RO130705B1 - Dispozitiv şi metodă pentru crioincludere a materialului tisular în vederea examinării microscopice - Google Patents

Description

Invenția se referă la un dispozitiv portabil destinat crioincluderii materialului tisularîn vederea examinării microscopice, utilizată cu precădere în spitale și laboratoare de cercetare.

Este cunoscut, din practica medicală și literatura de specialitate, faptul că materialul tisular recoltat intra-operator poate fi înghețat folosind un mediu de includere de tipul OCT- Sakura Tek (optimum cutting temperature compound - amestec apos de glicoli și rășini), pentru a fi apoi secționat și examinat în microscopie optică, în vederea punerii unui diagnostic intra-operator (examen extemporaneu). De asemenea, multe tehnici de cercetare și diagnostic necesită procesarea materialului tisularîn stare înghețată. în principal sunt folosite două metode:

- înghețare la -20°C, urmată de secționare imediată;

- înghețare la -80°C, urmată de stocare în congelatoare de temperatură ultra-joasă (ultra-low temperature freezer). Stocarea la -80°C permite temporizarea secționării materialului, ceea ce înseamnă că materialul rămâne viabil câteva luni. în momentul procesării, blocul de gheață ce conține țesutul trebuie încălzit la -20°C, pentru a putea fi prelucrat, iar temperatura de prelucrare poate varia în funcție de țesut.

Pentru ambele procedee este necesar ca timpul de înghețare să fie redus pentru a limita inducerea de artefacte de înghețare (cristalele aciculare de gheață) care rup membranele celulelor, denaturând proba cu material tisular de cercetat.

în mod uzual, pentru procesarea de înghețare (sau „la gheață) a fragmentelor de țesut, procedura de înghețare se realizează în interiorul criotomului, aparatul ce realizează și secționarea materialului rezultat. Se folosește o piesă port obiect peste care se depune un strat de mediu de înghețare (OCT - optimum cutting temperature compound), iarîn acesta se așază țesutul de interes pentru investigare medicală sau în scop de cercetare. Piesa port obiect astfel formată este introdusă în camera criotomului la o temperatură medie de -20°C, pentru a îngheța țesutul de investigat. Răcirea poate fi grăbită prin folosirea extractoarelor de căldură (piese metalice cu suprafață plană), care se pun peste piesa „port obiect de înghețat. Ulterior înghețării se poate efectua în bune condiții secționarea mecanică a materialului tisular, și etalarea pe lama folosită ca suport pentru explorarea microscopică.

Dezavantajele acestei tehnici uzuale sunt următoarele:

- răcirea se produce mai lent și facilitează apariția artefactelor induse de îngheț;

- necesită un criotom, aparat voluminos, dificil de transportat în diverse locații;

- materialul recoltat trebuie transportat de la locul recoltării până în laboratorul de procesare, și în acest interval de timp intermediar unii compuși intracelulari cu durata de viață scurtă pot fi deja metabolizați, și nu mai pot fi evidențiați;

- în general nu se recomandă ca materialul înghețat intermediar la -20°C să fie apoi stocat la -80°C;

- pentru stocare la -80°C, metoda cea mai răspândită este de a îngheța rapid piesa în azot lichid, tehnică ce necesită personal calificat și proceduri speciale de manevrare a agentului frigorific.

Este cunoscută invenția US 2002162337 (A1), intitulată „Apparatus and method for precission cryoembeddingoftissue samples, în care, în scopul crioincluderii țesutului tisular de investigat, se folosește un aparat ce constă într-un ansamblu compus dintr-un set de cuve de includere, port-piese și blocuri de răcire care se introduc peste port-piese, cu accesorii de manipulare a pieselor. Aparatul poate fi răcit de surse externe, sau utilizat în interiorul unui criotom. Aparatul este destinat a fi folosit la -25^oC...-30^oC.

