PT97151B

PT97151B - Processo para a demonstracao da aglutinacao eritrocitaria destinado as analises de compatibilidades sanguineas

Info

Publication number: PT97151B
Application number: PT97151A
Authority: PT
Inventors: Lucienne Mannessier
Original assignee: Fond Rech Diagnostique De Lab
Priority date: 1990-03-27
Filing date: 1991-03-26
Publication date: 1999-12-31
Also published as: ES2089160T3; EP0454509A3; FR2660437A1; ATE139847T1; PT97151A; DE69120463T2; FR2660437B1; EP0454509B1; SG47462A1; DE69120463D1; DK0454509T3; GR3020960T3; EP0454509A2

Description

A presente invenção diz respeito a um processo para a demonstração da aglutinação eritrocitária utilizada em imuno-hematologia transfusionai, de acompanhamento da gravidez e de diagnóstico, que leva a um aumento significativo da sensibilidade e da fiabilidade em relação aos outros métodos conhecidos.

A diminuição da frequência dos acidentes de transfusão sanguínea e de imcompatibilidade feto-maternal’é o resultado do grande número de testes de compatibilidade utilizados e do melhoramento constante da sua especificidade e da sua fiabilidade

Estes testes, cujo número e as modalidades de execução são fixados pela lei, compreendem a grupagem ABO e Rhesus padrão, a pesquisa de anticorpos irregulares anti-eritrocitãrios, os testes de compatibilidade e a determinação precisa dos fenotipos eritrocitários.

Os testes de grupagem sanguínea ABO-Rh padrão compreendem uma prova globular de detecção dos antigénios à superfície dos

eritrocitos (ou hemãcias ou glóbulos vermelhos) com anti-soros padronizados e, para o grupo ABO, uma prova sérica de detecção dos anticorpos presentes no sangue e dirigidos contra os antigénios eritrocitãrios com a ajuda de eritrocitos-testes.

A pesquisa de anticorpos irregulares, quer dizer de anticorpos diferentes do anti-A e -B, e que não são comuns ao conjunto da população, constitui a base da segurança imunológica das transfusões e da prevenção dos acidentes de albo-imunização feto-maternal.

A determinação precisa dos fenotipos eritrocitãrios do dador e do receptor é necessária quando se detectou anticorpos irregulares no receptor; é recomendada nos pacientes que necessitam de transfusões repetidas; é obrigatória na mulher grávida. Com efeito, em casos de necessidade transfusionai, o doente deve imperativamente ser transfundido com sangue fenotipado (sangue do dador) quer dizer desprovido do antigénio correspondente ao anticorpo identificado e compatibilizado no laboratório.

Estes diferentes testes são realizados mediante técnicas clássicas de imuno-hematologia que compreendem uma demonstração da aglutinação eritrocitária (devida ã reacção antigénio-anticorpo)- quer directa, em meio salino, eventualmente após tratamento dos eritrocitos com uma enzima (tripsina, papaína, bromelina) cuja acção sobre as membranas diminui a repulsão espontânea

-3/

dos eritrocitos (devido às cargas negativas dos grupos carboxílicos das moléculas de ácido siálico presentes na superfície dos eritrocitos),

quer indirecta, ou seja em duas etapas, inicialmente uma sensibilização dos eritrocitos com anticorpos (que não são necessariamente aglutinantes), seguida da sua aglutinação mediante adição de antiglobulina polivalente. Esta reacção efectua-se na presença de anti-complemento. Esta técnica conhecida com o nome de Coombs indirect é particularmente demorada e delicada e deixa vãrias possibilidades de erros de manipulação e de leitura do resultado.

domínio de aplicação destes testes compreende a pesquisa de aglutininas irregulares, as provas de compatibilidade pré-transfusionai e feto-maternal, diferentes diagnósticos de acidentes hemolíticos (doença hemolítica do recém-nascido, anemia hemolítica auto-imune, hemólise pós-transfusional, etc.).

grande número de testes actualmente praticados e legalmente exigidos tanto para a segurança pré-transfusionai como no acompanhamento da gravidez torna muito desejável a pesquisa de aperfeiçoamentos técnicos para facilitar a realização e a leitura do teste aumentando sempre a fiabilidade do resultado.

