RO125232B1 - METODĂ PENTRU DETERMINAREA CONCENTRAȚIILOR DE METANOL Șl ETANOL DIN AMESTECURI FĂRĂ SEPARAREA ANALITILOR - Google Patents
METODĂ PENTRU DETERMINAREA CONCENTRAȚIILOR DE METANOL Șl ETANOL DIN AMESTECURI FĂRĂ SEPARAREA ANALITILOR Download PDFInfo
- Publication number
- RO125232B1 RO125232B1 ROA200800696A RO200800696A RO125232B1 RO 125232 B1 RO125232 B1 RO 125232B1 RO A200800696 A ROA200800696 A RO A200800696A RO 200800696 A RO200800696 A RO 200800696A RO 125232 B1 RO125232 B1 RO 125232B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- methanol
- ethanol
- aox
- biosensor
- adh
- Prior art date
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 210
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 207
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title description 5
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 34
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 34
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims description 12
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- YTEJSAFVYHDCSN-UHFFFAOYSA-K zinc;benzo[a]phenoxazin-9-ylidene(dimethyl)azanium;trichloride Chemical group [Cl-].[Cl-].[Cl-].[Zn+2].C1=CC=C2C(N=C3C=CC(C=C3O3)=[N+](C)C)=C3C=CC2=C1 YTEJSAFVYHDCSN-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZYBWTEQKHIADDQ-UHFFFAOYSA-N ethanol;methanol Chemical compound OC.CCO ZYBWTEQKHIADDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 241001557891 Basidiomycota sp. Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 241000123255 Peniophora Species 0.000 description 1
- 241000222393 Phanerochaete chrysosporium Species 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 241001619461 Poria <basidiomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000970 chrono-amperometry Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 description 1
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Invenția se referă la o metodă pentru determinarea concentrațiilor de metanol și etanol din amestecuri fără separarea analiților.
Invenția se referă la o metodă ameliorată pentru determinarea concentrațiilor de metanol și etanol, fiind utilizată, în special, la identificarea băuturilor alcoolice falsificate, produse cu metanol sau amestec metanol+etanol în loc de etanol, prin determinarea metanolului și etanolului, în domeniul de concentrații al amestecurilor: 0,005...0,2 mmol/L metanol și 0,03...0,2 mmol/L etanol.
Sunt cunoscute metode pentru analiza amestecurilor de etanol și metanol utilizând separarea celor doi analiți prin cromatografie de gaze sau lichide, și apoi cuantificarea cu diferiți detectori. Cu toate că metodele cromatografice cunoscute permit o separare a celor doi analiți, și determinarea acestora cu o rezoluție și limită de detecție suficiente, aceste metode sunt complexe prin faptul că determinările trebuie efectuate utilizând aparatură scumpă și sofisticată, aparatele nu sunt portabile, sunt necesari reactivi cu puritate foarte înaltă, iar personalul trebuie să fie bine calificat.
L.V. Shkotova, A. P. Soldatkin, Μ. V. Gonchar, W. Shuhmann, S. V. Dzyadevych, în lucrarea Amperometric biosensor for ethanol detection based on alcohol oxidase immobilised within electrochemically deposited Resydrol film, Materials Science and Engineering C, voi. 26, pp. 411-414, 2006, menționează un biosenzor amperometric utilizat pentru analiza etanolului din băuturi alcoolice, biosenzor bazat pe alcool oxidază (ADX) imobilizată în film de Resydrol depus electrochimie, și pe detectarea peroxidului de hidrogen. ADX a fost izolată și purificată dintr-o tulpină de Hansenula polymorpha.
