RO131463B1 - Dispozitiv separator pentru modificarea unei plăci de cultură celulară, placă de cultură modificată cu acest dispozitiv, şi metodă de măsurare în timp real a deplasării celulelor în sistem in vitro folosind impedanţa celulară - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la un dispozitiv separator special modificat pentru plăcile de cultură și la o metodă de măsurare în timp real a deplasării celulelor în sistem in vitro folosind impedanța celulară. Măsurarea deplasării celulelor pe substratul atașat era o metodă destul de subiectivă ce se baza doar pe simpla observare a procesului de migrare al celulelor în câmpul optic al microscopului; migrarea fiind cuantificată printr-un program software manevrat de către utilizator, ce analizează imaginile efectuate la intervale orare foarte mari.

Dispozitivul separator și metoda conform invenției asigură analiza acestei mișcări celulare în plan unidimensional în timp real și fără intervenția umană în cuantificarea acestui fenomen din sistemul in vitro.

Testele pentru migrarea celulelor au fost efectuate in vitro de mulți ani, fiind considerate metode simple și economice de a studia comportamentul celulelor ca efect al diferitelor condiții și substanțe cu care sunt tratate, inclusiv în evaluarea capacității de migrare și proliferare în diferite condiții de cultură.

Aceste teste implică, în primul rând, creșterea celulelor în condiții optime pentru a forma un monostrat confluent. Stratul este apoi perturbat („rănit), prin distrugerea sau deplasarea unui grup de celule, de multe ori prin zgârierea stratului cu un ac sau micropipetă (fig. 1). Odată ce monostratul de celule este distrus și suprafața de cultivare celulară (plastic sau sticlă) este reexpusă, zona respectivă este atunci observată la microscop și fotografiată la diferite intervale de timp pentru a evalua rata cu care se apropie celulele unele de altele peste suprafața liberă. Această repopulare poate dura de la câteva ore până la 1 zi, în funcție de tipul de celule, condițiile de mediu și, desigur, de suprafața „zgâriată. Rezultatele pot fi transmise printr-o serie de microfotografii sau în măsurători mai sofisticate, astfel încât datele pot fi exprimate în mai mulți termeni cantitativi. De la aceste date și interpretări de rezultate se poate calcula o rată de migrare sau repopulare.

Testele tradiționale de acest fel necesită o manipulare pe scară largă a celulelor în cultură, atât înaintea realizării fantei pentru deplasarea monostratului celular, cât și după, prin reanalizarea repopulării spațiului respectiv.

Există o serie de dezavantaje și limitări ale testelor in vitro de migrare celulară. Acestea sunt complementare testelor de chemotaxie, neputând să înlocuiască alte metode bine stabilite cum arfi testul camerei Boyden, pentru chemotaxie. Așa cum era de așteptat, în cazul în care zona de decelularizare mecanică nu este controlată cu precizie, calculele migrării au variații foarte mari la măsurători și mai ales îngreunează reproductibilitatea. Este nevoie de un timp relativ lung pentru analiza migrării, comparat cu alte metode: sunt necesare una sau două zile pentru formarea de celule monostrat și apoi 8...18 h pentru migrarea celulelor pentru repopulare. De asemenea, trebuie luat în calcul faptul că aceasta este o metodă de analiză secvențială, pe intervale de timp, neputând face o evaluare în timp real a migrării celulelor în funcție de condițiile de testare.

Abordările tipice de analiză a celulelor includ citometria de flux, imagistică, imunofenotipări și tehnici de microscopie. Aceste metode pot oferi informații despre modificări normale sau patologice ca urmare a tratamentelor la care sunt supuse. Pentru asta este nevoie, de obicei, de pași de marcare fluorescentă, chemiluminiscentă sau chiar radioactivă, pași ce implică adesea distrugerea celulelor. Procesele de marcare pot duce astfel la perturbarea metabolică și morfologică a celulelor, fapt ce poate crea rezultate fals pozitive.

Cererea de brevet US 2009/0054262 A1 descrie sisteme de analiză celulară pentru detectarea și cuantificarea numărului de celule și pentru identificarea poziției spațiale a acestora. Aceste sisteme cuprind un substrat, de exemplu o placă de cultură cu godeuri, în fiecare godeu putând fi inserat câte un element din material polimeric care să delimiteze pe fundul godeurilor zonele de însămânțare a celulelor, de zonele de excludere a celulelor.

RO 131463 Β1

Zona de însămânțare este o suprafață tratată, de exemplu o suprafață tratată cu colagen, 1 pe care celulele pot adera. Elementul de inserție este configurat astfel încât pereții să adere la godeu. Acest element de inserție are rolul de a funcționa ca un transportor sau orificiu de 3 inserare/însămânțare a celulelor doar în zonele de însămânțare, nu și în zonele de excludere. Substratul este incubat pentru a permite celulelorînsămânțate să adere la supra- 5 fața tratată. După înlăturarea elementelor de inserție, se constată că celulele care au aderat sunt situate numai în zona deînsămânțare. După o incubare suplimentară, celulele migrează 7 în zona de analiză, unde pot fi monitorizate prin tehnici de microscopie.

