică cu adaos de substanţe emulsionabile prin ultrasonicare folosind Echipamentul Sonic Vibracel WCX130 cu puterea de 130 W şi frecvenţa de 20 kHz, la temperatura de 25°C, folosind ca agenţi de emulsionare lecitina şi gelatina în proporţii diferite, în funcţie de reţeta de fabricaţie, f. ambalarea produsului în recipientede plastic cu volumul cuprins între 500...1000 ml şi etichetarea acestora, şi g. depozitarea recipientelor în încăperi fără expunere la radiaţia solară, cu temperatura cuprinsă între 15...25°C.

Description

PREPARATE NATURALE CU ACȚIUNE ANTIFUNGICĂ SI ANTIMICOTOXIGENĂ FOLOSITE CA AGENTI DE PROTECȚIE A CEREALELOR SI PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTORA

Inventatori: Alexa Ersilia¹, Sumalan Renata Maria¹, Lintia Vasile², Negrea Monica¹, Obistioiu Diana¹, Pop Georgeta¹, Radulov Isidora¹, Crista Laura¹, Rus Cristian¹ 'Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară a Banatului „Regele Mihai I al României” din Timișoara, ²SC Panetone SRL

L Context

Invenția se referă la produse naturale cu acțiune antifungică (PNA) si antimicotoxigenă cu efect proiectiv împotriva speciilor de Fusarium respectiv a micotoxinelor dezvoltate în cultura de cereale, pe bază de uleiuri esențiale (UEs) din plante medicinale si condimentam din familiile Lamiaceae si Umbelifere, precum și la un procedeu de obținere a PNA printr-o metodă compatibilă cu agricultura organică.

Cerealele și produsele cerealiere reprezintă una din cele mai importante surse de hrană pentru om și animale. în fiecare an o parte semnificativă a producției cerealiere suferă de atacul fungic în câmp sau pe perioada depozitării, producînd pierderi economice importante, dar și efecte negative asupra sănătăți umane [1]. Aceste fungi produc metaboliti secundari, compuși chimici cu acțiune toxică, numiți micotoxine, care se dezvoltă în timpul creșterii și multiplicării fungiilor, când condițiile microecologice sunt favorabile [2-3]. Practic, contaminarea cu micotoxine este răspândită pe tot globul, estimându-se că 25-60% din producția de cereale este afectată de micotoxine produse de lungii de tipul: Aspergillus, Fusarium, Penicillium [4]. Contaminarea cerealelor cu micotoxine reprezintă o problemă în spațiul balcanic, cu influențe în producerea nefropatiei endemice, care se consideră a afecta, în zona rurală, cel puțin 25 000 de locuitori [5].

a 2018 00561

31/07/2018

Speciile de Fusarium, în special Fusarium graminearum și Fusarium culmorum reprezintă fungi producătoare de tricotecene, din care deoxinivalenol (DON) reprezintă micotoxina cea mai fiecvent întâlnită în cereale [6-10]. DON afectează sistemul imun al animalelor și produce tulburări digestive în organismul uman [11].

Fusarium graminearum reprezintă un patogen al plantelor care se regăsește în mod frecvent în cereale, îndeosebi în grâu si orz si produce fusarioza, o boală cunoscuta si sub numele de înrosirea spicelor care este una dintre cele mai răspândite si păgubitoare boli la cereale, producând anual pierderi de 1 -3%, în unii ani pagubele în țara noastră ridicându-se până la 6580% [12-13].

Incidența frmgică si a micotoxinelor în cereale este influențată de condițiile climatice. România este caracterizată printr-un climat continental caracterizat prin ierni reci și uscate și veri calde și ploioase, ceea ce creează condiții optime de dezvoltare a fungiilor. Cercetările anterioare privind incidența micotoxinelor DON în România, in perioada 2010-2011, ca urmare a contaminării boabelor de grâu cu specii de Fusarium, au evidențiat faptul că DON a fost identificat în 73.08% din probele recoltate în anul 2010, nivelul maxim de contaminare fiind de 3.39 ppm. în anul 2011, incidența DON a fost mai scăzută comparativ cu anul anterior, cu o frecventa de 19.23% și o medie a valorilor probelor pozitive de 0.763 ppm [14], Rezultate similare au fost raportate de alți autori în vestul României [15-17]. Valorile înregistrate în probele din România sunt superioare celor recoltate în alte țări europene [18]. Prevenția infecției fungice în timpul dezvoltării plantelor, recoltării și depozitării, precum și măsurile necesare pentru decontaminarea matricelor cerealiere reprezintă priorități current ale Comisiei Europene [19].