Recent a fost raportată în literatură (B. Bucur, G.L. Radu, C.N. Toader, “Analysis of methanol-ethanol mixtures from falsified beverages using a dual biosensors amperometric system based on alcohol dehydrogenase and alcohol oxidase”, Eur. Food Res. Technol, voi. 226, pp. 1335-1342, apr. 2008) o metodă simplă, ieftină, rapidă, portabilă, pentru determinarea concentrațiilor de metanol și etanol din amestecuri, bazată pe măsurători amperometrice utilizând, pentru aceeași probă, succesiv doi biosenzori enzimatici bazați fiecare pe câte o enzimă: alcool dehidrogenaza (ADH, EC 1.1.1.1.) și alcool oxidaza (AOX, EC 1.1.3.13). Principiul de detecție este bazat pe faptul că un biosenzor bazat pe ADH va permite analiza doar a etanolului dintr-un amestec metanol+etanol, pe când răspunsul biosenzorilor bazați pe AOX este produs în special de către metanol, dar și de etanol. Această metodă de analiză nu necesită etape îndelungate și complicate de separare a analiților, și permit realizarea unor dispozitive portabile, dar selectivitatea măsurării metanolului și etanolului în amestecuri nu este la fel de bună ca în cazul metodelor cromatografice. Metoda enzimatică raportată poate analiza amestecuri metanol+etanol în următoarele domenii de concentrație: 3...70 mmol/L pentru metanol și, respectiv, 15...110 mmol/L etanol.
Metoda enzimatică de analiză raportată în European Food Research and Technology, 226, 1335-1342, 2008, este suficient de sensibilă pentru a determina metanolul și etanolul la niveluri de concentrație întâlnite în mod normal în băuturile alcoolice, nefiind nevoie de preconcentrarea analiților, ci eventual de simpla diluare a probelorîn cazul în care concentrațiile sunt prea mari. Problema care trebuie rezolvată în cazul identificării băuturilor alcoolice falsificate cu metanol, utilizând metoda enzimatică de analiză, constă în mărirea selectivității de măsurare a metanolului în prezența etanolului, pentru a se lărgi gama de concentrații de metanol pentru care poate fi furnizată o alarmă privind prezența metanolului în băutura alcoolică respectivă.
Metoda conform invenției, pentru determinarea concentrațiilor de metanol și etanol, în special din băuturi alcoolice falsificate, prin analize amperometrice, cu ajutorul unui sistem format din doi biosenzori, dintre care unul este un biosenzor bazat pe alcool dehidrogenază
RO 125232 Β1 (ADH), modificat cu Meldola blue, iar cel de-al doilea este un biosenzor bazat pe alcool 1 oxidază (AOX), modificat cu Co-ftalocianină, constă în următoarele etape:
- se măsoară semnalul analitic atât pentru biosenzorul pe bază de ADH, cât și pentru 3 biosenzorul pe bază de AOX, unde AOX este extrasă din Hansenula polymorpha, în soluții agitate magnetic, ce cuprind tampon, ca diferență între intensitatea curentului, măsurată 5 după injectarea unei probe care cuprinde amestec de etanol și metanol, și intensitatea curentului, măsurată înainte de injectarea probei; 7
- se determină concentrația de etanol din probă, prin interpolarea semnalului analitic măsurat pentru biosenzorul bazat pe ADH într-o curbă de calibrare prestabilită; 9
- se determină concentrația de metanol prin interpolarea semnalului analitic măsurat pentru biosenzorul pe bază de AOX, din Hansenula polymorpha, într-o curbă de calibrare 11 prestabilită, care depinde atât de concentrația de metanol, cât și de cea de etanol, în care concentrația de etanol a fost în prealabil determinată cu biosenzorul bazat de ADH. 13
Metoda de analiză, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:
- mărește selectivitatea analizei metanolului în prezența etanolului; 15
- îmbunătățește sensibilitatea determinărilor;
- are erori de măsură (deviație relativă standard) reduse; 17
- este simplu de utilizat chiar și de personal mediu calificat;
- are un preț de cost scăzut; 19
- este portabilă;
- permite identificarea rapidă a băuturilor alcoolice falsificate care conțin metanol; 21
- nu necesită utilizarea unor reactivi toxici.
