RO131926A2 - Procedeu de condiţionare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de condiţionare a microorganismelor biostimulante pentru plante pentru obţinerea unor bioproduse pentru tratamentul solului. Procedeul conform invenţiei constă în cultivarea axenică pe medii minimale semi-lichide, care includ 20% ceramici poroase cu capacitate ridicată de eliberare a acidului ortosilicic, laH optim şi aerare prin agitare cu varierea temperaturii de incubare cu un interval de 10°C timp de 3...5 zile, recoltarea şi uscarea biomasei de microorganisme şi a ceramicilor poroase până la maximum 5% umiditate reziduală.

Description

PROCEDEU DE CONDIȚIONARE A MICROORGANISMELOR BIOSTIMULANTE PENTRU PLANTE PE SUPORTURI CERAMICE POROASE

Prezenta invenție se referă la un procedeu de condiționare a microorganismelor benefice pentru plante, în special a celor care au o acțiune de biostimulare a plantelor, prin dezvoltare pe suporturi ceramice poroase, pentru a obține bioproduse destinate tratamentelor aplicate solului, în cadrul tehnologiilor de cultură a plantelor, și în special a plantelor nutraceutice.

Sunt cunoscute diferite procedee de realizare a bioproduselor cu eliberare controlată a microorganismelor benefice plantelor, destinate tratării solului, care utilizează purtători solizi minerali, cu o structură foarte poroasă. Brevetul FR 2899580 B1 descrie includerea unor forme L de Rhizobium (rezultate prin tratarea cu lizozim a suspensiilor de bacterii obținute după cultivarea 24-48 de ore pe medii lichide), în zeoliți naturali, și utilizarea compoziției astfel rezultate. Brevetul EP 0203708 B se referă la un procedeu de obținere a inoculanților utilizabili în agricultură, pe bază de bacterii în stare de dormanță, alcătuit din următoarele etape: menținerea unei suspensii bacteriene, de Rhizobium sau de alte bacterii, substanțial separată din mediul său de cultură, și suspendată într-o soluție de zaharide (sucroză, lactoză, trehaloză, sorbitol sau adonital), la o temperatură cuprinsă în intervalul de aproximativ 0 - 30 ° C, pe perioade de timp de 0-96 ore, în condiții aseptice; amestecarea cu un purtător poros granular inert chimic (revendicat ca perlită, vermiculită sau cărbune activ), într-un raport în greutate a purtătorului la suspensia de bacterii în intervalul de la 0,5 la 1,5; uscarea cu aer pentru o perioadă de 2 până la 10 zile, în condiții aseptice.

Cererea de brevet W02004005219 A1 prezintă un procedeu prin care se amestecă o suspensie de rhizobii, turbă, apă și argile (bentonită sau saponită, în proporție de 50...98%), care apoi se granulează și se usucă pentru a se obține o compoziție cu eliberare controlată.

Brevetul SUA 8728460 B2 revendică un nutrient biologic pentru sol, care combină microorganisme benefice plantelor de cultură (exemplificate prin fungi de micoriză obligat paraziți din genul Glomus și bacterii benefice din genul Bacillus) în stare de dormanță, cu nutrienți pentru plante și pentru microorganisme și biostimulanți, inclusiv acizi humici, și înglobează amestecul rezultat în ceramici poroase.

a 2015 00948

02/12/2015

Avantajul formulărilor de microorganisme în granule minerale poroase este determinat de administrarea relativ ușoară și de contribuția acestor biopreparate și la aerarea solurilor, dar dezavantajul comun este dat de rata de supraviețuire redusă a microorganismelor la condiționarea prin înglobare în structuri poroase, care implică stresul uscării, și ulterior, de rata relativ redusă de supraviețuire (deși structurile minerale poroase protejează suplimentar microorganismele înglobate).

Prin soluția tehnică descrisă de brevetul SUA 8728460 B2 microorganismele înglobate în ceramici sunt protejate fizic de o serie de factori adverși de mediu, fără a se acționa asupra unor componente / mecanisme fiziologice / biochimice implicate în rezistența microorganismelor la factorii adverși de mediu.