In agricultura organică, preparatele naturale reprezintă alterantive viabile la produșii sintetici cu acțiune antifiingică. In acest sens, proprietățile antifungice ale uleiurile esențiale și a principalilor componenți chimici asupra speciilor de Fusarium au fost demonstrate recent în diferite studii [20-25]. Activitatea biologică a uleiurilor esențiale depinde de principalele chemotipuri determinate de genotip și influențate de condițiile agrotehnice și de mediu [25]. Funcționalitatea plantelor medicinale și condimentam se bazează pe relația existentă între structura chimică a principiilor active și acțiunea biologică exercitată asupra diferitelor celule, organe sau organisme. Diferite mecanisme de acțiune asupra celulelor microbiene pentru uleiurile volatile au fost propuse de-a lungul timpului. Astfel, se consideră că uleiurile volatile pot afecta atât membrana protoplasmatică cât și citoplasmă celulei. Caracterul lor hidrofobic pare a fi responsabil de distrugerea structurii bacteriene care conduce la creșterea permeabilității

a 2018 00561

31/07/2018

Plantele din familia Lamiaceae reprezintă sursa cea mai importantă de compuși aromatici care fortifică, stimulează sau protejează anumite organe, aparate sau sisteme de agresiunea factorilor externi. S-a demonstrat faptul că plantele din familia Lamiaceae au proprietăți antifungice ceea ce sugerează că aceste plante pot reprezenta alternative viabile la produșii sintetici utilizați în agricultura organică [26]. De asemenea, rolul funcțional al plantelor din familia Umbelifere, inclusiv efectul antifungic, a fost raportat anterior în literatura de specialitate [26].

Π. Parte experimentală

Partea experimentală a invenției revendicate a presupus realizarea următoarelor etape:

A. Obținerea uleiurilor esențiale din plante medicinale din familiile Lamiaceae si Umbelifere si evaluarea in vitro si in vivo a efectului antifungic si fungicidal;

B. Obținerea preparatelor naturale cu acțiune antifungică (PNA);

C. Evaluarea potențialului antifungic, fungicidal si micotoxicogen in vitro si in vivo in condiții controlate, stabilirea efectelor fitotoxice a preparatelor naturale in cultură si asupra germinației semințelor de cereale.

D. Procedeu tehnologic aplicat la scară pilot de obținere a preparatelor naturale cu acțiune antifungică si antimicotoxigenă.

A. Obținerea uleiurilor esențiale si evaluarea in vitro si in vivo a efectului antifungic si fungicidal

Plantele medicinale studiate aparțin familiei Lamiaceae (Satureja montana, Thymus vulgaris și Origanum vulgare) si Umbelifere (Coriandrum sativum, Anethum graveolens, Foeniculum vulgare) au fost obținute din culturile provenite de la Stațiunea Didactică a Universității de

Științe Agricole și Medicină Veterinară a Banatului “Regele Mihai I al României” din

Timișoara, Romania (21013Έ longitudine, 45045' N latitudine), din producția

S.C.PANETONE SRL, întreprinderea Individuală Lintia Vasile sau achiziționate din culturile

Stațiunii Didactice Secuieni și Plafar. Identificarea speciilor a fost confirmată de către

Departamentul de plante aromatice de la USAMVB Timișoara și o probă voucher a fost păstrată. Aceste plante au constituit material vegetal pentru obținerea preparatelor naturale cu acțiune antifungică. Extracția uleiurilor esențiale s-a realizat prin antrenare cu vapori de apă utilizând instalația de extracție Clevenger.

Uleiurile esențiale menționate au fost analizate in vitro in scopul stabilirii concentrației minime cu impact asupra creșterii miceliene a fungilor de tip Fusarium prin tehnica mediului otrăvit sau food poison. technique [27-28]. Aceasta presupune introducerea în mediul de cultura a unei a 2018 00561

31/07/2018

cantitati determinate de substanța pentru a studia capacitatea de regenerare si creștere a miceliului fungic. Mediul de cultivare a fost CYGA (chloramphenicol-yeast-glucose agar), iar concetratiile UEs testate: 0.02%, 0.04%, 0.06%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0,5% si 0,6%. Varianta de control negativ a fost reprezentată de proba fara adaos, iar controlul pozitiv l-a constituit un fungicid comercial Topsin (tiofanat metil) utilizat in concentrația recomandata in practica agricola.