Invenția vafi prezentată în continuare în legătură cu fig. 1...3 și tabelul, ce reprezintă: 23
- fig. 1: reacțiile, mecanismele și ecuațiile cineticii producerii H2O2 în urma oxidării catalizate enzimatic simultan a metanolului și etanolului; 25
- fig. 2: schema aparatului;
- fig. 3: curba de calibrare a aparatului, intensitate - concentrația standardelor de 27 metanol în soluție;
- tabelul: valorile KM pentru metanol și etanol, raportate pentru AOX extrasă din 29 diferite organisme. în legendă sunt prezentate concentrațiile de etanol pentru care sunt trasate curbele. 31
Metoda ameliorată, conform invenției, pentru determinarea concentrațiilorde metanol și etanol în special din băuturi alcoolice falsificate, prin analize amperometrice în soluții agitate, 33 utilizează doi biosenzori: 1) un biosenzor bazat pe alcool dehidrogenază (ADH), care oxidează etanolul la aldehidă acetică și reduce NAD+ la NADH, mediatorul folosit pentru modificarea 35 electrodului indicator fiind Meldola blue, și, respectiv, 2) un al doilea biosensor bazat pe alcool oxidaza (AOX) extrasă din Hansenula polymorpha, care oxidează metanolul la aldehidă formică 37 și etanolul la aldehidă acetică, în ambele reacții catalizate enzimatic se transformă O2 în H2O2, mediatorul folosit pentru modificarea electrodului indicator fiind Co-ftalocianină. Principiul 39 detecției metanolului și etanolului fără separarea analiților este același ca în metoda publicată în European Food Research and Technology, 226,1335-1342,2008, dar metoda de analiză 41 conform invenției utilizează AOX extrasă din Hansenula polymorpha cu afininate sporită pentru metanol și soluții agitate magnetic, ce permit coborârea limitelor de detecție și ameliorarea 43 erorilor măsurătorilor. Biosenzorul bazat pe ADH permite stabilirea concentrației de etanol din probă (nu este influențat de prezența metanolului). Răspunsul biosenzorului bazat pe AOX 45 este dat în principal de metanol, dar este influențat și de etanol. Determinarea concentrației de metanol din probă este realizată pe baza răspunsului AOX, în care concentrația de etanol 47 este cunoscută datorită analizei efectuate cu biosenzorul bazat pe ADH.
RO 125232 Β1
Selectivitatea analizelor metanolului pentru metoda enzimatică de analiză este dată de caracteristicile AOX și, în special, selectivitatea acesteia pentru metanol în prezența etanolului.
Selectivitatea determinării metanolului în prezența etanolului a fost ameliorată prin utilizarea în construcția biosenzorului a unei AOX extrasă dintr-un alt organism, având la bază cinetica Michaelis-Menten pentru o enzimă care catalizează simultan conversia a două substraturi în competiție pentru situl activ al enzimei. Pentru biosenzorii bazați pe AOX, semnalul analitic este dat de cuantificarea vitezei de producere a H2O2 de către AOX, prin oxidarea catalitică simultană a ambilor alcooli. în fig. 1 sunt prezentate reacțiile, mecanismele și ecuațiile care descriu cinetica ce este catalizată enzimatic pentru viteza totală de obținere a unui produs de reacție comun (H2O2), în urma catalizării oxidării simultane a două substraturi. Conform acestor ecuații, semnalul analitic obținut pentru fiecare amestec metanol+etanol este mai mare decât semnalele analitice obținute pentru fiecare analit separat, la aceeași concentrație și în același timp, mai mic decât suma curenților individuali. Aceste rezultate certifică faptul că din semnalele analitice obținute pentru amestecuri este posibil să cuantificăm ambii analiți. în ecuațiile 1 ...6, indicele1) reprezintă metanol și2) etanol. Teoretic, viteza de producere a H2O2 de către AOX dizolvată în soluție, în urma oxidării simultane a metanolului și etanolului în prezență de O2 (reacțiile R1 și R2, cu mecanismele 1 și, respectiv, 2), este calculată în aceeași manieră ca și cinetica Michaelis-Menten pentru un singur substrat. în acest caz sunt două complexe enzimă-substrat care se formează (ecuația 3) și, în consecință, condiția de stare staționară este calculată prin luarea în considerare a acestor două complexe enzimă-substrat (ecuația 4). Viteza totală de producere a H2O2 este dată în ecuația 5 și este egală cu suma vitezelor de producere a formaldehidei (ecuația 6) și a acetaldehidei (ecuația 7). Ameliorarea adusă de acest brevet constă în maximizarea raportului vitezei reacției de producere a formaldehidei, în raport cu producerea acetaldehidei prin oxidarea preferențială a metanolului în prezența etanolului, acest deziderat fiind obținut pentru enzimă ce are un raport maxim KM2/KM1. Este demn de observat că, în cazul în care concentrația unuia dintre substraturi (metanol sau etanol) este 0, ecuațiile 5, 6 și 7 devin ecuația clasică Michaelis-Menten (9: exemplul dat pentru S2 = 0, dar aceeași observație este valabilă și pentru S1 = 0).
