RO128703B1 - Nanoparticule lipidice, antioxidante şi procedeu de obţinere a acestora - Google Patents

Description

Invenția prezenta se referă la un procedeu de obținere a unor nanoparticule lipidice antioxidante pe bază de ulei din sâmburi de strugure și ulei de squalenă, ce pot fi utilizate cum este cazul β-carotenului, cu aplicații în domeniul farmaceutic și bio-aiimentar.

Dezvoltarea de nanostructuri funcționale ce pot încapsula, proteja și distribui controlat substanțe organice bio-active sensibile este unul dintre domeniile majore în industriile legate de sănătatea publică, care va fi îmbunătățită în mod semnificativ prin dezvoltarea unor abordări combinate ale nanotehnoiogiei cu utilizarea de compuși naturali proveniți din plante, fructe sau alte surse naturale, în ultimii ani, multe companii de profil au alocat timp și cercetări intense asupra dezvoltării de produse naturale extrase din plante, cu scopul de a produce remedii mai eficiente și pentru a satisface preferințele consumatorilor pentru produse naturale cu proprietăți multifuncționale,

Nanoîncapsularea de compuși bioactivi este o condiție esențială pentru producția de alimente sau medicamente multifuncționale destinate să îmbunătățească sănătatea pe termen lung și bunăstareaconsumatorilor în toată lumea. Din categoria compușilor bio-acti vi face parte și β-carotenul, substanță ce furnizează cel mai mare aport de vitamina A și are abilitatea de a capta radicalii liberi oxigenați datorită proprietăților sale antioxidante.

Stresul oxidativ indus de speciile oxigenate reactive joacă un rol cheie în patologiile multor boli, incluzând ateroscleroză, hipertensiune, tromboză, diabet și infarct miocardic. Ca atare, combaterea stresului oxidativ vasculareste importantă pentru profilaxia Și tratamentul acestor maladii. Carotenul a fost implicat în prevenirea sau protecția împotriva unor tulburări grave de sănătate, cum arfi bolile de inimă, survenite în urma unor procese de stres oxidativ. Cu toate acestea, efectele benefice ale β-carotenului sunt limitate, deoarece, fiind un compus puternic hidrofob, el este dificil de dispersat, foarte reactiv și, ca atare, instabil la oxigen, ceea ce de multe ori duce la apariția de produși de degradare care manifestă efecte prooxidante. Aceste efecte nedorite trebuie atent controlate, deoarece modificările fizico-chimice ale β-carotenului pot afecta utilizarea acestui ingredient activ în diferite formulări de natură farmacologică sau bio-alimentară.

în acest context, în literatură sunt prezentate diferite cercetări realizate cu scopul de a solubiliza și stabiliza β-carotenul în sisteme veziculare submicronice, cum ar fi niozomii și nanodispersiile rezultate prin auto-asamblarea monomerilor de agenți tensioactivi. De exemplu, performanța câtorva emulsifianți (de exemplu: caseinat de sodiu, Tween 20, monolaurat de decaglicerol, proteine), precum și combinații ale acestora în prepararea nanodispersiilor de β-caroten a fost dovedită în două cercetări recente (Nakajirna et al., 2007, 2009) prin utilizarea unui proces bazat pe tehnica de evaporare - emulsionare cu solvent. De asemenea, a fost demonstrată și fezabilitatea de a crește stabilitatea β-carotenului prin Încapsulare în nanoparticule de acid polilactic (Cao-Hoang et al., 2011). în aceste cercetări, au fost utilizate micele de Tween 80 pentru a împiedica creșterea și aglomerarea particulelor deearoten. încapsularea β-carotenuluiîn particule de acid polilactic a condus la organizări supramoleculare mai stabile, care oferă o protecție mai bună împotriva oxidării. Alte studii prezintă utilizarea unor sfere de furcellaran (Laos at al, 2007) și manitol în sinergie cu cationi bivalenți (Sutter et al., 2007), ca matrice eficientă pentru încapsularea β-carotenului, cu același scop de a proteja degradarea acestuia.

US 0028444 Α1/201Ό descrie utilizarea unor nanoparticule de caroten dispersabile în apă de dimensiuni cuprinse între 100...300 nrri, ca modulatori de gust pentru reducerea gustului amar din alimente sau băuturi. Brevetul de invenție US 0112073 Ă1/2010 prezintă sinteza unor nanoparticule ce prezintă un miez nepolar îmbogățit cu compuși hidrofobi de

RO 128703 Β1 tipul β-carotenului, un strat de surfactant intermediar (lecitină) pentru stabilizarea miezului 1 hidrofob și un înveliș protector de polimer glucidic reticulat, de tipul acidului alginic, utilizând o metodă combinată de ultrasonare cu tehnica „layer-by-layer. Formarea unor nanoparticule 3 organice cu conținut variabil de β-earoten se regăsește și în US 0021592 A1/2011. Invenția furnizează un procedeu pentru prepararea unor pulberi redispersabiie de nanoparticule de 5 β-caroten, ce implică obținerea unei microemulsii ulei-in-apă formate în sistemul Tween 80/lecitină/toluen/propanol/manitol/apă și β-caroten. 7

Referitor la tipul de matrice utilizată drept „rezervor pentru încapsularea altor compuși bio-activi de natură hidrofobă, se cunosc studii destinate obținerii de nanoparticule 9 lipidice solide. De exemplu, US 0247619 A1 relatează producerea și caracterizarea unor vectori lipidici nanostructurați cu conținut de Riluzol, obținuți pe baza amestecurilor de 11 mono-, di- și trigliceride cu acid behenic, precum și utilizarea lor la prepararea unor formulări farmaceutice pentru tratamentul sclerozei. Metoda prezintă dezavantajul utilizării de solvenți 13 organici necesari formării unor sisteme auto-organizate de microemulsie cu ajutorul fosfatidilcolinei și a taurocolatului de sodiu, precum și necesitatea utilizării unor concentrații 15 > 10% de surfactanți. Alte tipuri de nanoparticule lipidice au fost preparate utilizând aceeași metodă a microemulsionării. US 0233275 A1/ 2010 prezintă un proces pentru prepararea 17 nanoparticulelor lipidice, respectiv a unor nanocapsule ce prezintă un miez lipidic solid încărcat cu un agent bio-activ și un Înveliș lipidic solid, utilizând metoda microemulsiei. în 19 mod similar, US 0306032 Α1/2Ό09 descrie prepararea și utilizarea unor nanoparticule lipidice solide obținute din microemulsii pe bază de propionat de colesteril și/sau butirat de colesteril 21 pentru tratamentul patoiogiiior inflamatorii sau vasculare.