Tehnica de lucru a constat in obținerea culturilor fungice preinocul de Fusarium graminearum, cu o vechime de 4 zile din care s-au recoltat discuri miceliene, cu diametru de 9mm, care au fost transferate pe variantele de medii adiționate cu cantitati diferite de UEs in placi Petri (cate

3). Incubarea s-a realizat la temperatura 22±2, in condiții de alternanță lumina /intumeric 12h/12h. In ziua a 5- a s-au făcut observații prin masurarea a doua diametre perpendiculare pentru fiecare disc micelian inoculat. Datele brute au fost folosite in calcularea suprafeței miceliene nou crescute (SMN) folosind formula: SMN= [(RM2*3.14/4)-SFI]/100, unde: RMraza suprafeței miceliene, SFI - Suprafața inițială inoculată

Rezultatele ( cm2) au fost ulterior exprimate procentual raportat la control.

Concentrația minimă cu efect fimgistatic (CMFs) este considerata a fi aceea concentrație de la care creșterea fimgica este nula (SMN= 0), iar prin transferul discului fungic inoculat pe un alt mediu proaspăt (fara adaos de UEs) se constata reluarea creșterii hifale si refacerea miceliului fungic.

Concentrația minimă cu efect fungicid (CMFg) este considerata a fi aceea concentrație de la care creșterea fimgica este nula (SMN= 0), iar prin transferul discului fungic inoculat pe un alt mediu proaspăt NU se constata reluarea creșterii hifale, practic miceliul fiind inactivat.

Evaluarea in vivo a efctului antifungic si fimgicidal s-a efectuat prin determinarea indicelui de contaminare a semințelor (ICS) si identificarea genurilor fungice si a micotoxinelor elaborate in cazul fumigarii semințelor de grâu. Genurile fungice studiate au fost: Mucor, Aspergillus, Altemaria, Penicillium, Cladosporium, Rhizopus si Fusarium.

Pentru experiment a fost folosit grâu obtinut prin tehnologie ecologică, soiul Antille, care a fost inoculat artificial cu suspensie de spori Fusarium graminearum cu titrul 2xl0⁶/ml. După 2 zile cate 50 gr semite au fost cântărite si tratate cu 5 ml din varintele de amestecuri naturale. După tratament au fost introduse in recipiente închise, cântărite si păstrate la 20-22 °C, la întuneric. După 7 zile din fiecare proba au fost extrase câte 10 semințe care s-au folost pentru determinarea germinației si prezentei lui Fusarium.

a 2018 00561

31/07/2018

Observațiile au fost făcute prin estimarea gradului de germinație a semințelor si a indexului de contaminare a semințelor (ICS) pentru fiecare varianta de tratament, după procedeul descris de Doolotkeldieva si colab.. [27].

ICS (%) = (număr semințe contaminate/numar total semințe) x 100

Rezultatele experimentale au arătat faptul că indicele de colonizare al semințelor (ICS), după o saptamana de la tratament, este inferior controlului in cazul utilizării uleiurilor esențiale de coriandru, cimbru si mărar. Speciile fungice predominante in această fază sunt: Fusarium, Cladosporium si Rhizopus. După două săptămâni de la efectuarea tratamentului, se observă că ICS este maxim in cazul controlului, că tratamentul cu uleiuri esențiale asigură protecție fungică, iar potențialul de inhibare al colonizării micelare creste in ordinea: fenicul<marar=oregano<coriandru<cimbru de câmp. In această etapă predomină specia fungică Altemaria, regăsindu-se, in control, si tulpini fungice de Aspergillius, Penicillium si Fusarium.

B. Obținerea preparatelor naturale cu acțiune antifungică (PNA)

Pe baza datelor experimentale obținute, a concentrație minima cu efect fungistatic (CMFs) si concentrație minimă fungicidă (CMFg), correlate cu aspect de ordin economic, au fost selectate 3 uleiuri esențiale pentru a fi incluse in preparatele naturale cu efect antifungic asupra Fusarium graminaerum, care au fost introduse în preparate naturale (PNA) sub formă de nanoemulsii obtmandu-se 3 variante de lucru: G-M-O/ (mărar- oregano); G-M-T / (marar-tymus); M-OT/(marar-oregano-tymus). Doua substanțe emulsifiante (gelatina si lecitina) care au fost utilizate in obținerea nanoemulsiilor ca atare au servit ca si control. Modul de preparare a emulsiilor este prezentat la punctul D al prezentei documentații tehnice.