Um progresso significativo foi jã trazido pela utilização

de um meio gelificado e de uma etapa de centrifugação suave para separar os glóbulos do soro (Mollison- Blood transfusion in clinicai medicine”- ed. Blackwell - Oxford - 1983 - p. 512).

Um progresso suplementar foi obtido pela aplicação do mesmo princípio â retenção selectiva de aglutinatos eritrocitários, por analogia com uma técnica clássica em imunologia para demonstrar, em gel, as redes aglutinadas de antigénios-anticorpos.

J

Este processo descrito na patente de invenção francesa N2. 2 577 321, consiste em uma centrifugação suave das amostras a testar em um tubo de fundo cónico cheio de gel de dextrano; permite uma leitura fácil mesmo para um técnico pouco experimentado, visto que os eritrocitos não aglutinados (teste negativo) sedimentam muito nitidamente no fundo do tubo enquanto os aglutinados de eritrocitos ligados pelos anticorpos são atrasados e retidos no gel e isto tanto mais quanto mais fortemente positiva for a resposta. Este tipo de teste é chamado resumidamente

J gel-centrifugação.

processo patenteado foi desenvolvido e comercializado sob a forma de kits pela sociedade Dia Med (SA-Morat CH 3280 Suiça ou 75002 Paris França). Estes kits permitem efectuar um grande número de testes em pouco tempo e são fáceis de ler. Contudo, não oferecem a mesma segurança que os testes clássicos em tubos e verificam-se discordâncias significativas na detecção

de certas aglutininas irregulares que podem ser responsáveis por acidentes transfusionais.

A requerente pretende, portanto, aumentar a precisão deste tipo de teste em gel-centrifugação para garantir a fiabilidade do resultado.

Mais particularmente, a requerente verificou que se podia aumentar o poder de discriminação do gel pela incorporação de um segundo gel, de reticulação mais fina. Assim mistura-se com vantagem Sephadex G100 (cujas partículas têm um diâmetro compreendido entre 20 e 50 jJtm) e Sephasorb HP Ultrafino (cujas partículas têm um diâmetro compreendido entre 10 e 23 ytm); estes dois produtos são dextranos comercializados por Pharmacia (Pharmacia Fine Chemicals - Uppsala - Suíça). Pode-se igualmente utilizar outros materiais semelhantes e classicamente utilizados para as separações cromatograficas mediante simples peneiração molecular.

Diferentes reagentes específicos para cada tipo de teste são com vantagem incorporados no gel.

Assim, - para o teste em meio salino e para o teste após tratamento das hemãcias com enzimas, incorpora-se um soro AB humano previamente controlado, ou imunoglobulinas purificadas, para facilitar a sedimentação dos glóbulos não aglutinados;

-6TÍ para os testes de aglutinação directa ou indirecta de Goombs (ou qualquer outro teste derivado destes), incorporam-se as antiglobulinas polivalentes ou específicas e anti-complemento no gel.

As antiglobulinas levam a uma aglutinaçao das hemácias sensibilizadas por um processo imunológico.

. As antiglobulinas humanas são de natureza IgG e desempenham o mesmo papel que o soro AB humano ou as IgG humanas purificadas, a saber melhorando a sedimentação das hemácias não aglutinadas.

Como nos testes clássicos, as antiglobulinas utilizadas para a aglutinação indirecta são antiglobulinas polivalentes e/ou anti-IgG policlonais de coelho e/ou anti-complementares de coelho.

A requerente melhorou fortemente o desempenho do teste de Coombs directo e indirecto mediante substituição do anti-complemento padrão por um anticorpo monoclonal de especificidade anti-C^d, em que ela seleccionou o hidroma de acordo com critérios escolhidos em função deste teste.

