RO122254B1 - Procedeu de obţinere a esculetinei în stare pură, din scoarţa de aesculus hippocastanum sau din scoarţa de fraxinus species - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a esculetinei în stare pură, din scoarţa de Aesculus hippocastanum sau din scoarţa de Fraxinus species, ce constă în aceea că materia primă vegetală se supune unor serii de extracţii succesive, efectuate cu un amestec constituit din 70...80% acetonă şi 20...30% apă structurată "I", urmate de etape de filtrare, concentrare sub vid, uscare şi pulverizare, având ca rezultat obţinerea în mod succesiv a unui total de glicozide cumarinice cu următorul conţinut: 65...72% esculină, 20...22% fraxină şi 5...6% taninuri catechinice, esculină purificată, cu conţinut de 90% esculină şi 4...5% fraxină, după care esculina în stare pură cristalizată, cu un conţinut de 98%, se supune unui proces de hidroliză acidă, cu un amestec 1:1 v/v alcool metilic - apă structurată "I", rezultând o suspensie la care se adaugă sub reflux 5% HCl şi 5 volume diclormetan m/v, pentru hidroliza şi dizolvarea esculetinei, obţinându-se esculetina amorfă, cu un conţinut de 96%,care se dizolvă în acetonă, se diluează cu apă distilată, se filtrează sub vid, se usucă şi se pulverizează, obţinându-se esculetina pură cristalină, cu conţinut de 98%.

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu de obținere a esculetinei în stare pură, din scoarța de Aesculus hippocastanum sau scoarța de Fraxinus species, cu utilizare în terapeutica umană și veterinară, precum și în dermatocosmetică.

Speciile de castan (Aesculus hippocastanum) sunt cultivate ca arbore decorativ în majoritatea zonelor geografice ale lumii, fiind utilizate de secole și ca plantă medicinală cu marcate calități terapeutice, de către medicina tradițională din diverse țări.

în terapeutica actuală sunt cunoscute numeroase produse farmaceutice de uz intern și extern, care conțin extracte standardizate de castan sau substanțe purificate, care constituie componenta bioactivă de bază a unor medicamente destinate terapiei curative a diferitelor disfuncții ale circulației periferice, manifestate ca tulburări de irigație sanguină venoasă și de permeabilitate capilară, cu complicațiile lor inflamatorii.

Structura chimică a componentelor bioactive caracteristice speciei Aesculus hippocastnum este diferită, în funcție de organele plantei (frunze, flori, semințe, scoarță) și conține variate clase de substanțe naturale, dintre care unele sunt specifice acestei specii, iar altele sunt nespecifice, fiind prezente și în alte plante medicinale (I. Ciulei și colab., Fitochimie și Fitoterapie, Editura Medicală, București, 1993, voi. 1, pag. 370).

Substanțele bioactive specifice apar fie în anumite organe ale plantei, precum escina care este prezentă numai în semințe sau în mai multe părți ale plantei precum glicozidele cumarinice - esculina și fraxina - care sunt prezente, în mod preponderent în scoarță, dar în cantități reduse și în semințe, iar bioflavonoidele sunt prezente atât în frunze, muguri, flori, cât și în semințe (C. D. Nenițescu, Chimie organică, Ediția VII, Editura Didactică și Pedagogică, București, 1973).

Compușii cumarinici glicozidați - esculina și fraxina - constituie componentele bioactive principale ale scoarței de castan, dar și ale scoarței arborelui de frasin (Fraxinus species: Fraxinus ornus, Fraxinus excelsior, Fraxinus angustifolia), cu areal geografic european, asiatic și american (E. Steinegger, Pharmakognosie, Springer-Verlag Berlin, 1992, pag. 377).

Esculina și fraxina aparțin clasei cumarinelor naturale, de origine vegetală, fiind glicozide ale esculetinei (6,7-dihidroxi-cumarin-6-glucozida), respectiv fraxetinei (6-metoxi-7-hidroxicumarin-8-glucozida):

(HCI)

-CfiHuOe

Fraxina Fraxetina

RO 122254 Β1

Ca toate glicozidele vegetale, esculina și fraxina pot fi transformate în agliconii co- 1 respunzători, prin hidroliză chimică în mediu acid sau pe cale enzimatică, cu ajutorul unei β-glicozidaze (precum emulsină), ambele moduri de hidroliză aplicându-se numai asupra 3 substanțelor în stare pură (E. Steinegger, Pharmakognosie, Springer-Verlag, Berlin, 1992, pag. 377). 5

Referitor la activitatea farmacologică, esculina și esculetina fac parte dintr-o importantă grupă de substanțe naturale vegetale, care deși au fost identificate și 7 caracterizate fizico-chimic cu peste un secol în urmă, abia în ultimele decenii au fost studiate și puse în valoare din punct de vedere al efectelor biologice și posibilităților de aplicare în 9 terapeutică și dermatocosmetică.

Astfel, s-a evidențiat activitatea tonifiant-vasculară și venotropă tip vitamina Pa 11 esculinei, similară flavonoidelor tip Rutin, dar la doze de 10...20 ori mai mici, prezentând, comparativ cu acestea, avantajul solubilității în apă și posibilitatea de administrare pe cale 13 parenterală, sub formă de soluții injectabile sau perfuzabile (H. Wagner, Pharmazeutische Biologie, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1988, pag. 256; Martindale The Extra 15 Pharmacopoeia, 29^th ed. The Pharmaceutical Press, London, 1989, pag. 1539).

Activitatea tip vitamină P a esculinei se exercită în principal, prin efecte de redresare 17 a permeabilității capilare și a fragilității vasculare, de activare a circulației periferice arteriale și venoase, la care se adaugă și alte efecte vasculoprotectoare precum: trombolitice, 19 antihialuronidazice și antiflogistice (Martindale The Extra Pharmacopoeia, 29^,h ed. The Pharmaceutical Press, London, 1989, pag. 1539; DAB - Deutsche Arzmeimitel Buch-10 21 Grundlfg. 1991)

Această activitate biologică variată a esculinei a condus la obținerea a numeroase 23 compoziții medicamentoase pe bază de esculină, în asociere cu alte componente bioactive tonifiant-vasculare: extract din semințe de castan, standardizat în escină, Rutin, Troxerutin, 25 Dihidroergocristină, vitaminele B1 și C (Rote Liste, 2002, Frankfurt/Main, 83060; 83084;

Agenda Medicală/2003, Editura Medicală, București, 2003, pag. 1642; RO 99 523). 27

Aceste compoziții medicamentoase sunt destinate terapiei disfuncțiilor circulatorii periferice și figurează ca produse farmaceutice, prevăzute în nomenclatoarele de 29 medicamente din diverse țări (Rote Liste, 2002, Frankfurt/Main, 83060; 83084; Agenda Medicală/2003, Editura Medicală, București, 2003, pag. 1642). 31

