PT99908A

PT99908A - PROCESS FOR THE PREPARATION OF PHENOXANES AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM

Info

Publication number: PT99908A
Application number: PT99908A
Authority: PT
Inventors: Gerhard Hoefle; Hans Reichenbach; Wolfram Trowitzsch-Kienast; Edgar Forche; Klaus Gerth; Herbert Irschik; Rolf Jansen; Brigitte Kunze; Florenz Sasse; Norbert Bedorf; Heinrich Steinmetz
Original assignee: Ciba Geigy Ag; Biotechnolog Forschung Gmbh
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1992-12-31
Also published as: IL100453A0; ZA9110053B; AU9068891A; WO1992011257A1; IE914520A1; DE4041282A1; MX9102729A

Description

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Como meio nutritivo é preferido usar uma solução ou suspensão aquosa que contem fontes apropriadas de carbono e de azoto assim como sais minerais. Fontes de carbono e de azoto particularmente apropriadas são substancias orgânicas complexas, tais como proteínas e hidrolisados de proteína, típicamente caseina e proteína unicelular (tal como a partir de Methvlomonas çlarae), e também agar de levedura. Sais minerais apropriados incluem típicamente cloretos, carbonatos, sulfatos e fosfatos de metais alcalinos e, mais particularmente, de metais terrosos alcalinos, por exemplo sódio, potássio e, de preferência, cálcio < e magnésio, e também misturas de elementos vestigiais comercial mente disponíveis. É também vantajoso adicionar ainda substancias promotoras do crescimento, especialmente vitaminas, convenientemente sob a forma de soluções de vitaminas padronizadas comercialmente disponíveis. É preferido usar os meios nutritivos utilizados nos Exemplos aqui indicados. A cultura é realizada aerõbicamente, isto é convenientemente em culturas à superfície em repuso, ou de preferência submersa com vibração ou agitação introduzindo-se entretanto ar ou oxigénio no frasco ou fermentador agitado. A cultura é de preferência realizada numa gama de pH neutro, isto é a um pH de cerca de 6-8, de preferência com pH 7, e numa gama de temperatu-ras variando entre 25-35°C, de preferência a cerca de 30°C. 0 tempo de cultura é de preferência de 3 a 5 dias.As the nutrient medium it is preferred to use an aqueous solution or suspension containing appropriate carbon and nitrogen sources as well as mineral salts. Particularly suitable carbon and nitrogen sources are complex organic substances, such as proteins and protein hydrolysates, typically casein and unicellular protein (such as from Methvlomonas çlarae), as well as yeast agar. Suitable mineral salts typically include alkali metal chlorides, carbonates, sulfates and phosphates and, more particularly, of alkali earth metals, for example sodium, potassium and, preferably, calcium < and magnesium, and also mixtures of trace elements commercially available. It is also advantageous to further add growth promoting substances, especially vitamins, conveniently in the form of commercially available standard vitamin solutions. It is preferred to use the nutrient media used in the Examples herein. The culture is performed aerobically, i.e. conveniently in over-the-counter or preferably submerged crops with vibration or agitation, while introducing air or oxygen into the shaken flask or fermenter. The culture is preferably carried out in a neutral pH range, i.e. at a pH of about 6-8, preferably at pH 7, and in a temperature range ranging from 25-35 ° C, preferably at about 30 ° C. The culture time is preferably from 3 to 5 days.

Para isolar o fenoxano, a biomassa é separada do caldo de cultura quando a cultura está completa, e é extraída com um solvente aprótico dipolar, orgânico. Solventes apróticos dipola-res apropriados incluem ésteres de ácidos alifáticos, tipicamente ésteres de alquilo inferior, tais como ésteres metílicos ou etílicos, de ácido acético, e éteres, tais como tetrahidrofurano e dioxano, e cetonas alifáticas, tais como acetona. Após 5To isolate the phenoxane, the biomass is separated from the culture broth when the culture is complete, and is extracted with an organic, dipolar, aprotic solvent. Appropriate dipolar aprotic solvents include esters of aliphatic acids, typically lower alkyl esters, such as methyl or ethyl esters of acetic acid, and ethers, such as tetrahydrofuran and dioxane, and aliphatic ketones, such as acetone. After 5

concentração do extracto, o resíduo é dividido entre água e um solvente aprótico dipolar, orgânico não miscível com a água, convenientemente um dos ésteres atrás mencionados. Após concentração da fase orgânica, o resíduo é dividido entre um alcanol inferior (isto é C^-C^) , tal como etanol ou, de preferência, metanol, e um hidrocarboneto inferior, de preferência um hidro-carboneto alifático, que é não miscível com o referido alcanol, tipicamente hexano ou heptano. A fase alcanólica é isolada e concentrada, e o resíduo é misturado com um éter alifático inferior, de preferência um di(C^-C^)éter, tal como éter dietíli-co ou, de preferência, éter terc-butilmetílico e, se necessário, filtrado sobre gel de sílica. Para se obter fenoxano puro, a solução etérea é diluida com éter de petróleo e arrefecida. 0 fenoxano cristalizado pode ser submetido a posterior cristalização a partir de éter terc-butilmetílico. O fenoxano da fórmula indicada pode ser cos-trans-iso-merizado por radiação UV no que se refere ao agrupamento 1-fenil--1-propen-i-ilo. O invento consequentemente relaciona-se também com os isómeros puros assim como suas misturas. As misturas de isómeros podem ser separadas por métodos convencionais, tais como métodos cromatográficos, nos isómeros individuais.concentration of the extract, the residue is partitioned between water and a non-water miscible organic, dipolar, aprotic solvent, conveniently one of the aforementioned esters. After concentration of the organic phase, the residue is partitioned between a lower (C 1 -C 4) alkanol, such as ethanol or, preferably, methanol, and a lower hydrocarbon, preferably an aliphatic hydrocarbon, which is not soluble with said alkanol, typically hexane or heptane. The alkanol phase is isolated and concentrated, and the residue is admixed with a lower aliphatic ether, preferably a di (C1 -C4) ether, such as diethyl ether or, preferably, tert-butylmethyl ether and, if desired, necessary, filtered on silica gel. To obtain pure phenoxane, the ethereal solution is diluted with petroleum ether and cooled. The crystallized phenoxane may be subjected to further crystallization from tert-butyl methyl ether. The phenoxane of the indicated formula can be cos-trans-isomerised by UV radiation with respect to the 1-phenyl-1-propen-1-yl group. The invention therefore also relates to the pure isomers as well as mixtures thereof. Mixtures of isomers may be separated by conventional methods, such as chromatographic methods, into the individual isomers.