Nanoparticulele lipidice solide au fost intensiv investigate drept vehicule pentru 23 distribuția de compuși bio-activi. US 0206341 A1/2008 și US 0224447 A1/2011 descriu implicarea nanoparticulelor lipidice ca vehicule pentru distribuția acizilor nucleici, în scopuri 25 terapeutice, încorporarea peptidelor, proteinelor, oligonucleotidelor și a unor absorberi UV în nanoparticule lipidice formate în principal din monogliceride este semnalată în patentele 27 US 0038941 A1/2011, US 0206341 A1, US 0224447 A1 și US 0235540 A1/2003.

în ceea ce privește formarea unor matrici antioxidante cu rol de nanotransportori 29 eficienți pentru diferite substanțe bio-active, US 7597907 B2/2010 prezintă încapsularea unor proteine active (de exemplu: enzime antioxidante implicate în detoxifierea xenobioticeior) în 31 matrici polimerice sintetice, pentru utilizare în prevenirea stresului oxidativ.

Prepararea unor matrici lipidice cu rol de nanotransportori lipidici antioxidanți, pe bază 33 de uleiuri naturale bio-active de tipul uleiului din sâmburi de struguri sau a uleiului de squalenă izolat din ficatul de rechin, nu se regăsește în literatură, deși folosirea unor 35 compuși naturali poate eficientiza un proces de sinteză atât în ceea ce privește costul de producție, cât și prin îmbunătățirea proprietăților produsului final. Câteva articole de 37 specialitate au menționat și demonstrat proprietățile biologice, farmacologice și terapeutice ale uleiului din semințe de struguri. Aceste uleiuri de origine vegetală îmbunătățesc 39 sănătatea cardiovasculară, manifestă proprietăți împotriva radicalilor liberi și a stresului oxidativ, inhibă creșterea și formarea anumitor tipuri de cancer, îmbunătățesc performanțele 41 vizuale, reduc simptomeie ulcerului gastric și protejează celulele împotriva consumului excesiv de medicamente (Jayaprakâsha et al., 2003, Yilrnaz et al., 2004, Leifert et al., 43 2008). Squalena posedă activitate antioxidantă și s-a dovedit a fi un bun agent de prevenire în apariția cancerului (Reddy et al., 2009). 45

RO 128703 Β1

Problema tehnică pe care o rezolvă procedeul conform invenției constă în obținerea unor nanoparticule lipidice cu proprietăți antioxidante amplificate, și activitate antimicrobiană semnificativă. Procedeul de obținere a nanoparticulelor lipidice pe bază de uleiuri naturale conform invenției cuprinde:

a) formarea unei faze lipidice libere, ce conține un amestec de lipide solide și lipide lichide naturale de monostearatdeglicerikpalmitatde cetikulei din sâmburi de strugure sau ulei de squalenă, într-un raport de greutate = 1,16:1,16:1, la o temperatură de 85°C, respectiv formarea unei faze lipidice îmbogățite cu concentrații cuprinse între 0,05...0,20% componentă activă de natură hidrofobă (β-earoten);

b) formarea unei faze apoase ce conține un amestec de surfactanți într-un raport de greutate derivat monoalehil-polioxietilensorbitan:leeitina:eopolimer polietilenglicoi-polipropilenglicol = 1:0,25:0,25 și la o temperatură de 85°C, care este supusă ulterior unei omogenizări cu grad înalt de forfecare, la 25000 rpm, timp de 2 min.

c) formarea unei pre-emulsii lipidice - precursoare de nanoparticule lipidice solide prin contactarea sub agitare magnetică a celor două faze, apoasă și lipidică, și menținere la un regim de temperatură constant de 85°C timp de 2 h;

d) formarea unor dispersii apoase de nanotransportori Iipidici încărcați cu β-caroten, prin supunerea pre-emulsiei lipidice la o energie mecanică externă - aplicând o omogenizare cu grad înalt de forfecare de 25000 rpm, timp de 10 min, urmată de răcirea ușoară, sub agitare magnetică, la temperatura camerei.

e) obținerea de nanotransportori lipidici în formă solidă prin supunerea nanodispersiilor apoase unei etape de liofilizare la -55°C timp de 72 h.

Nanotransportorii lipidici încărcați cu β-caroten obținuți pe bază de lipide lichide naturale cuprind:

-22,13...21,82% ulei din sâmburi de struguri sau ulei de squalenă dintr-o matrice înalt dezordonată, formată prin utilizarea unui amestec complex de lipide biocompatibile și naturale ce imprimă un caracter antioxidant specific întregului transportor lipidic;

- 0,37...1,47% substanță activă (β-caroten) încapsulată în rețeaua lipidică astfel formată, procentele fiind exprimate în greutate.

Invenția prezintă următoarele avantaje:

- asigură încapsularea unor componenți puternic hidrofobi (de exemplu: β-caroten) în particule sferice de dimensiune nanometrică, folosind materii prime bio-compatibile, concentrații de surfaetant/co-surfactantîn concentrații minime (< 3,5%) și fără utilizareaunor substanțe agresive (de exemplu: solvenți organici sau surfactanți periculoși);

- procedeul de încapsulare a β-carotenului în astfel de nanomatrici lipidice pe bază de uleiuri naturale se desfășoară în mediu apos, nu utilizează condiții de proces care să conducă la denaturarea principiului bio-activ, nu afectează integritatea structurală a acestuia, ci, mai mult, îi intensifică proprietățile;

- procedeul propus evită utilizarea unor etape de ultrasonare (cum apare deseori în literatura de specialitate) prin introducerea unei etape de omogenizare cu grad înalt de forfecare pe un interval scurt de timp (2 min), ce are ca scop principal distrugerea lipozomilor multilamelari de dimensiuni mai mari de 1 pm ce se formează preponderent prin utilizarea lecitinei în fază apoasă;

- folosește uleiuri naturale, necostisitoare care manifestă un dublu rol:

a) participă la formarea de matrici lipidice eficiente ce pot fi utilizate ca transportori ai unor concentrații semnificative de principiu bio-activ de natură hidrofobă;

b) protejează, prin virtutea proprietăților sale antioxidante, compușii chimici sensibili la oxidare, cum este cazul β-carotenului;

RO 128703 Β1

c) vine cu proprietăți biologice Specifice și, ca atare, un important potențial terapeutic 1 de natură să îmbunătățească sănătatea publică, în completare la cele ale principiului bioactiv selectat pentru încapsulare; 3

- prin acest procedeu se formează o rețea lipidică înalt dezordonată, fapt ce conduce la încapsularea unor concentrații net superioare de substanță bio-activă, datorită 5 imperfecțiunilor/golurilor create prin utilizarea unor lipide cu structuri chimice diferite;