Cercetări farmacologice recente (Z. Ștefanova, J. Ethnopharmacol., 1995, 46(2), pag. 101-106; H. C. Huang, EuropJ. Pharmacol., 1993,237, pag. 39-44) efectuate prin investigații 33 complexe comparative in vitro și in vivo, au evidențiat noi efecte farmacologice ale esculinei și esculetinei, aplicabile în domenii terapeutice prioritare, cu largă incidență socială, sub forma 35 unor produse farmaceutice brevetate. Astfel:

Publicația WO 91/07959/13.06.1991, intitulată „Utilizarea derivaților de 1,2-benzopyronă 37 pentru tratamentul tumorilor maligne la oameni”, descrie posibilitatea producerii unor medicamente pe bază de esculină și esculetina în stare pură, pentru terapia curativă a tumorilor maligne 39 umane, localizate la creier, plămâni, rinichi, prostată și piele. Se subliniază efectul puternic inhibitor al acestordouă substanțe hidroxi-cumarinice asupra tumorilor creierului, care în practica 41 medicală oncologică curentă răspund dificil și insuficient la chimioterapie și radioterapie.

Brevetul de invenție JP 10226641/25.08.1998, intitulat „Preparat terapeutic pentru 43 artropatie”, precum și brevetul de invenție US 5 455 268/3.10.1995 (aparținând aceluiași colectiv de autori) prezintă compoziții farmaceutice având drept componente bioactive 45 esculetina sau derivații săi (precum 4-metil-esculetina), condiționate pentru administrare parenterală și destinate tratării artropatiei, prin protecția și redresarea cartilajului articular 47 expus distrugerii în artrita reumatoidă și osteoartrită.

RO 122254 Β1

Se consideră ca un nou efect farmacologic proprietatea compușilor pe bază de esculetină de a determina o inhibiție semnificativă asupra depleției proteoglicanilor - componenți majori ai matricei cartilajelor - ceea ce justifică utilizarea acestei substanțe drept agent chondroprotector pentru inhibarea distrugerii cartilajelor articulare. Se demonstrează acest efect terapeutic printr-un studiu farmacologic comparativ față de Indometacină, ca medicament de referință, în cadrul căruia depleția proteoglicanilor a fost evaluată prin măsurarea glicozaminoglicanilor - constituent major al proteoglicanilor.

Datele experimentale obținute au demonstrat că esculetină inhibă sau reduce semnificativ pierderea conținutului de glicozamină și inhibă sau suprimă depleția de proteoglicani, în timp ce Indometacina - medicament antiinflamator și analgezic cu largă utilizare terapeutică - nu inhibă depleția de proteoglicani, ci dimpotrivă exercită un efect de exacerbare a distrugerii cartilajelor.

Din stadiul tehnicii analizat rezultă că activitatea biologică complexă a esculinei și esculetinei are o largă aplicabilitate nu numai în terapeutică ci și în dermatocosmetică, datorită unei multitudini de efecte specifice acestui domeniu, dintre care se menționează faptul că esculina și esculetină:

- ca și alte cumarine naturale, au proprietatea de a absorbi masiv radiațiile UV, fiind utilizate ca agenți naturali de protecție anti-UV-B în produse cosmetice și ca mijloace de ecranare anti-UV în optică și în diferite domenii tehnice;

- acționează ca agenți de albire a pielii printr-un efect inhibitor asupra producerii de melanină;

- prezintă și efecte antiinflamatoare semnificative, acționând rapid în sedarea inflamațiilor atribuite excesului de radiații UV, precum și asupra altor tipuri de procese inflamatorii: alergice, atopice etc.

Brevetul de invenție US 6 291 519/18.09.2001 prezintă o metodă de prevenire a afectării țesuturilor ochilor de către radiațiile UV și ozon, prin utilizarea unor produse de uz extern, condiționate ca gel, unguent, soluție uz extern, care conțin drept componente active: vitaminele A și E, alături de esculină.

Numeroase brevete de invenție japoneze revendică formulele unor preparate cosmetice conținând esculină, cu efecte de albire asupra pielii normale sau a celei afectate de petele de vârstă și de unele perturbări patologice (JP 5000934; 5092917; 2002040).

Alte brevete de invenție japoneze prezintă formule de produse dermatocosmetice antiinflamatoare, pe bază de esculină, esculetină sau alte cumarine naturale (JP 2006 028094; 2004 075619).

Din cele prezentate rezultă că esculina și esculetină fac obiectul unor cercetări recente diversificate, în vederea utilizării lor drept componente bioactive ale unor compoziții medicamentoase sau dermatocosmetice.

Indiferent de domeniul de aplicare, este necesar ca aceste substanțe să fie utilizate la un grad de puritate avansată, similară altor componente naturale în stare pură (minimum 97%).

în cazul esculinei, Farmacopeea germană(DAB 10/1991) prevede un conținut de minimum 97,5%, care asigură administrarea terapeutică a substanței și pe cale parenterală (DAB 10/1991).

Pentru obținerea esculinei la scară industrială, se utilizează ca materii prime vegetale scoarța arborilor de castan sau de frasin, în care esculina se găsește alături de fraxină și alte componente bioactive: proantocianidine, flavonoide, fitosteroli, de care se separă prin purificări selective și cristalizări succesive.

RO 122254 Β1

Printre brevetele de invenție și cererile de brevet recente care, prezintă procedee de 1 obținere a esculinei, se numără cele ce urmează:

Brevetul de invenție RO 87724/1985.10.26 prezintă un procedeu de obținere a 3 esculinei din Cortex Aesculus hippocastanum, ce prevede extracția materiei prime vegetale prin macerare, la temperatura ambiantă, cu acetonă apoasă 40...60%, concentrarea extrac- 5 telor reunite sub vid, până la reziduu uscat, conținând totalul brut de glicozide cumarinice, care se extrage cu alcool la reflux, apoi extractul alcoolic se concentrează la reziduu uscat 7 din care, prin 2 cristalizări succesive din metanol - apă 9:1 și apă, se obține esculină cu un conținut de 94...96%, care nu se încadrează în prevederile Farmacopeei Germane 9 (DAB 10/1991) pentru substanță de uz terapeutic.

Brevetul de invenție RO 97802/22.08.1989 prezintă un procedeu de obținere a 11 esculinei pure din cortex Aesculus hippocastanum, ce prevede extracția materiei prime vegetale la temperatura ambiantă sau la reflux, cu alcool metilic, concentrarea soluțiilor 13 extractive reunite sub vid, până la raportul 1:1 (g/v), menținerea extractului concentrat la temperatura de 5...6°C, timp de 24...48 h, filtrarea suspensiei sub vid și separarea totalului de 15 glicozide cumarinice, care se purifică prin extracție la reflux cu alcool metilic, decolorarea cu cărbune activ a soluției alcoolice, urmată de izolarea esculinei prin 2 cristalizări succesive 17 din amestec metanol-apă 70% și din apă.