Dezavantajele acestui aparat sunt următoarele:

- aparatul nu poate fi folosit pentru a produce blocuri de gheață ce includ material tisular la o temperatură mai joasă de -30°C. Pentru stocarea de lungă durată a materialului tisular, este necesară înghețarea la -80°C într-o singură etapă, și cât mai rapid posibil;

RO 130705 Β1

- aparatul nu prezintă înveliș izolator, ceea ce face ca încălzirea dispozitivului să fie 1 rapidă, iar intervalul de folosire în afara unei incinte răcite (de tipul criotomului) este limitat;

- aparatul prezintă un număr mare de piese mobile; 3

- aparatul nu este dotat cu un termometru propriu pentru monitorizarea temperaturii de includere. 5

Se cunoaște, de asemenea, invenția WO 2007028243 (B1), ce utilizează un aparat și o metodă constând dintr-o platformă de înghețare introdusă într-o cutie izolatoare din poli- 7 stiren, o matriță de înghețare și un port obiect. Aparatul în general este răcit cu zăpadă carbonică, dar poate folosi și alte surse, cum este azotul lichid sau compresor propriu de răcire. 9 Dezavantajele acestui aparat sunt următoarele:

- unele surse de răcire necesită material adițional și, eventual, personal calificat în 11 manevrarea lor (zăpadă carbonică, azot lichid);

- învelișul izolator este din polistiren, care este inferior poliuretanului din punct de 13 vedere al calităților izolatoare și al rezistenței la manipulare;

- aparatul nu este dotat cu un termometru propriu pentru monitorizarea temperaturii 15 de includere;

- aparatul nu prezintă un înveliș exterior cu rezistență chimică crescută. 17

Aparatele și metodele cunoscute prezintă în general următoarele dezavantaje:

- lipsa portabilității și autonomia scăzută de utilizare; 19

- număr mai mare de piese în alcătuirea aparatului;

- necesitatea unui agent frigorific (de exemplu, azot lichid), corelată cu necesitatea 21 unei calificări suplimentare pentru manevrarea azotului lichid;

- înghețarea în două trepte (-20°C și apoi -80°C); 23

- absența monitorizării temperaturii pentru asigurarea condițiilor optime de înghețare;

- rezistență mecanică și chimică scăzută a învelișului exterior; 25

- imposibilitatea stocării blocului de gheață pentru procesare ulterioară.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unui dispozitiv de 27 crioincludere a materialului tisular de investigat, care să fie portabil, ușor de manipulat, care să permită înghețarea țesutului la temperatură ultra-scăzută (-80°C), fără pericolul formării 29 artefactelor sau alterarea țesutului, și care să fie utilizabil autonom, cu posibilitatea monitorizării temperaturii, și cu rezistență mecanică și chimică sporită a învelișului exterior. 31

Dispozitivul pentru crioincluderea materialului tisular, în vederea examinării microscopice, conform invenției, ce are în compunere un bloc din metal cu conductivitate termică și 33 căldură specifică crescută, prevăzut cu niște locașuri tronconice cu rol de cavități formatoare, pentru includerea țesuturilor într-o masă de gheață, rezolvă problema tehnică și înlătură 35 dezavantajele menționate prin aceea că blocul din metal este montat într-o cuvă, fiind înglobat într-un strat izolator, din poliuretan, care îmbracă la interior cuva, și care se îmbină 37 etanș, printr-o renură de profil pătratic, prevăzută pe suprafața de închidere, cu un strat superior din material izolator de poliuretan, care căptușește un capac ce determină, împre- 39 ună cu cuva, un spațiu interior cu rol de cameră de înghețare, și care prezintă pe suprafața de închidere o adâncitură cu profil similar, în care pătrunde renura, capacul fiind prevăzut 41 cu niște dopuri tronconice pe direcția axelor de simetrie ale locașurilor tronconice din blocul de metal, atât stratul izolator, cât și stratul superior fiind acoperite cu câte un înveliș exterior 43 din material plastic.