Os novos compostos apresentam propriedades úteis, especialmente farmacológicamente úteis, e podem ser usados para a prevenção e tratamento de doenças num mamífero, tal como um ser humano ou um animal. São, por exemplo, apropriados para o tratamento de doenças autoimunitárias tais como a artrite reumática, esclerose múltipla, diabetes mellitus dependente da insulina, psoríase e lupus eritematoso sistémico, assim como doenças alérgicas tais como doenças alérgicas mediadas por IgE e asma. Além disso, inibem a rejeição dos enxertos por células T. - 6The novel compounds have useful, especially pharmacologically useful, properties, and may be used for the prevention and treatment of diseases in a mammal, such as a human or animal. They are, for example, suitable for the treatment of autoimmune diseases such as rheumatic arthritis, multiple sclerosis, insulin dependent diabetes mellitus, psoriasis and systemic lupus erythematosus, as well as allergic diseases such as allergic diseases mediated by IgE and asthma. In addition, they inhibit rejection of T-cell grafts.

O invento também se relaciona com composições farmacêuticas que contêm fenoxano juntamente com veículos e/ou diluentes habituais. São preferidas composições para administração entérica, especialmente oral, assim como parentérica. De preferência, a composição contem o ingrediente activo conjuntamente com um veículo farmacêuticamente aceitável. yThe invention also relates to pharmaceutical compositions containing phenoxane together with usual carriers and / or diluents. Compositions for enteral, especially oral, as well as parenteral administration are preferred. Preferably, the composition contains the active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier. and

As composições farmacêuticas contêm cerca de 5% a 95% do ingrediente activo, contendo as formulações sob a forma de unidade de dosagem simples de preferência cerca de 20% a 90% do ^ ingrediente activo, e as formulações não sob a forma de unidade de dosagem simples contendo de preferência cerca de 5% a 20% de ingrediente activo. As formas de unidade de dosagem tais como grageias, comprimidos ou cápsulas contêm de cerca de 0,01 g a 1,0 g de ingrediente activo.The pharmaceutical compositions contain about 5% to 95% of the active ingredient, containing the formulations in single dosage form preferably about 20% to 90% of the active ingredient, and the formulations not in the form of a dosage containing preferably about 5% to 20% active ingredient. Unit dosage forms such as dragees, tablets or capsules contain from about 0.01 g to 1.0 g of active ingredient.

As composições farmacêuticas do presente invento são preparadas de um modo conhecido per se. por exemplo por métodos convencionais de mistura, granulação, confecção de doçarias, dissolução ou liofilização. As composições farmacêuticas para administração oral podem ser convenientemente obtidas por combinação do ingrediente activo com veículos sõlidos, facultativamente granulando uma mistura resultante e processando a mistura ou granulado, se desejado ou necessário após a adição de excipientes apropriados, a núcleos de comprimidos ou grageias.The pharmaceutical compositions of the present invention are prepared in a manner known per se. for example by conventional methods of mixing, granulating, confectioning, dissolving or lyophilizing. Pharmaceutical compositions for oral administration may conveniently be obtained by combining the active ingredient with solid carriers, optionally granulating a resulting mixture and processing the mixture or granulate, if desired or necessary after addition of suitable excipients, to tablets or dragee cores.

Veículos apropriados são em particular agentes de enchimento tais como açucares, convenientemente lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose e/ou foafatos de cálcio, tipicamente fosfato tricálcico ou bifosfato de cálcio, e também agentes de ligação tais como pastas de amido, tipicamente amido de maís, milho, arroz ou batata, gelatina, tragacanto, metil celulose e/ou polivinilpirrolidona, e/ou, se desejado, agentes de desintegração, tais como os amidos atrás referidos, também amido carboximetílico, polivinilpirrolidona de ligação cruzada, agar, ácido algínico, ou um seu sal tal como alginato de sódio. Excipientes são em particular agentes de deslizamento e lubrificantes, convenientemente sílica, talco ácido esteárico ou seus sais, tais como estearato de magnésio ou estearato de cálcio, e/ou polietileno glicol. Os núcleos das grageias podem ser proporcionados com revestimentos apropriados não entéricos ou entéricos, tipicamente usando soluções concentradas de açúcar que podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de goma laca em solventes orgânicos apropriados ou misturas de solventes ou, para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de preparações apropriadas de celulose tais como ftalato de acetil celulose ou ftalato de hidroxipropil metil celulose. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou grageias, por exemplo para identificar ou indicar doses diferentes do ingrediente activo.Suitable carriers are in particular fillers such as sugars, suitably lactose, sucrose, mannitol or sorbitol, cellulose preparations and / or calcium phosphates, typically tricalcium phosphate or calcium biphosphate, and also binding agents such as starch pastes, typically corn starch, maize, rice or potato, gelatin, tragacanth, methyl cellulose and / or polyvinylpyrrolidone, and / or, if desired, disintegrating agents, such as the aforementioned starches, also carboxymethyl starch, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar , alginic acid, or a salt thereof such as sodium alginate. Excipients are in particular glidants and lubricants, conveniently silica, talc stearic acid or its salts, such as magnesium stearate or calcium stearate, and / or polyethylene glycol. The dragee cores may be provided with suitable non-enteric or enteric coatings, typically using concentrated sugar solutions which may contain gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and / or titanium dioxide, lacquer solutions in appropriate organic solvents or mixtures solvents or, for the preparation of enteric coatings, solutions of suitable cellulose preparations such as acetyl cellulose phthalate or hydroxypropyl methyl cellulose phthalate. Dyes or pigments may be added to tablet or dragee coatings, for example to identify or indicate different doses of the active ingredient.