Din punct de vedere al aplicării tehnologiei la nivel industrial, acest procedeu prezintă 19 dezavantajul utilizării alcoolului metilic, în toate fazele tehnologice, creându-se astfel probleme speciale de protecție a condițiilor de muncă, datorită toxicității ridicate a acestui 21 solvent, mai ales în cazul prelucrării industriale în flux continuu.

Cererea de brevet de invenție PCT/CN/WO 2004/020427/11.03.2004 prezintă un 23 procedeu de preparare a totalului de cumarine din scoarța de frasin (Fraxinus sp.), ce prevede extracția materialului vegetal cu solvenții: apă, amestec hidroalcoolic 50...90%, 25 alcool 95%, concentrarea soluțiilor extractive, precipitarea extractului apos concentrat cu alcool etilic, filtrarea suspensiei formate, separarea și uscarea precipitatului, care constituie 27 totalul de cumarine, condiționat sub formă de capsule sau tablete, în produse medicamentoase pentru tratarea tulburărilor acute sau cronice de gută. 29

Se prezintă și un procedeu de obținere a esculinei purificate, din totalul de cumarine, în care se prevede extracția acestuia cu alcool metilic, la temperatura de 4O...5O°C, 31 concentrarea extractului alcoolic până la o soluție saturată, din care se separă esculină sub formă de cristale galbene, care se recristalizează din alcool metilic - apă, rezultând esculină 33 purificată, cu un conținut de 94,4%, care se condiționează sub formă de capsule sau tablete a 200 mg, destinate terapiei tulburărilor acute sau cronice de gută. 35

Procedeul citat prezintă ca dezavantaj faptul că nu prezintă date analitice referitoare la evaluarea calitativă și cantitativă a totalului de cumarine, în funcție de cele 3 variante 37 tehnologice de extracție, aplicate cu solvenți diferiți de extracție: apă, amestec hidroalcoolic

50...90% și alcool 95%. Este cunoscut că diferențele de polaritate ale acestor solvenți 39 conduc la un conținut variabil al totalului de cumarine, atât din punct de vedere cantitativ (gradul de puritate), dar mai ales calitativ - prin valori diferite ale raportului esculină/fraxină, 41 care deși au o structură chimică de bază similară, prezintă solubilități, efecte farmacologice și utilizări terapeutice diferențiate. 43 în vederea obținerii esculetinei din esculină, sunt cunoscute și aplicate în acest scop metodele clasice de hidroliză a glicozidelor naturale, realizate pe cale enzimatică, (cu 45 ajutorul unei 6-glicozidaze, precum emulsina sau acidă (HCI, H₂SO₄) (C. D. Nenițescu,

Chimie organică, Ediția VII, Editura Didactică și Pedagogică, București, 1973). Ca mediu de 47

RO 122254 Β1 hidroliză se utilizează apa sau alcoolii monohidroxilici (metilic, etilic), ambele tipuri de medii de hidroliză (alcoolic sau apos) prezentând unele dezavantaje din punct de vedere al obținerii produsului finit - esculetina, în stare pură, precum:

- hidroliză glicozidelor cumarinice, în mediu de alcooli concentrați prezintă dezavantajul că glucoza scindată din molecula de esculină, nefiind solubilă în mediul alcoolic de hidroliză, rămâne în acest mediu sub formă de suspensie fină, din care se încorporează în esculetina rezultată prin hidroliză, scăzându-i gradul de puritate;

- hidroliză glicozidelor cumarinice în mediu apos cu acizi tari (HCI) are ca dezavantaj tendința monozaharidelor scindate prin hidroliză de a se descompune și transforma în componente macromoleculare, nedefinite chimic, de culoare brună, care impurifică substanțele agliconi (precum esculetina), rezultate prin procesul de hidroliză, ceea ce determină efectuarea unor operații suplimentare de purificare [26].

Brevetul de invenție US 4238483/9.12.1980 prezintă un procedeu de preparare a unor compoziții antimicrobiene, utilizând ca materii prime glicozideflavonoidice (hesperidina, naringina) sau cumarinice (esculină), supuse unui proces de hidroliză acidă, cu HCI 0,5...0,8 N, în mediu apos, la temperatura de 9O...98’C, timp de 1 h, rezultând compuși intermediari, colorați în galben brun, cu structură complexă și activitate antibacteriană - antifungică.

Din datele prezentate cu privire la stadiul tehnicii în domeniul obținerii esculinei și eculetinei în stare pură, din scoarța de Aesculus hippocastanum și de Fraxinus species, rezultă următoarele dezavantaje:

- unele procedee prezintă obținerea esculinei cu un conținut de 94%, care nu se încadrează în prevederile normelor actuale ale Uniunii Europene pentru substanțele în stare pură, de uz terapeutic (minimum 97%);

- un alt procedeu de obținere a esculinei pure prezintă dezavantajul utilizării alcoolului metilic în toate fazele tehnologice, de la extracția plantei, la cristalizarea substanței, ceea ce determină dificultăți la aplicarea industrială a procedeului, datorită toxicității acestui solvent;

- procedeul de obținere a esculetinei din esculină, prin hidroliză în mediu de alcool concentrat sau apos, cu acizi tari (HCI), prezintă dezavantajul impurificării esculetinei cu glucoza scindată prin hidroliză sau cu compuși macromoleculari de degradare a acesteia, ceea ce implică aplicarea unor faze tehnologice suplimentare de purificare a produsului finit;

- nu se cunosc procedee de valorificare a scoarței de castan sau de frasin, prin obținerea concomitentă a esculinei și esculetinei în stare pură.

Problema tehnică pe care o rezolvă prezenta invenție este obținerea esculetinei în stare pură, din scoarța de Aesculus hippocastanum (castan) sau de Fraxinus species (frasin).

Soluția este obținerea esculetinei - de puritate avansată, minimum 98%.

Procedeul de obținere a esculetinei, conform invenției, constă în aceea că materia primă vegetală se supune unor serii de extracții succesive, efectuate cu un amestec constituit din 70...80% acetonă și 20...30% apă structurată “I”, urmate de etape de filtrare, concentrare sub vid, uscare și pulverizare, având ca rezultat obținerea în mod succesiv a unui total de glicozide cumarinice cu următorul conținut: 65%...72% esculină, 20...22% fraxină și 5...6% taninuri catechinice, esculină purificată cu conținut de 90% esculină și

4...5% fraxină, după care esculină în stare pură, cristalizată, cu un conținut de 98%, se supune unui proces de hidroliză acidă cu un amestec 1:1 v/v alcool metilic - apă structurată “I”, rezultând o suspensie, la care se adăugă sub reflux 5% HCI și 5 volume diclormetan m/v, pentru hidroliză și dizolvarea esculetinei, obținându-se esculetina amorfă cu un conținut de 96%, care se dizolvă în acetonă, se diluează cu apă distilată, se filtrează sub vid, se usucă și se pulverizează, obținându-se esculetina pură, cristalizată, cu conținut de 98%.