Prin învelișul tip carcasă, pe lateral, este montat un termometru de contact, care 45 pătrunde cu o sondă de detecție sub formă de tijă, în blocul de metal pentru monitorizarea temperaturii acestuia. La partea superioară a ansamblului de tip cuvă se dispune un ansam- 47 blu amovibil, de tip capac de carcasă, format dintr-un strat superior din material izolator de

RO 130705 Β1 poliuretan, și un înveliș exterior din material plastic, ce realizează, prin suprapunere peste stratul menționat și învelișul ansamblului tip cuvă, un spațiu pentru o cameră de înghețare, deoarece marginile stratului și ale învelișului depășesc înălțimea blocului de metal. Pe suprafața de închidere a celor două ansambluri se realizează, pentru etanșare și poziționare fermă, o adâncitură de profil pătratic în stratul superior, în care pătrunde o renură de profil pătratic și dimensiuni corespondente unei asamblări cu joc de pe stratul izolator al cuvei, asemănătoare montajului de tip mamă-tată. Ansamblul amovibil de tip capac de carcasă este prevăzut cu niște dopuri in dreptul axei locașurilor de formare pentru includere a țesuturilor în masa de gheață, dopuri ce susțin niște piese „port-obiect pe care se crioinclude materialul tisular.

Metoda pentru crioincluderea materialului tisularîn vederea examinării microscopice, conform invenției, se realizează prin următoarele etape succesive:

1. Dispozitivul constituit din ansamblul de tip cuvă, fără ansamblul mobil de tip capac-carcasă, se introduce și se menține în congelatorul de temperatură ultrajoasă până la obținerea temperaturii de -80°C a blocului de metal.

2. Capacul de carcasă prevăzut cu dopurile și piesele „port-obiect se montează la deschiderea congelatorului, și înainte de a scoate restul ansamblului din mediul de -80°C.

3. Se transportă dispozitivul cuvă cu capac în condiții normale de temperatură, la locul recoltării.

4. în momentul în care este necesară operațiunea de includere, se detașează ansamblul mobil de tip capac, se așază în cuva de includere, în locașurile corespunzătoare fragmentul de țesut de interes, peste care se toarnă mediul de înghețare (OCT), astfel încât nivelul acestuia să depășească ușor planul superior al blocului de metal.

5. Se așază ansamblul mobil de tip capac peste carcasa dispozitivului cu piesele „port obiect deasupra, mediul de înghețare situat deasupra planului blocului intrând cu șanțurile piesei „port obiect, și facilitând legarea eșantioanelor cu material tisular.

6. După înghețare, prin rotirea dopurilor, se obține detașarea blocului de gheață cu țesut tisular înglobat, format pe placa circulară a piesei „port obiect.

7. Piesa „port obiect cu șanțuri unidirecționale permite ca, prin presarea blocului de gheață, cu material tisular, în direcția șanțurilor, să se obțină detașarea acestuia, putând fi utilizat imediat, sau stocat pentru utilizare ulterioară.

Dispozitivul pentru crioincluderea materialului tisular în vederea examinării microscopice, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:

- portabilitatea de a asigura disponibilitatea procesului de înghețare a țesutului la locul recoltării acestuia, minimizând timpul scurs între momentul obținerii fragmentului de țesut și crioincluderea acestuia;

- autonomia crescută de utilizare, prin scăderea transferului termic cu mediul ambiant, datorită izolării camerei de înghețare;

- număr scăzut de piese din care este constituit dispozitivul;

- nu necesită agent frigorific suplimentar (de exemplu, azot lichid, zăpadă carbonică);

- dispozitivul poate fi folosit de oricine, fără a necesita o calificare și abilitare în utilizarea sa;

- înghețarea se face rapid la temperatură ultrascăzută (-80°C);

- controlul temperaturii prin prezența termometrului asigură condițiile optime de înghețare;

- rezistență mecanică și chimică crescută a învelișului exterior (PVC);

- oferă posibilitatea stocării blocului de gheață pentru procesare ulterioară, atât în camera de înghețare (temporar), cât și prin transfer ulterior, în congelatoare de temperatură ultrajoasă.