în lucrarea ștințifică “Microencapsulated equine mesenchymal stromal cells 9 promote cutaneous wound healing in vitro”, Stern Cell Research & Therapy, 2015, voi 6, p 66 , autor L. Bussche ș. a. se prezintă măsurarea migrării fibroblaștilor cu ajutorul 11 tehnicii ECIS (Electric Cell-Subtrate Impedance Sensing) care presupune crearea unui defect circular, respectiv “o rană” bine definită, în monostratul celular prin electroporare letală. 13 Celulele vii migrează în zona bine definită, reparând “rana” circulară, și reacoperă electrodul, determinând creșterea impedanței. Măsurarea variației impedanței în funcție de timp se reali- 15 zează în timp real, dar cu toate acestea, tehnica de electroporare este invazivă pentru celule.

Procesele de detectare ce nu implică marcarea sau tehnici non-invazive pentru celule 17 sunt avantajoase pentru că oferă răspuns în timp real la stimulii variabili la care sunt supuși, fapt ce le clasează ca fiind de un real folos în viitoarele experimente biomedicale. 19

O serie de tehnologii fără marcare celulară au fost dezvoltate de-a lungul timpului, inclusiv măsurarea impedanței celulă-substrat (I. Giaever, și C.R. Keese (1986), Use of 21 electric fields to monitor the dynamical aspect of cell behavior in tissue culture. IEEE Trans. Biomed. Eng. 33:242-247; I. Giaever și C.R. Keese (1991), Micromotion of 23 mammalian cells measured electrically. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7896-7900. (Erratum 90:1634.); I. Giaever și C.R. Keese (1993), A morphological biosensor for 25 mammalian cells, Nature 366:591-592), microbalansare cu cristale de cuarț (T. Zhou, K.

A. Marx, M. Warren, H. Schuize, S. J. Braunhut (2000) The quartz crystal microbalance 27 as a continuous monitoring tool for the study of endothelial cell surface attachment andgrowth, Biotechnol Prog 16:268-277; S. J. Braunhut, D. Mclntosh, E. Vorotnikova, 29 T. Zhou, K. A. Marx (2005), Detection of Apoptosis and Drug Ftesistance of Human Breast Cancer Cells to Taxa ne Treatments Using Quartz Crystal Microbalance 31 Biosensor Technology, Assay Drug Dev Technol 3: 77-88), și spectroscopie de ghidare în câmp optic a luminii (J. J. Ramsden, F. Hook, J. Voros, M. Rodahl, R. Kurrat, P. Boni, 33

M. Textor, N.D. Spencer, P. Tengvall, J. Gold, B. Kasemo (2002), Comparative study of protein adsorption on titanium surfaces using in situ ellipsometry, optical waveguide 35 lightmode spectroscopy, and quartz crystal microbalance/dissipation, Coli. Surf. B Biointerfaces 24, 155-170; Irving Itzkan, Le Qiu, Hui Fang , Munir M. Zaman, Edward 37 Vitkin , lonita C. Ghiran, Saira Salahuddin , Mark Modell, Charlotte Andersson, Lauren M. Kimerer, Patsy B. Cipolloni, Kee-Hak Lim, Steven D. Freedman, Irving Bigio, 39

Benjamin P. Sachs, Eugene B. Hanlon și Lev T. Perelman (2007), Confocal light absorption and scattering spectroscopie microscopy monitors organelles in live cells 41 with no exogenous labels, PNAS voi. 104, nr. 44,17255-1726), toate fiind raportate ca un mijloc de monitorizare a celulelor vii într-o manieră non-invazivă și în timp real. 43 între acestea se regăsește și spectroscopia electrică/impedanța electrochimică (IES) ce a fost recunoscută ca o tehnică electrochimică puternică, ce poate monitoriza comporta- 45 mentul celulelor vii în timp real.

RO 131463 Β1

Proprietățile electrice distincte asociate cu procesele biologice specifice se corelează cu impedanța, fiind o tehnică bună de analiză celulară.

Prin cultivarea celulelor biologice pe suprafața electrodului, IES poate detecta în mod direct informații detaliate despre activitățile celulare care apar pe o suprafață de electrod sau substrat prin măsurarea modificărilor induse de diferiți stimulenți fizico-chimici, eliminând multiplele protocoale de marcare și analiză utilizate în mod obișnuit în multe alte metode bazate pe celule. în plus, tehnica impedanței celulare folosește dispozitive ce pot fi adaptate nevoilor de miniaturizare a dispozitivelor de măsurare, o cerință atât de des cerută în ultima vreme pentru cercetările biomedicale.