RO 122254 Β1

Procedeul de obținere a esculetinei în stare pură, conform invenției, prezintă urmă- 1 toarele avantaje:

- este un procedeu de valorificare superioară a scoarței de castan sau de frasin, care 3 conduce la obținerea în etape succesive esculetinei în stare pură, printr-un flux tehnologic continuu și unitar, un număr redus de faze tehnologice, cu posibilitatea aplicării sale la nivel 5 industrial și respectarea regulilor de bună practică de fabricație a medicamentelor din Uniunea Europeană: 7

- obținerea esculetinei lărgește aria de aplicabilitate a invenției și asigură rentabilitatea în raporturi cantitative variabile, în funcție de necesitățile terapeutice umane și veteri- 9 nare pentru uz intern și extern, precum și pentru dermatocosmetică;

- utilizează apa structurată „I” cu pH acid = 1,8...2,6 pentru efectuarea fazelor 11 tehnologice, ceea ce determină o creștere a selectivității și a randamentelor de extracție, purificare și cristalizare cu un grad avansat de puritate (minimum 98%), similar substanțelor 13 de referință din Cataloagele internaționale de reactivi pentru analiză.

Conform procedeului de obținere a esculetinei în stare pură, materia primă vegetală, 15 constituită din scoarța de Aesculus hippocastnum (castan) sau de Fraxinus species (frasin), în stare uscată și pulverizată, se extrage în raportul 1/20 m/v, cu solventul de extracție con- 17 stituit din amestecul: 70...80% acetonă cu 20...30% apă structurată „I” cu pH acid = 1,8...2,6, prin percolare continuă, timp de 12 h, la 2O...3O°C, soluția extractivă filtrată se concentrează 19 sub vid, la 35...40’C, în raportul: 1/20 v/vfață de volumul inițial, rezultând o suspensie care se menține 12 h la 5...10°C, după care se filtrează sub vid, precipitatul obținut după uscare 21 și pulverizare constituind totalul de glicozide cumarinice, cu un conținut de minimum 65% esculină, 20...22% fraxină și 5...6% taninuri catechinice. 23 în scopul purificării, totalul de glicozide cumarinice se dizolvă în raportul 1/100 m/v în amestec de solvenți constituit din 70...80% acetonă cu 20...30% apă structurată „I” cu pH 25 acid = 1,8...2,6, prin încălzire la reflux, iar soluția obținută se purifică prin adsorbție cu 10% m/m cărbune activ, după care se concentrează sub vid până la 1/10 v/vfață de volumul 27 inițial, rezultând o suspensie, din care, după filtrare și uscarea precipitatului, rezultă escuiina purificată, cu un conținut de minimum 90% esculină și 4...5% fraxină. 29 în vederea obținerii esculinei pure, cristalizate, escuiina purificată se dizolvă în raportul 1/80 m/v în amestec de solvenți constituit din 70... 80% acetonă cu 20...30% apă 31 structurată „I” cu pH acid -1,8...2,6, prin încălzire la reflux, iar soluția obținută se purifică prin adsorbție cu 5% m/m cărbune activ, după care se concentrează sub vid până la 1 /5... 1 /6 v/v 33 față de volumul inițial, rezultând o suspensie din care se separă escuiina în stare pură, cristalizată, cu un conținut de minimum 98%, evaluat prin HPLC. 35

Pentru obținerea esculetinei în stare pură, escuiina în stare pură, cu un conținut de minimum 98%, obținută din scoarța de castan sau de frasin, se supune unui proces de 37 hidroliză acidă, cu 10 volume mediu de hidroliză, alcătuit din amestec 1:1 (v/v) alcool metilic apă structurată „I”, la care se adaugă 5 volume diclormetan (m/v) și 5% HCI, ca agent de 39 hidroliză.

Procesul de hidroliză se efectuează la temperatura de 6O...7O°C, timp de 3 h, după 41 care din mediul de hidroliză răcit la temperatura ambiantă, se separă faza diclormetanică, care se concentrează la reziduu sicc, constituit din esculetină amorfă cu un conținut de 43 minimum 96%, care, în vederea cristalizării se dizolvă în 10 volume (m/v) acetonă, prin încălzire la reflux, soluția obținută se diluează cu 1/2 volum apă distilată, când se formează 45 o suspensie, din care, după filtrare și uscare la 105°C, se obține esculetină pură, cristalizată, cu un conținut de minimum 98% , evaluat prin HPLC, care datorită purității avansate poate 47 fi utilizată, ca și escuiina, în terapeutica umană, pentru uz intern, condiționată sub formă de soluții injectabile, capsule, tablete. 49

RO 122254 Β1

Conform procedeului de obținere a esculetinei în stare pură, din prezenta invenție, materia primă vegetală, constituită din scoarța de Aesculus hippocastnum (castan), cu un conținut minim de 4% esculină sau de Fraxinus species (frasin), cu un conținut minim de 3% esculinăîn stare uscată și pulverizată, se extrage în raportul 1/20 m/vcu solventul de extracție constituit din amestecul: 70...80% acetonă cu 20...30% apă structurată „I” cu pH acid = 1,8...2,6, prin percolare continuă, timp de 12 h, la 2O...3O°C, soluția extractivă filtrată se concentrează sub vid, la 35...40°C, în raportul 1/20 v/v față de volumul inițial, rezultând o suspensie care se menține 12 h la 5... 10°C, după care se filtrează sub vid, precipitatul obținut după uscare timp de 4 h la 105°C și pulverizare constituind totalul de glicozide cumarinice, cu un conținut de minimum 65% esculină, 20...22% fraxină și 5...6% taninuri catechinice.

în scopul purificării, totalul de glicozide cumarinice se dizolvă în raportul 1/100 m/v în amestec de solvenți constituit din 70...80% acetonă cu 20...30% apă structurată „I” cu pH acid = 1,8...2,6, prin încălzire la reflux la 60°C, iar soluția obținută, răcită la 20...25’C, se purifică prin adsorbție cu 10% m/m cărbune activ, la 4O...5O°C, sub agitare, timp de 1 h și răcire la 2O...3O°C, după care se filtrează și se concentrează sub vid la 35...40°C, până la 1/10 v/v față de volumul inițial, rezultând o suspensie care se menține timp de 12 h la

5.. .10°C, din care, după filtrarea sub vid și uscarea precipitatului la 105°C timp de 4 h și pulverizare, rezultă esculină purificată, cu un conținut de minimum 90% esculină și 4...5% fraxină.