Outras composições farmacêuticas para administração oral são cápsulas cheias a seco feitas de gelatina e também cápsulas seladas-moles contendo gelatina e um agente de plasticidade tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas cheias a seco podem conter o ingrediente activo sob a forma de grânulos, convenientemente em mistura com agentes de enchimento tais como lactose, agentes de ligação tais como amidos, e/ou agentes de deslizamento tais como talco ou estearato de magnésio, e com ou sem estabilizadores. Em cápsulas moles, o ingrediente activo é de preferência dissolvido ou suspenso num líquido apropriado, tipicamente um óleo gordo, óleo de parafina ou um polietileno glicol líquido, ao qual pode também ser adicionado um estabilizador. 8Other pharmaceutical compositions for oral administration are dry filled capsules made of gelatin and also sealed-soft capsules containing gelatin and a plasticizer such as glycerol or sorbitol. Dry-filled capsules may contain the active ingredient in the form of granules, conveniently in admixture with fillers such as lactose, binders such as starches, and / or glidants such as talc or magnesium stearate, and or without stabilizers. In soft capsules, the active ingredient is preferably dissolved or suspended in a suitable liquid, typically a fatty oil, paraffin oil or a liquid polyethylene glycol, to which a stabilizer may also be added. 8

Composições farmacêuticas apropriadas para administração rectal são tipicamente supositórios, que consistem numa combinação do ingrediente activo com uma base para supositório. Exemplos de bases apropriadas para supositórios são triglicerí-deos naturais ou sintéticos, hidrocarbonetos de parafina, poli-etileno glicois e alcanois superiores.Pharmaceutical compositions suitable for rectal administration are typically suppositories, which consist of a combination of the active ingredient with a suppository base. Examples of suitable bases for suppositories are natural or synthetic triglycerides, paraffin hydrocarbons, polyethylene glycols and higher alkanols.

Formas de dosagem particularmente apropriadas para administração parentérica são suspensões para injecção tipicamente aquosas que podem conter substancias que fazem aumentar a viscosidade, convenientemente carboximetil celulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano, e facultativamente estabilizadores. Além disso, o ingrediente activo, com ou sem adjuvantes, pode também apresentar-se sob uma forma liofilizada e ser suspenso antes da administração parentérica por adição de água e, facultativamente, as substancias adicionais mencionadas. O invento também se relaciona com um método para tratar quaisquer doenças especificadas num mamífero, método esse que compreende a administração ao referido mamífero de uma quantidade terapêuticamente eficaz de fenoxano juntamente com veículos farmacêuticamente aceitáveis. A dosagem do ingrediente activo, isto é, fenoxano, irá depender da doença a ser tratada e do estádio da doença, assim como da espécie, idade, peso e condição individual do paciente, e também do modo de aplicação, e será assim seleccionada pelo médico assistente. Por exemplo, as doeças autoimunitárias são usualmente tratadas por meio de uma dose diária durante alguns dias, isto é, 1 a 4 dias. A dose diária quando administrada a um mamífero especialmente um ser humano, de aproximadamente 70 kg de peso corporal, varia entre cerca de 0,3 e cerca de 30 mg/kg. A administração é feita sob a forma de composições farmacêuticas tal como é especificado anteriormente. 9Particularly suitable dosage forms for parenteral administration are typically aqueous injection suspensions which may contain viscosity increasing substances, suitably sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol and / or dextran, and optionally stabilizers. In addition, the active ingredient, with or without adjuvants, may also be present in a freeze-dried form and be suspended prior to parenteral administration by addition of water and, optionally, the additional substances mentioned. The invention also relates to a method for treating any specified diseases in a mammal, which method comprises administering to said mammal a therapeutically effective amount of phenoxane together with pharmaceutically acceptable carriers. The dosage of the active ingredient, i.e., phenoxane, will depend on the disease to be treated and on the stage of the disease, as well as on the species, age, weight and individual condition of the patient, and also on the mode of application, and will thus be selected by physician assistant. For example, autoimmune diseases are usually treated by a daily dose for a few days, i.e. 1 to 4 days. The daily dose when administered to a mammal, especially a human, approximately 70 kg body weight, ranges from about 0.3 to about 30 mg / kg. Administration is in the form of pharmaceutical compositions as specified above. 9

0 invento é ilustrado pelos Exemplos não limitativos que se seguem.The invention is illustrated by the following non-limiting Examples.