- procedeul propus este simplu și eficient, implică etape distincte și ușorde reprodus, 7 asigurând același nivel de control și prin transpunerea la scară pilot;

- procedeul constituie o metodă optimă pentru obținerea unor nanotransportori lipidici 9 pe bază de ulei din sâmburi de struguri sau ulei de squalenă ce manifestă proprietăți antioxidante și antibacteriene amplificate; 11

- particulele lipidice îmbogățite cu β-caroten obținute prin procedeul propus pot fi utilizate sub ambele forme - ca dispersii apoase, pentru dezvoltarea de alimente funcționale, 13 sau sub formă de produs solid, pentru dezvoltarea unor formulări farmaceutice ce prezintă proprietăți specifice. 15

Procedeul conform invenției constă în aceea că se formează inițial o pre-emulsie lipidică ce conține 10% amestec lipidic și 3...3,5% amestec de surfactanți, la o temperatură 17 de 85°C, prin contactarea sub agitare magnetică a două faze, o fază lipidică ce conține monostearat de gliceril/palmitat de cetikulei din sâmburi de strugure sau ulei de squalenă 19 într-un raport de greutate = 1,16:1,16:1 și o fază apoasă ce conține derivat monoalchilpolioxietilensorbitan:lecitină:copolimer polietilengiicol-polipropilenglicol într-un raport de 21 greutate - 1:0,25:0,25, cu mențiunea că faza apoasă a fost supusă înainte de contactare unei omogenizări cu grad înalt de forfecare, la 15000 rpm, timp de 2 min; pre-emulsia 23 formată este menținută ia un regim de temperatură constant de 85°C, timp de 2 h, după care este supusă unei energii mecanice externe prin aplicarea unei omogenizări cu grad înalt de 25 forfecare de 25000 rpm, timp de 10 min, urmată de răcirea ușoară, sub agitare magnetică, la temperatura camerei, și ulterior supunerea la un proces de liofilizare la -55°C timp de 72 h, 27 conduce la obținerea de nanoparticule lipidice stabile din punct de vedere fizic, cu diametre medii de ordinul zecilor de nanometri și valori ale potențialului electrocinetic puternic 29 electronegative, ce manifestă proprietăți antioxidante și antibacteriene amplificate.

în cazul prezentei invenții, pentru observarea efectului și tipului de matrice lipidică 31 asupra obținerii unor nanoparticule lipidice ce manifestă activitate antioxidantă, respectiv pentru analiza gradului de încărcare a acestora cu β-caroten, s-au utilizat două tipuri de 33 matrici:

a. Nanomatrici lipidice libere (fără conținut de component activ), formate prin 35 combinarea a două lipide solide bio-compatibile (palmitat de cetii și monostearat de gliceril), cu un amestec de ulei vegetal complex (ulei din sâmburi de strugure), respectiv un ulei izolat 37 din ficat de rechin (squalenă).

b. Nanomatrici lipidice îmbogățite cu concentrații variabile de componentă hidrofobă 39 bio-activă (β-caroten), formate prin combinarea acelorași lipide solide bio-compatibile cu lipidele lichide naturale, acestea jucând rolul de transportor lipidic nanostructurat (NLC) 41 pentru β-caroten.

Etapele de obținere a nanomatricei lipidice, îmbogățită cu o componentă hidrofobă 43 bio-activă, sunt:

- formarea unei topituri lipidice^ prin utilizarea de lipide solide și lichide diferite 45 structural (monostearat de gliceril, palmitat de cetii și ulei din sâmburi de struguri sau ulei de squalenă); 47

- adăugarea în topitura lipidică a unor concentrații cuprinse între 0,05...0,20% β-caroten. 49

RO 128703 Β1

Se dau, în continuare, trei exemple de realizare a procedeului conform invenției, în legătură cu tabelul și figurile care reprezintă:

-în tabel, compoziția și caracterizarea fizico-chimică a probelor de β-caroten - NLCs;

- fig. 1, distribuția dimensiunii particulelor lipidice de tip β-caroten - NLG preparate cu diferite tipuri de surfactanți și concentrații de β-caroten;

- fig, 2, evaluarea stabilității probelor de β-caroten - NLCs pe baza potențialului electrocinetic;

- fig. 3, microscopia electronică de transmisie pentru probele de β-caroten - NLCs preparate cu ulei din sâmburi de struguri (stânga) și ulei de squalenă (dreapta);

- fig. 4, curbele DSC pentru β-caroten - NLCs, în comparație cu NLCs libere și amestecul fizic de lipide: a. NLCs preparate cu squalenă, b. și c. NLCs preparate cu ulei din sâmburi de strugure;

- fig. 5, spectrele de absorbție UV-Vis a β-caroten - NLCs preparate cu squalenă (A) și ulei din sâmburi de strugure (B), cu ambele tipuri de surfactanți și o concentrație inițială de 0,20% β-caroten: (a) caroten pur; (b) NLC liber; (c) β-caroten - NLCs;

- fig. 6, determinarea in vitro a proprietăților antioxidante, a probelor de β-caroten NLCs, în funcție de concentrația de caroten, tipul de ulei natural folosit și surfactant neionic principal: a. NLCs preparate cu ulei de squalenă; b. NLCs preparate cu ulei din sâmburi de strugure;

- fig, 7, activitatea antibacteriană manifestată de probele de β-caroten - NLCs determinată împotriva creșterii bacteriei de E. Coli,

Exemplul 1

Se formează o fază lipidică prin topirea la o temperatura de 82.. ,85°C a unui amestec de monostearatdeglicerikpalmitat de cetii:ulei din sâmburi de strugure sau ulei de squalenă, într-un raport de greutate de 1,16:1,16:1. Separat, se formează o fază apoasă compusă dintr-un amestec de surfactanți, neionic și ionic, și un co-surfactant, într-un raport de greutate derivat monoalchil-polioxietilensorbitan:lecitină:copolimer polietilenglicol-polipropilenglicol de 1:0,25:0,25 și la o temperatură de 85°C. Cele două faze, apoasă și lipidică, se mențin % h la un regim de temperatură de 82,..85°C, după care faza apoasă se supune unui proces de omogenizare cu grad înalt de forfecare, la 15000 rpm, timp de 2 min. Se formează o preemulsie lipidică prin contactarea celor două faze, sub agitare magnetică și la o temperatură de 82,.85°C, după care se menține la regim de temperatură constant, timp de 2 h. Preemulsia fierbinte rezultată se supune ulterior unei energii mecanice externe prin omogenizare cu grad înalt de forfecare, aplicând 25000 rpm timp de 10 min, după care se lasă să se răcească lent la temperatura camerei cu formarea unei dispersii de nanoparticule lipidice libere - NLCs (fără conținut de componentă activă). Pentru eliminarea excesului de apă și obținerea nanoparticulelor lipidice în formă solidă, dispersiile de NLCs sunt inițial congelate la -25°C timp de 24 h, după care se supun unui proces de IiofiUzare -55°C, pentru o perioadă de 72 h.