în vederea obținerii esculinei pure, cristalizate, esculină purificată se dizolvă în raportul 1/80 m/v în amestec de solvenți constituit din 70... 80% acetonă cu 20...30% apă structurată „I” cu pH acid = 1,8...2,6, prin încălzire la reflux la 60°C, timp de 1/2 h, iar soluția obținută se purifică prin adsorbție cu 5% m/m cărbune activ, se filtrează, după care se concentrează sub vid până la 1/5...1/6 v/v față de volumul inițial, rezultând o suspensie care după menținere 24 h la 5...10°C se filtrează sub vid, iar precipitatul se spală pe filtru cu 0,5 I apă distilată, răcită la 5...10°C, până la pH neutru, se usucă la 105°C timp de 4...6 h până la greutate constantă, se pulverizează, obținându-se esculină în stare pură, cristalizată, cu un conținut de minimum 98%, evaluat prin HPLC.

Pentru obținerea esculetinei în stare pură, esculină în stare pură, cu un conținut de minimum 98%, obținută din scoarța de castan sau de frasin, se supune unui proces de hidroliză acidă, cu 10 volume mediu de hidroliză, alcătuit din amestec 1:1 (v/v) alcool metilic apă structurată „I”, suspensia se încălzește la 60...70°C, sub agitare, adăugându-se sub reflux 5% HCI ca agent de hidroliză și 5 volume diclormetan (m/v) ca agent de dizolvare a esculetinei rezultate prin hidroliză.

Procesul de hidroliză se efectuează în mediu heterogen de solvenți nemiscibili la

60.. .70°C, timp de 3 h, după care, din mediul de hidroliză răcit la 2O...3O°C, se separă faza diclormetanică, care se concentrează la presiune normală la 40°C până la reziduu sicc, constituit din esculetină amorfă, cu un conținut de minimum 96%, care în vederea cristalizării se dizolvă în 10 volume (m/v) acetonă, prin încălzire la reflux, soluția obținută se diluează cu 1/2 volum apă distilată, când se formează o suspensie, care după menținere 24 h la

5.. .10°C, filtrare sub vid și spălare a precipitatului pe filtru cu 100 ml apă distilată, se usucă la 105°C timp de 3...4 h până la greutate constantă și se pulverizează, obținându-se esculetină pură, cristalizată, cu un conținut de minimum 98%, evaluat prin HPLC, care datorită purității avansate poate fi utilizată, ca și esculină, în terapeutica umană și veterinară, pentru uz intern, condiționată sub formă de soluții injectabile, capsule, tablete, precum și pentru uz extern, și în dermatocosmetică.

RO 122254 Β1

Se prezintă, în continuare, 3 exemple de realizare a invenției. 1

Exemplul de realizare 1. Obținerea esculinei în stare pură, din scoarța de castan kg scoarță de castan (Aesculus hippocastanum), uscată și pulverizată, cu un 3 conținut de 4% esculină, se aduc într-un vas de extracție din inox, tip percolator și se extrag prin percolare continuă, la temperatura ambiantă de 2O...3O°C, cu 2001 solvent de extracție 5 constituit din amestecul: 160 I acetonă cu 40 I apă structurată I cu pH=1,8...2,6, timp de 12 h, după care se colectează minimum 1801 soluție extractivă, colorată în brun-roșcat, care 7 după filtrare la presiune normală se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 9 I (raport 1/20 față de volumul inițial), suspensia rezultată se menține 12 h la 9 temperatura de 5...10°C, după care se filtrează sub vid, iar precipitatul de pe filtru se usucă la 105°C, timp de 4 h și se pulverizează. Rezultă minimum 400 g total de glicozide 11 cumarinice, sub formă de pulbere amorfă, de culoare brun-roșcată, care conține: minimum 64% esculină, 20...22% fraxină și 5...6% taninuri catechinice. 13 în scopul purificării, totalul de glicozide cumarinice se dizolvă în 40 I (100 volume) amestec de solvenți constituit din: 32 I acetonă, cu 81 apă structurată Ί” cu pH=1,8...2,6, prin 15 încălzire sub agitare la reflux (60°C), iar soluția limpede obținută, colorată în brun-roșcat, răcită la temperatura de 2O...25°C, se purifică prin adsorbție cu 40 g (10% m/m) cărbune 17 activ, adăugat în vasul de dizolvare, continuându-se agitarea la temperatura de 40...50°C timp de o oră; după răcire la temperatura ambiantă, suspensia se filtrează la presiune 19 normală, rezultând o soluție colorată în galben-deschis, care se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 4 I (raport 1/10 față de volumul inițial), 21 rezultând o suspensie, care după menținere 12 h la temperatura de 5... 10°C, se filtrează sub vid, iar precipitatul de pe filtru se usucă la 105°C, timp de 4 h și se pulverizează. 23

Rezultă minimum 300 g esculină purificată, sub formă de pulbere amorfă albă, slab gălbuie, cu un conținut de minimum 90% esculină și 4...5% fraxină. 25 în vederea obținerii esculinei pure, cristalizate, 300 g esculină purificată se dizolvă în 24 I (80 volume) amestec de solvenți constituit din: 19,2 I acetonă cu 4,8 I apă structurată 27 I cu pH=l,8...2,6, prin încălzire sub agitare, la reflux (60°C), timp de 30 min, iar soluția limpede, slab gălbuie, obținută, se purifică cu 15 g (5 % m/m) cărbune activ, se filtrează, iar 29 filtratul se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 4 I (raport 1/6 față de volumul inițial), rezultând o suspensie care se menține 24 h la temperatura de 31

5...10°C, se filtrează sub vid, precipitatul se spală pe filtru cu 0,5 I apă distilată, răcită la temperatura de 5...10°C, până la pH neutru, se usucă la 105°C, timp de 4...6 h (până la 33 greutate constantă), se pulverizează și se ambalează în containere etanșe, ferite de lumină și umiditate. 35

Se obțin minimum 250 g esculină pură, cristalizată, sub formă de pulbere albă, microcristalină, cu aspect sidefat, cu un conținut de minimum 98%, evaluat prin HPLC, ceea 37 ce reprezintă un randament final al tehnologiei de minimum 60%, raportat la conținutul în esculină al scoarței de castan prelucrate. 39

Exemplul de realizare 2. Obținerea esculinei în stare pură, din scoarța de frasin kg scoarță de frasin (Fraxinus excelsior), uscată și pulverizată, cu un conținut de 41 3% esculină, se aduc într-un vas de extracție din inox, tip percolator și se extrag prin percolare continuă, la temperatura ambiantă de 2O...3O’C, cu 200 I solvent de extracție 43 constituit din amestecul: 160 lacetonăcu 40 I apă structurată “I” cu pH=l,8...2,6, timp de 12 h, după care se colectează minimum 180 I soluție extractivă, colorată în brun roșcat, care 45 după filtrare la presiune normală, se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 9 I (raport 1/20 față de volumul inițial), suspensia rezultată se menține 12 h la 47 temperatura de 5...10’C, după care se filtrează sub vid, iar precipitatul de pe filtru se usucă la 105°C, timp de 4 h Și se pulverizează. 49

RO 122254 Β1

Rezultă minimum 330 g total de glicozide cumarinice, sub formă de pulbere amorfă, de culoare brun-roșcată, care conține: minimum 65% esculină 22...25% fraxină și 5...6% taninuri catechinice.

