PT97650B - Anticorpos monoclonais uteis para a melhoria imunologica do efeito somatogenico da somatotropina com um anticorpo - Google Patents

Anticorpos monoclonais uteis para a melhoria imunologica do efeito somatogenico da somatotropina com um anticorpo Download PDF

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Description

JAMFO DU INVEN ii
Este invento relaciona-se com a preparação de anticorpos, ssi particular anticorpos monoclonais, em relação à somatotropina porcina CpST). Quando estes anticorpos são administrados juntamente com pST, o crescimento dos vertebrados é superior ao alcançado com a administração de ρ·8Τ isoladamente» Este invento administração de anticorpos em relação somatotropinas tíe aumento do crescimento dos vertebrados o qual, comparado com a. administração dessas somatropinas isoladaments, persiste durante períodos de tempo prolongados»
FUNDAMENTOS DQ INVENTO
A somatotropina. è um polipeptídeo segregado pela pituitária anterior em animais ds sangue quente e actua através de receptores superficiais celulares específicos localizados principalmente no fígado (Hughes, J = r,= and Friesen, H= S» , An π. Rev» Physioi»» 47, 469-482 <1985))»
Somatotropina é útil para melhorar o crescimento destes oorcmo !·. porcos
a.nxma.is, tais como bovinos t.gaoo vacum) , caprinos (cabras), aves, (frangos, perus, gansos, etc) e coelhos, entre outros» Somatotropina é também útil para -aumentar o crescimento de outros vertebrados, tais como peixes»
Especificamente, a hormona do crescimento pST é zida pelos porcos e contribui para a maturação do animal, indo o aumento da taxa de crescimento e a relação entre produinclucarne magra e goruura» Verificou-se que pST é uma cadeia polipeptídica
•=-Ãfl'iPlíSiL- coíTi 191 emxno ácxdos com duas ρ·_»sts~- de uistins liyandu resíduos 53-164 e 181-189, respectivamente CAbdel-Meguid, 8,.5., et -al», Prec» Nat. ftcad, 8ci. , 84, 6434-6437 (1987)»
Porque as quantidades endógenas de pST são pequenas, . tem sido feitos converqir esforços na preparação de pST exógena para utilização em larga, escala em agronomia» Têm também sido feitos esforços dirigidos è. identif icação de pequenas porçSes de moléculas de pST, à produção de anticorpos em relação a. essas porçSes, e a administração desses anticorpos jun tamen te com pST ι ’ para -aumentar o crescimento» Ver, por exemplo, o Requerimento publicado da Patente Europeia No» 284»406=
RESUMO DO INVENTO
Embora as tentativas descritas anteriormente se tenham revelado prometedoras para o aumento do crescimento animal, continua a existir a necessidade de desenvolver estratégias e tecnxcas aoicionaxs nesce campo»
Consequentemente, constitui um objectivo deste invento produzir anticorpos, em particular anticorpos monoclonais, em relação a toda a molécula de pST, em oposição a porçSes dessa molécula.
Constitui outro objectivo deste invento melhorar o crescimento tratando vertebrados com um ou mais desses anticorpos em combinação com pST»
Constitui ainda outro objectivo deste invento conseguir uma potenciação equivalente do pST reduzindo entretanto a quantidade de pST administrada ao loriqo do tratamento de vertebrados <3
com um ou mais desses anticorpos em combinação com uma quantidade reduzida, de pST„
Constitui ainda um outro objectivo deste invento acelerar a potenciação da pST por administração a vertebrados de um ou mais desses anticorpos em combinação com pST de modo a alcançar-se uma potenciação equivalente com a referida combinação em menos tempo do que a alcançada com a aamxnxsrraçao ae pbi i so1adament e»
Constitui um objectivo mais geral deste invento potenciar a aetividade de uma somatotropina durante periodos de tempo prolongados administrando a um vertebrado uma somatotropina em combinação com um ou mais anticorpos em relação á referida somatotropina, de modo a que o peso do vertebrado continue a exceder o de um vertebrado tratado com a mesma quantidade da somatotropina isolada durante um determinado período de tempo» invento é também dirigido a anticorpos de somatotropinas tendo sequências modificadas de amino ácidos, na medida em que as funções de aumento do crescimento anteriormente descritas desses anticorpos sejam mantidas»
Estes objectivos são realizados na descrição do invento ibaixo.