La analiza cu biosenzorul bazat pe AOX a unor amestecuri metanol-etanol, pentru a avea un răspuns cât mai selectiv pentru metanol în prezența etanolului, este esențial ca enzimă să aibă o selectivitate cât mai mare pentru metanol, relativă la selectivitatea pentru etanol. Selectivitatea AOX pentru metanol în prezența etanolului este dată de diferența între afinitățile pentru cele două substraturi. Afinitatea unei enzime pentru substrat este caracterizată de constanta Michaelis (KM), care este exprimată în valori de concentrație. Cu cât este mai mare valoarea acestei constante, cu atât va fi mai mică afinitatea enzimei pentru substratul respectiv. Din ecuațiile teoretice prezentate în fig. 1, se observă că o mai bună selectivitate în determinarea metanolului în prezența etanolului este dată de raportul constantelor KM ale AOX determinate pentru etanol și metanol. Este cunoscut faptul că enzimele provenite din diferite organisme prezintă KM diferite. Astfel, este posibil să se aleagă o sursă pentru AOX care să permită ca semnalul analitic obținut să fie cât mai selectiv pentru metanol. Din KM prezentate în tabel se observă că AOX provenită din Hansenula polymorpha permite o ameliorare a selectivității. Astfel, raportul constantelor KM pentru AOX provenită din Hansenula polymorpha este de 7,53, semnificativ mai mare în comparație cu 2,0, cât este raportul pentru AOX provenită din Pichia pastoris, enzimă care este utilizată în metoda publicată în European Food Research and Technology, 226, 1335-1342, 2008.
RO 125232 Β1
Proba de analizat (băutură alcoolică potențial falsificată) este analizată direct cu cei 1 doi biosezori bazați pe ADH (pentru determinarea concentrației de etanol) și, respectiv, AOX (pentru cuantificarea semnalului furnizat de amestecul metanol+etanol). în cazul în care 3 proba este prea concentrată (semnal mai mare decât curba de calibrare), aceasta va fi diluată în tampon și reanalizată. Biosenzorii sunt cuplați la un potențiostat și este măsurată 5 intensitatea curentului la potențial constant (semnal analitic), care este corelată cu concentrația de analit din probă. 7
Aparatul pentru realizarea metodei conform invenției cuprinde un ansamblu format dintr-un potențiostat controlat de calculator, un agitator magnetic pentru asigurarea 9 transportului prin convecție a analiților către suprafața biosenzorilor, doi biosenzori enzimatici, bazați pe ADH și, respectiv, AOX, utilizați succesiv. Inițial proba este analizată 11 cu biosenzorii bazați pe ADH, pentru a se stabili concentrația de etanol, și apoi este analizată cu biosenzorii bazați pe AOX, pentru a se măsura răspunsul produs de metanol+etanol. 13 Cunoscându-se concentrația de etanol, se poate afla, cu ajutorul biosenzorilor bazați pe AOX, concentrația de metanol din probă. 15
Construcția biosenzorilor a fost realizată prin imobilizarea enzimei (AOX, respectiv,
ADH), prin includere în matrice fotopolimerizabilă pe electrozi screen printați care conțin un 17 mediator. Pentru cuantificarea H2O2 rezultată din reacțiile catalizate de AOX au fost folosiți electrozi indicatori modificați cu Co-ftalocianină. Pentru cuantificarea NADH rezultat din 19 reacția catalizată de ADH au fost utilizați electrozi indicatori modificați cu Meldola blue. în afara electrodului indicator pe care au fost imobilizate enzimele, electrozii screen printați mai 21 conțin un electrod de referință Ag/AgCI și, respectiv, un electrod auxiliar.