Măsurătorile de impedanță prin utilizarea microelectrozilor au fost folosite mai întâi pentru a studia caracteristicile de fixare de substrat pentru diferite linii celulare (I. Giaever și C.R. Keese(1984), Monitoring fibroblast behavior with an applied electric field, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3761 -3764). De atunci, tehnica s-a îmbunătățit și rafinat continuu, metoda fiind denumită detectarea impedanței electrice dintre celulă-substrat (IECS) (I. Giaever și C.R. Keese (1991), Micromotion of mammalian cells measured electrically, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7896-7900, (Erratum 90:1634); I. Giaever și C.R. Keese (1993), A morphological biosensor for mammalian cells, Nature 366:591-592). Alți cercetători au folosit metode similare de detectare a impedanței pentru a număra celulele atașate la un substrat (R. Ehret, W. Baumann, M. Brischwein, A. Schwinde, K. Stegbauer, B. Wolf (1997), Monitoring of cellular behavior by impedance measurements on interdigitatedelectrode structures, Biosens Bioelectron, 12:29-41; R. Ehret, W. Baumann, M. Brischwein, A. Schwinde, B. Wolf (1998), On-line control of cellular adhesion with impedance measurements using interdigitated electrode structures, Med Biol Eng Comput, 36:365-70). Recent, tehnologia bazată pe detectarea impedanței a câștigat o mare atenție pentru studiul celulelor canceroase și monitorizarea activităților celulare induse de medicamente (K. Solly, X. Wang, X. Xu, B. Strulovici și W. Zheng (2004) Application of real-time ceti electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays, Assay Drug Dev Technol 2, 363-372; P. Linderholm, T. Braschler, J. Vannod, Y. Barrandon, M. Brouard, P. Renaud (2006), Two-dimensionalimpedance imaging of ceti migration and epithelial stratification, Lab Chip. 6:1155. doi: 10.1039/b603856e, R. McGuinness (2007), Impedance-based cellular assay technologies: recent advances, future promise, Current Opinion in Pharmacology, 7:535-540; D. Kloss, R. Kurz, H. G. Jahnke, M. Fischer, A. Rothermel, U. Anderegg, J. C. Simon, A. A. Robitzki (2008), Microcavity array (MCA)-based biosensor chip for funcțional drug screening of 3Dtissue models, Biosens Biolectron, v. 23, p. 1473-1480; C. S. Chen, X. Y. Jiang, G. M. Whitesides (2005), Microengineering the environment of mammalian cells in culture. MRS Bull.; 30:194-201; Q. J. Liu, J. J. Yu, L. Xiao, J. C. O. Tang, Y. Zhang, P. Wang, M. Yang (2009), Impedance studies of bio-behavior and chemosensitivity of cancer cells by micro-electrode arrays, Biosensors & Bioelectronics, 24:1305-10).

Problema tehnică pe care își propune să o rezolve invenția este de a crește gradul de acuratețe al măsurătorii deplasării celulelor în plan concomitent cu obținerea cât mai rapidă a răspunsului.

Dispozitivul separator conform invenției are o formă de paralelipiped dreptunghic ale cărui fețe laterale sunt din material plastic. Acest dispozitiv se introduce într-un godeu circular al unei plăci de cultură cu godeuri sau cu microelectrozi de aur, perpendicular pe baza godeului, astfel încât dispozitivul să traverseze centrul godeului, iar una dintre fețele laterale mici ale dispozitivului să vină în contact direct cu baza godeului și să separe suprafața bazei godeului în două arii egale.

RO 131463 Β1

Invenția se mai referă la o placă de cultură cu godeuri care cuprinde dispozitivul 1 separator inserat în cel puțin unul dintre godeurile sale.

Un alt obiect al invenției îl reprezintă o placă de cultură cu microelectrozi de aur care 3 cuprinde dispozitivul separator inserat în cel puțin unul dintre godeurile sale.

Invenția se mai referă și la o metodă de măsurare în timp real a migrării celulare într-o 5 placă de cultură cu microelectrozi de aur modificată cu dispozitivul separator conform invenției, care constă în aceea că: 7

- se însămânțează celule în fiecare godeu, de-o parte și de alta a dispozitivului separator; 9

- se lasă celulele să sedimenteze, după care se supun condițiilor de cultivare;

- se obține variația indicelui celular în funcție de impedanță, în timp real; 11

- după ce celulele din godeuri au ajuns la confluență maximă, se îndepărtează dispozitivul dreptunghiular, creându-se astfel pe fundul godeului acoperit cu electrozi de aur o 13 zonă bine determinată neacoperită de celule;

- se măsoară din nou variația indicelui celular în funcție de impedanță, în timp real, 15 pentru a se stabili rata de ocupare a spațiului gol creat prin detașarea dispozitivului.

Prezenta invenție se referă la un dispozitiv pentru modificarea plăcii de cultură carac- 17 terizat prin aceea că, în plăcuța de cultură cu 96 godeuri ce au suprafața de 0,2 cm²/godeu, se inserează un dispozitiv dreptunghiular din material plastic, de exemplu din polipropilenă 19 (PP), având o lățime de 1 mm, lungime de 4,9 mm, înălțimea de 123 mm, și cu o suprafață de contact de 4,9 mm², astfel încât celulele sunt cultivate în plăcuțele de cultură de o parte 21 și de alta a dispozitivului.