BREVE DESCRIC%Q DAS FIGURAS a l·rt xqura i reoroQu;
um Bbuuub ί»a imunosspecxTxcidade do anticorpo monoclonal onde pST, bST e cST são.
PS-7.Ó sm relação a vãrios antigénios, respectivamente, somatotropina poroina, bovina e de frangos, PRL é prolactína, SRIF é somatostatina e GRF
é factor libertador da. 'hormona do crescimento» Na Figura 1, várias Figuras subsequentes e Quadro 1, o anticorpo monoelonai é abreviado como MoAb» eproduz um estudo no decurso do tempo comparando a efeito sobre o crescimento de ratos hipofissetomizaisoladamente, anticorpo monoelonai Combinação com anticorpo monoelonai dos do tratamento com pST F‘S~7«ó isoladamente. pST sm nas Fiquras
P<. 0,001 e 6, representam resultados estatisticamente - p<0,05= $’# = p<05©í; ~
A Figura 3 reproduz um estudo no decurso do tempo ds longa duração (56 dias) comparando o efeito sobre o crescimento de ratos hipofissetomizados do tratamento com pST isoladamente» pST em combinação com o anticorpo monoelonai PS-~7 = 6» ou sem tratamento»
A Figura 4 reproduz o efeito sobre o crescimento de ratos hipofisectomizados do tratamento com pST isoladamente, pST em combinação com imunoglohulina de controlo da ascite do mieloma SP2/0, pSí em combinação com anticorpo monoelonai PS-7.-.6. ou sem tratamento»
A Figura 5 reproduz a resposta à dose da administração de anticorpo monoelonai PS-7,6 mais pST sobre o crescimento ds ratos hipof .issetomizados» em comparação com sem tratamento (sem pST5, to (uma
H figura 6 reproduz injecçãò cor dia) o efeito da frequência do tratamencom pST isoladamente ou pST em
combinação con? anticorpo monoclonal PS-7.6 sobre cí crescimento de ra tos hi pof i sec t om i z a d os..
A Figura 7 reproduz o efeito sobre o crescimento de ratos hipofisectomizados tratados com pST isoladamente, p-ST em combinação com anticorpos monoclonais F‘S-3.12, PS—7.6 e PS-8.3, respectivamente, ou sem tratamento»
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Este invento ê dirigido & produção de anticorpos, em em pS i = Esses particular anticorpos monoclonais. anticorpos são então administrados juntamente com pST a vertebrados, tais como animais de sangue quente s peixes, para aumentar a performance do seu crescimento potenciando a actividade da pST. Alternativaments, estes anticorpos são administrados a vertebrados que são em seguida tratados com pST.
-elação
Os anticorpos monoclonais em relação a pST deste invento têm efeito sobre a actividade da pST dos modos qus se seguem 5
1) Os anticorpos potenciam a actividade da pST quando se administra a um vertebrado uma quantidade de pST qus aumenta o crescimento eficaz e uma quantidade potsnciadora ds pST eficaz ds um ou mais anticorpos monoclonais em relação a pST. Assim, durante um determinado período ds tempo uma determinada quantidade de pb'T administrada a. vertebrados recebendo também esses anticorpos provocará um aumento ds crescimento..
2) Os anticorpos realizam uma potenciação equivalente da pST reduzindo entretanto a auantidade ds oST administrada
quando ss administra a um vertebrado uma quantidade de pST que aumenta o crescimento eficaz e uma quantidade potenciadora de pST eficaz de um ou mais anticorpos monoclonais em relação a pST, de modo a se conseguir uma potenciação equivalente com, a referida combinação de pST e um ou mais anticorpo(s) monoclonal(ais) em relação a pST à alcançada com uma maior quantidade de pST administrada isoladamente. Assim, durante um determinada período de tempo, é alcançado o mesmo crescimento com menos ρ-ST se esses anticorpos forem também administrados»
3) Os anticorpos provocam uma aceleração da potenciação de pST quando ss administra a um vertebrado uma quantidade de pST que aumenta o crescimento eficaz e uma quantidade potenciado— ra ds pST eficaz de um ou mais anticorpos monoclonais era relação a pST, de modo produzir-se uma potenciação equivalente com a referida combinação de pST e de um ou mais anticorpos monoclonais em relação a pST em menos tempo do que quando se administre pST isoladamente. Assim, para uma determinada quantidade de pST atinge-se o mesmo crescimento em menos tempo se es forem também administrados.