C. Evaluarea potențialului antifungic, fungicidal si micotoxicogen in vitro si in vivo, in condiții controlate si stabilirea efectelor fitotoxice a preparatelor naturale in cultură si asupra germinației semințelor de cereale.

Cele 3 emulsii au fost testate in vitro asupra Fusarium graminaerum folosind tehnica menționata la testarea uleiurilor, in 3 concentrații diferite (1/10, 1/50, 1/100), rezultatele evidentind faptul ca preparatele naturale prezintă activitate antifungică pronunțată, creșterea de miceliu nou, exprimata in valori SMN, fiind in majoritatea variantelor 0. Se evidențiază faptul că eficienta preparatelor naturale asupra creșterii miceliului de Fusarium variază in ordinea: GMT>GMO>MOT. Preparatul GMT a dovedit cele mai puternice efecte antifungice, valorile SMN fiind cele mai reduse pentru Fusarium, inregistrandu-se cele mai mari diferențele a 2018 00561

31/07/2018 fata de control, atat pentru dilutia 1/10 cat si 1/100. Preparatul GMT 1/10 inhibă dezvoltarea Fusarium graminaerum in proporție de 69.69% comparativ cu martorul.

Variante de lucru: Martor- fara tratament, G-M-T concentrat, G-M-T dil 1/10, G-M-T dil 1/50, G-M-O concentrat, G-M-O dil 1/10, G-M-O dil 1/50, M-O -T - concentrat, M-O-T 1/10, MO-T 1/50

Rezultatele obținute au evidențiat o scădere semnificativă a numărului de semințe contaminate cu Fusarium, in raport cu controlul, in toate variantele experimentale, eficienta inhibării crescând in ordinea: MOT<GMO<GMT. Preparatul GMT, 1/50 asigură 84% protecție împotriva dezvoltării micelului de Fusarium în raport cu controlul, in timp ce GMO 1/50 asigură 80% protecție.

Experimentul in vivo efectuat pe genuri fungice dezvoltate pe culturi de cereale s-a efectuat pe grâu soiul Antile, conform metodei descrie la punctual A. In cazul utilizării de produse naturale antifungice (PNA), se observă un profil fungic asemănător experimentului in care s-au utilizat uleiuri esențiale. După prima săptămână de la fumigarea semințelor genurile fungice predominante sunt: Fusarium, Cladosporium, Rhizopus. De remarcat este o scădere semnificativă a numărului de semințe contaminate cu Fusarium, in raport cu controlul, in toate variantele experimentale, eficienta inhibării crescând in ordinea: MO<GMO<GMT. Preparatul GMT, 1/50 asigură 84% protecție împotriva dezvoltării micelului de Fusarium în raport cu controlul, in timp ce GMO 1/50 asigură 80% protecție.

După două săptămâni de la fumigare incidența Cladosporium-ului si Rhizopus-ului scade, dar numărul de semințe contaminate cu Fusarium nu se reduce semnificativ comparativ cu valorile înregistrate după prima săptămână de fumigare, ceea ce evidențiază faptul că durata tratamentului de prevenție in controlul fungic din silozurile de cereale este de 7 zile, după această perioadă fiind necesar un al doilea tratament. In ceea ce privește concentrația recomandată, dilutia 1/50 asigură protecție corespunzătoare corelată cu eficiență economică. Determinarea micotoxinelor. Metoda utilizata a fost metoda imunoenzimatică (ELISA), iar prepararea probelor s-a realizat in conformitate cu instrucțiunile producătorului de kit-uri pentru analiza deoxinivalenolului (DON) din cereale (R-Biopharm). Proba măcinată (5g) a fost extrasă cu 100 ml apă distilată si omogenizată cu ajutorul unui agitator 20 min pentru extracție. Extractul se filtrează, iar filtratul este direct utilizat pentru analiza enzimatică. Soluțiile standard si probele (50 μ!) se amestecă cu 50 μΐ conjugat enzimatic in celule individuale din plăcile kitului ELISA. Se adaugă 50 μΐ soluție anticorp si se lasă la incubat 10 min. la temperatura camerei. Se spală celulele de trei ori cu cate 250 μΐ apă distilată si se adaugă substratul (100 μΐ) si se lasjLîncă 5 min Ia temperature camerei. Soluția de stopare (100 μΐ) se adaugă in fiecare a 2018 00561

31/07/2018

celulă si intensitatea culorii galbene se măsoară la 450 nm utilizând un cititor ELISA 96 (PR1100, Bio-Rad Laboratories, USA).