Invenția se referă, de asemenea, la o metodă de măsurare a migrării celulare utili- 23 zând plăcuța de cultură cu godeuri ce au suprafața de 0,2 cm² unde a fost inserat dispozitivul separator. 25

Utilizarea plăcuței de cultură modificată cu dispozitivul respectiv este indicată doar pentru folosirea culturilor celulare aderente de substrat. în cadrul acestei invenții am folosit 27 drept exemplu o linie celulară primară umană. în plăcuțe de cultură de 75 cm² am însămânțat 250000 de celule. între timp, în plăcuța de cultură cu godeuri ce au suprafața de 0,2 cm² am 29 inserat dispozitivele dreptunghiulare din material plastic. „Lipirea dispozitivelor dreptunghiulare din material plastic s-a efectuat cu 5 pi per godeu de Colagen de tip 1 din coadă de 31 șobolan. După ce au ajuns la confluență, celulele din plăcuțele de cultură de 75 cm² au fost detașate de substrat prin digestie enzimatică. Apoi 7000 celule au fost însămânțate pe 33 godeu. Celulele din fiecare godeu au fost resuspendate în 200 μΙ de mediu de cultură,

DMEM 1%o Glucoză + 10% Ser Bovin Fetal + 1% Antibiotic. După 48 h, perioadă în care 35 celulele au ajuns la confluență, dispozitivele separatoare au fost îndepărtate pentru a permite continuarea expansiunii celulare în spațiul nou eliberat. La intervale definite de timp (6, 8 și 37 12 h) am obținut imagini cu ajutorul microscopului optic pentru fiecare godeu în parte. Rezultatele experimentelor de migrare celulară au fost analizate cu ajutorul software-ului 39 ImageJ (National Institutes of Health).

Datele obținute prin această metodă au fost suficiente, însă existau variabile de luat 41 în calcul pentru definitivarea rezultatelor, și anume timpul și acuratețea procesului de migrare. în dorința de a perfecționa această tehnică de migrare celulară, am adaptat dispozi- 43 tivul dreptunghiular din material plastic la plăcuța de cultură cu microelectrozi de aur ce măsoară impedanța celulară, tocmai pentru a obține rezultate în timp real; astfel se salvează 45 și timpul alocat acestei tehnici, ce necesită o perioadă lungă de monitorizare și interpretare a rezultatelor, evitând totodată subiectivitatea operatorului. 47

RO 131463 Β1 în prezenta invenție, sistemul bazat pe măsurarea impedanței celulare a fost folosit nu numai pentru a monitoriza adeziunea și migrarea celulară, dar și pentru evaluarea răspunsului la diferiți stimuli chimici ce ar putea influența rata de proliferare și migrare. Modelul de celule folosite este preluat din cultivarea și proliferarea celulelor stern din cordon ombilical (Wharton's jelly) expuse la 17-beta estradiol (Sigma-AIdrich, St Louis, MO, USA) și inhibitorul de moleculă, Fulvestrant (Sigma-AIdrich, St Louis, MO, USA).

Sistemul folosit constă dintr-o stație de analizare cu senzori electronici pentru trei plăci, fiecare cu 16 godeuri pentru cultivarea celulelor. în plăcuța de 16 godeuri, fiecare godeu este echipat cu o serie de micro-electrozi de aur intercalați în linie ce prezintă din loc în loc dilatări circulare în așa fel încât să ocupe o cât mai mare suprafață, dar totodată să nu se atingă între ele, acoperind astfel aproximativ 80% din toată suprafața godeului. Diametrul unui godeu este 5 mm ± 0,075 mm. Suprafețele cu electrozi sunt pretratate pentru cultura de celule.

Experimentul demarează cu însămânțarea celulelor în plăci și montarea plăcilor în stația de analizare cu senzori. întregul dispozitiv (stație de analiză plus placa cu electrozi) a fost plasat în interiorul unui incubator la 37°C și la o concentrație de 5% CO₂. Sistemul a fost conectat la un calculator, și toate măsurătorile au fost controlate de software-ul stației de analiză în timp real (SATR). Sistemul monitorizează activitățile celulare prin măsurarea impedanței celulare, comportându-se ca niște senzori ce sunt integrați pe fundul plăcii de 16 godeuri. Pe baza măsurării impedanței, indicele celular (IC) este calculat și înregistrat în funcție de timp, pentru a furniza informații cantitative despre starea celulară, inclusiv numărul de celule, viabilitate și morfologie.

Principiul sistemului SATR este similar cu multe alte sisteme de măsurare a impedanței (Giaever și Keese, 1984-1991). Practic, instrumentele transmit prin electrod o tensiune de curent alternativ cu frecvență specifică și rezultatul este transformat în mesaj digital ce este afișat sub forma unui grafic ce prezintă pe abscisă timpul și pe ordonată indexul celular.