ant icemos
Este invento é também dirigido ã observação mais generalizada de que o aumenta da crescimento resultante da administração de anticorpos em relação â somatotropina (incluindo, mas não limitada a pST) em combinação com a referida somatotropina não é um fenómeno transitório» Em vez disso, os pesos dos veretebrados continuam a exceder os dos veretebrados tratados com somatotropina isoladamente durante um determinado período de tempo» Os anticorpos potenciam a actividade de uma somatotropina durante períodos de tempo prolongados- quando se administra a um vertebrada uma quantidade de somatotropina que aumenta o crescimento eficaz e uma quantidade potenciadora da somatotropina eficaz de um ou mais anticorpos era relação à referida tis um
somatotropina, ds modo a qus o pesa da vertebrada continue a exceder o de um veretebrado tratado com a mesma quantidade da referida somatotropina isoladamente durante um determinado período de tempo»
Este invento é ainda dirigido a anticorpos em relação a peptídeos tendo sequências de amino ácidos que são antxgénxcamen— te equivalenbtes às de uma somatotropina» Pode-se dizer que estes peptídeos sao equivalentes antiqénxcamente a uma somatotropina se as suas sequências de amino ácidos díferirírsm por eliminações a partir de, adições a ou substituições em relação á sequência da somatotropina, de tal modo que as configuraçSes secundárias e/ou terciárias dos peptídeos se apresentem substancialmente inalteradas em relação às da somatotropina e anticorpos possam ser gerados em relação a esses peptideos»
Num outro aspecto deste invento, anticorpos monoclonais são preparados imunizando ratinhos com uma somatotropina, removendo os baços dos ratinhos-, preparando suspensões de linfocitos, fundindo estes linfocitos com células de mieloma de ratinho, cultivando as células e recolhendo os produtos flutuantes de hibridomas sobreviventes para análise dos anticorpos por ensaio de imunoabsorção liqado a enzima ce fase sólida (ELISA)» Os hibridomas que produzem anticorpos desejados são ainda seleccionados e injectados em ratinhos» 0 líquido ascítico é então recolhido das cavidades perxtoneais do ratinho e a Ímunoglobulina (IG) e purificada por ou precipitação de sulfato de amónio ou por coluna de afinidade sm relação à proteína A por cromatograf ia liquida de proteína rápida (FPLC). Amostras de 1G assim purificado sao ensaiadas contra antigénios usando ELISA para identificar os anticorpos formados»
jaivcaiuU, tófi LX LOr ytí—- HíUnOí—IOÍ i S» ÍS uma somatotropina são oroduzidos e purifiçados a
Num outro aspecto deste invent em relação i partir de animais de sangue quente imunizados tais como porcos e coelhos» Os anticorpos policlonais são produzidos imunizando vertebrados com essa somatotropina»
Os anticorpos monoclonais são recuperados obtendo em primeiro lugar uma amostra de sangue a partir de um animal imunizado depois tíe um tempo suficiente para a administração de somatotropina dar origem ã formação de anticorpos» 0 soro (que contem os anticorpos) é isolado por meios convencionais tais como centrifugação. 0 soro é separado em fracçSes contendo imunoglobulina Cnão-lg) por meios tais como FPLC» fracção IS contem anticorpos sm relação aos peptídeos» corpos são então isolados a partir da fracção IS por electroforese em sulfato dodecilico de sódio-gel poliacrilamida (SDS-PASE)
Ig e sem Apenas a. Qs anti—
A pureza dos anticorpos assim isolados é superior tal como é determinado por SDS-PASE» 0 nível de titulação do anticorpo é ensaiado usando ELISA de acordo com processos convencionais,
Embora a somatotropina exemplifiçada nesta aplicação seja pST, qualquer especialista nesta técnica pode utilizar as técnicas aqui descritas para produzir anticorpos monoclonais e policlonais em relação a outras somatotropinas»
Os anticorpos monoclonais e policlonais deste invento podem ser utilizados de dois modos para potenciar e aumentar a actividade promotora do crescimento de uma somatotropina» Em primeiro lugar, um anticorpo é administrado a um vertebrado juntamente com uma somatotropina, tal como pST» Alternativamente, o vertebrado é tratado com uma ou mais doses de um anticorpo anti-somatotropina a é subsèquentemente tratado com somatotropi— na» Em qualquer dos processos, pode-se utilizar mais de um
soma to t r opi na» Ass i m, o ção de combinações de eq u i vs1en tes an t iaén i— anticorpo em relação a uma determinada invento também contempla a administra anticorpos anti-somatotropina ou dos seus cos«
Os anticorpos podam ser administrados por vias convencionais tais como injecção subcutânea, injecção intramuscular e fluxo intravenoso, assim como por administração transdermica s oral« έ preferível administrar os anticorpos em associação com um veículo apropriado, é particularmente preferido utilizar um regime de dosagem onde uma administração inicial dos anticorpos é seguida por uma ou mais administrações intensificadoras dos mesmos anticorpos com intervalos de tempo regulares.