Exemplo 1: Condições de Produção 1. Estirpe de produção: bactéria Polvanaium spec., estirpe PI V019, família das Polyanaiaceae. subordem das Soranaineae. ordem dos Mvxobacterales. 2. Origem da estirpe de produção: isolada em Março de 1988 a partir de uma amostra de solo retirada de Efeso, Turquia. 3. Descrição da estirpe de produção: as células vegetativas são cilíndricas com extremidades achatadas, 0,6-0,7 x 2~5μιη. Num meio nutritivo sólido o organismo cresce bem em agar de levedura, por exemplo VY/1 Agar (fermento de padeiro 0,5%, à base do peso fresco; CaCl2*2H2= 0,1%, cianocobalamina 0,5 mg/1, agar 1,5%; pH 7,2). Não é observado qualquer crescimento em meios puros de glucose-sal mineral. As proteínas são rápidamente hidrolisadas, por exemplo caseína ou proteína unicelular. A quitina não é atacada. A estirpe cresce de preferência a 30°C numa gama de pH neutra e aeróbicamente. Em meios nutritivos apropriados a colónia espalha-se gradualmente sobre a placa de cúltura e penetra profundamente no agar. Formam-se na superfície fissuras radiais amplas, curtas. Se estiverem presentes células da levedura no meio nutritivo, elas serão substancialmente degradadas. Após alguns dias podem formar-se corpos de frutificação. Estes consistem em esporangiolos castanhos-acinzentados com cerca de 15-30 μη de diâmetro, que estão densamente reunidos em pilhas planas. No seu interior são encontrados mixosporos, que são morfológicamente muito semelhantes a células vegetativas, mas são células que repousam fisiológicamente resistentes à secagem. Nos meios líquidos a estirpe cresce em pequenos aglomerados de células, tanto num frasco para agitação a 160 rpm (100 ml de meio num frasco Erlenmeyer de 250 ml e 500 ml de meio num frasco Erlen-meyer de 1.000 ml, respectivamente) assim como em bioreactores (testados até uma escala de 60 l). Um meio de cultura apropriado é meio de Poli: Probion PS (proteína unicelular a partir de Methvlomonas clarae: Hoechst, Frankfurt) 0,4%; amido 0,3%; MgS04*7H20 0,1%; CaCl2*2H20 0,05%; 1 ml/1 de solução de elementos vestigiais padronizados (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, 56th ed., p. 174, Thieme-Verlag, Stuttgart 1985), e 1 ml/1 de solução de vitamina padronizada (Schlegel, loc. cit. p. 174) pH 7,0. As culturas são mantidas a 30°C durante 3-4 dias. A estirpe PI V019 pode ser preservada, convenientemente por congelamento a -80°C ou com azoto liquido. 4. Eficácia da estirpe de produção: em extractos celulares, e também nalguns produtos de eluição em XAD (ver mais abaixo) de PI V019, uma actividade anti-HIV é detectável no teste celular. A inibição da transcriptase reversa pode ser detectada in vitro num lisado-HIV assim como em produtos isolados a partir de vírus M-MulV. A substancia contendo pirona foi chamada fenoxano. 5. Acessibilidade da estirpe: a estirpe de produção PI V019 foi depositada no dia 11 de Dezembro de 1990 com o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) (German Collection of Micro-organisms) (Colecção Alemã de Microorganismos) em Braunschweig sob o No. DSM 6270. 6. Detecção de fenoxano: A detecção qualitativa de fenoxano é feita por extracção da biomassa com acetona. Alternativamente, as culturas podem também ser agitadas com XAD 1180 (ex Rohm & Haas, Frankfurt) e e o produto eluido com XAD após passagem por crivo com metanol e acetona. Porções alíquotas dos extractos concentrados são testadas quanto à inibição da transcriptase reversa a 11 partir do Vírus Da Leucemia Murina de Moloney (M-Mul V). No teste da cromatografia de placa delgada, o fenoxano é identificado em comparação com substancia pura isolada. A manipulação, isolamento e caracterização são efectudos de acordo com o Exemplo 3. 7. Condições de produção de fenoxano: Num frasco para agitação, o fenoxano é formado durante o crescimento e atinge uma activida-de máxima no final da fase logarítmica a estacionária precoce após 3-4 dias.Example 1: Production Conditions 1. Production strain: Polvanaium spec. Bacterium, strain PI V019, family of Polyanaiaceae. suborder of the Soranaineae. order of Mvxobacterials. 2. Origin of the production strain: isolated in March 1988 from a soil sample taken from Ephesus, Turkey. 3. Description of the production strain: the vegetative cells are cylindrical with flattened ends, 0.6-0.7 x 2 ~ 5μιη. In a solid nutrient medium the organism grows well on yeast agar, for example VY / 1 Agar (0.5% baker's yeast, fresh weight; CaCl2 * 2H2 = 0.1%, cyanocobalamin 0.5 mg / l , 1.5% agar, pH 7.2). No growth is observed in pure glucose-mineral salt media. Proteins are rapidly hydrolyzed, for example casein or single-cell protein. Chitin is not attacked. The strain preferably grows at 30øC in a neutral and aerobically pH range. In appropriate nutrient media the colony gradually spreads over the culture plate and penetrates deeply into the agar. Wide, short, radial fissures form on the surface. If yeast cells are present in the nutrient medium, they will be substantially degraded. After a few days fruiting bodies can form. These consist of brownish-gray sporangiols with about 15-30 μη in diameter, which are densely packed in flat cells. Inside, mixospores are found, which are morphologically very similar to vegetative cells, but are physiologically resistant to drying cells. In the liquid media the strain is grown in small agglomerates of cells, both in a shake flask at 160 rpm (100 ml medium in a 250 ml Erlenmeyer flask and 500 ml medium in a 1000 ml Erlenmeyer flask, respectively) as well as in bioreactors (tested up to a scale of 60 l). An appropriate culture medium is Poly: Probion PS (unicellular protein from Methvlomonas clarae: Hoechst, Frankfurt) 0.4%; 0.3% starch; 0.1% MgSO 4 · 7H 2 O; 0.05% CaCl2 · 2H2 O; 1 ml / 1 standardized test solution (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, 56th ed., 174, Thieme-Verlag, Stuttgart 1985), and 1 ml / 1 standardized vitamin solution (Schlegel, loc. 174) pH 7.0. Cultures are maintained at 30 ° C for 3-4 days. The PI strain V019 may be preserved, conveniently by freezing at -80øC or with liquid nitrogen. 4. Efficacy of the production strain: in cell extracts, and also in some XAD elution products (see below) of PI V019, an anti-HIV activity is detectable in the cell assay. Inhibition of reverse transcriptase can be detected in vitro in an HIV lysate as well as in products isolated from M-MulV virus. The substance containing pyrone was called phenoxane. 5. Accessibility of the strain: the production strain PI V019 was deposited on 11 December 1990 with the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) (German Collection of Microorganisms) in Braunschweig under No. DSM 6270. 6. Detection of phenoxane: The qualitative detection of phenoxane is made by extraction of the biomass with acetone. Alternatively, the cultures may also be agitated with XAD 1180 (ex Rohm & Haas, Frankfurt) and the product eluted with XAD after sieving with methanol and acetone. Aliquots of the concentrated extracts are tested for inhibition of reverse transcriptase from the Moloney Murine Leukemia Virus (M-Mul V). In the thin-plate chromatography test, phenoxane is identified in comparison with isolated pure substance. The manipulation, isolation and characterization are carried out according to Example 3. 7. Phenoxane production conditions: In a vial for stirring, phenoxane is formed during growth and reaches a maximal activity at the end of the logarithmic phase to early stationary after 3-4 days.