As condições de realização de cada teste foram particularmente adaptadas a esta técnica de gel-centrifugação. Assim, a

requerente verificou que a qualidade da reacçao do teste de Coombs em tampão de baixa força iónica pode ser aumentada pela qualidade da preparação de eritrocitos (que estão classicamente em suspensão em uma solução salina de pequena força iónica, de acordo com o descrito por Low e Messeter - Vox Sang. 26, 1974, 53-61) e, em particular, pela adição nesta suspensão de 0,26% de EDTA dissódico, escolhido pelo seu papel de agente quelante do cálcio ionizado; exerce assim um efeito protector contra a hemólise das hemácias (o meio de baixa força iónica provoca uma sensibilização nao específica das hemácias pelas fraeções do complemento presentes nos soros a testar). É necessário notar que em uma concentração muito elevada de EDTA, os anticorpos que fixam o complemento não são detectados. Este efeito pode ser compensado pela dopagem da antiglobulina polivalente com o anti-Cgd monoclonal purificado e concentrado para melhor se detectar os anticorpos que fixam o complemento tais como os anti-Jka sem por isso diminuir a actividade anti-IgG.

A requerente aumentou igualmente as vantagens do teste pela escolha de anticorpos padrão particularmente vantajosos em que são vários os anticorpos monoclonais.

Em um caso específico e particularmente difícil de identificar, como a fenotipagem Fya, a requerente demonstrou que a adiçao de metilcelulose na solução de anticorpos melhora a sensibilidade da reacção.

A presente invenção diz por conseguinte respeito a um processo para a demonstração de aglutinatos eritrocitários caracterizado pelo facto de compreender um conjunto de operações todas adaptadas particularmente ao processo em gel - centrifugação. Mais particularmente, a presente invenção é caracterizada pelo facto de :

se utilizar como gel uma mistura de 2 dextranos de finura de reticulação diferentes;

se adicionar a este gel reagentes adaptados ao tipo de teste a realizar, quer dizer soro AB (ou imunoglobinas purificadas) ou a mistura antiglobulina (polivalente ou específica)/anti-complemento;

se utilizar um meio contendo EDTA dissódico para suspender as hemácias que serão utilizadas no teste o que aumentará o poder de discriminação do teste preservando as hemácias da hemólise.

A utilização de um anticorpo monoclonal de especificidade anti-Cgd com forte afinidade e um título muito elevado em vez de um anticorpo anti-complemento padrão, assim como a selecção do hibridoma que produz este anticorpo monoclonal fazem igualmente parte da presente invenção. Em particular, a crivação dos hibridomas efectua-se mediante titulação, para favorecer a selecção de uma linha produtora de anticorpos monoclonais de título muito

elevado, quer dizer ainda positivo na diluição 1/512.

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção sem contudo a limitarem de modo algum.

A figura 1 ilustra um exemplo da aplicação da presente invenção sob a forma de quatro dos resultados comparados da despistagem e da identificação de 106 anticorpos irregulares, por 3 processos : o processo de referência em tubo (designado tubo), o processo vendido sob a forma de kit por Dia Med (designado gel Dia Med) e o processo de acordo com a presente invenção (designado gel Lille); efectuam-se 2 tipos de testes em paralelo : o teste enzimático (designado papaína) e o teste de Coombs indirecto em meio de baixa força iõnica (designado CI-BFI).

EXEMPLO I - Preparação dos geles e repartição em microtubos.

I.a - Composição do gel de base comum a todos os testes.

gel é constituído por 2 dextranos de finura de reticulaçao diferente :

Sephadex G100 Superfino (20 - 50 /toi)

Sephasorb HP Ultrafino (10 - 23 /tm).

Estes 2 produtos são comercializados por Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala - Suécia).

As proporções das 2 substâncias variam em função do teste a efectuar :

para os testes de Coombs utiliza-se g de Sephadex e 5 mg (ou 10 mg) de Sephasorb para os testes em meio salino e os testes enzimãticos utiliza-se g de Sephadex e 5 mg (ou 10 mg) de Sephasorb.

Suspende-se esta mistura em 90 ml (ou 100 ml) de solução salina de baixa força iónica (meio clássico utilizado por Low e Messeter - Vox Sang. 26, 1974, 53-61) que contém NaCl 0,03 M.

I.b. - Reagentes específicos.