Exemplul 2

Similar exemplului 1, cu deosebirea că se adaugă în faza lipidică încălzită la 85°C diferite cantități de β-caroten, ce corespund unor concentrații de 0,05...0,20% în dispersia de NLC obținută conform procedeului descris anterior, cu formarea unei soluții limpede de topitură lipidică, Topitura lipidică se menține la 85°C timp de 5 min pentru a se asigura o bună dispersare a componentei active, după care are loc contactarea celor două faze, apoasă și lipidică. Etapele ulterioare corespund celor descrise în cadrul exemplului 1, cu obținerea unor dispersii de nanoparticule lipidice încărcate cu β-caroten pe bază de ulei din sâmburi de strugure și, în final, a nanoparticulelor lipidice în formă solidă. Compoziția fiecărei formulări de NLC este prezentată în tabel.

RO 128703 Β1

Compoziția și caracterizarea fizico-chimică a caroten - NLCs

Proba*	Compoziția dispersiilor de NLC	Zav [nm] ± SDS	PDI ± SDS	ț [mV]± SDS
Caroten, %	Surfactant principal
Caroten - NLC 1	0,05	2,5% Tween 20	85,7 ± 2,136	0,184 ± 0,004	-39,8 ± 0,557
Caroten - NLC 2	0,07	2,5% Tween 20	85,2 ± 1,677	0,190 ± 0,017	-37,6 ± 0,368
Caroten - NLC 3	0,20	2,5% Tween 20	90,0 ± 1,320	0,198 ± 0,013	-29,3 ± 0,458
Caroten - NLC 4	0,05	2% Tween 80	108,4 ± 3,119	0,238 ± 0,009	-30,2 ±1,112
Caroten - NLC 5	0,07	2% Tween 80	111,0 ± 3,751	0,245 ± 0,010	-29,9 ± 0,404
Caroten - NLC 6	0,20	2% Tween 80	117,2 ± 2,818	0,335 ± 0,041	-22,4 ± 0,503
Caroten - NLC 7	0,05	2,5% Tween 20	94,0 ± 0,404	0,180 ±0,090	-40,4 ± 0,520
Caroten - NLC 8	0,07	2,5% Tween 20	89,2 ± 1,604	0,191 ±0,010	-41,0 ± 0,061
Caroten - NLC 9	0,20	2,5% Tween 20	100,3 ± 1,601	0,224 ± 0,013	-36,8 ± 0,208
Caroteri-NLC 10	0,05	2% Tween 80	100,4 ±3,037	0,210 ±0,017	-37,5 ±1,300
Caroteri-NLC 11	0,07	2% Tween 80	115,5 + 2,113	0,230 ±0,003	-39,2 ± 0,529
Caroteri-NLC 12	0,20	2% Tween 80	129,2+2,335	0,237 ± 0,016	-40,5 ± 0,850

* probele caroten - NLC 1...6.sunt preparate cu ulei din sâmburi de struguri, iar probele caroten - NLC 7...12 sunt preparate cu 19 ulei de squalenă.

Exemplul 3

Similar exemplului 2, cu deosebirea că uleiul natural de origine vegetală este înlocuit 23 cu un ulei de origine animală (ulei din ficatul de rechin-squaienă), cu obținerea unor dispersii de nanoparticule lipidice încărcate cu β-caroten pe bază de ulei de squalenă și, în final, a 25 nanoparticulelor lipidice în formă solidă.

Distribuția mărimii și stabilitatea fizică a nanoparticulelor lipidice încărcate cu β- 27 caroten. Evaluarea distribuției dimensiunii nanoparticulelor lipidice și stabilitatea acestora s-a realizat în sistemele optimizate de tip Tween 20 sau 80/lecitină/copolimer bloc, în funcție de 29 concentrațiile de β-caroten încapsulate și tipul de ulei natural folosit la formarea matricei lipidice. Rezultatele obținute au semnalat faptul că nanoparticulele lipidice încărcate cu 31 diferite concentrații de β-caroten (β-caroten - NLCs) prezintă o distribuție de dimensiune relativ îngustă (fig. 1) și o stabilitate excelentă a particulelor lipidice aflate în suspensie 33 apoasă, reflectată prin valorile potențialului electrocinetic (fig. 2). Fig. 1 exemplifică distribuția dimensiunii particulelor a câtorva nanodispersii de β-caroten - NLCs preparate cu ulei din 35 sâmburi de struguri (GSO) și, respectiv, ulei de squalenă (Sq), iar în tabel sunt prezentate caracteristicile tuturor probelor de NLC încărcate cu componenta activă. în general, uleiul din 37 semințe de struguri duce la nanoparticule lipidice mai mici, comparativ cu cele preparate prin utilizarea Sq. Rezultatele obținute în urma analizei DLS au evidențiat prezența unor distribuții 39 monomodale a dimensiunii particulelor pentru majoritatea probelor de β-caroten NLCs, cu diametre medii în jurul valorii de o sută de nanOmetri (fig. 2). 41 în cazul folosirii amestecului de surfactanți ce utilizează Tween 20 drept surfactant neionic principal, pentru ambele tipuri de uleiuri naturale nu au existat diferențe semnificative 43 între diametrele medii ale nanoparticulelor lipide, comparativ ou sistemul Tween 80/Lecitină/copolimer bolc care au arătat o ușoară creștere a Z_av pe măsură ce concentrația 45

RO 128703 Β1 de β-căroten a crescut de la 0,05 la 0,20%. Cele mai mici nanoparticule Iipidice au fost obținute pentru primul sistem și o concentrație inițială de 0,07% caroten (Z_av = 85,2 ± ± 1,677 nm pentru GSO și Z_av = 89,2 ± 1,604 nm pentru Sq), cu un indice de polidispersitate mai mic de 0,19, ceea ce indică prezența particulelor monodisperse. Analiza TEM (fig. 3) confirmă prezența nanoparticulelor monodisperse obținute pe baza uleiului din sâmburi de struguri. Probele de β-caroten - NLCs preparate cu Tween 80 ca surfactant neionic principal au prezentat diametre medii mai mari de 100 nm, cu valori ale indicelui de polidispersitate relativ ridicate (Pdl: 0,24...0,33 pentru cazul GSO și 0,21...0,24 pentru Sq). Nanodispersia preparată cu 0,20% caroten și ulei de squalenă a prezentat cea mai mare valoare a diametrului mediu, de 129,2 nm, și o polidispersitate de 0,239.