Exemplo 2: Fermentação num biorreactorExample 2: Fermentation in a bioreactor

Bioreactor 65 1 (b50) ex Giavanola Frères, Monthey,Bioreactor 65 1 (b50) ex Giavanola Frères, Monthey,

Switzerland, com agitador de lâmina. Meio: Probion PS (proteína unicelular a partir de Methvlomonas clarae: Hoechst, Frankfurt) 0,4%; MgS04-7H20 0,1%; CaCl2· 211^0 0,05%; 1 ml/1 cada de solução padronizada de elemento vestigial e vitamina (Schlegel, loc. cit.), pH 7,2. 60 1 de meio são inoculados com 5 1 de uma cultura a partir de frascos de agitação bem cultivados. A taxa de arejamento é ajustada para 200 Nl/hora, a velocidade até 200 rpm. O valor p02, que é de 90% de saturação no início da fermentação, desce contínuamente até 50% até a fermentação ficar completa após 100 horas. O pH aumenta no decurso da fermentação de 7,0 a 7,5. 3$) Nos extractos celulares, também nalguns produtos de eluição com XAD (ver atrás) de PI V019, é detectável uma activi-dade antibiótica contra alguns fungos (por exemplo Botrvtis çinerea). Porções alíquotas dos extractos concentrados são ainda testadas contra fungos no teste de difusão de agar. No teste de cromatografia de placa delgada, o fenoxano é identificado em comparação com substancia pura isolada. 12Switzerland, with blade agitator. Medium: Probion PS (unicellular protein from Methvlomonas clarae: Hoechst, Frankfurt) 0.4%; 0.1% MgSO4 · 7H2 O; CaCl2 · 211 · 0-0.05%; 1 ml / 1 each of standardized trace element and vitamin solution (Schlegel, loc. Cit.), PH 7.2. 60 1 of medium are inoculated with 5 1 of a culture from well-cultured shake flasks. The aeration rate is set to 200 Nl / hour at speed up to 200 rpm. The p02 value, which is 90% saturation at the beginning of the fermentation, drops steadily up to 50% until the fermentation is complete after 100 hours. The pH increases in the course of the fermentation from 7.0 to 7.5. In cell extracts, also in some XAD elution products (see above) of PI V019, an antibiotic activity against some fungi (for example Botrvtis çinerea) is detectable. Aliquot portions of the concentrated extracts are further tested against fungi in the agar diffusion test. In the thin plate chromatography test, phenoxane is identified in comparison with isolated pure substance. 12

Exemplo 3: Isolamento e caracterização de fenoxano 615 g de biomassa húmida são obtidos a partir de uma fermentação de 60 1 da estirpe Pl V019 e extraídos 4 vezes com cerca de 150 ml de acetona. Os extractos combinados são concentrados sob vácuo e o resíduo é dividido entre acetato de etilo e água. No caso de fraca separação de fase, adiciona-se solução de NaCl. A fase orgânica é concentrada (7,7 g) e o resíduo é dividido entre metanol e heptano. 3,9 g do produto crú a partir da fase de metanol são misturados com éter terc-butilmetílico e filtrados sobre 50 ml de gel de sílica. O produto crú (3,2 g) eluido com éter terc-butilmetílico é subsequentemente filtrado em éter butilmetílico sobre 100 ml de Florisil. O produto eluido contendo fenoxano é armazenado para cristalização a partir de éter terc--butilmetílico/éter de petróleo. 185 mg de fenoxano cristalino são separados. São obtidos mais 68 mg após cristalização dos líquidos mãe combinados.Example 3: Isolation and characterization of phenoxane 615 g of wet biomass are obtained from a 60 l fermentation of strain Pl V019 and extracted 4 times with about 150 ml of acetone. The combined extracts are concentrated in vacuo and the residue is partitioned between ethyl acetate and water. In the case of poor phase separation, NaCl solution is added. The organic phase is concentrated (7.7 g) and the residue is partitioned between methanol and heptane. 3.9 g of the crude product from the methanol phase are mixed with tert-butyl methyl ether and filtered over 50 ml of silica gel. The crude product (3.2 g) eluted with tert-butyl methyl ether is subsequently filtered into butylmethyl ether over 100 ml of Florisil. The eluted product containing phenoxane is stored for crystallization from tert-butyl methyl ether / petroleum ether. 185 mg of crystalline phenoxane are separated. A further 68 mg is obtained after crystallization of the combined mother liquors.

Propriedades físicas e químicas do fenoxano HPLC analítica: Coluna (<p· comprimento) 4*250 mm, embalada com HD-Sil 18-5-100 (ex Kronwald), detecção por absorção UV a 210-250 nm, eluente metanol/água (80:20), fluxo 1,5 ml/min, tR=7,9 min; p.f. 92-94°C. UV (Metanol) lambdam^ (e/lg €)=204 (75420/4,877), 229Physical and chemical properties of phenoxane Analytical HPLC: Column (<p · length) 4 * 250 mm, packed with HD-Sil 18-5-100 (ex Kronwald), UV absorption detection at 210-250 nm, eluent methanol / water (80:20), flow 1.5 ml / min, t R = 7.9 min; mp 92-94 ° C. UV (methanol) λmax (æl / æl) = 204 (75420 / 4,877), 229