în vederea purificării, 330 g total de glicozide cumarinice se dizolvă în 33 I (100 volume) amestec de solvenți constituit din: 26,4 I acetonă cu 6,6 I apă structurată “I” cu pH=1,8...2,6, prin încălzire sub agitare, la reflux (60°C), iar soluția limpede obținută, colorată în brun-roșcat, răcită ta temperatura de 2O...25°C, se purifică prin adsorbție cu 33 g (10% m/m) cărbune activ, adăugat în vasul de dizolvare, continuându-se agitarea la temperatura de 4O...5O’C, timp de o oră; după răcire la temperatura ambiantă, suspensia se filtrează la presiune normală, rezultând o soluție colorată în galben deschis, care se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 3,31 (raport 1/10 față de volumul inițial), rezultând o suspensie care după menținere 12 h la temperatura de 5...10°C se filtrează sub vid, iar precipitatul de pe filtru se usucă la 105°C, timp de 4 h și se pulverizează.

Rezultă minimum 220 g esculină purificată, sub formă de pulbere amorfă albă, slab gălbuie, cu un conținut de minimum 90% esculină și 5...6% fraxină. în vederea obținerii esculinei pure, cristalizate, 220 g esculină purificată se dizolvă în 17,61 (80 volume) amestec de solvenți constituit din: 14,1 I acetonă cu 3,5 I apă structurată “I” cu pH=1,8...2,6, prin încălzire sub agitare la reflux (60°C), timp de 30 min, iar soluția limpede, slab-gălbuie, obținută, se purifică cu 11 g (5% m/m) cărbune activ, se filtrează, iar filtratul se concentrează sub vid, la temperatura de 35...40°C, până la volumul de 3 I (raport 1/6 față de volumul inițial), rezultând o suspensie care se menține 24 h la temperatura de 5...10°C, se filtrează sub vid, precipitatul se spală pe filtru cu 0,4 I apă distilată, răcită la temperatura de 5...10°C, până la pH neutru, se usucă la 105°C, timp de 4...6 h (până la greutate constantă), se pulverizează și se ambalează în containere etanșe, ferite de lumină și umiditate.

Se obțin minimum 190 g esculină pură, cristalizată, sub formă de pulbere albă, microcristalină, cu aspect sidefat, cu un conținut de minimum 98%, evaluat prin HPLC, ceea ce reprezintă un randament final al tehnologiei de minimum 60%, raportat la conținutul în esculină al scoarței de frasin prelucrate.

Exemplul de realizare 3. Obținerea esculetinei în stare pură

200 g esculină pură, cu un conținut de minimum 98%, obținută din scoarța de castan sau de frasin, conform exemplelor de realizare 1 și 2, se aduc într-un vas de reacție din sticlă, în care s-au introdus în prealabil 2000 ml mediu de hidroliză, constituit din amestecul de solvenți: 1000 ml alcool metilic și 1000 ml apă structurată „I” cu pH=1,8...2,6. Se adaptează vasul de reacție la o instalație de distilare ascendentă, prevăzută cu refrigerent de reflux și sistem de agitare, iar suspensia se încălzește la 65°C, sub agitare, în vederea dizolvării esculinei. Peste soluția limpede, incoloră, rezultată, se adaugă, sub reflux, 250 ml HCI concentrat, ca agent de hidroliză, și 1000 ml diclormetan, ca solvent de dizolvare a esculetinei rezultate prin hidroliză.

Procesul de hidroliză se efectuează în mediu heterogen, din solvenți nemiscibili la temperatura de 65°C, timp de 3 h, după care, mediul de hidroliză, răcit la temperatura ambiantă (2O...25°C), se aduce cantitativ într-o pâlnie de separare, de unde se colectează faza inferioară diclormetanică (circa 950 ml), care se concentrează la presiune normală la temperatura de 40°C, până la reziduu sico - circa 90 g sub formă de pulbere amorfă, albă, constituită din esculetină amorfă, cu un conținut de minimum 96%.

în vederea obținerii substanței pure cristalizate, 90 g pulbere amorfă de esculetină se dizolvă în 900 ml acetonă, prin încălzire la reflux, iar soluția limpede, incoloră, rezultată, se diluează, sub agitare, cu 1/2 volum de apă distilată (450 ml), când se formează o suspensie, care se menține 24 h la temperatura de 5...10°C, după care se filtrează sub vid,

RO 122254 Β1 precipitatul se spală pe filtru cu 100 ml apă distilată, se usucă la 105’C timp de 3...4 h (până 1 la greutate constantă), se pulverizează și se ambalează în containere etanșe, ferite de lumină și umiditate. 3

Se obțin minimum 85 g esculetină pură, sub formă de pulbere albă, microcristalină, cu aspect sidefat, cu un conținut de minimum 98%, evaluat prin HPLC, ceea ce reprezintă 5 un randament final de minimum 85%, raportat la conținutul în esculetină al cantității de esculină prelucrate. 7

TESTE PENTRU CARACTERIZAREA ANALITICĂ, CALITATIVĂ Șl CANTITATIVĂ,

A PRODUSELOR REALIZATE CONFORM INVENȚIEI 9

Caracterizarea analitică, calitativă și cantitativă, a esculinei și esculetinei, obținute conform invenției, s-a efectuat prin aplicarea următoarelor metode de analiză: 11

- cromatografie în strat subțire,

- cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), 13

- spectrometrie de absorbție moleculară în VIS.

Testul nr. 1. Evaluarea calitativă a esculinei și esculetinei prin cromatografie în strat 15 sub fi re

Reactivi și metodă 17

- Plăci cromatografice cu Silicagel G (Merck);

- Fază mobilă: acetat de etil-metanol-apă (100:16,5:13,5) (v/v); 19

- Reactiv de identificare: examinare în UV la 340 nm;

- Soluție de referință: 21

a. 0,100 g esculină - substanță de referință în 100 ml alcool metilic,

b. 0,100 g esculetină - substanță de referință în 100 ml alcool metilic. 23

- Soluție de analizat:

a. 0,100 esculină - probă de analizat în 100 ml alcool metilic, 25

b. 0.100 g esculetină - probă de analizat în 100 ml alcool metilic.