Evaluarea stabilității sistemelor caroten - NLCs. Analiza stabilității nanodispersiilor lipidice, determinată pe baza valorilor potențialului electrocinetic, a relevat faptul că aproape toate probele de β-caroten - NLCs prezintă o stabilitate fizică excelentă, cu valori medii ale ξ mai electronegative de 30 mV (tabel). în fig. 2 este reprezentată distribuția valorilor potențialului zeta pentru câteva probe reprezentative.

în cazul probelor de β-caroten - NLCs preparate cu Sq, nu au fost semnalate modificări distincte ale potențialelor zeta (valori ce se situează la ~ -40 mV, tabel și fig. 2), în timp ce probele preparate cu ulei din sâmburi de strugure prezintă o creștere a ξ pe măsură ce concentrația de β-caroten a crescut (exemplu: -39,8 mV pentru o concentrație de 0,05% și -26,3 mV pentru o concentrație de 0,20%, în cazul în care s-a folosit sistemul Tween 20/Lecitină/Sinperonic F68; respectiv de -30,2 mV pentru o concentrație de 0,05% și -22,4 mV pentru o concentrație de 0,20%, caz în care a fost folosit sistemul Tween 80/Lecitina/Sinperonic F68), ceea ce evidențiază o scădere ușoară a stabilității fizice a sistemelor analizate. Cu toate acestea, valorile mai electronegative de -25 mV demonstrează faptul că aproape toate dispersiile NLCs obținute prin folosirea celor două uleiuri naturale și un procedeu modificat de omogenizare cu grad înalt de forfecare sunt sisteme stabile din punct de vedere fizic.

Este de remarcat faptul că nu există o corelație directă între dimensiunea nanoparticulelor lipidice și proprietățile antioxidante ale probelor de β-caroten - NLCs, în timp ce, dacă observăm stabilitatea fizică a dispersiilor preparate cu 0,20% caroten și GSO, valoarea a crescut de până la -22 mV (care sugerează o scădere moderată a stabilității în timp) ce ar putea fi asociată cu scăderea activității antioxidante până la 80% (fig. 6). în plus, această presupunere este de asemenea susținută de analiza comparativă prin calorimetrie de scanare diferențială, care a arătat că nanoparticulele preparate cu GSO și o concentrație de 0,20% caroten au suferit o rearanjare a rețelei lipidice, fapt ce a condus la o rețea mai ordonată și, ca rezultat, la o expulzare potențială a substanței active.

Caracterizarea morfologică. O imagine TEM reprezentativă a nanoparticulelor lipidice obținute plecând de la o concentrație de 0,07% β-caroten, în sistemul Tween 20/Lecitină/ Sinperonic F68 și ambele tipuri de uleiuri naturale este prezentată în fig. 3. Se poate observa că indiferent de tipul de ulei natural utilizat, particulele au o formă sferică, cu o dimensiune mai mică de 100 nm (fig. 3). Acest ultim aspect subliniază o structură cristalină a fazei lipidice mai puțin ordonată (forma a de cristalizare), deoarece o structură ordonată (forma β) este caracteristică unor cristale de formă alungită. Prevenirea conformației β este de dorit, deoarece acesta este asociată cu expulzarea componentei active încapsulate. Această observație este de asemenea confirmată de analiza DSC.

Efectele tipului de ulei natural și a prezenței β-carotenului asupra cristalinității lipidelor. Beneficiile nanoparticulelor lipidice solide, cum ar fi, de exemplu, stabilitatea fizică și chimică a acestora, reies în principal pornind de la starea solidă a particulelor.

RO 128703 Β1

După cristalizare, particulele pot suferi diferite tranziții polimorfe, Care sunt în principal un 1 rezultat al tipului de constituenți lipidiei. Componenții matricei lipidice determină tipurile de modificări cristaline care se pot forma. Structura cristalină lipidică este în general corelată 3 cu capacitatea de încărcare cu substanță activă și cu comportarea la eliberare a acesteia. Structurile lipidice amorfe furnizează o capacitate de încărcare superioară față de structurile 5 cristaline. Pe măsură ce nanoparticulele lipidice trec de la o stare solidă mai puțin ordonată la una ordonată, apare fenomenul nedorit de eliberare bruscă a componentei active, în 7 detrimentul unei eliberări controlate a acesteia. Prin urmare, este esențială verificarea stării lipidice solide și a polimorfismului nanoparticulelor lipidice. 9

Evaluarea structurii cristaline a probelor de β-caroten - NLCs a fost realizată pe baza calorimetriei de scanare diferențială (DSC). Probele de NLCs încărcate cu β-caroten și 11 preparate cu cele două tipuri de uleiuri naturale au prezentat un comportament endoterm similar (într-un domeniu de temperatură apropiat), ceea ce indică faptul că tipul de ulei 13 natural nu a condus la modificări semnificative ale rețelei lipidice (fig. 4). în intervalul 30.,.100°C, s-a observat prezența unui vârf endoterm principai(îa 54...60°C) și a unui umăr 15 (la 62 ,.64°Q, primul fiind atribuit în principal lipidelor solide de palmitat de cetii și monostearat de gliceril, în timp ce umărul este rezultatul prezenței uleiului din sâmburi de 17 struguri sau a uleiului de squalenă. Curba endotermă la temperaturi < 65°C sugerează prezența unor faze cristaline lipidice diferite și mai puțin ordonate. Acest comportament era 19 de așteptat, datorită amestecului de lipide complexe folosit la prepararea matricei transportor. Acest lucru reprezintă un avantaj, având în vedere că obținerea unei structuri 21 cristaline ordonate este puțin probabilă ca urmare a numărului crescut de componente lipidice și a heterogenității chimice a acestora. 23

Prin compararea curbelor DSC ale probelor de NLCs încărcate cu β-caroten, a NLCs libere și a amestecurilor fizice de lipide (fig. 4), se pot face următoarele afirmații: 25

Prezența agenților tensioactivi conferă rețelei lipidice un aranjament ordonat, după cum se poate observa prin îngustarea domeniului de topire în cazul probelor de NLCs comparativ 27 eu amestecurile fizice de lipide solide și lichide.

Temperaturile de topire ale probelor de NLCs încărcate cu caroten au fost deplasate 29 cu 1...3°C față de cele ale NLCs libere, ceea ce indică o perturbare a matricei lipidice și o ușoară creștere a dimensiunii particulelor. Mai mult decât atât, prin compararea NLCs 31 Încărcate cu cele libere, s-a observat că încorporarea β-carotenului în matricea lipidică solidă a condus la o scădere a aranjamentul cristalin, subliniată și de scăderea intensității picului 33 endoterm.