Para o teste de Coombs com a antiglobulina, incorpora-se no gel 15 ml de antiglobulina polivalente (anti-IgG policlonal de coelho) e de anti-complemento (anti-C^d monoclonal de murganho - ver adiante -).

Para o teste enzimático (quer dizer quando se utilizam hemácias previamente tratadas com enzimas), incorpora-se no gel 10 ml de soro humano AB previamente controlado (ou 100 mg de

imunoglobulinas purificadas), ou eventualmente imunoglobulinas purificadas.

I. c. - Repartição do gel nos microtubos.

Utilizam-se microtubos para centrifugar, de fundo cónico (por exemplo do tipo Elkay de 250 yl de capacidade). Reparte-se o gel com a pipeta automática à razão de 100 yul por tubo.

Os tubos são centrifugados durante 2 minutos a 1500 g para comprimir o gel e eliminar as bolhas.

EXEMPLO II - Realização dos testes

II. a. - Preparação das hemácias

As amostras a estudar são centrifugadas durante 15 minutos a 2000 g.

>

Para o teste de Coombs, as hemácias são suspensas a 0,8% (ou 1% para certos testes) na solução salina de baixa força iónica (ver antes), adicionada de 0,26% de EDTA dissódico. Esta modificação do meio leva a um melhoramento significativo da sedimentação das hemácias através do gel quando a reacção é negativa (soro sem anticorpos) dirigidos contra os antigénios das hemácias).

Para os testes em meio salino e os testes enzimáticos (papaína, tripsina, bromelina, efectuados de acordo com os métodos clássicos), as hemácias são suspensas a 0,8% em água fisiológica (ou a 1% para certos testes).

II.b - Realização do teste

Em cada microtubo deposita-se à superfície do gel - em um primeiro tempo, 50 yjil de hemácias em suspensão (como definido em lia) em um segundo tempo, 25 jn.1 de soro.

Após uma incubação de 15 minutos em banho-Maria a 37°C centrifugam-se os microtubos durante 9 minutos a 430 g e a leitura efectua-se macroscopicamente.

Quando o teste á negativo, as hemácias formam um sedimento nítido no fundo do tubo.

Quando o teste é positivo, as hemácias aglutinadas são mais ou menos retardadas no gel; os resultados anotam-se por um número de + compreendido entre 1 e 4.

Pode-se observar uma hemólise das hemácias tratadas pelas enzimas quando os anticorpos fixam o complemento (sobrenadante rosado).

*

EXEMPLO III

Selecgão de um anticorpo monoclonal anti-complemento de especificidade anti-Cgd, de forte afinidade e de título muito elevado.

método clássico de indução de hibridomas de Kholer e Milstein mediante fusão de esplenôcitos de murganhos imunizados e de células de mieloma murino não secretor de imunoglobulinas foi adaptado tendo em vista a preparação de hibridomas secretores de anti-complemento de especificidade anti-Cgd.

1) Escolha do imunogénio

Murganhos são imunizados com hemácias de dador são, controladas, cobertas com a fracção Cgd do complemento. A preparação destas hemácias-Cgd realiza-se in vitro da seguinte maneira :

1-a - Preparação de hemácias-Cg de acordo com o método de baixa força iónica a frio.

- Preparar a seguinte solução A : 1,0 M K₂HPO₄

0,2 M Na₂ EDTA sacarose água destilada

- Preparar a seguinte solução B 1,0 M KH₂PO₄0,2 M Na₂ EDTA

1.25 ml

5.25 ml

23,1

q.b.p. 250 ml

1,1 ml 5,25 ml sacarose

23,1 g água destilada

q.b.p. 250 ml

- Preparar a seguinte solução C : 2,0 M MgCl₂ 6H₂O água destilada ml

q.b.p. 50 ml

Prepara-se o tampão de fosfato/sacarose pH 5,1 mediante a adição da solução A à solução B até â obtenção do pH pretendido.

Colocam-se 19 ml de tampão de fosfato/sacarose pH 5,1 em um copo de 50 ml mergulhado em um banho de gelo fundente.

Mistura-se até que a temperatura do tampão esteja compreendida entre 0°C e 1°C.