Modul de lucru 27

Pe cromatoplacă se spotulează câte 0,01 ml din soluțiile de referință a) și b) și din soluțiile de analizat a) și b), lăsându-se ca faza mobilă să migreze minimum 15 cm, după 29 care cromatoplaca se usucă și se examinează în lumină UV la 340 nm, când se identifică spoturile esculinei (Rf = 0,62) și esculetinei (Rf=0,84, ambele având o fluorescență albastră. 31 Absența altor spoturi fluorescente indică absența altor compuși cumarinici (precum fraxină) și confirmă puritatea substanțelor - probă analizată ca fiind similară substanțelor de referință. 33

Testul nr. 2. Evaluarea cantitativă a esculinei și esculetinei prin HPLC

Reactivi și metodă 35

Evaluarea cantitativă prin HPLC s-a efectuat conform metodologiei generale de analiză prin HPLC a hidroxi-cumarinelor naturale, aplicându-se metoda publicată de Gordana 37

Stanic și colab.[27], în scopul determinării prin HPLC a esculinei și fraxinei din extractele metanolice ale scoarței de Aesculus hippocastanum, care prevede următorii parametri de 39 lucru;

- separarea substanțelor cumarinice pe o coloană cu fază inversă; 41

- eluția coloanei cu faza mobilă constituită din amestec de acid acetic 1% și metanol în raportul 84:16 (v/v); 43

- cuantificarea datelor prin măsurarea absorbantei în UV la 340 nm.

Testul nr. 3. Evaluarea cantitativă a esculinei și esculetinei prin spectrometrie de 45 absorb fie moleculară în VIS

RO 122254 Β1

Reactivi și metode

0,050 g substanță de analizat se dizolvă în 100 ml alcool etilic 96% (soluție A), 5,0 ml soluție A se diluzează, cu alcool etilic 96% la 100 ml (soluție B), măsurându-se absorbția la 340 nm și calculându-se conținutul % în raport cu substanța de referință.

REZULTATE EXPERIMENTALE OBȚINUTE ÎN CADRUL EVALUĂRILOR CANTITATIVE

Dozarea esculinei și esculetinei în stare pură, prin HPLC și spectrometrie de absorbție moleculară în VIS

Nr. pro- bă	Esculină%	Esculetină %
HPLC	Spectrometrie	HPLC	Spectro- metrie
	Aesculus hippocastanum	Fraxinus species	Aesculus hippocastanum	Fraxinus species
1	98,3	98,1	98,5	98,3	98,1	98,4
2	98,5	98,3	98,7	98,5	98,3	98,6
3	98,8	98,6	98,9	99,1	98,2	98,3
4	99,1	98,8	99,6	99,3	98,5	98,8

CARACTERISTICI ANALITICE ALE ESCULINEI

Nr. crt.	Caracteristici analitice	Specificații standard de calitate
1.	Denumire	Aesculin 6,7 dihidroxi-cumarin-6glucozida
2.	Formula moleculară	C15H16Og-1,5 H2O
3.	Greutate moleculară	367,3
4.	Proprietăți fizice: - descriere	- pulbere microcristalină albă, cu aspect strălucitor, fără gust sau miros
	- solubilitate	- insolubilă în apă rece, solubilă în apă la fierbere, în amestecuri hidroalcoolice sau hidroacetonice, moderat solubilă în alcooli monohidroxilici, insolubilă în
	- punct de topire	solvenți organici nepolari -2O3...2O5°C
5.	Identificare: - cromatografie în strat subțire	- un singur spot cu Rf = 0,62

RO 122254 Β1

Tabel (continuare)

Nr. crt.	Caracteristici analitice	Specificații standard de calitate
6.	Determinare cantitativă Conținut esculină % - metoda HPLC - metoda spectrometrică	- minimum 98% - minimum 98%
7.	Pierdere prin uscare %	- maximum 1,0
8.	Reziduu la calcinare %	- maximum 0,1
9.	Controlul purității - metale grele - reziduu solvenți organici	- maximum 10 ppm - absent
10.	Contaminare microbiană - nr. total bacterii aerobe, ufc/ml - nr. total levuri și fungi filamentoși /ml - bacterii condiționat patogene • Enterobacteriaceae/m I •Staphylococcus aureuslm\ •Escherichia coli/m\ •Salmonella typhimurium/W g	- maximum 104 - maximum 102 - maximum 102 - maximum 102 - absent - absent - absent
11.	Conservabilitate	- minimum 3 ani, la temperatura ambiantă (2O...25°C) în containere etanșe, ferit de lumină și umiditate

CARACTERISTICI ANALITICE ALE ESCULETINEI

Nr. crt.	Caracteristici analitice	Specificații standard de calitate
1.	Denumire	Aesculin; 6,7 dihidroxi-cumarin-6-glucozida
2.	Formula moleculară	CgFIgC^
3.	Greutate moleculară	178,14
4.	Proprietăți fizice: - descriere	- pulbere microcristalină albă, cu aspect strălucitor, fără gust sau miros
	- solubilitate	- insolubilă în apă, în amestecuri hidroalcoolice sau hidroacetonice, solubilă în alcooli monohidroxilici, acetonă, acetat de etil și solvenți organici nepolari
	- punct de topire	- 266...271 °C

RO 122254 Β1

Tabel (continuare)

Nr. crt.	Caracteristici analitice	Specificații standard de calitate
5.	Identificare: - cromatografie în strat subțire	- un singur spot cu Rf = 0,84
6.	Determinare cantitativă Conținut esculină % - metoda HPLC - metoda spectrometrică	- minimum 98% - minimum 98%
7.	Pierdere prin uscare %	- maximum 1,0
8.	Reziduu la calcinare %	- maximum 0,1
9.	Controlul purității - metale grele - reziduu solvenți organici	- maximum 10 ppm - absent
10.	Contaminare microbiană - nr. total bacterii aerobe, ufc/ml - nr. total levuri și fungi filamentoși /ml - bacterii condiționat patogene •Enterobacteriaceae/m\ •Staphylococcus aureuslm\ •Escherichia colilm\ •Salmonella typhimurium/îO g	- maximum 104 - maximum 102 - maximum 102 - maximum 102 - absent - absent - absent
11.	Conservabilitate	- minimum 3 ani, la temperatura ambiantă (2O...25°C) în containere etanșe, ferit de lumină și umiditate

Procedeul conform invenției utilizează apa structurată „I” cu pH acid = 1,8...2,6 în componența solvenților necesari pentru efectuarea fazelor tehnologice, ceea ce determină o creștere a selectivității și a randamentelor proceselor de extracție, purificare, cristalizare și separare a celor două produse cumarinice realizate conform invenției.