Deplasarea temperaturii completată de scăderea intensității picului endoterm este o 35 indicație clară a efectului compusului activ asupra agregării fazei lipidice. Carotenul încapsulat, chiar și într-o concentrație foarte mică, poate afecta modul de cristalizare a rețelei 37 lipidice. Efectul concentrațiilor de β-caroten încapsulat în nanoparticulele lipidice asupra cristaîinității fazei lipidice este prezentat în fig. 4b. Pe măsură ce concentrația de caroten 39 crește de la 0,05 la 0,07%, curbele DSC adoptă un aranjament cristalin mai puțin ordonat.

Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că un comportament diferit a fost observat pentru 41 NLCs încărcate cu 0,20% β-caroten, preparate cu ulei din sâmburi de struguri și Tween 80 ca surfactant principal (caroten - NLC 6). Creșterea intensității picului endoterm localizat la 43 56,7°C (fig. 4c), comparativ cu NLC liber este o indicație a faptului că miezul lipidic a suferit o rearanjare a rețelei cristaline, ceea ce înseamnă că a avut loc o tranziție în matricea 45 lipidică, de la o rețea mai puțin ordonată la una mai ordonată. Acest aspect a fost confirmat și de scăderea capacității antioxidante pentru aceste probe, ca urmare a unei potențiale 47 expulzări a β-carotenului (fig. 6).

RO 128703 Β1

Spectroscopia UV-VIS. β-carotenul este un pigment care absoarbe puternic în regiunea vizibilă (400...500 nm). Drept urmare, înregistrarea spectrelor UV-VIS reprezintă o dovadă clară a prezenței β-carotenului în nanoparticulele lipidice preparate cu cele două uleiuri naturale. Stabilitatea β-carotenului este o condiție esențială în vederea menținerii proprietăților sale.

Stabilitatea β-carotenului la oxidare depinde de forma sa și poate fi crescută prin încapsulare. Pentru observarea prezenței acestuia, precum și a stabilității lui după încapsulare, au fost comparate spectrele UV-Vis ale probelor de β-caroten - NLCs, NLClibere, precum și ale carotenului pur. β-carotenul nativ prezintă două picuri majore la 464 nm și 492 nm, responsabile pentru culoarea lui, portocaiiu-roșiatic, în timp ce NLC liber-prezintă numai picuri de absorbție în domeniul NI R, caracteristice grupărilor OH libere și asociate din amestecurile lipidice și de surfactanți (fig. 5). Prin investigarea spectrelor de absorbție UV-VIS în intervalul 350...550 nm a probelor de β-caroten - NLCs se poate observa că în ambele tipuri de NLC preparate cu Sq sau GSO, absorbțiile sunt în general similare și prezintă două domenii de absorbție. în primul domeniu de absorbție, picurile specifice carotenului pur sunt întâlnite în probele de β-caroten - N LCs sub forma unei benzi puternice largi, situate între 450...500 nm. în cel de-al doilea domeniu de absorbție, apariția unui umăr Situat la aproximativ 530 nm (care nu a fost observatîn spectrul β-carotenului nativ), ar putea fi asociat structurii supramoleculare adoptate de caroten. Conform unor cercetări recente, există doi parametri majori care afectează spectrele UV-VIS (Auweter et al., 1999): dimensiunea particulelor și tipul de agregare a moleculelor supramoleculare de β-caroten. Datorită hidrofobieității sale ridicate, chiar și în mediu lipopfil, doar o mică proporție de caroten rămâne în formă monomeră. Auweter și colab au identificat două agregate într-un studiu realizat asupra nanoparticulelor de β-caroten, ca o consecință a dimensiunii diferite a particulelor: agregat-H, cu o dimensiune medie de 150 nm și agregat-J, cu o dimensiune medie de 250 nm. Aceste aspecte menționate în literatură sunt confirmate și de rezultatele analizelor DLS și UV-VIS realizate în acest studiu.

Apariția umărului la 530 nm, care a fost observată în toate probele de β-caroten NLCs, este caracteristică unei absorbții a β-carotenului ce se află într-o stare de tip triplet triplet (Dad et al., 2005). Mai mult, un studiu realizat de Hoang et al. asupra stabilității și structurii supramoleculare a β-carotenului, prin încapsulare în nanoparficule de acid polilactic, a demonstrat faptul că formarea unor compuși pro-oxidanți nedoriți este redusă atunci când β-carotenul se află într-o stare de excitate triplet, care este caracterizată prin apariția unui pic de absorbție la 520 nm (Cao-Hoang, 2011). Această ultimă afirmație, cu privire la evitarea formării compușilor pro-oxidanți a fost de asemenea confirmată de rezultatele obținute în acest studiu, prin analiza chemiluminescenței.

Determinarea in vitro a activității antioxidante a β-caroten - NLCs. Efectele benefice ale β-carotenului asupra sănătății sunt recunoscute, însă mai puțin cunoscut este faptul că β-carotenul are proprietăți antioxidante controversate, deoarece el poate acționa și ca un pro-oxidant din cauza sensibilității sale precare, ce are ca rezultat direct formarea produșilor de oxidare. Acest efect nefavorabil cu rezultate neașteptate, de exemplu, un risc mai mare de cancer pulmonar a fost dovedit de către Palozza și colab. (2003). Prin urmare, această parte de studiu are drept scop investigarea activității antioxidante a probelor de β-caroten NLCs în funcție de concentrația de β-caroten și tipul de ulei natural folosit la formarea nanomatricei lipidice.

Evaluarea proprietăților antioxidante a probelor de β-caroten - NLCs a fost realizată prin metoda chemiluminescenței, care este o tehnică adecvată de măsurare a radicalilor liberi oxigenați. în scop comparativ, probele de NLCs încărcate cu β-caroten, soluțiile de caroten nativ, precum și NLCs liberi au fost expuse la un sistem generator de radicali liberi care eliberează radicali intermediari liberi cu un bogat conținut energetic.