Impedanța sistemului este determinată prin raportul dintre tensiunea aplicată și curentul de răspuns, și este exprimată în termeni de magnitudine. Impedanța măsurată a fost convertită la un parametru denumit indice celular. IC a fost calculat conform ecuației lui Solly (K. Solly, X. Wang, X. Xu, B. Strulovici și W. Zheng (2004) Application ofreal-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays, Assay Drug Dev Technol 2, 363-372). într-o celulă, considerând fiecare canal de ioni unic ca un rezistor și rezistența totală a membranei ca o combinație de rezistori conectați în paralel, rezistența totală a membranei poate varia de la 1 ΜΩ la 100 GQ pm² în funcție de tipul de celulă și locația senzorului pe membrană (Borkholder, 1998). Capacitatea membranei este de aproximativ 0,01 pF/Qm², presupunând grosimea membranelor celulare biologice ca fiind approximativ 8 nm (B. Hille (1992): Ionic Channels ofExcitableMembranes, 2nd ed., 607 pp. Sinauer Assoc, Sunderland, Mass. (1sted., 1984)). Pethig de asemenea a raportat că membranele celulare naturale (grosime de 5...10 nm) au o capacitate membranară de 0,5...1,3 QF/cm²și o rezistență membranară de 10²... 10⁵ Qcm² (R. Pethig (1979) Dielectric and Electronic Properties of Biological Materials, Chichester: J. Wiley & Sons).

Datorită acestor caracteristici electrice celulare, atunci când celulele sunt atașate pe o suprafață de electrod, acestea vor modifica impedanța sistemului de electrozi. Atunci când celulele sunt fixate pe suprafața electrodului, datorită membranei celulare ce are rol de izolare, se reduce eficiența electrodului din dreptul contactului cu celula și, prin urmare, crește impedanța (R. Ehret, W. Baumann, M. Brischwein, A. Schwinde, K. Stegbauer,

B. Wolf (1997), Monitoring of cellular behavior by impedance measurements on

RO 131463 Β1 interdigitated electrode structures. Biosens Bioelectron, 12:29-41; R. Ehret, W. 1 Baumann, M. Brischwein, A. Schwinde, B. Wolf(1998), On-line control of cellular adhesion with impedance measurements using interdigitated electrode structures. 3 Med Biol Eng Comput, 36:365-70). Prezența celulelor afectează și mediul ionic local de la interfața electrod/soluție, ce conduce la o creștere a impedanței electrodului (K. Solly, X. 5 Wang, X. Xu, B. Strulovici și W. Zheng (2004) Application of real-time ceti electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays, Assay Drug Dev Technol 2, 363- 7

372). Prin urmare, statutul și activitățile celulare, inclusiv densitatea celulară, adeziunea celulară, creșterea celulară, morfologia celulară și comportamentul pe termen lung al 9 celulelor pe electrozi vor afecta impedanța electrodului.

De exemplu, impedanța este, de asemenea, dependentă de gradul în care celulele 11 se răspândesc pe suprafața electrodului. Răspândirea pe o suprafață mai mare a contactului dintre celule și electrod va duce la o creștere a rezistenței și, astfel, la o creștere a indexului 13 celulelor. Pe de altă parte, dezlipirea indusă de medicamente, moartea celulelor sau apoptoza va avea ca rezultat o rezistență redusă și, prin urmare, o impedanță redusă. 15

Prezenta invenție descrie atât metoda combinată prin care se obțin date în timp real despre migrarea celulelor în sistem in vitro înainte și după crearea fantei de migrare, dar de 17 asemenea descrie și dispozitivul separator ce permite obținerea acestor rezultate în timp real. Totodată, cu ajutorul acestei invenții se poate observa și influența diferiților factori 19 chimici în acest proces de migrare celulară.

Folosind principiile de bază ale măsurării impedanței membranei celulare și a dispo- 21 zitivului de măsurare și interpretare a acestui proces fizic, am transpus metoda de analiză în măsurarea precisă a deplasării celulelor în plan. Cu ajutorul metodei noastre și a dispo- 23 zitivului separator, se creează un standard de analiză și interpretare a datelor măsurate de aparat, privitor la deplasarea celulelor aderate de substrat. 25 în vederea obținerii rezultatelor pentru acest studiu, s-a folosit sistemul de măsurare al impedanței celulare - xCELLigence-, produs sub licență ACEA Biosciences, CA, SUA 27 (fig. 2). Ulterior, dispozitivul în care sunt însămânțate celulele și cu ajutorul căruia putem obține date relevante despre IC a fost modificat. Prezenta invenție mai aduce un plus și dato- 29 rită metodei de măsurare în timp real ce poate fi utilizată pe acest dispozitiv nou, modificat.

Până în prezent, sistemul xCELLigence este bine stabilit și utilizat pe scară largă în 31 analiza în timp real a proliferării și migrării celulare.

Datorită faptului că sistemul xCELLigence este un sistem experimental de încredere, 33 am efectuat analiza în timp real a celulelor (ATRC), combinată cu un alt test utilizat pe scară largă, și anume testul migrării celulare în urma deteriorării monostratului celular, așa numitul 35 „scratch test” sau „wound healing”.