Brevetul FI 119597 B propune o formulare sub formă de pastă, care include 0,25-5% microorganisme benefice plantelor (Phlebiopsis gigantea, Chondrostereum purpureum, Gliocladium catenulatum, Nectria pity-rodes, Myrothecium sp., Streptomyces sp.); 5-25% purtători solizi; 5-35% substanțe protective; până la 100% apă (sau 0,25-2% microorganisme; 10-20% purtători solizi; 5-15% substanțe protective; până la 100% apă, într-o altă revendicare). Purtătorii solizi, selectați dintre caolin, bentonită, talc, ghip, chitosan, celuloză, tărâțe, rumeguș, talaș, turbă, vermiculită, perlită, silice amorfă sau argile granulare, includ suporturi minerale poroase. Substanțele protective sunt selectate din sucroză, fructoză, lactoză, trehaloză, glicerol, sorbitol, glicin-betaină, poliacrilamidă, polietilen-glicol, polipropilen-glicol, carboximetil-celuloză, amidon și pectină sau amestec al acestora. Formularea sub formă de pastă care include suporturi minerale poroase și substanțe protective crește rata de supraviețuire a microorganismelor, dar se pierd avantajele determinate de structura minerală poroasă, legate de ușurința aplicării și de contribuția acestor biopreparate și la aerarea solurilor.

Sunt necesare procedee prin care să se stimuleze sistemele interne de protecție ale microorganismelor, pentru a crește rezistența lor intrinsecă la condiționarea ulterioară prin înglobare și uscare în structuri minerale poroase în care microorganismele sunt supuse stresului major al uscării.

Autorii au stabilit că acidul ortosilicic, cunoscut ca fiind un biostimulant care crește rezistența plantelor la stresurile biotice și abiotice (Sawas și Ntatsi, 2015 Scientia Horticulturae, 19: 66-81) și ca având un efect de stimulare a creșterii microorganismelor (Wainwright et al. 1997, Mycological Research, 101: 933-938),

a 2015 00948

02/12/2015 are și un efect de stimulare a sistemelor interne de protecție a microorganismelor fată de factorii adversi de mediu.

I

Acidul ortosilicic este un acid foarte slab, cu patru funcțiuni acide, la care valoarea pKa cea mai mică este de 9,8 (IIer, The Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, New York, 1979, pg. 207). Aceasta înseamnă că la pH 9,8 acidul ortosilicic este prezent 50% în stare nedisociată și 50% în stare disociată. Intre valorile de pH 2 și 8 acidul ortosilicic este o moleculă neutră, complet nedisociată. La concentrații mai mari de 2 mM începe să polimerizeze, prin reacții de policondensare, cu eliberare de apă (Mclntosh, 2012, Physical Chemistry Chemical Physics, 14: 996-1013). Datorită acestei tendințe de policondensare acidul ortosilicic nu poate fi inclus în mediile de cultură ale microorganismelor în concentrații mari, ci trebuie să fie eliberat constant în concentrații mici, biologic active, din compuși precursori. Biomasa rezultată trebuie să fie apoi ușor de condiționat în formule de tablete efervescentă, cu asigurarea unei supraviețuiri ridicate a microorganismelor.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția este de a descrie un procedeu, ușor de realizat, de condiționare a microorganismelor benefice plantelor, în special a celor cu activitate de biostimulare a plantelor de cultură, în suporturi ceramice poroase, prin care să se asigure o rată ridicată de supraviețuire a microorganismelor și o producere simplificată a biopreparatului.

Este un alt obiect al acestei invenții de a descrie un procedeu de obținere a biomasei de microorganismelor cu rezistență mare la factorii de mediu, prin cultivarea pe medii în care sunt eliberate constant concentrații mici, active biologic, de acid ortosilicic.

Procedeul conform invenției constă în următoarele etape:

Cultivarea axenică pe medii minimale semi-lichide, care includ 20% ceramici poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic, la pH optim și aerare prin agitare, cu varierea temperaturii de incubare cu un interval de 10°C, 12 ore la 20°C și 12 ore la 30°C, timp de 3-5 zile;

Recoltarea biomasei de microorganisme și a ceramicilor poroase prin filtrare sub vacuum de min. -0,5 bar;

Uscarea biomasei de microorganisme și a ceramicilor poroase, până la max. 5% umiditate reziduală.

Ceramicele poroase cu capacitate de eliberare a acidului ortosilicic se obțin din: diatomită 40%, amestec Na₂SiO3 + dioxid de siliciu coloidal, 1,5:1, 55% și 5%

a 2015 00948

02/12/2015 substrat epuizat de ciuperci Pleurotus, cultivate pe paie de grâu, amestecare omogenizare - granulare continuă a ingredientelor, uscare la 104°C și calcinare la

960°C si eliberează constant în mediul de cultură acid ortosilicic, sub nivelul de concentrație de 1 rriM.