2,6 mg de AOX (extrasă din Hansenula polymorpha, conform invenției) a fost 23 imobilizată, 10 Ul/mg au fost diluați cu 40 pLapă distilată, peste care s-au adăugat 40 pLde mer PVA-SbQ. Apoi, amestecul enzimă cu PVA-SbQ a fost omogenizat prin amestecare cu 25 un vortex, după care 2 pL din această soluție au fost depuși și întinși pe suprafața electrodului indicator. Electrozii au fost expuși la lumină de neon timp de 4 h, la +4°C, pentru 27 a avea loc includerea enzimei prin fotopolimerizarea merilor. Electrozii au fost după aceea stocați maximum o lună la -20 °C, în pungi de plastic închise, pentru a fi protejați de 29 umiditate. Enzima ADH a fost imobilizată identic cu metoda raportată în European Food Research and Technology, 226, 1335-1342, 2008, și anume: 3 mg de ADH au fost solu- 31 bilizate în 50 pL apă distilată și amestecate cu 40 pL PVA-SbQ. Pe suprafața electrozilor indicatori care au un mediator specific NADH au fost depuși câte 2 pL și polimerizați în mod 33 identic cu biosenzorii bazați pe AOX. Prezenta invenție se referă la ameliorarea performanțelor analitice ale sistemului bienzimatic prin utilizarea de AOX extrasă din 35 Hansenula polymorpha, biosenzorii bazați pe ADH fiind identici cu cei publicați în articolul menționat. 37
Analizele amperometrice realizate cu biosenzorii bazați pe ADH sau AOX au fost realizate în soluții agitate magnetic, utilizând un agitator 1 și o bară magnetică acoperită cu 39 teflon 2. Măsurătorile electrochimice au fost realizate într-o celulă electrochimică 3, în soluție de tampon 0,1 mol/L tampon fosfat pH = 8,0, care conține și 0,1 mol/L KCI. Volumul de 41 tampon utilizat este de 5 mL pentru biosenzorii bazați pe AOX și, respectiv, 4,75 mL pentru biosenzorii bazați pe ADH. Măsurătorile au fost efectuate cu un potențiostat 8 dotat cu un 43 filtru pentru reducerea zgomotului electromagnetic creat de câmpul magnetic variabil al agitatorului. Potențiostatul este controlat de un calculator 9, ce realizează și înregistrarea și 45 prelucrarea semnalelor. La electrodul indicator 4 pe suprafața căruia a fost imobilizată AOX a fost aplicat un potențial constant +600 mV, măsurat față de electrodul screen printat 47 Ag/AgCI de pseudoreferința 5. Pentru biosenzorii bazați pe ADH a fost aplicat un potențial
RO 125232 Β1 de -10 mV și adăugat în celula elecrochimică 250 pL de soluție 80 mmol/L NAD+. Conexiunea între electrozii 4 și 5 și potențiostat a fost realizată cu ajutorul unui cablu ecranat 7. După stabilizarea curentului (măsurarea liniei de bază), 50 pL de probă au fost injectați cu o pipetă mecanică 6 și a fost înregistrată variația intensității curentului până la stabilizarea pe un platou. Semnalul analitic constă în diferența între intensitatea curentului între linia de bază și platou. Timpul necesar pentru stabilizarea liniei de bază a fost de 2...3 min și, pentru obținerea platoului, de aproximativ 1 ...2 min. Electrozii și celula electrochimică au fostspălați cu apă distilată între măsurători.