Am combinat testul de migrare prin zgâriere a monostratului celular cu utilizarea 37 sistemului xCELLigence, și am stabilit un protocol fiabil pentru analiza în timp real a migrării celulelor în noul spațiu format în placa de cultură cu microelectrozi din aur prin măsurarea 39 impedanței celulare.

Avantajele metodei conform invenției sunt următoarele: 41

- procedeul permite analiza migrării celulelor in vitroîn urma stimulării cu diferite substanțe, totul fiind într-un mediu controlat și în timp real. Astfel, se poate studia cum interac- 43 ționează celulele aderente cu diverse citokine sau cu componentele matriceale de interes;

- interpretarea studiilor de migrare celulară ex vivo este rapidă și obiectivă datorită 45 analizei în timp real a impedanței celulare care se corelează direct cu numărul de celule și dispersia lor în godeu; 47

- dimensiunile unui godeu în care se face analiza propriu-zisă este de 0,2 cm², dimensiune ce avantajează printr-un volum mic de mediu de cultură folosit și mai ales pentru 49 numărul mic de celule utilizat (7000...10000);

RO 131463 Β1

- dispozitivul care desparte inițial godeul în două părți egale nu influențează ambientul celulelor și totodată ne ajută să determinăm și mai bine gradul de migrare celulară, având o suprafață cunoscută (4,9 mm²). Având drept constante timpul și distanța, putem să extrapolăm datele noastre de analiză prin raportarea la viteza medie a migrării celulelor în cm/s, cm/h, mm/h etc.

Plăcuța specială de citire a impedanței celulare prezintă 16 godeuri în care se pot cultiva celulele și în care se pot face respectivele măsurători de migrare. Numărul mare de godeuri pe o singură placă avantajează experimentele în care este nevoie de analize multiple pentru factori diferiți, rezultând un amplu răspuns la factorii de studiu al migrării per godeu pentru celulele studiate.

Etapele parcurse pentru asamblarea dispozitivului separator pentru a conduce la posibilitatea folosirii metodei de măsurare în timp real a deplasării celulelor în sistem in vitro folosind impedanța celulară sunt prezentate în fig. 3.

în cele ce urmează, se dă un exemplu concret de realizare a invenției, reprezentat în fig. 1...5. Pentru exemplificare, am utilizat celule stern mezenchimale (CSM) izolate din cordon ombilical uman, ulterior acestea fiind stimulate cu 17-beta estradiol (E2) sau E2 + Fulvestrant.

Prezentare pe scurt a figurilor.

Fig. 1, tehnica de wound healing: a) perturbarea stratului celular (suprafața zgâriată); b) refacerea stratului celular după un anumit interval de timp.

Fig. 2, a) laptopul cu software de analizare; b) sistemul de măsurare a impedanței celulare - xCELLigence; c) plăcuța de cultură cu microelectrozi de aur.

Fig. 3, a), b) reprezentarea schematică a unui godeu dintr-o placă de cultură cu componenta care trebuie adăugată pentru realizarea dispozitivului separator pentru măsurarea IC; c), d) imaginea dispozitivului separator după asamblare.

Fig. 4, diagrama IC în funcție de timp: primul pas - celulele au fost însămânțate în plăcuța cu microelectrozii de aur ce prezintă în interiorul fiecărui godeu circular un dispozitiv separator ce a fost îndepărtat după aproximativ 40 h; în cel de-al doilea pas, măsurarea impedanței celulare s-a continuat până la aproximativ 78 h. Nota: n = 4; celulele stern mezenchimale (CSM) au fost tratate fie cu 17-beta estradiol (E2), fie cu antagonistul acestuia (Fulvestrant), drept control au fost utilizate celulele (CSM) împreună cu mediul de cultivare (DMEM).

Fig. 5, microscopie optică ilustrând partea inferioară a plăcuței de cultură cu microelectrozi de aur: a) dispozitivul dreptunghiularde plastic inseratîn godeul plăcuței de cultură, lungimea acestuia fiind aceeași cu diametrul godeului; a se observa un detaliu foarte important, și anume că celulele nu se află sub dispozitivul separator, ci se regăsesc numai de o parte și de alta a acestuia; b) mărirea imaginii la microscopul optic pentru o mai bună vizualizare a godeului în care a fost inserat dispozitivul dreptunghiular de plastic; lățimea dispozitivului separator este de 1 mm.

Exemplu înainte de însămânțarea pe placă a celulelor, trebuie adaptată plăcuța respectivă conform cerințelor experimentului în cauză. Astfel, se folosește dispozitivul dreptunghiular din material de plastic care se inserează pe centrul godeului în așa fel încât fundul godeului să fie în contact direct cu dreptunghiul de plastic (fig. 3).