In scopul testării efectului proiectiv asociat tratamentului cu preparate naturale emulsionabile, 50 g proba de grâu (cu o concentrație DON cunoscuta) au fost stropite cu diferite concentrații de emulsii, iar după Ί zile si 14 zile au fost analizate din punct de vedere al conținutului de DON. Conținutul mediu de DON (ppm) determinat inițial in probele de grâu a fost de 0.464 ppm iar umiditatea probei a fost 12,41% si aw 0,9.

In cazul utilizării preparatelor naturale, GMT concentrat reduce conținutul de DON in proporție de 20,56% după 7 zile de tratament, respectiv 52,41% după 14 zile. Se observă o disponibilitate accentuată de inhibare a dezvoltării DON in cazul dilutiei de 1/50 comparativ cu 1/10. Gradul de inhibare după 7 zile, fiind de 7,80% la dilutia 1/50 si 2,48% la dilutia 1/10. După 14 zile de tratament, nivelul de DON este redus cu 10.0% in cazul dilutiei 1/10 respectiv 33,45% pentru dilutia 1/50.

In cazul tratamentului cu preparatul natural MOT se observă o descreștere progresivă a contaminării cu DON, liniară si invers proporțională cu concentrația aplicată, nivelul contaminării fiind minim in cazul aplicării tratamentului cu dilutie 1/50, după 14 zile de la administrare. In acest caz, reducerea este seminificativă (88,10%), comparativ cu martorul. Important de evidențiat este faptul că, in absenta tratamentului cu preparatele naturale, gradul de reducere a contaminării cu DON este de doar 4.6% intre 7-14 zile.

Preparatul natural GMO prezintă eficientă maximă in protecția împotriva DON, după 14 zile de la administrare, in cazul utilizării dilutiei 1/50 (92,93% comparativ cu controlul).

Prin coroborarea datelor privind efectul protectiv al preparatelor naturale asupra contaminării cu DON a semințelor de grâu expuse atacului cu Fusarium si producției de micotoxine (DON), datele experimentale evidențiază faptul că preparatul natural GMO prezintă eficientă maximă, după 14 zile de la administrare, in cazul utilizării dilutiei 1/50 (92,93% comparativ cu controlul).

Testarea in vivo, in condiții controlate, in seră Phytotron al efectului antifungic al produselor naturale pe semințe de cereale si produse derivate infectate artificial cu spori de Fusarium si evaluarea efectelor fitotoxice.

In această etapă experimentală, grâu tratat cu PNA si ulterior inoculat artificial cu suspensie sporala de Fusarium graminearum (5xl0⁵/ml) a fost amplasat in vase de vegetație urmărinduse periodic atacul cu fuzarioză si conținutul de micotoxine. Evaluarea atacului fungic asupra plantelor inoculate cu spori de Fusarium evidențiază o scădere a numărului de plante atacate a 2018 00561

31/07/2018 comparativ cu controlul, eficiența maximă remarcându-se in cazul preparatului GMT 1/10, urmat de produsul GMO 1/10.

Evoluția conținutului de clorofila in timp evidențiază faptul că, in cazul probelor neinoculate, după 7 zile de tratament, crește concentrația de clorofilă, atat in control cat si in probele supuse tratamentului cu uleiuri esențiale, cu excepția preparatului GMO, pentru care conținutul de clorofila a crescut după aplicarea tratamentului și in proba inoculată cu Fusarium.

După 14 zile de tratament conținutul de clorofila in probele martor, inoculate si neinoculate este egal, ceea ce demonstrează funcționalitatea mecansimelor de aparare si reglare ale plantei in scopul protecției naturale a acesteia la atacul cu fungii. Efectul pozitiv al uleiurilor testate asupra conținutului de clorofila din probele inoculate cu Fusarium este evident după 14 zile de tratament, când conținutul de clorofila, in varianta GMO inoculată, este superior probei neinoculate, ceea ce demonstrează eficienta preparatelor naturale atat ca si agenți antifungici cat si nutritivi. După 21 de zile de la tratament, controlul inoculat si netratat prezintă valori mai scăzute ale conținutului de clorofila comparativ cu varianta neinoculata, in timp ce preparatul GMO demonstrează eficienta tratamentului, conținutul de clorofila crescând cu 7,4 unitati SPAD, care se dovedește a fi cel mai eficient produs, atat antifungic cat si nutritiv.