Domeniul liniar al biosenzorilor bazați pe ADH este 0,001...0,09 mmol/L etanol (n = 5; l(nA) = 1650xConcEtanol (mmol/L) + 17.021; R2 = 0,9913). Biosenzorii bazați pe ADH prezentați în European Food Research and Technology, 226, 1335-1342, 2008, aveau un domeniu liniar al răspunsului, cuprins între 0,3 și 8 mmol/L. Diferența între aceste domenii de concentrație este explicată prin modificarea metodei de analiză: cronoamperometrie în picătură pentru metoda raportată în literatură (puțin sensibilă) și, respectiv, amperometrieîn soluție agitată magnetic (cu sensibilitate sporită), pentru metoda optimizată din prezentul brevet. Diferența de sensibilitate este dată de agitarea magnetică a soluțiilor care modifică modalitatea de transport a analiților la suprafața biosenzorilor unde sunt analizați. Dacă în picătură analiții sunt transportați din masa soluției către electrod prin difuzie-transport lent și ineficient, prin agitarea soluției se asigură un transport rapid al analiților către suprafața electrozilor, ceea ce asigură o concentrație locală de analit crescută și, în consecință, o sensibilitate mărită a determinărilor. Un dezavantaj care apare în cazul agitării magnetice a soluțiilor este inducerea unui curent alternativ parazit în bucla formată de electrozi-soluțieconector, din cauza câmpului magnetic variabil indus de agitator. Pentru îndepărtarea acestui zgomot electromagnetic este necesar ca potențiostatul utilizat să conțină un filtru tip low-pass, pentru separarea curentului continuu (faradaic-semnal analitic) de cel alternativ datorat inducției. Acest filtru permite ameliorarea limitei de detecție prin reducerea zgomotului de fond. Cum a fost demonstrat și în articolul publicat în European Food Research and Technology, 226, 1335-1342, 2008, răspunsul biosenzorilor la etanol nu este afectat de prezența metanolului în soluție. Astfel, prin interpolarea intensității măsurate la analiza unei probe reale care conține etanol+metanol, se obține concentrația de etanol din proba de analizat.
Biosenzorii bazați pe AOX din Hansenula polymorpha sunt capabili să analizeze soluții de amestec metanol+etanol care conțin alcooli în următorul domeniu de concentrații: 0,005...0,2 mmol/L metanol și, respectiv, 0,03...0,3 mmol/L etanol. Aceste domenii de concentrație sunt mult reduse în comparație cu cele raportate în European Food Research and Technology, 226, 1335-1342, 2008 (3...70 mmol/L pentru metanol și, respectiv, 15...110 mmol/L etanol), întrucât se folosesc soluții agitate magnetic.
Pentru interpolarea matematică a rezultatelor experimentale obținute pentru metanol și etanol au fost utilizate 30 de puncte experimentale l(nA) = f(Concentrație metanol, Concentrație etanol): 6 de la graficul de calibrare realizat pentru metanol (în absența etanolului), 5 de la graficul de calibrare realizat pentru etanol (în absența metanolului), 18 pentru soluții standard cu amestecuri metanol-etanol și forțarea trecerii graficului prin origine. Interpolarea rezultatelor experimentale a fost făcută conform ecuației (5), folosind un soft disponibil comercial: GOSA-fit v3.b2 (© Bio Log). Parametrii de interpolare regăsiți au fost notați cuapm deoarece sunt determinați pentru AOX din Hansenula polymorpha imobilizată, și nu liberăîn soluție (ap- aparent), și corectate pentru amestec substraturi (m - mixt). Parametrii ecuației interpolate regăsiți au fost: KMapmmetano, = 0,2±0,1 mmol/L, lmax apmmetanoi = 369±105 nA și, respectiv, KM apmmetanol = 0,3±0,14 mmol/L, lmaxapmmetanoi= 298±106 nA, cu un coeficient de corelație de R2 = 0,949. De notat că în cazul enzimei imobilizate parametrul Vmaxeste înlocuit cu lmax apm pentru ambii analiți.