JuaX (53850/4,731), 244 (sh), 252 (sh), 262 (sh), 274 nm (sh). 1H-RMN ([D4]metanol, 600,127 MHz): í=8,39 (s, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,19 (m, 3H), 6,33 [S, lH(br.)], 4,10 (s, 3H), 3,15 (t, 1H, J=7,4Hz), 2,88 (q, 3H, J=7,4Hz), 2,72 (t, 1H,J=7,4Hz(br.)], 1,93 (d, 3H,J=l,2Hz), 1,88 (s, 3H), 1,11 ppm (t, 3H, J=7,4Hz); I3c-RMN ([D4]metanol, 75,5 MHz): $=182,65 S, 166,89 S, 164,46 s, 149,75 S 140,70 d, 139,58 s, 137,80 s, 135,31 s, 130,00 d (2C) , 129,22 d (2C), 127,84 d, 127,42 d, 126,37 s, 101,11 s, 56,85 q, 38,82 t, 27,85 t, 18,58 t, 17,76 q, 140,00 q, 7,30 q. (+)FAB Espectroscopia de Massa (xenon, glicerina matriz), m/z=380 [M+H]+: EI—MS (70 eV, 160 C, m/z>90): M/z (%)=379 (100), 365(22), 364(88), 336(5), 323(14), 308(13), 234(49), 207(10), 194(18), 192(12), 171(14), 156(16), 143(11), 131(69), 129(37), 128(17), 116(26), 115(31), 91(92).JuaX (53850 / 4,731), 244 (sh), 252 (sh), 262 (sh), 274 nm (sh). 1 H-NMR ([D 4] methanol, 600.177 MHz): δ 8.39 (s, 1H), 7.30 (m, 2H), 7.19 (m, 3H), 6.33 [ br)), 4.10 (s, 3H), 3.15 (t, 1H, J = 7.4Hz), 2.88 (q, 3H, J = 7.4Hz), 2.72 (t, 1H, J = 7.4Hz (br.)], 1.93 (d, 3H, J = 1.2Hz), 1.88 (s, 3H), 1.11ppm (t, 3H, J = 4Hz); 13 C-NMR ([D4] methanol, 75.5 MHz): δ = 182.65 S, 166.89 δ, 164.46 s, 149.75 δ 140.70 d, 139.58 s, 137 , 80.00, 135.31 s, 130.00 d (2 C), 129.22 d (2 C), 127.84 d, 127.42 d, 126.37 s, 101.11, (+) FAB Mass Spectroscopy (xenon, glycerin matrix), m / z = 380 [M + H] +. M + H] +: EI-MS (70 eV, 160 C, m / z> 90): M / z (%) = 379 (100), 365 (22), 364 (88), 336 (5), 323 (14), 308 (13), 234 (49), 207 (10), 194 (18), 192 (12), 171 (14), 156 (16), 143 (11) 129 (37), 128 (17), 116 (26), 115 (31), 91 (92).

Separação elevada: C23H25N°4 calc· 379.1783 encontrados 379.1781 (EI-MS).High separation: C 23 H 25 N 4 Calc 379.1783 found 379.1781 (EI-MS).

Exemplo 4: Caracterização biológica do fenoxanoExample 4: Biological characterization of phenoxane

Actividade antibiótica A actividade antibiótica é determinada em teste de difusão de agar a partir da zona de inibição, no teste de séries de diluição a partir da densidade da cultura, o fenoxano inibe o crescimento de alguns fungos, por exemplo hisfflâlia, tis .gjp.erea, Gibberella fuiikuroi. Rhizoous arrhizus. Pvthium debaryanum. A CIM para Ustilaao mavdis é de 19 ng/ml.Antibiotic activity Antibiotic activity is determined in agar diffusion test from the inhibition zone, in the dilution series test from the density of the culture, phenoxane inhibits the growth of some fungi, for example histilia, tis .gjp. erea, Gibberella foramikuroi. Rhizoous arrhizus. Pvthium debaryanum. The MIC for Ustilaao mavdis is 19 ng / ml.

Inibição da oxidação NADH O fenoxano inibe a oxidação NADH de partículas submito-condriais de corações bovinos. Investigações por espectroscopia diferencial indica como sitio de actividade para fenoxano o complexo I(NADH: oxidoreductase da ubiquinona) da cadeia respiratória eucariótica.Inhibition of NADH oxidation Phenoxane inhibits the NADH oxidation of submito-condylar particles of bovine hearts. Investigations by differential spectroscopy indicate the I-complex (NADH: ubiquinone oxidoreductase) of the eukaryotic respiratory chain as the site of activity for phenoxane.

Injfrjgâ? da_proliferação de linfocitos T separados de ficoll humano induzida por derivado proteico purificado (PPD\ Método: Sangue venoso heparinizado (10 U heparina/ml, liquemina, Roche) é diluído 1:2 em PBS e colocado em camada sobre um meio volume de Ficoll-Hypaque (Pharmacia( (por exemplo: 15 ml ficoll + 30 ml de sangue/PBS em tubo cónico de 50 ml). Tubos são centrifu-gados a 2.000 g durante 10 minutos (ou 500 g durante 45 minutos) à temperatura ambiente sem interrupção. A interface é recolhida suavemente e lavada 2-3 vezes com PBS ou BSS e suspensa de novo em RPMI 1640 suplementado com ou 5% de soro humano reunido ou com 10% de soro de vitelo fetal. A viabilidade é determinada e a densidade celular é ajustada para 0,7-1 x 106 células/ml. Após a adição de 0,5 /xg/ml PPD as células (150 μΐ por recipiente) são distribuídas em placas de fundo plano com 96 recipientes (Costar Nr. 3596). Os recipientes são então suplementados com volumes de 50 μΐ dos compostos do teste diluídos em RPMI.Injfrjgâ? (10 U heparin / ml, lichenine, Roche) is diluted 1: 2 in PBS and layered over a half volume of Ficoll- Hypaque (Pharmacia (15 ml ficoll + 30 ml blood / PBS in 50 ml conical tube) Tubes are centrifuged at 2000 g for 10 minutes (or 500 g for 45 minutes) at room temperature without interruption The interface is collected gently and washed 2-3 times with PBS or BSS and resuspended in RPMI 1640 supplemented with either 5% pooled human serum or 10% fetal calf serum Viability is determined and cell density After the addition of 0.5 μg / ml PPD the cells (150 μg per container) are distributed into 96-well flat bottom plates (Costar No. 3596) The containers are then supplemented with 50 μl volumes of test compounds diluted in RPMI.