RO 130705 Β1

Se dă în continuare un exemplu de realizare a invenției în legătură cu figurile ce 1 reprezintă:

- fig. 1, secțiune longitudinală a dispozitivului; 3

- fig. 2, un port obiect ce permite detașarea blocului de gheață cu eșantionul de pe acesta. 5

Dispozitivul pentru crioincluderea materialului tisular în vederea examinării microscopice, conform invenției, este alcătuit dintr-un ansamblu de tip cuvă A, care, împreună cu 7 un ansamblu de tip capac de carcasă B, delimitează o cameră de înghețare în care se realizează și stochează eșantioane cu material tisular pentru investigații microscopice. în 9 ansamblul de tip cuvă A se montează un bloc 1 solid de metal cu conductivitate termică și căldură specifică crescută, de regulă aluminiu (fig. 1). Acesta este prevăzut cu mai multe 11 locașuri 2 tronconice, care au rolul cavităților formatoare pentru includerea țesuturilor în masă de gheață. Dimensiunile și numărul locașurilor 2 sunt variabile în funcție de necesita- 13 tea de investigație a diferitelor țesuturi și, ca atare, vor determina dimensiunea minimă a blocului 1. Grosimea blocului 1 este cea care determină în final autonomia dispozitivului deoa- 15 rece cu cât blocul este mai gros, având o masă mai mare, inerția termică este mai mare, iar încălzirea lui se va realiza într-un interval de timp mai mare. 17

Blocul 1 de metal este înglobat într-un strat 3 izolator, de poliuretan, de forma ansamblului tip cuvă A, liber la partea superioară în dreptul locașurilor 2. La exterior stratul izolator 19 3 de forma unei cuve este cuprins într-un înveliș 4 de tip carcasă, din material plastic, de regulă din PVC - policlorură de vinii - care asigură structura suport și de rezistență a dispo- 21 zitivului. Prin învelișul 4 tip carcasă, pe lateral, este montat un termometru de contact 5 care pătrunde cu o sondă 6 de detecție, sub formă de tijă, în blocul 1, pentru monitorizarea tem- 23 peraturii blocului 1 de metal. Afișajul termometrului se află la exterior, pe laterală, aplicat peste învelișul 4, de tip carcasă, extern. La partea superioară a ansamblului de tip cuvă A, 25 format din blocul 1, stratul izolator 3, învelișul 4 și termometrul de contact 5, se dispune un ansamblu amovibil de tip capac de carcasă B, format dintr-un strat superior 7, din material 27 izolator de poliuretan, și un înveliș exterior din material plastic realizează, prin suprapunere peste stratul 3 și învelișul 4, un spațiu pentru o cameră 8 de înghețare, deoarece marginile 29 stratului 3 și ale învelișului 4 depășesc înălțimea blocului 1. Pe suprafața de închidere a celor două ansambluri se realizează, pentru etanșare și poziționare fermă, o adâncitură de profil 31 pătratic în stratul superior 7, în care pătrunde o renură de profil pătratic și dimensiuni corespondente unei asamblări cu joc de pe stratul izolator 3, asemănătoare montajului de tip 33 mamă-tată.

în corpul stratului superior 7 sunt așezate, pe aceleași axe verticale cu cele ale locașu- 35 rilor tronconice 2 din blocul 1, și corespondent cu numărul acestora, niște dopuri 9 tronconice, de grosimea stratului superior 7, care, la partea superioară, sunt prevăzute cu niște proeminențe 37 10 de formă cilindrică, ce constituie zone de apucare pentru extragerea prin apucare-tragere a dopurilor 9 atunci când se dorește accesul operatorului pentru manipularea selectivă a unui 39 eșantion de țesut înghețat, în vederea secționării unor lame pentru examinare microscopică.