Atât pentru plăcuța de cultură cu godeuri cu suprafața de 0,2 cm², cât și pentru plăcuța de cultură cu microelectrozi de aur cu 16 godeuri s-a folosit același dispozitiv din material plastic (polipropilenă) cu aceleași dimensiuni, și anume lățimea de 1 mm, lungimea de 4,9 mm, înălțimea de 123 mm, și suprafața de contact de 4,9 mm²; acest dispozitiv,

RO 131463 Β1 provenind dintr-o bară de plastic cu înălțimea de 10 cm (Roth, Karlsruhe, Germania), lățimea 1 de 1 mm și lungimea de 4,9 mm, fiind ulterior secționat pentru dimensiunile standard ale unui godeu cu suprafața de 0,2 cm². 3

Dispozitivul special modificat din material plastic este poziționat perpendicular pe fundul godeurilor, iar zona de contact dintre partea inferioară a dispozitivului și a plăcuței de 5 cultură este sigilată în urma adăugării unui material biocompatibil, Colagen de tip 1 din coadă de șobolan. 7 în prezentul exemplu a fost folosită o plăcuță (tip placă, xCelligence, produs sub licență ACEA Biosciences, CA, SUA, care a fost modificată prin introducerea dispozitivului 9 așa cum a fost descris anterior.

S-au folosit celule stern mezenchimale obținute din cordonul ombilical uman crescute 11 în condiții normoxice (37°C și 5% CO₂) și mediu de cultură special DMEM 1%o Glucoză + 10% Ser Bovin Fetal + 1% Antibiotice (Gibco, CA, SUA). 13

La un interval de 4 zile de la însămânțarea pe o placă de cultură cu suprafața de 75 cm², celulele s-au multiplicat până au ajuns la o rată de ocupare a suprafeței de aproxi- 15 mativ 80%.

în acest moment, celulele au fost detașate enzimatic de substrat cu scopul reînsă- 17 mânțării pe plăcuța specială de 16 godeuri.

Pentru sigilarea spațiului dintre fundul godeului și dispozitivul dreptunghiular din 19 material plastic se folosește ca „adeziv Colagen tip 1 din coadă de șobolan (BD Biosciences, CA, SUA). Se folosește o cantitate de Colagen de 5 pi în fiecare godeu. După 21 15 min, timp în care Colagenul se usucă, se adaugă 100 μΙ mediu cultură pentru a face citirea de referință a plăcii la SATR. în urma stabilirii indicelui de referință pentru fiecare 23 godeu, se adaugă încă 100 μΙ mediu conținând un numărfix de celule pentru fiecare godeu.

Pentru distribuția egală de celule în cele două părți nou formate ale godeului se optează 25 pentru resuspendarea mediului de 2...4 ori cu vârful de pipetă.

Pentru 30 de min, plăcuța de cultură cu 16 godeuri se menține la temperatura 27 camerei într-o zonă cu flux de aer steril pentru sedimentarea celulelor pe fundul plăcii. Aerul cald din incinta incubatorului arfi determinat ca celulele să migreze spre centrul godeului în 29 timpul sedimentării, creând o perturbare a măsurătorilor ulterioare.

Plăcuța cu microelectrozii de aur este introdusă în incubatorul ce păstrează condițiile 31 propice cultivării celulelor în condiții in vitro unde se atașează dispozitivului SATR. Cu ajutorul software-ului din dotare se pornește analiza în timp real a dispozitivului la intervale 33 de timp bine stabilite (intervale de citire de la câteva secunde până la câteva ore) și astfel începe observarea proliferării și dispersiei celulelor în godeu. Toate măsurătorile sunt 35 reprezentate de către software grafic și digital. Astfel, la fiecare citire a impedanței celulelor dintr-un godeu se generează un indice celular care este direct proporțional cu numărul de 37 celule și care este raportat la citirea de referință a godeului făcută anterior când godeul era fără celule, doar cu mediu. Totodată, pe baza acestui indice, software-ul generează automat 39 un grafic bidimensional care are pe axa X ca referință Timpul (în ore) și pe axa Y ca referință Indicele celular (valori arbitrare) al fiecărui godeu în parte. 41 în momentul când celulele din godeu au ajuns la confluență maximă, fapt care se corelează cu faza de platou din graficul afișat de software-ul de analiză, se trece la următorul 43 pas, care constă în trecerea aparatului pe modulul Pauză și detașarea plăcii speciale din dispozitiv. Odată detașată, într-un mediu cu flux de aer steril, se face extracția dreptunghiului 45 de plastic din centrul godeului. Astfel s-a creat, pe fundul godeului acoperit cu electrozi de aur, o suprafață bine determinată, neacoperită de celule, iar acest loc va fi ulterior acaparat 47 de celulele aflate la graniță. Prin acest mod se mobilizează deplasarea celulelor spre spațiul nou creat. 49

RO 131463 Β1

Imediat ce dispozitivul dreptunghiular de plastic a fost detașat, se reintroduce plăcuța cu microelectrozii de aurîn dispozitivul de măsurare pentru a se continua măsurătoarea. Din acest moment, se poate stabili rata de ocupare a spațiului gol creat în funcție de condițiile de tratare a celulelor. Având suficiente godeuri la dispoziție, se pot face și analize pentru probe martor, astfel încât să se poată decela în funcție de condițiile experimentale.