Culturas estimuladas são pulsadas radioactivamente após 5 dias (37°C, 7% C02 em ar) adicionando 1,0 μΟι H-Timidina/reci-piente em 10 μιη RPMI (Amersham:spec. act. 5 Ci/mmol) . Após 20 horas adicionais as células são colhidas com um aparelho para colher com 96 recipientes (LKB) sobre filtros de fibra de vidro (LKB). Os filtros são secos e a radioactividade retida é contada em Optiscint (LKB) num contador de cintilação (LKB) de Betaplate (LKB). Os resultados são expressos como cpm médio de recipientes em triplicado, na presença ou ausência de drogas. O efeito de drogas é referido como inibição percentual como se segue:Stimulated cultures are pulsed radioactively after 5 days (37øC, 7% CO 2 in air) by adding 1.0 μ H-Thymidine / recycle in 10 μιη RPMI (Amersham: spec. 5 Ci / mmol). After an additional 20 hours the cells are harvested with a 96-well collector (LKB) on glass fiber filters (LKB). The filters are dried and the radioactivity retained is counted in Optiscint (LKB) in a scintillation counter (LKB) of Betaplate (LKB). Results are expressed as mean cpm of triplicate containers in the presence or absence of drugs. The drug effect is referred to as percent inhibition as follows:

Exp. cpm % inibição - 100 - ------------x 100 controlo cpmExp. Cpm% inhibition - 100 - ------------ x 100 cpm control

Exp. cpm * Linf. T + PPD + composto controlo cpm = Linf. T + PPD (100% incorp.) A curva de inibição é registada e a CI5Q é referida em micromolar. Neste ensaio fenoxano tinha uma IC5Q de 0,018 μΜ.Exp. Cpm * Linf. T + PPD + control compound cpm = Linf. T + PPD (100% incorporated) The inhibition curve is recorded and the IC50 is referenced in micromolar. In this test phenoxane had an IC 50 of 0.018 μ.

Inibição da proliferação de células T no ratinho induzida por antiqénio (ovalbumina) Método tal como foi descrito em Eur. J. Immunol. 8: 112,1978):Inhibition of antigen-induced mouse T cell proliferation (ovalbumin) Method as described in Eur. J. Immunol. 8: 112, 1978):

Ratinhos (Balb/c ou qualquer outra) são injectados na base da cauda s.c. com 100 μg de antigénio em 50 μΐ (por exemplo ovalbu-mina, Miles, fracção V, 2 mg/ml em PBS, misturada 1:1 com CFA,Mice (Balb / c or any other) are injected at the base of the s.c. tail with 100 μg of antigen in 50 μg (for example ovalbumin, Miles, fraction V, 2 mg / ml in PBS, mixed 1: 1 with CFA,

Difco). Sete a oito dias mais tarde os ganglios que drenam a linfa são recolhidos, reunidos e é feita uma suspensão de células simples em BSS frio (solução salina equilibrada) usando um homogenizador (FORTUNA, Nr. 1,2440.33, Huber * Co. Reinach). 7 7Difco). Seven to eight days later the lymph-draining lymph nodes are collected, pooled and a single cell suspension is made in cold BSS (equilibrated saline solution) using a homogenizer (FORTUNA, Nr. 1.2440.33, Huber * Co. Reinach) . 7 7

As células (2 x 10 x 10 por ratinho) são lavadas 3 vezes em BSS e o número de células viáveis (usando FDA) é ajusta do para 2,2 x 106 células/ml em Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM, Gibco) contendo L-glutamina 4 mM, Penicilina (100 μg/ml), Estreptomicina (100 μg/ml), 2-mercaptoetanol (50 μΜ, Gibco) e soro de cavalo inactivado pelo calor a 5% (Gibco).The cells (2 x 10 x 10 per mouse) are washed 3 times in BSS and the number of viable cells (using FDA) is adjusted to 2.2 x 106 cells / ml in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco) containing L-glutamine 4 mM, Penicillin (100 μg / ml), Streptomycin (100 μg / ml), 2-mercaptoethanol (50 μg, Gibco) and 5% heat-inactivated horse serum (Gibco).

Ensaio ex vivo: 20 μΐ/recipiente de ovalbumina (em PBS 300 μg/ml de solução de caldo), 20 μΐ/recipiente de compostos do teste (em DMEM) e 160 μΐ/recipiente de suspensão de células são pipetados para placas de microtitulação de fundo plano com 96 recipientes (Nunclon, Delta 167008). A concentração final de a) antigénio:30 μg/ml; b) de compostos 25 a 0,09 μΜ; c) de células 16Ex vivo assay: 20 μΐ / vial of ovalbumin (in PBS 300 μg / ml broth solution), 20 μΐ / test compound vessel (in DMEM) and 160 μΐ / cell suspension vessel are pipetted into microtiter plates with 96 containers (Nunclon, Delta 167008). The final concentration of a) antigen: 30 μg / ml; b) 25 to 0.09 μ compostos compounds; c) of cells 16

5 . . 3,6 χ 10 /recipiente. Ciclosponna A (CSA) é incluída em cada ensaio como composto de referência.5. . 3.6 χ 10 / container. Cyclosponna A (CSA) is included in each assay as reference compound.

As culturas são feitas vibrar após 48 horas de incuba- 3 ção (37°C, 7% C(>2 ao ar) adicionando 1,0 μΟί H-Timidina/reci- piente (Amershamispec. act. 5 Ci/mmol) em 10 μΐ DMEM. Após 20 horas adicionais as células são colhidas com um aparelho para colher com 96 recipientes (LKB) em filtros de fibra de vidro (LKB). Os filtros são secos e a radioactividade retida é contada em Optiscint (LKB) num contador de cintilação (LKB) de Betaplate (LKB). Os resultados são expressos como cpm média de recipientes em triplicado, na presença ou ausência de drogas. O efeito das drogas é referido como a inibição percentual como se segue:The cultures are shaken after 48 hours incubation (37øC, 7% C (> 2 air)) by adding 1.0 μ H-Thymidine / vessel (Amershamispec, act 5 Ci / mmol) (LKB) on glass fiber (LKB) filters. The filters are dried and the radioactivity retained is counted in Optiscint (LKB) in The results are expressed as mean cpm of recipients in triplicate in the presence or absence of drugs.The effect of the drugs is referred to as percent inhibition as follows:

Exp. cpm % inibição = 100 - ------------x 100 controlo cpmExp. Cpm% inhibition = 100 - ------------ x 100 cpm control

Exp. cpm = Linf. T + ovalbumina + composto controlo cpm = Linf. T + ovalbumina (100% incorp.)Exp. Cpm = Linf. T + ovalbumin + control compound cpm = Linf. T + ovalbumin (100% incorporated)

A curva de inibição é registada em μιηοΐ/litro. O «Pf fenoxano apresenta uma melhor potência (IC5:0,002 μΜ) que CSA (IC5Q:0,03 μΜ) na inibição da activação/proliferação das células T específicas do antigénio. Este efeito da droga não foi devido a toxicidade porque, quando foi adicionada à cultura não às 0 horas mas sim às 48 horas (depois de ter ocorrido a proliferação), não afectou a viabilidade de células T aos níveis de 10 μΜ. Verifi-cou-se também que o composto não era tóxico em relação aos fibroblastos Swiss 3T3 em níveis de 10 μΜ.The inhibition curve is recorded in μιηοΐ / liter. PF phenoxane shows better potency (IC5: 0.002 μ) than CSA (IC5Q: 0.03 μ) in inhibiting the activation / proliferation of antigen-specific T cells. This effect of the drug was not due to toxicity because, when it was added to the culture at not 0 hours but at 48 hours (after proliferation occurred), it did not affect the viability of T cells at 10 μ níveis levels. It was also found that the compound was non-toxic to Swiss 3T3 fibroblasts at 10 μ níveis levels.

Exemplo 5: Composição farmacêutica para administração oral Cápsulas contendo 25 mg de ingrediente activo, isto é fenoxano, são preparadas como se segue:Example 5: Pharmaceutical composition for oral administration Capsules containing 25 mg of active ingredient, i.e. phenoxane, are prepared as follows:

Composição (para 1.000 cápsulas) ingrediente activo 25 g talco 3,6 g amido de milho 2,4 g estearato de magnésio 1,6 g lactose 0,4 g 33 gComposition (for 1000 capsules) active ingredient 25 g talc 3.6 g corn starch 2.4 g magnesium stearate 1.6 g lactose 0.4 g 33 g

As substancias em pó são feitas passar através de um crivo de 0,6 mm e misturadas. Porções de 33 mg da mistura são introduzidas nas cápsulas de gelatina numa máquina para encher cápsulas.The powdered substances are passed through a 0.6 mm screen and mixed. 33 mg portions of the blend are filled into the gelatin capsules in a capsule filling machine.

Claims

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EIVINDICATIONS 1 *. A process for the preparation of a phenoxane of the formula

CH3 OCH3 or a phenoxane having the following parameters: Analytical HPLC: Column (φ · length) 4 * 250 mm, packed with HD-sil 18-5-100 (ex Kronwald), UV absorption detection at 210-250 nm, eluent methanol / water (80:20), flow 1.5 ml / min, t R = 7.9 min; mp 92-94 ° C. UV (methanol) lambda (e / g e) = 204 (75420 / 4,877), 229 lDcàX (53850 / 4,731), 244 (bossa (b)), 252 (b), 262 (b), 274 nm . 1 H-NMR ([D 4] methanol, 600.177 MHz): δ 8.39 (s, 1H), 7.30 (m, 2H), 7.19 (m, 3H), 6.33 [s, 1H J = 7.4Hz), 2.88 (q, 3H, J = 7.4Hz), 2.72 (s, 3H) 1H), 1.93 (d, 3H, J = 1.2Hz), 1.88 (s, 3H), 1.11 ppm (t, 3H, J = 7Hz) , 4Hz); 13 C-NMR ([D 4] methanol, 75.5 MHZ): δ = 182.65 S, 166.89 S, 164.46 s, 149.75, 140.70 d, 139.58s, 137.80s , 135.31 s, 130.00 d (2 C), 129.22 d (2 C), 127.84 d, 127.42 d, 126.37 s, 101.11 S, 56.85 q, 38.82 t, 27.85 t, 18.58 t, 17.76 q, 140.00 q, 7.30 q. 19

Mass spectrometry of (+) BAR (xenon, glycerin matrix), m / z = 380 [M + H] +: MS EI (70 ev, 160 C, m / z > 90): M / Z (12), 379 (100), 365 (22), 364 (88), 336 (5), 323 (14), 308 (13), 234 (49), 207 (10), 194 , 171 (14), 156 (16), 143 (11), 131 (69), 129 (37), 128 (17), 116 (26), 115 (31), 91 (92). High Resolution: C23H25N04 calc. 379.1783 found 379.1781 (MS-IE); characterized by cultivating Polianqium spec. DSM 6270 in a suitable nutrient medium and isolating the phenoxane. 2". 2. A process according to claim 1, characterized in that: Polvangium spec. DSM 6270 in a medium containing carbon sources, nitrogen sources and mineral salts, separate the biomass from the culture and extract said biomass with an aprotic, dipolar organic solvent, concentrate the extract, mix the residue with water and a organic solvent which is not miscible with water, the organic solvent phase is concentrated, the concentrate is mixed in a lower alkanol and a lower hydrocarbon which is non-miscible with said alkanol, the alkanol phase is concentrated, the mixture is mixed the residue is dissolved in a lower aliphatic ether and, if necessary, the liquid phase is filtered on silica gel, and phenoxane is isolated in a manner known per se from the liquid phase. 3a. A process according to claim 2, characterized in that the phenoxane is crystallized from tert-butyl methyl ether / petroleum ether.

48. A process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising the phenoxane prepared according to the process of any one of claims 1 or 2 together with pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents in said composition.

58. A method for the therapeutic or prophylactic treatment of the human or animal organism characterized in that a compound prepared according to the process claimed in any one of claims 1 or 2 is administered in a daily dosage range of about 0.3 to about 30 mg per kilogram of body weight per day. Lisbon, December 20, 1991

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