Adiciona-se 0,5 ml de sedimento de hemãcias do grupo 0, lavadas três vezes.

Adiciona-se 0,5 ml de soro ou de plasma fresco diluído a 1/50 em solução salina isotónica e 0,1 ml de solução C.

Incubam-se durante trinta minutos a 0°C.

Centrifuga-se, elimina-se o sobrenadante, lava-se quatro vezes as hemãcias com 20 ml de tampão PBS e desperdiça-se depois o último sobrenadante de lavagem.

Adicionam-se 14,5 ml de tampão PBS ao sedimento celular.

Obtém-se deste modo uma suspensão a 3% de hemácias apresentando o determinante Cgb do complemento â sua superfície (estas hemácias são chamadas EC^b).

1-b - Preparação de hemácias C^d mediante tratamento com tripsina das hemácias EC^b.

►

Dilui-se 2,5 ml de ácido clorídrico IN em 50,0 ml de água destilada.

Dissolve-se 0,1 g de tripsina cristalisada (SIGMA ref. T8253) em 10 ml de ácido clorídrico 0,05N.

Separa-se em fracções de 0,1 ml e conserva-se a -20°C.

Prepara-se a seguinte solução C :

I 1,0 M K₂HPO₄ 5,0 ml água destilada q.b.p. 50 ml

Prepara-se a seguinte solução D :

1,0 M KH₂PO₄ 1,0 ml água destilada q.b.p. 10 ml

Adiciona-se a solução D à solução C sob agitação até à obtenção de pH 7,7.

Aliquota-se em 10 ml e conserva-se a -20°C.

Prepara-se 1,0 ml de tripsina a 0,1% mediante adição de 0,9 ml de tampão de fosfato pH 7,7 a 0,1 ml da solução armazenada de tripsina a 1,0%.

Adiciona-se 1 ml de tripsina a 0,1% a 0,5 ml de sedimento de hemácias EC^b ou EC^ preparadas de acordo com o descrito em a) em um copo de 25 ml, mistura-se e incuba-se durante 30 minutos a 37°C.

Lavam-se as hemácias quatro vezes com 20 ml de tampão PBS e elimina-se depois o último sobrenadante de lavagem.

Adicionam-se 14,5 ml de tampão PBS ao sedimento celular.

Obtém-se deste modo uma suspensão a 3% de hemácias apresentando o determinante C^d do complemento à sua superfície (estas hemácias são chamadas EC^d).

2) Protocolo de imunização dos murganhos

Escolheu-se um protocolo de imunização susceptível de favorecer a indução de anticorpos de alta afinidade (quer dizer uma imunização repetitiva de longa duração : até 6 meses).

Os murganhos receberam 2 vezes por semana injecções por via intraperitoneal com 300 jtfL da suspensão de hemácias ECgd a 3Z descrita anteriormente. A última injecção realiza-se por via intravenosa.

Três dias depois desta última injecção, colhe-se o baço dos murganhos e homogeniza-se; coloca-se o conjunto das células a fusionar com 2,10? células de mieloma. Em seguida, realiza-se a selecção dos hibridomas, classicamente, em meio HAT. A crivação específica efectua-se 15 dias mais tarde.

3) Selecção de hibridomas que segregam uma elevada taxa de anticorpos anti-C^d.

A crivação dos hibridomas efectua-se em microplacas de fundo em U, na presença de hemácias recobertas com a fraeção Cgd do complemento.

São utilizados dois artifícios para favorecer a selecção dos clones produtores de uma taxa elevada de anticorpos :

3-a- Escolha do anticorpo revelador

Para detectar os clones produtores de anticorpos monoclonais anti-Cgd, utiliza-se como revelador hemácias de um paciente particularmente escolhido para este fim, quer dizer um paciente

com uma anemia hemolítica crónica com aglutininas frias, em que se demonstrou no laboratório que as hemácias estão cobertas com a fracção C^d do complemento.

3-d- Crivagão mediante titulação

A crivagão dos hibridomas não se efectua somente para a selecção dos clones positivos mas efectua-se, directamente, com várias diluições, de maneira a seleccionar os clones que produzam o anticorpo com o título mais elevado.