RO 125232 Β1 în fig. 3 este prezentat graficul de calibrare obținut pentru biosenzorii cu AOX pentru 1 ambii analiți prezenți simultan în soluție. Curba de calibrare este ca o reprezentare 2D, obținută folosind softul GOSA-fit pentru o înțelegere mai ușoară a interpolărilor făcute pentru ambii 3 analiți, și o mai bună reprezentare a diferențelor între valorile teoretice obținute (curbele) și punctele experimentale. Pentru interpolarea rezultatelor experimentale se folosesc curbele 5 de calibrare din fig. 3, iar concentrația de etanol este deja determinată folosind biosenzorii bazați pe ADH. 7
Limita de detecție a biosenzorilor cu AOX din Hansenula polymorpha pentru un alcool în absența celuilalt este de 0,005 mmol/L metanol, pentru care este înregistrat un semnal de 9 8 nA, și, respectiv, 0,03 mmol/L etanol, pentru care este înregistrat un semnal de 15 nA. în cazul în care în proba de analizat sunt prezenți ambii alcooli simultan, limita de detecție pentru 11 fiecare alcool depinde de concentrația celuilalt și este cu atât mai slabă cu cât este mai mare concentrația celuilalt alcool. 13
Deviația relativă standard, calculată pentru o probă care conține 0,1 mmol/L etanol și 0,04 mmol/L metanol, a fost de 3,9% pentru n = 11 determinări efectuate (I (nA) = 109±4,3 nA). 15
Această deviație relativă standard este mult ameliorată în comparație cu cea raportată în European Food Research and Technology, 226,1335-1342,2008 (RSD = 13,8%), unde erau 17 utilizate măsurători în picătură, ameliorare posibilă datorită utilizării pentru măsurători de soluții agitate magnetic ce asigură un transport reproductibil și constant al analiților către suprafața 19 biosenzorilor, unde sunt catalizați de enzimă. Totodată, agitatea magnetică asigură și îndepărtarea rapidă și reproductibilă a produșiior de reacție de la suprafața electrodului, asigurând astfel 21 condiții catalitice constante.
Tabel
| KM (mmol/L) | Raport KM etanol/metanol | Organism | |
| Etanol | Metanol | ||
| 16,2 | 2,15 | 7,53 | Hansenula polymorpha |
| 1 | 0,5 | 2 | Pichia pastoris |
| 0,13 | 0,019 | 6,84 | Candida sp. |
| 1 | 0,2 | 5,00 | Poria contigua |
| - | 0,5 | - | Pichia sp. |
| 1,97 | 0,785 | 2,51 | Phanerochaete chrysosporium |
| 10 | 1,52 | 6,58 | Basidiomycete sp. |
| 2,9 | 1,8 | 1,61 | Peniophora gigantea |
| 8,23 | 2,43 | 3,39 | Candida methanosorbosa |
| - | 3 | - | Candida boidinii |
Claims (3)
- Revendicări1. Metodă pentru determinarea concentrațiilor de metanol și etanol, în special din băuturi alcoolice falsificate, prin analize amperometrice, cu ajutorul unui sistem format din doi biosenzori, dintre care unul este un biosenzor bazat pe alcool dehidrogenază (ADH), modificat cu Meldola blue, iar cel de-al doilea este un biosenzor bazat pe alcool oxidază (AOX), modificat cu Co-ftalocianină, caracterizată prin aceea că:- se măsoară semnalul analitic atât pentru biosenzorul pe bază de ADH, cât și pentru biosenzorul pe bază de AOX, unde AOX este extrasă din Hansenula polymorpha, în soluții agitate magnetic, ce cuprind tampon, ca diferență între intensitatea curentului măsurată după injectarea unei probe care cuprinde amestec de etanol și metanol, și intensitatea curentului măsurată înainte de injectarea probei;- se determină concentrația de etanol din probă, prin interpolarea semnalului analitic măsurat pentru biosenzorul bazat pe ADH într-o curbă de calibrare prestabilită;- se determină concentrația de metanol prin interpolarea semnalului analitic măsurat pentru biosenzorul pe bază de AOX, din Hansenula polymorpha, într-o curbă de calibrare prestabilită, care depinde atât de concentrația de metanol, cât și de cea de etanol, în care concentrația de etanol a fost în prealabil determinată cu biosenzorul bazat de ADH.
- 2. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că biosenzorul pe bază de alcool dehidrogenază este realizat prin imobilizarea alcool dehidrogenazei pe suprafața unui electrod indicator, prin includere în matrice fotopolimerizabilă din PVA-SbQ.