A actividade biológica destes- anticorpos è testada em ratos hipofisectamisados Chipox). Os ratos—nipox têm um crescimento deficiente como resultado da remoção cirúrgica das suas glandulas pituitárias» Os ratos-hipox servem como modelo útil para o estudo do efeito da somatotropina sobre o crescimento ( 1V8 / )
D tratamento destes ratos—hipox com uma combinação de pST e anticorpos em relação a pST aumenta o efeito promotor do crescimento da ρ-ST das várias- maneiras- descritas anteriormente» A pST pode ser isolada a partir de várias fontes- ou pode ser preparada usando técnicas de recombinação tais- como as descritas nos requerimentos publicados de Patente Europeia Nos» 104.920 ou 111 »369= As fontes- de e o método de isolamento/preparação da própria pST não fazem parte deste invento» Os anticorpos- podem também ser usados em conjunto com pST recombinante em que -a sequência de amino ácidos da pST nativa foi modificada usando uma técnica tal como a mutagenese dirigida ao sítio,, na medida em que
a função oue faz -aumentar o crescimento da pST é mantida» Ver por exemplo, _ 97p.
requerimento publicado da Patente huropeia No»
Entre os anticorpos monoclonais a serem examinados» apresenta umverifica-se que o anticorpo PS-7» particularmente forte da actividade da pST e é escolhido para uma posterior análise» Verifica-se que os anticorpos monoclonais PS-3.12 e PS-8,3 também proporcionam uma forte potenciação á actividade de pST» ρο c en c :l ação □ anticorpo monoclonal PS--/»6 é uma imunoglobulina do subtipo IgS. com característícas de cadeia k lio-eiras» Um estudo de imunoespecificidade (Figura indica ser altamente reactivo com pST, fracamente com bST , mas não com cST, PRL, SRIF ou GRF»
Num bioensaio com rsto-hipox, é demonstrado (Figura 2) que injecçSes com 5 mg de pST isolada durante cinco dias consecutivos estimula, o crescimento destes animais» Este efeito è significativamente potenciado quando pST é incubada com anticorpo monoclonal PS—7»ó durante uma hora â temperatura ambiente antes da administração» 0 perfil do crescimento de ratos recebendo anticorpo monoclonal F’S-7.6 isoladamente ê semelhante ao dos controlos tratados, indicando que o anticorpo por sí próprio não constitui um estimulante do crescimento CFiqura 25 »
A potenciação da actividade tíe uma somatotropina durante períodos de tempo prolongados por anticorpos d-a referida somatotropina é demonstrada usando um ensaia com r semelhante» íi crescimento dos animais é monitorizai anticorpo monoclonal em relação a pST» Injecçí durante cinco dias produzem um aumenta de pese
duran te um
ι pST e um
apenas p-ST
de nota em
ratos-hipox, mas α efeito é significativo apenas até oito dias coincide completamente com a taxa de crescimento de animais não tratados pelo dia 28 (Figura
Con tudo, o tratamento com de crescimento anticorpo monoclonal t'S-Z.6 prolonga o padrãt elevado a um nível significativa até 28 tratados com anticorpo permanecem siqnificativamente mais pesados do que os tratados com pST e do que os controlos não tratadas durante pelo menos 56 dias após- o tratamento inicial, indicando claramente a sua longa persistência, 0 aumento do crescimento por anticorpo é de extrema longa duração, visto uma diferença signiX-7 ficativa no aumento do peso entre animais tratados com anticorpo (só pST) persistir durante pelo menos 56 (Figura 3). 0 efeito potenciador do crescimento do anticorpo monoclonal PS—7.6 sobre pST é signi— ficativamente superior ao de um anticorpo policlonal de controlo, □ anticorpo monoclonal PS-7.6 aumenta significativamente o efeito da actividade da pST enquanto que um anticorpo de controlo (Ig) não afecta a actividade de pST após cinco dias (Figura 4). Os anticorpos monoclonais PS~3,12 e PS~8,3 são comparáveis ao anticorpo monoclonal F'S-7.6 no seu efeito potenciador do crescimento sobre o pST (Figura 7)= e animais de controlo di.as aoós o tratamento inicial
Embora a dose eficaz de anticorpo monoclonal PS—7,6 irie entre €5,1 e 2,© mg/injecção, as doses óptimas são de 0,5 e ca resposta
UUteS i,i) mg/injecção (figura 5). Os resultados indicados na Figura 5 indicam que a acção do anticorpo monoclonal Ptí-7.6 com pSí é rápida. Injecções- repetidas· (cinco tratamentos) com anticorpo monoclonal PS~7,ó roais pST produz um efeito máximo, mas detecta—se um aumento significativo com apenas dois tratamentos (Figura ó). Em contraste, um aumento inerior com pST isoladamente requere um mínimo de três dias- de injecções e consegue—se um aumenta inferior com pST isaladamente após cinco dias de injecções qo que com dois dias- tie injecções- com anticorpo
*1
monoclonal PS—7.6 mais pST (Figura 6)» Os dados nas Figuras 5 e 6 demonstram que os anticorpos monoclonais em relação a ρ-ST deste invento (a) conseguem uma potenciação equivalente de pST reduzindo entretanto a quantidade de pST administrada, e Cb) conseguem uma aceleração da potenciação de pST» tomados em conjunto.