Após uma primeira selecção, os hibridomas são reclonados mediante titulação em diluição limite. São em seguida amplificados e testados de novo no que diz respeito à sua produção de anticorpos e à sua sensibilidade.

Reteve-se um clone particularmente vantajoso e derivou-se um lote piloto e um branco.

Esta linha produz um anticorpo monoclonal anti-C^d cujo título é 1/512 (última diluição que dá uma resposta positiva).

Contrariamente â noção correntemente divulgada, o elevado título deste anticorpo não leva ao aparecimento de respostas falsamente positivas nos testes de compatibilidade sanguínea (ver adiante) mas melhora muito significativamente a precisão dos resultados.

EXEMPLO IV

Despistagem e identificação dos anticorpos irregulares nos soros dos receptores e das mulheres grávidas processo de gel-centrifugação aplicado ao teste de Coombs indirecto e ao teste enzimático com a papaína foi utilizado sobre 2.050 soros, com a gama de hemãcias teste previstas pela lei.

J

Entre estas amostras, 453 apresentavam anticorpos irregulares (isolados ou associados). No total, 615 anticorpos irregulares foram despistados e identificados.

QUADRO I

ESPECIFICIDADES DOS 615 ALLO-ANTICORPOS IRREGULARES DETECTADOS (COOMBS E PAPAlNAS)

ANTICORPOS	NÚMEROS	ANTICORPOS	NÚMEROS
ANTI-D	106	ANTI-Lea	52
ANTI-C	72	ANTI-Leb	27
ANTI-E	101	ANTI-H	15
ANTI-c	32	ANTI-i	1
ANTI-Cw	22	ANTI-U	1
ANTI-e	5	ANTI-GE	2
ANTI-Ce	1	ANTI-LW	1
ANTI-K	63	ANTI-JMH	1
ANTI-k	2	ANTI-Tja	2
ANTI-Kpa	5	ANTI-Vel	2
ANTI-Fya	28	ANTI-Lub	3
ANTI-Fyb	1	ANTI-Wra	3
ANTI-Jka	25	ANTI-Vw	2
ANTI-Jkb	4	ANTI-M	14
ANTI-S	5	ANTI-N	1
ANTI-s	1	ANTI-PI	14
		ANTI-P	1

A sensibilidade e a fiabilidade do teste utilizado foram comparadas âs dos mesmos testes realizados quer de acordo com o método clássico em tubo quer mediante gel-centrifugação com o kit vendido por Dia Med.

Nos quadros seguintes utilizar-se-á para estes 3 testes as seguintes abreviaturas tubo; Dia Med; gel-Lille (para a presente invenção).

>

Dos 615 anticorpos irregulares identificados no total, único só é identificado pelo método de referência em tubo (o anticorpo anti-H).

614 são identificados em gel Lille, ou seja 99,84%

581 são identificados pelo método de referência em tubo, ou seja 94,47%

I

566 são identificados em teste Dia Med, ou seja 92,03%.

Com uma excepção, o processo de acordo com a presente invenção é, por conseguinte, mais vantajoso do que o método de referência e é sempre significativamente mais vantajoso do que o teste Dia Med.

Um estudo pormenorizado da identificação dos anticorpo (incidindo sobre 106 dos anticorpos detectados anteriormente) mostra importantes discordâncias entre os 3 processos. Os resultados pormenorizados são apresentados em anexo, na figura 1. As discordâncias podem resumir-se da seguinte maneira :

entre os anti-Rhesus, que se detectam melhor no teste enzimático com a papaína, 21 dão reacções discordantes em 339 estudados, ou seja 6,2% :

anti-D, 3 anti-C, 2 anti-e, 1 anti-Cw, 11 anti-E.

se se observar no quadro anti-E da Figura 1, verifica-se que . nos 19 anti-E detectados em gel-Lille (pelo teste com a papaína), . 11 não são detectados no teste Dia Med (sendo entre estes, 3 detectados em tubo) e não são detectados em tubo.