»

Diatomita utilizată pentru obținerea ceramicele poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic are următoarele caracteristici: schelet de silice cu 8595% SiO₂, 6% AI₂O₃, 1% Fe₂O₃ și 0,35 % CaO.

Amestecul de Na₂SiO3 + sol SiO₂ (3:2,5) utilizat pentru obținerea ceramicele poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic este constituit din soluție apoasă de Na₂SiO3 cu conținut de substanță solidă 33 -35% și dioxid de siliciu coloidal, fiind preparat prin adăugare treptată în porțiuni mici și amestecare continuă a celor două componente.

Dioxidul de siliciu coloidal utilizat pentru obținerea ceramicele poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic are o suprafață specifică BET cuprinsă între 129 și 155 m²/g, un conținut de siliciu de min. 39,50 % și generează suspensii cu un pH de 5,5.

Uscarea biomasei de microorganisme și a siliciului coloidal se face în pat fluidizat, în condiții blânde, la max. 40°C temperatură de operare, atunci când microorganismele cultivate sunt bacterii gram pozitive, care formează endo-spori sau ciuperci microscopice care formează conidii, și prin liofilizare, prin creșterea graduală a temperaturii de la -25°C la 25°C, la 0,9 mbar presiune, timp de 48 ore, atunci când microorganismele sunt bacterii gram-negative.

Prezenta invenție prezintă următoarele avantaje:

Asigură eliberarea constantă a unor concentrații mici, biologic active, de acid ortosilicic din ceramicele poroase, datorită compoziției acestora și condițiilor de cultivare a microorganismelor pe mediu minimal, care stimulează producerea de către aceste microorganisme a biocompușilor implicați în solubilizarea acidului ortosilicic;

Determină o rată de supraviețuire avansată a microorganismelor, care sunt cultivate în condiții care să favorizeze exprimarea mecanismelor interne de rezistență la factorii externi, datorită efectului protector ai acidului silicic, combinat cu șocurile de temperatură;

a 2015 00948

02/12/2015

Formează bioproduse în care microorganismele benefice sunt asociate direct cu ceramicile poroase, condițiile de creștere facilitând dezvoltarea sub formă de biofilme asociate structurilor poroase.

In continuare se prezintă exemple de realizare care ilustrează invenția fără a o limita.

Exemplu 1. într-un bioreactor semisolid (Wave® rocking bioreactor, Buckinghamshire, Marea Britanie), prevăzut cu un sac-bioreactor de unică folosință, de 5 litri, se aduc 2 litri mediu minimal M9 care conține la 1 litru: Na₂HPO₄ (anhidru) 6 g; KH₂PO₄3 g; NaCI 0.5 g; NH₄CI 1 g, 10 g lactoză. Se suspendă în mediul rezultat 400 g de ceramici poroase. Mediul rezultat se sterilizează prin autoclavare, și apoi se adaugă nouă microelemente, în următoarele concentrații finale: MgSO₄ 1 mM; CaCI₂ 0,1 mM; (NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O 3x10'⁹ M; H3BO3 4x10'⁷ M; CoCI2.6 H₂O 3x10’⁸ M; CuSO4.5H2O 1x10'⁸ M; MnCI2-4H₂O 8x10‘⁸ M; ZnSO₄. 7H₂O 1x10'⁸ M;

FeSO₄.7H₂O 1x10’⁶ M, provenite din soluții stoc sterilizate prin ultrafiltrare. Se verifică pH-ul și se aduce la pH 5,5 cu HC11 M sau NaOH 1 M.

Toți reactivi folosiți sunt proveniți de la Merck-Millipore, Darmstadt, Germania. Orice alți reactivi care au aceleași caracteristici tehnice pot fi utilizați.

Ceramicele poroase folosite sunt obținute conform următorului procedeu. Se amestecă 400 g de diatomită și 50 g substrat epuizat de ciuperci Pleurotus, cultivate pe paie de grâu, cu 550 g amestec Na₂SiO₃ + sol SiO₂ (300 g Na₂SiO3 + 250 g sol SiO2). Componenții solizi (diatomita și substratul de ciuperci) se omogenizează întrun amestecător. Amestecul Na₂SiO₃ + sol SiO₂ se diluează cu 500 ml apă. Amestecul solid omogenizat se încarcă într-un granulator cu taler, care efectuează mișcări de rotație. Soluția apoasă se pulverizează în mod continuu în granulator. Sub efectul umectării materialul începe să se granuleze. Instalația de granulare se oprește, când granulele ajung la 3 - 8 mm. Materialul astfel granulat se usucă la 105 - 110°C, apoi se calcinează la 960°C.