tes dados indicam que os inti1 corpos monoclonais PS-3.12, PS-/.6 e PS—8,d são muito activos no aumento da somatogensse da pST e, desse modo melhoria da performance do crescimento animal» ίο·3ΰ na
Para que este invento seja melhor compreendido, são apresentados os exemplos que se seguem» Os exemplos têm apenas um fim ilustrativo e não são elaborados da modo a limitarem o âmbito do invento»
EXEMPLO 1
Produção de Anticorpos Monoclonais, Incluindo
Anticorpo Mor? oc 1 on a 1 PS -7.6
Ratinhos Balb/C, com ssis a dez semanas de idade, são comprados a Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA. Estes ratinhos são imunizados com 100pg de pST emulsificada em adjuvante de Freund completo e reforçados com 50pg de pST de três em tres semanas osi em diante, :rsí dias após o última reforço senda 'preparadas suspensões celulares simples de linfócitos. Estes linfócitos são fundidos com células de mieloma de ratinho SP2./0 sem transíerase hipoxantina fosforilbosilo (HPRT) com 507, ds polietileno glicol, suspensos em meio de Eagle modificado con? Dulbecco (D-MEM) contendo 20% de soro , 13,6 pg/ml ds
vitelo fetal (Libe o), 0,175 pg/ml ds aminopteri:
hipoxantina. 3,88 pg/ml de timidína e 50 pg/í
(meio HAT)» Hf f ,i. ? ? ;Imante di stribuidos em placas
rer i ρ i ç?n b-ϊ? s s Após cultura durante 10 -14 dias,
os produtos flutuantes dos hibritíomas que sobreviveram devido ao fenotipo HPRT—positivo dos linfócitos (aproximadamente 30%) são recolhidos para avaliação dos anticorpos em ELISA de fase sólida» Os que são determinados como produtores de anticorpos apropriados (ao atingirem consistentemente títulos elevados nos produtos flutuantes — aproximadamente 25% dos aproximadamente 30% referidos anteriormente, para um valor líquido de aproximadamente 7%) são ainda, subclonados por meio de ura processo de diluição limitada para produzirem anticorpos que tenham interesse.
Três hibridomas produzem clones com particular interesse» Amostras destes hibridomas foram depositadas na American Type
Culture Collection e foi—lhes atribuído números de acesso tal são indicados no Quadro 1, juntamente com as designações dos
COiliO monoclonais de interesse anticorpoí mss ϊ
produzido?
por
3Kb ! i A òrido-íáUADRU i
Hibririoma
Número de .Acesso
Anticorpo Monoclonal
ATCC HB 104ÍÍ
MoAb PS—3„12
ATCC HB 104í 6
MoAb RS-7.Ó
ATCC HB 10417
MoAb PS—8.