în dopurile 9 cu orientare axial-centrală este inserată o piesă 11 port obiect, având 41 o tijă inserată în dopul 9 și, la partea opusă, o platformă de tip placă circulară 12 (fig. 2), care, la partea dinspre camera de înghețare, în zona cavității locașurilor 2 de formare prin 43 crioincludere a eșantioanelor de țesut, are prevăzute niște striațiuni 13 unidirecționale, în formă de V. Pe placa circulară 12, în procesul de crioincludere, în limitele determinate de 45 locașul 2 se formează prin înghețare un eșantion 14 care include țesutul de investigat. Striațiunile unidirecționale asigură rămânerea materialului tisular pe placa circulară 12, atunci 47

RO 130705 Β1 când, la scoaterea eșantionului, operatorul rotește tija 11 pentru desprinderea de locașul 2 formator a eșantionului crioinclus 14. Prin aplicarea unei forțe în sensul striațiunilor, prin alunecare, eșantionul 14 se va detașa de placa circulară 12, ceea ce va permite reutilizarea acesteia în cadrul aceleiași sesiuni de includere. Pentru creșterea autonomiei, respectiv, pentru stocarea temporară a eșantioanelor 14 se poate folosi un congelator portabil de temperatură ultrajoasă. Camera de înghețare poate fi folosită pentru stocarea temporară a blocurilor de gheață detașate, până la mutarea lor în congelatoare dedicate. în situația în care numărul de blocuri formate în această etapă este mai mic decât numărul de cuve de includere, detașarea blocului de gheață de cuva de includere se va realiza doar în momentul mutării blocului în criotom, pentru secționare, sau în congelator de temperatură ultrajoasă, pentru stocare.

Metoda pentru crioincluderea materialului tisularîn vederea examinării microscopice, conform invenției, se realizează prin următoarele etape succesive:

1. Dispozitivul constituit din ansamblul de tip cuvă, având stratul 3, învelișul 4 și blocul 1, cu termometrul de contact 5, fără ansamblul mobil de tip capac, se introduce și se menține în congelatorul de temperatură ultrajoasă până la obținerea temperaturii de -80°C a blocului de metal.

2. Capacul de carcasă, format din stratul superior 7, prevăzut cu dopurile 9 și piesele 11 „port-obiect, se montează la deschiderea congelatorului și înainte de a scoate restul ansamblului din mediu de -80°C.

3. Se transportă dispozitivul cuvă cu capac, în condiții normale de temperatură, la locul recoltării.

4. în momentul în care este necesară operațiunea de includere, se detașează ansamblul mobil de tip capac, se așază în cuva de includere în locașurile 2 fragmentul de țesut de interes, peste care se toarnă mediul de înghețare (OCT), astfel încât nivelul acestuia să depășească ușor planul superior al blocului de metal.

5. Se așază ansamblul mobil de tip capac peste carcasa dispozitivului cu piesele 11 „port obiect deasupra, mediul de înghețare situat deasupra planului blocului intrând în șanțurile piesei 11 „port obiect, și facilitând legarea eșantioanelor cu material tisular.

6. După înghețare, prin rotirea tijei piesei 11 port-obiect, se obține detașarea blocului de gheață cu materialul tisular înglobat, format pe placa circulară 12, de locașurile 2 de cuvă de includere.

7. Piesa 11 „port obiect, cu șanțuri unidirecționale, permite ca, prin presarea blocului de gheață, cu material tisular, în direcția șanțurilor, să se obțină detașarea acestuia, putând fi utilizat imediat, sau stocat pentru utilizare ulterioară.