Efectele fitotoxice ale amestecurilor naturale asupra germinării semințelor s-a realizat utilizând semințe inoculate si fumigate cu preparatele naturale utilizate in experimentul anterior. La stabilirea concentrațiilor luate in lucru s-a tinut cont de performanta uleiurilor si preparatelor naturale in asigurarea efectului fungicidal rezultat in urma testărilor in vitro pe mediul de cultura.

In cazul preparatelor emulsionabile, testate in 3 concentrații (concentrate, dilutie 1/50 si 1/100) se observa ca acestea conferă protecția germinativa de peste 80%. Astfel, la dilutiile 1/100, pentru preparatele GMT si GMO, respectiv 1/50, pentru preparatele GMO, gradul de germinare nu este afectat, fiind comparativ cu controlul, iar pentru celelalte variante experimentale germinația este de 90%., cu excepția GMT concentrat pentru care capacitatea germinativa este de 80%.

Avand in vedere datele obținute cu privire la protecția in vivo a preparatelor naturale asupra semințelor de grâu din depozite, atacate de Fusarium si contaminate cu DON si coroborând aceste rezultate cu capacitatea germinativă, recomandăm utilizarea preparatelor MOT (1/50), GMO (1/50) si GMT (1/10) ca agenți de protecție optimă în cultura cerealelor în condițiile utilizării alternative, prin tratament la sămânță si in vegetație.

a 2018 00561

31/07/2018

D. Procedeu de obținere a preparatelor naturale cu acțiune antifungică si antindcotoxigenă

Procedeul de obținere a preparatelor naturale cu acțiune antifungică, precum si condițiile tehnologice sunt prezentate în schema tehnologică anexată. La întocmirea fluxului tehnologic au fost evaluate riscurile de contaminare și elaborat planul HACCP pentru procesul tehnologic. Fazele tehnologice aferente acestei tehnologii cuprind următoarele etape:

• Sortarea materialului vegetal alcătuit din semințe, inflorescențe si plantă întreagă herba proaspătă se realizează manual prin îndepărtarea semințelor alterate, mucegăite, putrezite, a corpurilor străine de natură minerală (pietriș, nisip), organică (resturi vegetale din alte culturi, buruieni, insecte) sau a altor impurități. Pentru plantele din familia Lamiaceae s-a folosit herba proaspătă în forma integrală, iar pentru plantele din familia Umbelifere s-au folosit semințele.

• Uscarea materialului vegetal se realizează prin dispunerea acestuia în plan deschis pe suprafețe uscate, în spatii aerisite, cu ventilație si umiditate controlată, la temperatură de 20-25°C. Umiditatea este controlată periodic, conform SR EN ISO 712:2010, iar uscarea se consideră încheiată când conținutul de umiditate este sub 8%.

• Măruntirea materialului vegetal se realizează prin măcinare uscată folosind o moară de laborator tip GRINDOMIX RETSCH si măcinate la turatie de 1000 rot/min, timp variabil în funcție de natura materialului vegetal.

• Obținerea uleiului esențial presupune antrenarea cu vapori de apă a principiilor volatile constituente utilizând instalația de extracție Clevenger modificată. Materialul vegetal este dispus pe o sită perforată situată la partea superioară a vasului de extracție, care conține apă încălzită la temperatura de fierbere, vaporii formați antrenând principiile volatile eliberate din matricea vegetală. Randamentele de extracție a uleiurilor esențiale variază între 0.5-4%, in funcție de specie.

• Obținerea preparatelor naturale cu acțiune antifungică (PNA) de tip nanoemulsii de tip U/A pe baza de uleiuri esențiale din familiile Lamiaceae si Umbelifere, cu adaos de substanțe emulsionabile se realizează prin ultrasonicare folosind Echipamentul Sonic Vibracel WCX130, la temperatura de 25°C. Caractersitici aparatura: Putere 130 W, frecventa 20kHz. Ca agenti de emulsionare se folosesc compuși netoxici, organici (lecitină si gelatina) utilizate in procente diferite in funcție de natura si numărul de uleiuri volatile introduse in reteta de fabricație. Investigațiile de granulometrie prin metoda DLS au fost efectuate cu ajutorul aparatului de la Malvern numit Zetasizer Nano a 2018 00561

31/07/2018 7

ZS, prin imprastierea înapoi (173°) a unui fascicul laser HeNe (632.8 nm). Rezultatele experimentale au evidențiat faptul că emulsiile pe bază de uleiuri esențiale au fost stabile in timp si se încadrează in categoria nanoemulsiilor cu un diametru al particulelor variind intre 220-244 nm, astfel încât tehnologia de obținere poate fi aplicată la scară micropilot si industrială.