Os clones seleccionados são injectados intraperitonealmente em ratinhos Balb/C sendo-lhes fornecido pristano para a produção de ascitos contendo anticorpo» A identificação do isótopo dos anticorpos monoclonais é realizada com um estojo para isotipificação do anticorpo (Zymed Laborato
South San
Francisco, CA), 0 anticorpo monoclonal designado por PS-7,6 é seleccionado como exemplo para estudo posterior neste exemplo 1»
2« Preparação de Anticorpo
A ascite é recolhida a partir das cavidades peritoneais de ratinhos e Ig é purificado com a técnica de precipitação com 50a de sulfato ds amónio» Alternativamente, amostras são diluidas até 50% com tampão ds ligação (NaCl 314, glicina 1,5M, pH 8,9) e carregadas numa coluna preparativa Protéina A superas© HR Í&/5 num sistema FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ). A fracção não-Ig é eluida a partir da coluna com o tampão de ligação e a ligação Ig é subsequentemente recolhida lavando a coluna com ácido cítrico 0,1M, pH 3» é imediatamente neutralizada até pH 7-8 com tampão
Tris 2M, pH
Us anticorpos preparados por ambos os processos
são considerávelmente dialisados com uma solução salina tamponada concentrados por com fosfato (PBS)
Danvers, MA), sefsarados em porçSes armazenados a ~20°C até á utilização» u 1t r a f i 11 ra ç -S o (Am i c on, a 1 i quotas , e final men te
3= ELISA Fase Sólida
Os antigénios são dissolvidos sm PBS e adiciona-se 1 μη an 100 μΐ a cada recipiente de uma placa de polistireno de fundo plano com Só recipientes» Após ser incubada durante uma hora, a placa é lavada três vezes com pBS contendo 0,05% tíe Tvieen-2@ por meio de uma máquina de lavagem da pia 11» Chanti11y. VA 5 automática (Bynatech Nash Cada recipiente ê fornecido com 200 pm de albumina do soro bovino a 2% (Sigma) e a placa é incubada durante mais uma hora» As amostras são adicionadas aos recipientes, incubadas durante minutos» lavadas vezes com adicionadas com 100μ1 de IgG F Cab' )o de ratinho-anti cabra conjugado com fosfatase alcalina (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)» A placa é lavada de novo após 3® minutos de incubação e adicionam-se como substrato para desenvolvimento da cor 100 μΐ de fosfato de ρ-nitrofenilo (1 mg/ml, Sigma) sm dietanolamina ©,1M, pH 10,3» Finalmente, a resposta calorimétrica é registada como densidade óptica (OD) por um leitor de placa ELISA com um comprimento de onda de 403 nm» 0 processo de incubação é sempre realizado a 37 °C»
4» Caractérização do Anticorpo Monoc1ona1 PS-7»ó
Pi imunoespecificidade do anticorpo monoclonal PS-7.6 é testado num ELISA de fase sólida» Vários antigénios são revestidos nos recipientes de uma placa com 96 recipientes- adioionando—se uma série de diluições de anticorpo monoclonal PS—7»6 da ascite para interseção» A Figura 1 indica que o anticorpo
monoclonal PS-z.ó respwnde ao antiyéniu pS Também indica uma ligeira reactividade cru com cST, PEL, SRIF e SRF.
ac en tuadamen te ada com bST, masbem não pOí' isotipo um ELISA ampli fic do anticorpo monoclonal F‘S~7»ó ado aves-biotina, dependente do d e t e r m i n a d o antigénio é
IgB. com características de- cadeia ligeira k.
5» Ensaios Biológicos em relação a psT e Anticorpo dos tal como munoreactividade dos anticorpos monoclonais foi descrito anteriormente é examinada em produziconjunto com pST» Ratos fêmeas Sprague-Dawley, com Ί pesando 50-65 g, são obtidos a partir de Tac town, NV = 0 bioensaio é realizado com este crescimento deficiente resultante da remoção glanduias pituitárias» Após -a entrega, estes durante 7—1O dias adicionais sob observação completa hipofisectomia» Os animais são distrd i dias de idade e onic Farm, Bermans ratos hipox com
cirúrgica das suas
ratos são mantidos
para assegurar uma
buídos ao acaso com
oito ratos para cada grupo. São sempre incluídos em todas as £? X pt? Γ ΐ. ffieH grupo con negativo» taçSes dois grupos de animais ds controla» U sista em ratos—hipox nao tratados que serve de primeiro controlo outro gryupo de controlo consiste em ratos-hipox que recebem um dose eficaz mínima de pSi (5 uq) por injecção diária servindo ass-im de controxo positivo» Q anticorpo í©,5 -a i mq) misturado com 5 pg de ρ-ST à temperatura ambiente durante uma hora é administrado subcutSneamente a cada rato experimental na região do pescoço. O crescimento destes animais è monitorizado individualmente e registado como aumento de peso no decurso da experi— ίΓυΞ’Π Ce.ÇS.O n s
Qs resultados são apresentados como aumento médio do peso juntamente com o erro padrão de médias para cada grupo de oito ratos» A avaliação estatística é realizada pela análise por mínimos quadrados da variância para esquema ao acaso usando o processo de General Linear Models do Statistícal Analysis System» A não ser que indicado de um modo diferente» a análise é feita por comparação com controlos negativos que não receberam mento»
6» Aumento do Crescimento com Anticorpo Monoclonal PS-7.6 efeito de aumento do crescimento do anticorpo :lonal PB~7»é> administrado com oST é avaliado em ;rat monoDs ratos-hipox são divididos em quatro grupos tal como foi descrito anteriormente» InjecçSes diárias sm animais de controlo não tratados com 5 pg ds pST durante cinco dias produz um aumento significativo do peso facto que é evidenciado por um aumento da inclinação do seu padrão de crescimento.-. Contudo, o efeito é de curta duração, visto a curva de crescimento acelerado destes animais de controlo abrandar quando se termina o tratamento no dia 5« Os controlos não tratados revelam uma taxa !i!