Claims (5)

1. Revendicări 1

   1. Dispozitiv pentru crioincluderea materialului tisular în vederea examinării micro- 3 scopice, care are în compunere un bloc din metal (1), cu conductivitate termică și căldură specifică crescute, prevăzut cu niște locașuri tronconice (2), cu rol de cavități formatoare 5 pentru includerea țesuturilor într-o masă de gheață, caracterizat prin aceea că blocul din metal (1) este montat într-o cuvă (A), fiind înglobat într-un strat izolator (3) din poliuretan, 7 care îmbracă la interior cuva (A), și care se îmbină etanș, printr-o renură de profil pătratic, prevăzută pe suprafața de închidere, cu un strat superior (7) din material izolator de poliu- 9 retan, care căptușește un capac (B) ce determină, împreună cu cuva (A), un spațiu interior cu rol de cameră de înghețare, și care prezintă pe suprafața de închidere o adâncitură cu 11 profil similar, în care pătrunde renura, capacul (B) fiind prevăzut cu niște dopuri tronconice (9) pe direcția axelor de simetrie ale locașurilor tronconice (2) din blocul de metal (1), atât 13 stratul izolator (3), cât și stratul superior (7) fiind acoperite cu câte un înveliș exterior (4, 8) din material plastic. 15
2. 2. Dispozitiv pentru crioincluderea materialului tisular în vederea examinării microscopice, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că lungimea dopurilor tronconice 17 (9) este egală cu grosimea stratului superior (7), dopurile fiind prevăzute la partea superioară cu niște proeminențe (10) de configurație cilindrică, pentru apucarea dopurilor în vederea 19 extragerii acestora, atunci când se dorește manipularea selectivă a unui eșantion de țesut înghețat. 21
3. 3. Dispozitiv pentru crioincluderea materialului tisular în vederea examinării microscopice, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că o cuvă (A) este prevăzută cu 23 un termometru de contact (5) montat lateral, aflat în legătură cu o sondă de detecție (6) sub formă de tijă, care pătrunde prin învelișul exterior (4), prin stratul izolator (3), până în blocul 25 de metal (1).
4. 4. Dispozitiv pentru crioincluderea materialului tisularîn vederea examinării microsco- 27 pice, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că dopurile tronconice (9) au inserate la partea inferioară câte o piesă port-obiect (11), constituită dintr-o tijă inserată în dop, și 29 continuată la capătul opus cu o platformă circulară (12), a cărei suprafață dinspre locașul tronconic (2) este prevăzută cu niște striații (13) unidirecționale, cu profilul în forma literei V. 31
5. 5. Metodă pentru crioincluderea materialului tisular în vederea examinării microscopice, care cuprinde etapa de introducere a cuvei (A) în congelatorul de temperatură ultra 33 joasă, și menținerea acesteia până la obținerea temperaturii de -80°C a blocului de metal (1), indicată de un termometru (5), urmată de transportarea dispozitivului în condiții normale de 35 temperatură la locul recoltării, și amplasarea fragmentelor de țesut de interes în locașurile tronconice (2) ale blocului de metal (1), peste care se toarnă mediul de înghețare OCT, astfel 37 încât nivelul acestuia să depășească ușor planul superior al blocului de metal (1), caracterizată prin aceea că, la obținerea temperaturii de -80°C a blocului de metal, se montează 39 capacul (B) prevăzut cu dopurile tronconice (9) și piesele port-obiect (11) peste cuvă (A), înainte de a o scoate din mediul de temperatură -80°C, capacul (B) detașându-se în momen- 41 tul efectuării operațiunii de includere, pentru a permite amplasarea fragmentelor de țesut, și repoziționându-se apoi peste cuvă (A), astfel încât mediul de înghețare să intre în striațiile 43 (13) de pe platforma piesei port-obiect (11), iar după înghețare, detașarea blocului de gheață cu materialul tisular înglobat de niște locașuri (2) făcându-se prin rotirea piesei port-obiect 45 (11) și prin presarea blocului de gheață în direcția striațiilor (13).