• Ambalarea produsului se realizează în recipiente din material plastic cu închidere etanșă, cu volum de 500-1000 ml, etichetate conform cerințelor cu menționarea specificațiilor tehnice, termenului de valabilitate si a instrucțiunilor de folosire.

• Depozitarea produsului se va realiza la temperatura ambientală 15-25°C, în încăperi fără expunere directă la radiațiile solare. Termenul de valabilitate se consideră 12 luni de la data fabricației, in condiții de depozitare corespunzătoare.

Bibliografie

1. Jajic I-, Juric V., Glamocic D., Abramovic B., Occurrence of Deoxynivalenol in Maize and Wheat in Serbia, Int J Mol Sci, 2008, 9:2114-2126.

2. Alexa E., Pop G., Sumalan R., Radulov I., Poiana M., Tulcan C., Fusarium species and Fusarium mycotoxins in cerealsfrom West Romania: preliminary survey. Comm Agr Appl Biol Sci., 2011,76(4):661 666.

3. Sumalan R., Alexa E., Pop G., Dehelean C., Sumalan R., The BiodiversityandDisseminationofMycotoxin- producing Fungi in Cereals and Cereai Products. In Proceedings of the 46th Croatian and 6th Internațional Symposium on Agriculture, Edited by Milan Pospisil, Zagreb, Croația, 2011: 770-773 [http://sa.agr.hr/pdf7201 l/sa201 l_proceedings.pdf]

4. Scott P.M., General referee report. Mycotoxins. J Assoc Off Anal Chem, 1990,73:98-105.

5. Puntaric D., Bosnir J., Smit Z., Skes I., Baklaic Z., Ochratoxin A in corn and wheat: geographical association with endemic nephropathy, Croat Med J, 2001,42:175—180.

6. Kuiper-Goodman T., Mycotoxins: riskassessment andlegislation, Toxicol Lett, 1995, 82-83:853-859.

7. Binder E.M., Tan L.M., Chin L.J., Handl J., Richard J., Worldwide occurrence of mycotoxins in commoditiesfeeds andfeed ingredients, Anim Feed Sci Technol, 2007,137:265—282.

8. Mankeviciene A., Butkute B., Gaurilcikiene 1., Dabkevicius Z., Suproniene S., Risk assessment of Fusarium mycotoxins in Lithuanian small cereai grains, Food Control, 2011,22:970-976.

9. Muthomi J.W., Ndung'u J.K., Gathumbi J.K., Mutitu E.W., Wagacha J.M., The occurence of Fusarium species and mycotoxins in Kenyan wheat, Crop Prot, 2008, 27:1215-1219.

10. Sokolovic M., Simpraga B., Survey of trichothecene mycotoxins in grains and animal feed in Croația bv thin layer chromatography. Food Control, 2006,17:733—740.

11. Richard J., Some major mycotoxins and their mycotoxicoses - an overview, Int J Food Microbiol, 2007, 119:3-10.

12. Pitt JI, Hocking AD: Fungi and food spoilage. Ed. Springer, New York; 2009:53-142.

13. Singh, Suman, In vitro antifungal activity of some essential oils, Joumal of Herbal Medicine and Toxicology 2010.4 (2) 107-111 a 2018 00561

31/07/2018

14. Alexa E, Dehelean C, Poiană MA, Radulov L Cimpean AM, Bordean DM, Tulcan C, Pop G, The occurrence of mycotoxins in wheat from western Romania and histopathological impact as effect of feed intake, Chemistry Central Joumal, 2013, 7(1): 99

15. Curtui V., Usleber E., Dietrich R., Lepschy J., Mertlbauer E., A survey on the occurrence of mycotoxins in wheat and maize from western Romania, Mycopathologia, 1998, 143:97-103.

16. Stroia C., Tabuc C., Neacsu A., Incidence of Fusarium species and its mycotoxins in cereals from western Romania, Res J Agric Sci, 2010,42:302-309.