în momentul în care s-a reajuns la faza de platou, experimentul se consideră încheiat.

Rezultatele obținute arată că prezenta invenție, legată atât de plăcuța de cultură cu microelectrozii de aur ce conține dispozitivul separator, cât și de metoda de măsurare în timp real a deplasării celulelorîn sistem in vitrofolosind impedanța celulară, funcționează la parametri optimi, acuratețea datelor obținute în timp real fiind mult crescută (fig. 4).

De asemenea, această metodă de măsurare aduce cu sine încă un beneficiu, și anume posibilitatea măsurării directe și în timp real a acțiunii anumitor antagoniști (testați în experimentele descrise în fig. 4), medicamente, substanțe chimice cu potențial toxic asupra celulelor umane, această invenție având și caracter potențial terapeutic pentru studiile clinice.

Tehnica de microscopie optică a permis vizualizarea părții inferioare a plăcuței de cultură cu microelectrozi de aur (fig. 5). Detaliul esențial pe care l-am observat datorită acestei tehnici, a fost legat de dispunerea și atașarea celulelor. Inserțiile dreptunghiulare de plastic au permis proceselor de migrare și atașare a celulelor să se efectueze strict de o parte și de alta a acestora. Acest lucru se datorează dimensiunilor precise și cunoscute ale dispozitivului dreptunghiular de plastic, fapt ce conduce la posibilitatea calculării extrapolării datelor de analiză prin raportarea la viteza medie a migrării celulelorîn cm/s, cm/h, mm/h având drept constante timpul și distanța. „Lipirea dispozitivului dreptunghiular de plastic s-a efectuat cu un polimer biologic format din aminoacizi, și anume Colagen de tip 1 din coadă de șobolan, proteină ce se găsește în abundență în organismul uman.

Datorită biocompatibilității Colagenului - atât in vitro, cât și in vivo - procedeul de atașare al dispozitivului separator este un procedeu ușor de utilizat, prezintă un grad de precizie înalt (atașarea controlată a celulelor de o parte și de alta a inserților drepunghiulare din plastic), și, mai mult decât atât, este un procedeu netoxic.

Claims (8)

1. Revendicări 1

   1. Dispozitiv separator sub formă de paralelipiped dreptunghic ale cărui fețe laterale 3 sunt din material plastic, care se introduce într-un godeu circular al unei plăci de cultură cu godeuri sau cu microelectrozi de aur, perpendicular pe baza godeului, astfel încât dispozitivul 5 să traverseze centrul godeului, iar una dintre fețele laterale mici ale dispozitivului să vină în contact direct cu baza godeului și să separe suprafața bazei godeului în două arii egale. 7
2. 2. Dispozitiv conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că acest contact direct cu baza godeului se realizează cu ajutorul unei proteine biocompatibile, precum colagen de 9 tip 1 din coadă de șobolan.
3. 3. Dispozitiv conform revendicării 1 sau 2, caracterizat prin aceea că are o lățime 11 de 1 mm, o lungime de 4,9 mm, o înălțime de 123 mm și o suprafață de contact de 4,9 mm², godeul plăcii în care este inserat are o suprafață de 0,2 cm². 13
4. 4. Dispozitiv conform revendicărilor 1...3, caracterizat prin aceea că materialul plastic din care este alcătuit este polipropilenă. 15
5. 5. Placă de cultură cu godeuri, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde dispozitivul separator definit în oricare dintre revendicările 1...4, inserat în cel puțin unul dintre 17 godeurile sale.
6. 6. Placă de cultură cu microelectrozi de aur, caracterizată prin aceea că aceasta 19 cuprinde dispozitivul separator definit în oricare dintre revendicările 1 ...4 inserat în cel puțin unul dintre godeurile sale. 21
7. 7. Metodă de măsurare în timp real a migrării celulare într-o placă de cultură cu microelectrozi de aur modificată, conform revendicării 6, cu dispozitivul separator definit în 23 revendicările 1...4, caracterizată prin aceea că:

   - se însămânțează celule în fiecare godeu, de-o parte și de alta a dispozitivului 25 separator;

   - se lasă celulele să sedimenteze, după care se supun condițiilor de cultivare; 27

   - se obține variația indicelui celular în funcție de impedanță, în timp real;

   - după ce celulele din godeuri au ajuns la confluență maximă, se îndepărtează dispo- 29 zitivul dreptunghiular, creându-se astfel pe fundul godeului acoperit cu electrozi de aur o zonă bine determinată neacoperită de celule; 31

   - se măsoară din nou variația indicelui celular în funcție de impedanță, în timp real, pentru a se stabili rata de ocupare a spațiului gol creat prin detașarea dispozitivului. 33
8. 8. Metodă conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că celulele cultivate de o parte și de alta a dispozitivului separator sunt celule stern mezenchimale umane obținute 35 din surse fetale atât în prezența, cât și în absența anumitor factori chimici sau biologici.