de crescimento retardado durante um período ds 16 dias (Figura 21« Pelo contrário, o efeito promotor do crescimento de pST é aumentado e prolongado ao longo do período da 18 dias pelo anticorpo monoclonal PS—7»ó quando ambos são incubados à temperatura ambiente durante um período de uma hora antes da administração» InjecçSes- do anticorpo monoclonal PS—7»6 isoladamente são ineficazes»
Numa experimentação separada, s demonstrada (Figura uma persistência extremamente longa do dias)» Os animais que receberam cinco ínjecçSss diárias d isaladamente revelaram de efeito do anticorpo novo uma melhoria
·.:=) {56 PST significativa no
-aumento do peso em relação aos controlos não tratados nos primeiros oito dias, mas o crescimento total após 56 dias é idêntico ao dos controlos não tratados» A -administração com uma combinação de pST e de anticorpo monoclonal F’S-7.6 não só aumenta ainda mais- a taxa de crescimento como mantém também estes animais com um peso significativamente mais elevado do que os- controlos tratados ou não tratados durante 28 dias após α tratamento inicial (p>0501)» Uma diferença apreciável no aumento de peso deste grupo de ratos de ambos os grupos de controlo persiste durante pelo menos Sódias (25% em relação aos controlos)» padrão de administração da Figura 3 é repetido com a inclusão de controlos adicionais de Ig não específico, tados após cinco dias são apresentados na Figura 4» 0
Ds resultratamento com pST isoladamente de novo potência acentuatíamente o crescimento dos ratos-hipox (aumento ds peso controlos não tratados (aumento do mistura de pST com Ig ds controlo a partir de ascite do mieloma SP2/0 (American Type Culture Collection» Rockville, MD) não aumenta a actividade da pST (aumento de peso = 756 g? ρ < ©,5), enquanto que a mistura de pST com anticorpo monoclonal PS-7»ó aumenta significativamente o efeito (aumento de peso - 10 g? ρ <
ójfc- g) em comparação uom peso = 2,9 g;
Efeito da Resposta à Dose do Anticorpo Monoclonal Pb:~/.6 sobre o Aumento da Actividade de pST de ratos doses ds tivos» 0
É realizado um estudo de resposta à dose por tratamento -hipox com 5 pg por dia de pST juntamente com várias anticorpo monoclonal PS-/»6 durante cinco dias consecu— crescimento © registado no dia i®, Os ratos não tratados apenas I g em todo o curso da experimentação» Dados na
Figura 5 indicam que qs animais que receberam pST isoladaments obtiveram um aumento de peso de 6,4 g» Contudo, o tratamento de combinação com anticorpo monoclonal PS--7„6 aumenta sígnif icativamente o ©feito da pST com uma variação da dose de ®,l-2mg/tratamento com a actividade máxima a 0,5 e í mg/tratamento (aumentos de peso -· 9,4 e 9,5 g, respectivamente)»
8= Efeito da Frequência do Tratamento do Anticorpo Monoclonal
85-7.6 sobre o Aumento da Actividade da pST
Ratos-hipox são injectados diáriamente com 5 pg por dia de pST ou pST mais um mg de anticorpo monoclonal PS-7»& durante um a cinco dias consecutivos e o crescimento é registado no dia oito» 0 efeito da pST isoladamente não é evidente até estes ratos receberem três injecçSes ou mais (Figura 6)» Pelo contrário, torna-se evidente um acentuado aumento no ganho de peso por um tratamento de combinação de pST e de anticorpo monoclonal PS-7.6 logo após a. segunda injecção» Mantém—se uma diferença significativa no aumento de peso entre os dois grupos de tratamento após cinco injecçSess na verdade o grupo recebendo uma combinação de pST e de anticorpo monoclonal PS-7.6 apresenta um maior aumento no acréscimo de peso após apenas duas· injecçSes em comparação com o aumento do grupo que recebeu apenas pST após cinco injecçSes» atos—hipox são divididos em cinco grupos n iUíiií aoap