Diatomita utilizată în compoziția de mai sus este diatomită cu următoarele caracteristici: schelet de silice cu 85-95% SiO₂, 6% AI₂O₃, 1% Fe₂O₃ și 0,35 % CaO.

Densitatea în stare uscată este sub 1 g/cm3 (0,15 — 0,30 g/cm3 ) culoare albă, albalbastră sau cenușie.

»

Amestecul de Na₂SiO₃ + sol SiO₂ (3:2,5) este constituit din soluție apoasă Na₂SiO₃ cu continui de substanță solidă 33 35% si dioxid de siliciu coloidal, obtinut prin adăugare treptată în porțiuni mici și amestecare continuă. Dioxidul de siliciu a 2015 00948

02/12/2015 coloidal utilizat pentru obținerea soluției are o suprafață specifică BET cuprinsă între 129 și 155 m²/g, un conținut de siliciu de min. 39,50 % și generează suspensii cu un pH de 5,5.

Mediul se inoculează cu 100 ml de suspensie de conidii de Trichoderma asperellum Td36b, NCAIM P(F) 001434, normalizate la 10® propagule per ml prin numărare la lamela citometrică. Tulpina T. asperellum Td36b este cunoscută ca având efect de biostimulare a plantelor de cultură (Raut et al. 2015. Journal of Biotechnology, 208, S62). Se cultivă tulpina Td36b timp de 5 zile, la o rată de aerare de 5 balansări pe min - cca 50% saturație de oxigen, cu varierea temperaturii de incubare cu un interval de 10°C, 12 ore la 20°C si 12 ore la 30°C.

Din oră în oră se prelevează aseptic probe de 2- 2,4 ml mediu de cultură cu microorganisme, în vase din HDPE (Nalgene, Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA). Se separă prin centrifugare supematantul, de sedimentul microbian și de ceramici poroase, și se preiau probe de câte 1 ml de supernatant, care este diluat cu 4 ml apă ultrapură, în tuburi Eppendorf conice de 15 ml (Eppendorf, Hamburg, Germania). Conținutul de acid ortosilicic liber este determinat cu un kit Merck (Merck Silicate Assay, 1.14794, Merck-Millipore). Acest test colorimetric este bazat pe reacția dintre silicat și ionii molibdat, pentru a forma un complex colorat de silicomolibdat albastru, care poate fi detectat spectrofotometric la 810 nm. Concentrația absolută de acid silicic este calculată după construcția unei curbe de calibrare, folosind un standard de siliciu (Merck 170236, Merck-Millipore). In mediu de cultură se determină o concentrație de acid ortosilicic care este permanent de sub 1 mM, fiind consecința a două procese concomitente - solubilizarea siliciului sub efectul metabolismului microbian si asimilarea acidului ortosilicic. In sedimentul de

I microorganisme, care se spală din ceramicele poroase cu tampon fosfat salin, se determină siliciul total, după mineralizare, prin ICP-OES (Georgiadis et al. 2013, Geoderma, 209: 251-261). Se constată o continuă creștere a conținutului de siliciu în biomasa de microorganisme, creștere care dovedește asimilarea acidului ortosilicic de către respectivele microorganisme. In ceramicele poroase spălate repetat de microorganisme cu tampon fosfat salin, se evidențiază asociații de tip biofilm cu Trichoderma, prin microscopie de baleiaj, conform metodei descrise de Triveni et al. 2015, Biocontrol Science and Technology, 25: 656-670.

După terminarea perioadei de cultivare se recoltează biomasa de microorganisme și ceramicele poroase prin filtrare sub vacuum de min. -0,5 bar, folosind o unitate Sartolab® (Sartorius, Goettingen, Germania). Ceramicele poroase

a 2015 00948

02/12/2015 cu biomasă de microorganisme se aduc într-un uscător în pat fluidizat (MiniGlatt, Glatt, Binzen, Germania) și se usucă în condiții blânde, la max. 40°C.

La sfârșitul procedeului de obținere se analizează conținutul de propagule de Trichoderma din bioprodusul pe suporturi ceramice poroase, prin cultivare pe medii selective. Acest conținut este de minim 5x10⁷ ufc/g, și nu scade cu mai mult de 10%, prin stocarea bioprodusului la temperatura camerei, timp de 6 luni.