- 3. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că biosenzorul pe bază de alcool oxidază este realizat prin imobilizarea alcool oxidazei pe suprafața unui electrod indicator, prin includere în matrice fotopolimerizabilă din PVA-SbQ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA200800696A RO125232B1 (ro) | 2008-09-11 | 2008-09-11 | METODĂ PENTRU DETERMINAREA CONCENTRAȚIILOR DE METANOL Șl ETANOL DIN AMESTECURI FĂRĂ SEPARAREA ANALITILOR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ROA200800696A RO125232B1 (ro) | 2008-09-11 | 2008-09-11 | METODĂ PENTRU DETERMINAREA CONCENTRAȚIILOR DE METANOL Șl ETANOL DIN AMESTECURI FĂRĂ SEPARAREA ANALITILOR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO125232A2 RO125232A2 (ro) | 2010-02-26 |
| RO125232B1 true RO125232B1 (ro) | 2012-11-29 |
Family
ID=47221007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA200800696A RO125232B1 (ro) | 2008-09-11 | 2008-09-11 | METODĂ PENTRU DETERMINAREA CONCENTRAȚIILOR DE METANOL Șl ETANOL DIN AMESTECURI FĂRĂ SEPARAREA ANALITILOR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO125232B1 (ro) |
-
2008
- 2008-09-11 RO ROA200800696A patent/RO125232B1/ro unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO125232A2 (ro) | 2010-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | A reagentless electrochemical sensor for aflatoxin B1 with sensitive signal-on responses using aptamer with methylene blue label at specific internal thymine | |
| Thiruppathi et al. | Simple aminophenol-based electrochemical probes for non-enzymatic, dual amperometric detection of NADH and hydrogen peroxide | |
| Samphao et al. | Monitoring of glucose and ethanol during wine fermentation by bienzymatic biosensor | |
| Liu et al. | Dual-signal electrochemical aptasensor involving hybridization chain reaction amplification for aflatoxin B1 detection | |
| Yang et al. | Applications of" wired" peroxidase electrodes for peroxide determination in liquid chromatography coupled to oxidase immobilized enzyme reactors | |
| Compagnone et al. | Glucose oxidase/hexokinase electrode for the determination of ATP | |
| Liang et al. | A facile and sensitive fluorescence assay for glucose via hydrogen peroxide based on MOF-Fe catalytic oxidation of TMB | |
| Csiffáry et al. | Ascorbate oxidase-based amperometric biosensor for L-ascorbic acid determination in beverages | |
| Xia et al. | Gold nanoparticle-based colorimetric method for the detection of prostate-specific antigen | |
| Campanella et al. | Organophosphorus and carbamate pesticide analysis using an inhibition tyrosinase organic phase enzyme sensor; comparison by butyrylcholinesterase+ choline oxidase opee and application to natural waters | |
| Guo et al. | A disulfide bound-molecular beacon as a fluorescent probe for the detection of reduced glutathione and its application in cells | |
| Tang et al. | Amperometric determination of organophosphorus pesticide by silver electrode using an acetylcholinesterase inhibition method | |
| Zuo et al. | A sensitive ratiometric electrochemiluminescence biosensor for hypoxanthine detection by in situ generation and consumption of coreactants | |
| Zhuang et al. | Rapid determination of sucrose and glucose in microbial fermentation and fruit juice samples using engineered multi-enzyme biosensing microchip | |
| Li et al. | Proximity hybridization-regulated electrochemical stripping of silver nanoparticles via nanogold induced deposition for immunoassay | |
| Kashiwagi et al. | Electrochemical determination of choline using nortropine-N-oxyl for a non-enzymatic system | |
| Sato et al. | Amperometric simultaneous sensing system for D-glucose and L-lactate based on enzyme-modified bilayer electrodes | |
| Faccendini et al. | Selective application of two rapid, low-cost electrochemical methods to quantify glycerol according to the sample nature | |
| Zein et al. | A CRISPR/Cas12a electrochemical biosensing to detect pig mtDNA D-loop for ensuring food authenticity | |
| Petersson | Amperometric assay of glucose and lactic acid by flow injection analysis | |
| Brainina et al. | State‐of‐the‐art electrochemistry for the assessment of oxidative stress and integral antioxidant activity of biological environments | |
| Li et al. | A highly sensitive and specific electrochemical sensing method for robust detection of Escherichia coli lac Z gene sequence | |
| Tu et al. | RETRACTED: A nano-molar sensitive disposable biosensor for determination of dopamine | |
| Yang et al. | An amperometric horseradish peroxidase inhibition biosensor for the determination of phenylhydrazine | |
| Wu et al. | Highly sensitive flow injection detection of hydrogen peroxide with high throughput using a carbon nanofiber-modified electrode |