Exemplo 2
Os passos 1—4 do Exemplo 1 são repetidos para produzir, purificar e caracterxzar os anticorpos monoclonais PS—3»12 e
PS-8.3. Q aumenta do crescimento com estes anticorpos é avaliadc em ratos-hipox em comparação com o anticorpo monoclonal F‘S-7„6» processo no passa O da Exemplo
primeiro grupo é de controlos nSo tratados? o segundo grupo recebe
PÍ3 í injecção durante cinco dias? os outros- grupos- recebem 5 pg d© pST durante cinco dias mais 1,0 mg de anticorpos monoclonais PS-3.12, PS-7.6 e PS-S.3, respectivamente» Os resultados- após cinco dias são apresentados na Figura 7» 0 tratamento com apenas pST potência acentuadamente o crescimento de ratos—hipox (aumento de peso = 6,6 g) em comparação com controlos não tratados (aumento de peso — 1,9 g(? p<0,ôí» 0 tratamento com pST juntamente com cada um dos três anticorpos monoclonais aumenta significativamente o efeito aumento de peso com PS—3» 12 = 9,4 g, p-í.0,001? aumento de peso com PS-7.6 = 10,© g? p<O,00í g? aumento de peso com PS-S.3 = 9,4 g? p<0,001»

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES:
    11. - Anticorpo monoclonal sík relação à somatotropina porcina ípST) ou um equivalente antigénico de pST, caracterizado por o anticorpo monoclonal é seleccionado de entre o grupo consistindo em anticorpos monoclonais designadas por
    PS-3.Í2 e PS-8.,3..
    pg.
  2. 2ã» - Anticorpo monoclonal de acordo :om reivintíi· cação 1, caracterizada por o anticorpo monoclonal ser o designado por PS-7.6
    31« — Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser o designado por PS-3.Í2
    41. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser o designado por Pb—tí.3 os«- Processo para a preparação oe uma composição !arnsac?utica caracterizado por se incluir na referida composição:
    (a) uma quantidade ds somatotropina eficaz para aumentar o crescimento, íb) uma quantidade de um anticorpo em relação à rererida soíBatotropina ou ds um equivalente antigénico da referida somatotropina eficaz para a potenciação da somatotropina, e íc) um veiculo farmaceuticamente aceitável
    S1?.
    de modo a que o peso do vertebrado tratado com a composição continue durante períodos de tempo prolongados a exceder o dos vertebrados tratados com a mesma quantidade da referida somatotropina isoladamente durante um determinado período de tempo; de modo a obter-se uma composição contendo, para cerca de 5 Mg de somatotropina, cerca de 0,1 a 0,2 mg de anticorpo.
  3. 6a. - Processo de acordo com a reivindicação 5, terizado por a somatotropina ser pST.
  4. 7a. - Processo de acordo com a reivindicação 6, terizado por o anticorpo ser um anticorpo monoclonal.
    caraccarac
  5. 8a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição;
    (a) uma quantidade de somatotropina porcina (pST) eficaz para o aumento do crescimento, (b) uma quantidade de anticorpo monoclonal em relação ao pST ou de um equivalente antigénico de pST eficaz para a potenciação de pST, em que os ι anticorpos monoclonais são seleccionados de entre o grupo consistindo em anticorpos monoclonais designados PS-7.6, PS-3.12 e PS-8.3, e (c) um veículo farmacêuticamente aceitável; de modo a obter-se uma composição contendo, para cerca de 5 /xg de somatotropina, cerca de 0,1 a 0,2 mg de anticorpo.
  6. 9a. - Hibridoma, caracterizador por produzir um anticorpo monoclonal seleccionado de entre o grupo consistindo em anticorpos monoclonais designados por PS-7.6, PS-3.12 e PS-8.3.
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