Exemplu 2. Se procedează ca în Exemplu 1, cu următoarele diferențe. Se folosește glucoză ca sursă de carbon și energie în mediul minimal, se utilizează tulpina Brevibacillus parabrevis B50, NCAIM (P) B 001413 (tulpină cunoscută ca fiind biostimulantă pentru plante (cerere de brevet RO RO128931), cultivarea se realizează timp de trei zile.

La sfârșitul procedeului de obținere se analizează conținutul de propagule de Brevibacillus din bioprodusul pe suporturi ceramice poroase prin cultivare pe medii selective. Acest conținut este de minim 10⁸ ufc/g, și nu scade cu mai mult de 10% prin stocarea bioprodusului la temperatura camerei timp de 6 luni.

Exemplu 3. Se procedează ca în Exemplu 1, cu următoarele diferențe. Se folosește glucoză ca sursă de carbon și energie în mediul minimal. Se utilizează tulpina Pseudoxanthomonas mexicana P32, NCAIM (P) B 001414, (cunoscută ca fiind biostimulantă pentru plante, brevet EP2738267 B1), iar cultivarea se realizează timp de 3 zile. Uscarea se face prin liofilizare, pe un liofilizator Christ Alpha 1-2 LD (Martin Chist, Osterode am Harz, Germania), prin creșterea graduală a temperaturii de la -25°C la 25°C, la 0,9 mbar presiune, timp de 48 ore.

La sfârșitul procedeului de obținere se analizează conținutul de propagule de Pseudoxanthomonas în bioprodusul pe suporturi ceramice poroase prin cultivare pe medii selective. Acest conținut este de minim 5x10⁷ ufc/g, și nu scade cu mai mult de 10% prin stocarea bioprodusului la temperatura camerei timp de 6 luni.

Această lucrare a fost realizată prin programul Parteneriate in domenii prioritare — PN II, derulat cu sprijinul MEN - UEFISCDI, proiect PN-II-PT-PCCA2013-4-0995, contract 160/2014 MAIA

Claims (6)

1. REVENDICĂRI

   1. Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase, conform invenției, caracterizat prin aceea că este constituit din următoarele etape: cultivarea axenică pe medii minimale semilichide, care includ 20% ceramici poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic, la pH optim și aerare prin agitare, cu varierea temperaturii de incubare cu un interval de 10°C, 12 ore la 20°C și 12 ore la 30°C, timp de 3-5 zile; recoltarea biomasei de microorganisme și a ceramicilor poroase prin filtrare sub vacuum de min. -0,5 bar; uscarea biomasei de microorganisme și a ceramicilor poroase, până la max. 5% umiditate reziduală.
2. 2. Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că utilizează ceramice poroase cu capacitate de eliberare a acidului ortosilicic care se obțin din: diatomită 40%, amestec Na2SiO3 + dioxid de siliciu coloidal, 1,5:1, 55% și 5% substrat epuizat de ciuperci Pleurotus, cultivate pe paie de grâu, amestecare - omogenizare - granulare continuă a ingredientelor, uscare la 104°C și calcinare la 960°C si care eliberează constant în mediul de cultură acid ortosilicic, sub nivelul de concentrație de 1 mM.

   I
3. 3. Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că diatomita utilizată pentru obținerea ceramicele poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic are următoarele caracteristici: schelet de silice cu 85-95% SiO₂, 6% AI₂O₃, 1% Fe₂O₃ și 0,35 % CaO.
4. 4. Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că amestecul de Na₂SiO₃ + sol SiO₂ (3:2,5) utilizat pentru obținerea ceramicele poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic este constituit din soluție apoasă de Na₂SiO₃ cu conținut de substanță solidă 33 -35% și dioxid de siliciu coloidal, fiind preparat prin adăugare treptată în porțiuni mici și amestecare continuă a celor două componente.
5. 5. Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că dioxidul de siliciu coloidal utilizat pentru obținerea ceramicele poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic are o suprafață specifică BET a 2015 00948

   02/12/2015 cuprinsă între 129 și 155 m²/g, un conținut de siliciu de min. 39,50 % și generează suspensii cu un pH de 5,5.
6. 6. Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că uscarea biomasei de microorganisme și a siliciului coloidai se face în pat fluidizat, în condiții blânde, la max. 40°C temperatură de operare, atunci când microorganismele cultivate sunt bacterii gram pozitive, care formează endo-spori sau ciuperci microscopice care formează conidii, și prin liofilizare, prin creșterea graduală a temperaturii de la -25°C la 25°C, la 0,9 mbar presiune, timp de 48 ore, atunci când microorganismele sunt bacterii gram-negative.