17. Tabuc C., Marin D., Guerre P., Sesan T., Bailly J.D., Mold andmycotoxin content of cereals in southeastern Romania, J Food Prot, 2009,72:662-665.

18. Binder E.M., Tan L.M., Chin L.J., Handl J., Richard Worldwide occurrence of mycotoxins in commoditiesfeeds andfeed ingredients, Anim Feed Sci Technol, 2007,137:265—282.

19. The Commission of the European Communities. Commission regulation (EC) Commission Recommendation 2006/576/EC on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT2 and fumonisins in products intended for animal feeding. [http://irmm.jrc.ec.europa.eu/EURLs/eurl_mycotoxins/legislation/Pages/index.aspx]

20. Nguefack J., Dongmo J.B.L., Dakole C.D., Leth V., Vismer H.F., Torp J., Guemdjom E.F.N., Mbeffo M., Tamgue O., Fotio D., et al., Foodpreservative potențial of essential oils andfractions from Cymbopogon citratus, Ocimum gratissimum and Thymus vulgaris against mycotaxigenic fungi, Int. J. Food Microbiol.

G.H.O., Grespan R., Mikcha JM.G., Machinski M., Antifungal properties and inhibitory effects upon aflataxin production of Thymus vulgaris L. by Aspergillus flavus Link, Food Chem. 2015,173:1006-1010.

22. Pinto E., Gonțalves M.J., Oliveira P., Coelho J., Cavaleiro C., Salgueiro L., Activity of Thymus caespititius essential oii and a-terpineol againstyeasts andfilamentous fungi. Ind. Crops Prod., 2014,62: 107-112.

23. Rajkovic K., Pekmezovic M., Barac A., Nikodinovic-Runic J., Arșic Arsenijevic V., Inhibitory effect of thyme and cinnamon essential oils on Aspergillus flavus: Optimization and activity prediction model development, Ind. Crops Prod. 2015,65: 7—13.

24. Rus C.F., Alexa E., Pop G., Sumalan R.M., Copolovici M., Antifungal Activity and Chemical Composition ofSalvia Officinalis L., Essential Oii. 2015,47(2): 186-194.

25. Tofana M., Socaci Ancuta, Mudura Elena, Old Principles — New Methods in the Volatile Oils Approach, Bull. UASVM Agric. 2010, 67(2): 439-446.

26. Stevi0 T., Beric T., Savikin M., Sokovid M., Godevac I., Dimkid I., Stankovic S., Antifungal activity of selected essential oils against fungi isolated from medicinal plani, Ind Crops Prod, 2014 55:116-122.

27. Doolotkeldieva TD: Microbiological control of flour-manufacture: Dissemination of mycotoxins producing fiingi in cereai products. Microbiology Insights, 2010.3:1-15.

28. Hocking AD, Pitt JI, Samson RA, Thrane U, Advances in Food Mycology. Ed. Springer, New Y ork;: 2006:

Claims (2)

1. REVENDICĂRI a 2018 00561

   1. Preparate naturale de tip nanoemulsii cn acțiune antifungică si antimicotoxigenă, destinate proiecției cerealelor, în cultură și depozite, cu aplicare fol iară si/sau la semințe, pentru utilizare in agricultura biologică, pe baza de uleiuri esențiale din familiile Lamiaceae si Umbelifere, cu adaos de excipienți organici naturali.

   Wte dm de principii itedw dp iddhri, «ssndsfe sfchswa W plante: mărar e 03—M learântdm'SmaB cantata da OSK si apă diferența pănu k WOK
2. 2. Procedeu de obținere a unor preparate naturale cu acțiune antifungică și antimicotoxigenă, de tip nanoemulsii pe baza de uleiuri esențiale din familiile Lamiaceae si Umbelifere, cu adaos de substanțe emulsionabile, prin tehnici compatibile cu agricultura organică.

   a 2018 00561

   31/07/2018

   Lecitină, glicerina, apă semințe, inflorescențe si herba proaspătă «purități grosiere

   Sortarea materialului vegetal ^ι^«31%ι>€38 CuCS

   28-25®C, condiții de umiditate controlată, până la

   Umax| 8%

   Măruntîre măcinare uscată

   Extracție ulei esențial

   Distilare prin antrenare eu vapori de apă

   Prepararea nanoemulsiilor prin ultrasonicare

   Ambalare in recipiente închise ermetic apă

   Apă aromată reziduu vegetai

   PNA