RO 128703 Β1 în toate probele testate, activitatea antioxidantă (AA%) a p-caroten - NLCs a fost 1 amplificată în comparație cu cea a carotenului pur (fig. 6), cea mai mare diferența fiind observată la concentrații mici de β-caroten (3,4 μΜ). De exemplu, pornind de la o activitate 3 antioxidantă slabă a soluției de 3,4 μΜ caroten nativ (AA = 29,1% ± 1,42), la o activitate antioxidantă moderată în cazul NLCs preparate cu ulei de squaîenă (69% ± 3,43 pentru 5 sistemul Tween 20/Lecitină/Șinperonic F 68, respectiv de 64,4% ± 0,37 pentru Tween 80/Lecitină/ Sinperonic F 68), se ajunge la o capacitate de a capta radicalii liberi de 87,2% 7 ± 0,21 și, respectiv, 92,8% ± 0,20 (fig. 6), atunci când se utilizează uleiul din sâmburi de struguri, 9

Prin creșterea concentrațiilor de β-caroten, s-a observat o intensificare a activității antioxidante a probelor de β-caroten - NLCs pentru ambele tipuri de uleiuri naturale și 11 amestecuri de surfaetanți, NLC-urile obținute au capacitatea de a capta între 64..,82% radicalii liberi oxigenați formați în sistemul de chemiluminescență (pentru probele de 13 β-caroten-NLCs obținute cu ulei de squaîenă) și, respectiv, între 87...95% (în cazul probelor de β-caroten - NLCs preparate cu ulei din sâmburi de struguri). Există o excepție în căzui 15 uleiului din sâmburi de struguri, unde la o concentrație maximă de 15 μΜ caroten încapsulat are loc o scădere a capacității AA%. La această concentrație, probele de β-caroten - NLCs 17 au prezentat cele mai mici valori ale activității antioxidante (82,4% ± 0,38 pentru amestecul tensioactiv prima, și 80,3% ± 0,33 pentru a doua). Așa cum a fost observat anterior, această 19 scăderea AA% poate fi rezultatul unei expulzări a β-carotenului datorate unei rearanjări în timp a rețelei lipidice, respectiv formării unei rețele mai ordonate. 21

Există doar o mică diferență între AA% a probelor de β-caroten - NLCs preparate cu cele două tipuri de amestec de surfaetanți (valabilă pentru ambele uleiuri naturale). De 23 asemenea, nu a existat o diferență semnificativă în activitatea antioxidantă a probelor de β-caroten - NLCs preparate cu ulei din sâmburi de struguri ce conțin între 3,4...7,5 μΜ 25 caroten. Cu toate acestea, capacitatea de a capta radicalii liberi este mai mare în cazul uleiului din sâmburi de struguri decâtîn cazul uleiului de squaîenă. Valorile mai mici ale AA% 27 întâlnite în cazul utilizării Sq, comparativ cu GSO, ar putea fi rezultatul unei activități antioxidante proprii GSO, dar și unui aranjament mai bun al carotenului în matricea lipidică 29 formată cu GSO decât cu Sq, fiind posibilă apariția unui efect de împiedicare sferică datorită faptului că Sq este o triterpenă cu lanț lung. 31

Nanoparticulele lipidice preparate cu GSO și Tween 80 ca agent tensioactiv principal au prezentat cea mai mare activitate antioxidantă împotriva radicalilor liberi oxigenați, 33 prezentând o amplificare cu 35% pentru probele cu 5,4 μΜ caroten (AA = 93% ± 0,86, comparativ cu 60 ± 0,33 pentru carotenul nativ) și cu 30% pentru 7,5 μΜ caroten (AA% = 35 = 94,6 ± 0,27, comparativ cu 67 ± 0,49 pentru carotenul nativ).

O primă explicație pentru comportamentul antioxidant manifestat de probele de 37 β-caroten - NLCs a fost inițial asociată dimensiunii și efectului de încapsulare a carotenului, dar având în vedere proprietățile antioxidante cunoscute ale celor două uleiuri naturale 39 selectate, activitatea antioxidantă a NLCs libere trebuie să fie, de asemenea, luată în considerare. Astfel, a fost determinată AA% și pentru probele de nanoparticule lipidice 41 neîncărcate cu substanță activă: AA% = 67,3 ± 2,06 și 63,8 ± 1,63 (pentru NLC-libere preparate cu Sq și Tween 20, respectiv Tween 80); AA% = 76,9 ± 2,63 și 73,7 + 0,62 (pentru 43 NLC preparate cu GSO și ambele sisteme de agenți tensioactivi). Valorile relativ ridicate ale activității antioxidante manifestate de NLCs-libere pot fi asociate cu ideea că ambele tipuri 45 de nanomatrici lipidice au potențialul de a capta radicalii liberi oxigenați și de a dezvolta o acțiune de blocare a reacțiilor în lanț. Această ultimă afirmație este susținută și de literatura 47 de specialitate, care menționează faptul că un acid gras saturat, cum ar fi acidul palmitic, prezintă o activitate antioxidantăscăzută, cu o reducere a speciilor de radicali liberi de 15,2% 49 (Nieman etal, 1995).

RO 128703 Β1

Având în vedere toate aceste aspecte, capacitatea antioxldantâ a probelor de β-caroten - NLCs poate fi asociată unui efeet combinat:

- efectul dimensiunii β-carotenuluui încapsulat, în combinație cu folosirea unor uleiuri naturale antioxidante care împiedică oxidarea acestuia;

- performanța matricei lipidice complexe, ceea ce înseamnă apariția unui efect sinergie între componentele lipidice. Acizii grași din uleiul din sâmburi de struguri poate acționa în sinergie, afectând astfel activitatea antioxidantâ totală a NLCs obținute. Capacitatea de a capta radicalii liberi a compușilor din GSE este mai mare decât cea a altor antioxidanți individuali, deoarece există multe grupări disponibile pentru a neutraliza radicalii liberi.

Oricare arfi factorul-cheie careduce la efectul de amplificare a activității antioxidante, cel mai important aspect rămâne capacitatea ridicată a probelor de β-caroten - NLCs, pe bază de ulei din sâmburi de strugure, de a capta peste 93% din radicalii liberi formați în sistemul de chemiluminescență.

Activitatea antimicrobiană, Uleiurile naturale pot reprezenta o sursă bogată de agenți antimicrobieni. Astfel, probele de β-caroten- NLCs au fost testate pentru capacitatea lor de a dezvolta activitate antimicrobiană împotriva unei bacterii de Escherichia coli, care reprezintă un indicator de contaminare a produselor alimentelor. Toate probele de caroten NLCs testate au fost rezistente la bacteria E. Coli. Mai mult decât atât, în unele cazuri acestea dezvoltă o zonă de inhibiție eficientă împotriva creșterii bacteriene.

investigațiile realizate au arătat o variație semnificativă în activitatea antibacteriană a β-caroten - NLCs care variază, în principal, în funcție de uleiul natural utilizat și concentrația de β-caroten. Probele de β-caroten - NLCs preparate cu ulei din semințe de struguri au prezentat o activitate antibacteriană mai bună împotriva bacteriei testate, în ceea ce privește zona de inhibiție, în comparație cu cele pe bază de squalenă (fig. 7), demonstrând astfel că plantele sunt agenți antibacterieni mai buni decât alți compuși sintetici.