Apa structurată „I” - activată inhibitor - se obține prin introducerea unei ape demineralizate sau distilate, îmbogățită, controlat, cu săruri minerale, pentru a atinge valori ale conductivității între 250 și 450 pS, într-o coloană paralelipipedică, chimic neutră, cu mai multe celule de structurare compuse din activatoare cu câte 2 electrozi lamelari, unul negativ și altul pozitiv, din plasă inox, dispuși de o parte și de alta a unui sandvici de membrane poroase, inerte chimic, și în urma proceselor de interacție dintre structurile moleculare dipolare ale apei cu câmpul electrostatic generat între electrozi, are loc un proces prin care se asigură ordonări, polarizări și energia necesară de legare prin punți de hidrogen cu radicali negativi [R ], rezultând apă structurată „I” cu pH = 1,8...2,6 și conductivitate între 1200 și 2500 pS, care se evacuează din spațiile din stânga, respectiv dreapta electrozilor pozitivi ai fiecărui activator.

Claims (9)

1. Revendicări 1

   1. Procedeu de obținere a esculetinei în stare pură, din scoarța de Aesculus hippocastanum 3 sau din scoarța de Fraxinus species, caracterizat prin aceea că materia primă vegetală se supune unor serii de extracții succesive, efectuate cu un amestec constituit din 70...80% acetonă 5 și 20...30% apă structurată “I”, urmate de etape de filtrare, concentrare sub vid, uscare și pulverizare, având ca rezultat obținerea în mod succesiv a unui total de glicozide cumarinice, 7 cu următorul conținut: 65...72% esculină, 20...22% fraxinăși 5...6% taninuri catechinice, esculină purificată cu conținut de 90% esculină și 4...5% fraxină, după care esculină în stare pură, 9 cristalizată, cu un conținut de 98%, se supune unui proces de hidroliză acidă cu un amestec

   1:1 v/v alcool metilic - apă structurată “I”, rezultând o suspensie, la care se adaugă sub reflux 11

   5% HCI și 5 volume diclormetan m/v, pentru hidroliza și dizolvarea esculetinei, obținându-se esculetina amorfă cu un conținut de 96%, care se dizolvă în acetonă, se diluează cu apă distilată, 13 se filtrează sub vid, se usucă și se pulverizează, obținându-se esculetina pură, cristalizată, cu conținut de 98%. 15
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că materia primă vegetală, constituită din scoarța de Aesculus hippocastanum cu un conținut de 4% esculină sau 17 de Fraxinus species cu un conținut de 3% esculină în stare uscată și pulverizată, se extrage în raportul 1/20 m/v, cu soventul de extracție constituit din 70...80% acetonă cu 20...30% apă 19 structurată Ί” cu pH acid = 1,8...2,6, prin percolare continuă, timp de 12 h, la 2O...3O°C, soluția extractivă filtrată se concentrează sub vid, la 35...40°C, în raportul 1/20 v/v față de volu- 21 mul inițial, rezultând o suspensie care se menține 12 h la 5...10°C, după care se filtrează sub vid, precipitatul obținut după uscare timp de 4 h la 105°C și pulverizare constituind totalul de 23 glicozide cumarinice, cu un conținut de 65...72% esculină, 20...22% fraxină și 5...6% taninuri catechinice. 25
3. 3. Procedeu conform revendicări 1 și 2, caracterizat prin aceea că totalul de glicozide cumarinice se dizolvă în raportul 1/100 m/v în amestec de solvenți constituit din 27 70...80% acetonă cu 20...30% apă structurată “I” cu pH acid = 1,8...2,6, prin încălzire la reflux la 60°C, iar soluția obținută, răcită la 2O...25°C, se purifică prin adsorbție cu 10% m/m 29 cărbune activ la 4O...5O°C, sub agitare, timp de 1 h, și răcire la 2O...3O°C, care după filtrare se concentrează sub vid la 35...40°C, până la 1/10 v/v față de volumul inițial, rezultând o 31 suspensie care se menține timp de 12 h la 5...10°C, din care, după filtrarea sub vid și uscarea precipitatului la 105°C timp de 4 h și pulverizare, rezultă esculină purificată, cu un 33 conținut de 90% esculină și 4...5% fraxină.
4. 4. Procedeu conform revendicărilor 1...3, caracterizat prin aceea că esculină 35 purificată se dizolvă în raportul 1/80 m/v în amestec de solvenți constituit din 70...80% acetonă cu 20...30% apă structurată Ί” cupH acid = 1,8...2,6, prin încălzire la reflux la 60°C, 37 timp de 1/2 h, iar soluția obținută se purifică prin adsorbție cu 5% m/m cărbune activ, se filtrează, după care se concentrează sub vid până la 1/5...1/6 v/v față de volumul inițial, 39 rezultând o suspensie, care după menținerea 24 h la 5...10°C se filtrează sub vid, iar precipitatul se spală pe filtru cu 0,5 I apă distilată, răcită la 5...10°C, până la pH neutru, se 41 usucă la 105’C timp de 4...6 h până la greutate constantă, se pulverizează, obținându-se esculină în stare pură, cristalizată, cu un conținut de 98%, evaluat prin HPLC. 43
5. 5. Procedeu conform revendicărilor 1...4, caracterizat prin aceea că esculină în stare pură, cristalizată, se supune unui proces de hidroliză acidă, cu 10 volume mediu de 45 hidroliză, alcătuit din amestec 1 : 1 v/v alcool metilic - apă structurată “I”, suspensia se încălzește la 6O...7O°C, sub agitare, adăugându-se sub reflux 5% HCI ca agent de hidroliză 47

   RO 122254 Β1

   1 și 5 volume diclormetan m/v ca agent de dizolvare a esculetinei rezultate prin hidroliză, hidroliză care se efectuează în mediu heterogen de solvenți nemiscibili la 6O...7O°C, timp de

   3 3 h, după care, din mediul de hidroliză răcit la 2O...3O°C, se separă faza diclormetanică, care se concentrează la presiune normală la 40°C până la reziduu sico, constituit din esculetină

   5 amorfă, cu un conținut de 96%.
6. 6. Procedeu conform revendicărilor 1...5, caracterizat prin aceea că esculetină 7 amorfă se dizolvă în 10 volume m/v acetonă, prin încălzire la reflux, soluția obținută se diluează cu 1/2 volum apă distilată, când se formează o suspensie, care după menținere 24 h
7. 9 la 5...
8. 10°C, filtrare sub vid și spălare a precipitatului pe filtru cu 100 ml apă distilată, se usucă la 105°C timp de 3...4 h până la greutate constantă și se pulverizează, obținându-se
9. 11 esculetină pură, cristalizată, cu conținut de 98%, evaluat prin HPLC.