Printre probele de β-caroten - NLCs preparate cu ulei din sâmburi de struguri, sistemul de surfactanți Tween 20/Lecitină/F 68 a prezentat cea mai bună activitate antibacteriană, inhibând tulpina de E. Coli la o concentrație de 0,50 mM caroten (5 mm rază medie de inhibiție), urmată de NLG care conține 1 mM caroten (cu o rază de inhibare de 4 mm). Scăderea activității antimicrobiene pentru probe preparate cu 1 mM caroten și ulei de struguri este justificată de asemenea prin pierderea de β-caroten confirmată în analizele anterioare.

Probele de β-caroten - NLCs preparate în sistemul Tween 80/Lecithin/F 68 pe bază de ulei de struguri și o concentrație de 0,50 mM caroten prezintă de asemenea o activitate antibacteriană semnificativă, cu o zonă de inhibare de 4 mm. O activitate moderată față de dezvoltarea bacteriei a fost găsită pentru NLC încărcate cu 0,35 mM și 1 mM caroten, cu o rază de inhibare de 3 mm. în cazul sistemelor de N LCs preparate pe bază de squalenă, doar o concentrație de 1 mM caroten, conduce la obținerea unei activități antibacteriene semnificative. Raza de inhibiție în aceste cazuri a fost de 5 mm în cazul utilizării sistemului de surfactanți Tween 80/Lecitină/ Sinperonic F68 și 4 mm pentru NLC preparate cu Tween 20 ca surfactant neionic principal. O concentrație mai mică de caroten nu a demonstrat o îmbunătățire a activității antibacteriene (fig. 7).

Nanotranșportorii lipidici încărcați cu β-caroten obținuți prin procedeul propus pot fi utilizați la prepararea de formulări farmaceutice pentru prevenirea patologiilor vasculare în virtutea capacității acestora de a capta până la 94% din radicalii liberi oxigenați formați în urma unor reacții de degradare.

Claims (11)

1. Procedeu de obținere a unor nanoparticule Iipidice antioxidante pe bază de uleiuri 3 naturale, libere și îmbogățite cu component bio-activ, caracterizat prin aceea că va cuprinde: 5

a. formarea unei pre-emulsii lipidice libere și îmbogățite cu componentă activă hidrofobă (β-caroten), obținute prin contactarea, sub agitare magnetică, a unei faze apoase 7 și a unei faze lipidice, ia o temperatura de 82.,,85°C, și menținere la regim de temperatură constantă, timp de 2 h; 9

b. obținerea unor dispersii apoase de nanotransportori lipidici liberi și încărcați cu βcaroten, prin supunerea pre-emuisiei lipidice unui proces de omogenizare cu grad înalt de 11 forfecare, la 25000 rpm, timp de 10 min, urmată de răcirea ușoară, sub agitare magnetică, la temperatura camerei; 13

c. obținerea de nanotransportori lipidici în formă solidă prin supunerea nancdispersiilor apoase unui proces de liofilizare, la -55°C timp de 72 h. 15

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că faza lipidică este formată dintr-un amestec de lipide solide și lichide naturale de mcnostearat de 17 glicerikpalmitat de cetikulei din sâmburi de strugure, într-un raport de greutate de

1,16:1,16:1, la o temperatură de 82. ,85°C. 19

3. Procedeu conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că, în loc de uleiul din sâmburi de struguri, se folosește ulei de squalenă. 21

4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că faza apoasă este formată dintr-un amestec de surfactanți, neionic și ionie, și un co-surfactant, într-un raport 23 de greutate derivat monoalchil-polioxietilensorbitan:lecitina:copolimer polietilenglicol-polipropilenglicol de 1:0,25:0,25 și la o temperatură de 85°C. 25

5. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările 1 și 4, caracterizai prin aceea că, înainte de contactare cu faza lipidică, faza apoasă se supune unui proces de omogenizare 27 cu grad înalt de forfecare, la 25000 rpm, timp de 2 min,

6. Procedeu conform oricăreia dintre revendicările de la 1 la 5, caracterizat prin 29 aceea că pre-emulsia lipidică conține 10% amestec lipidic, 3...3,5% amestec de surfactanți și 0...0,20% componentă activă de natură hidrofobă (β-caroten). 31

7. Nanoparticule lipidice încărcate cu β-caroten obținute pe bază de uleiuri naturale și având proprietăți antioxidante și antibacteriene, obținute prin procedeul definit în oricare 33 din revendicările de la 1 la 6, caracterizate prin aceea că acestea cuprind:

- 22,13.. .21,82% ulei din sâmburi de struguri sau ulei de squaienă dintr-o matrice înalt 35 dezordonată, formată prin utilizarea unui amestec complex de lipide solide și lichide;

- 0,37...1,47% β-caroten încapsulat în rețeaua lipidică astfel formată, procentele fiind 37 exprimate în greutate.

8. Nanoparticule lipidice conform revendicării 7 obținute prin procedeul definit în 39 oricare din revendicările de la 1 la 6, caracterizate prin aceea că sunt de formă sferică și au un diametru mediu cuprins între 85,2... 117,2 nm, în cazul utilizării uleiului din sâmburi de 41 struguri și între 89,2...129,2 nm în cazul utilizării uleiului de squalenă.

9. Nanoparticule lipidice conform revendicărilor 7 și 8 obținute prin procedeul definit 43 în oricare din revendicările de la 1 la 6, caracterizate prin aceea că prezintă o polidispersitate ce variază între 0,184.,.0,335, în cazul utilizării uleiului din sâmburi de struguri și 45 între 0,180...0,237 în cazul utilizării uleiului de squalenă.

10. Nanoparticule lipidice conform revendicării 7 obținute prin procedeul definit în 47 oricare din revendicările de la 1 la 6, caracterizate prin aceea că prezintă valori ale potențialului electrocinetic ce variază între -22,4...39,8 mV, în cazul utilizării uleiului din 49 sâmburi de struguri și între-36,8..,41,0 în cazul utilizării uleiului de squalenă.

11. Nanoparticule lipidice conform revendicării 7 obținute prin procedeul definit în 51 oricare din revendicările de la 1 la 6, caracterizate prin aceea că au abilitatea de a capta între64...82% din radicalii liberi oxigenați formați în sistemul de chemiluminescențâ, în cazul 53 utilizării uleiului din sâmburi de struguri și, respectiv, între 87 .,95%, în cazul utilizării uleiului de squalenă. 55