entre os 125 anticorpos detectáveis classicamente pelo método de Coombs indirecto (anti-Kell·, anti-Duffy, anti-Kidd, anti-S, etc.), 19 dão reacções discordantes (ora é necessário notar que os anticorpos anti-Kell, Duffy e Kidd, que não podem fixar o complemento, são particularmente perigosos em transfusões) :

anti-Kell, 4 anti-Fya, 5 anti-Jka anti-Jkb, 1 anti-S.

entre as outras especificidades estudadas, em 122 anticorpos 19 (ou seja 15,5%) dão reacções discordantes :

anti-Lea, 3 anti-Leb, 8 anti-M, anti-Pp 2 anti-H.

Entre todas estas discordâncias, verifica-se que o teste Dia Med nunca permite detectar um anticorpo que não tenha sido detectado pelo menos por um dos 2 outros métodos.

EXEMPLO V - Utilização do teste para a grupagem ABO-D e a fenotipagem das hemácias

V.a. A grupagem ABO-D e a fenotipagem Rh-Kell são efectuadas na presença de soro AB humano ou de imunoglobulinas purificadas, (de acordo com o descrito em I), mediante teste enzimático com a bromelina. Neste caso particular realiza-se uma suspensão de hemácias a 1% (ou de hemácias-teste para a contra-prova do grupo ABO), em uma solução de bromelina a 5% em água fisiológica

I (ou água fisiológica para alguns anticorpos). A incubação realiza-se à temperatura ambiente durante 10 minutos.

Os reagentes que se seguem são utilizados e incorporados no gel :

anticorpos monoclonais (seleccionados pela requerente) : anti-D, anti-C, anti-E anticorpos policlonais humanos controlados :

anti-c, antiCw, anti-e

V.b. Outras fenotipagens eritrocitárias são efectuadas em gel com a antiglobulina, (anti-IgG humana ou antiglobulina polivalente, padronizada e controlada e anti-complemento).

Esta fenotipagem diz mais particularmente respeito aos ) antigénios Kell, Duffy e S.

Para este teste, utiliza-se uma concentração de hemácias de 1%.

Para a fenotipagem Fya que é particularmente delicada, a solução salina de anticorpos é adicionada de 2 g por litro de metilcelulose.

V.c. Resultados

I processo de acordo com a presente invenção realizado em gel-Lille - centrifugação é particularmente vantajoso e isto aparece mais particularmente no estudo das populações duplas :

- o anti-D detecta 4% de hemácias D⁺ em 96% de D~ e

6% de D em 94% de D+

10% de hemácias C⁺ em 90% de C e 10% de C em 90% de C⁺

- o anti-C detecta

anti-E detecta	8% de 10% de
anti-c detecta	6% de
anti-e detecta	8% de 10% de
anti-Cw detecta	8% de
anti-Kell detecta	5% de 10% de
anti-Duffy detecta	10% de 10% de
anti-S detecta	10% de

hemãcias E⁺ em 92% de E e

E em 90% de E⁺ hemãcias c* em 94% de c hemãcias e* em 92% de e^- e e em 90% de e⁺ hemãcias Cw⁺ em 92% de Cw hemãcias K⁺ em 95% de K e K em 90% de K⁺ hemãcias Fy* em 90% de Fy^- e Fy em 90% de Fy* hemãcias S* em 90% de S.

EXEMPLO VI - Teste de Coombs directo processo de acordo com a presente invenção pode igualmente ser utilizado para efectuar um teste de Coombs directo. Este teste permite pôr em evidência anticorpos e/ou complemento fixados in vivo sobre hemãcias de doentes. Esta técnica aplica-se particularmente ao diagnóstico das anemias hemolíticas auto-imunes (devidas a auto-anticorpos anti-hemácias dirigidos contra antigénios normalmente presentes) ou das anemias hemolíticas de alio-imunização feto-maternal ou pós-transfusional.

r

Neste caso do teste de Coombs directo, utiliza-se o processo de acordo com a presente invenção nas seguintes condições :

Incorpora-se no gel o reagente de Coombs (15 ml para 100 ml de gel), quer dizer

- quer a antiglobulina polivalente

- quer a antiglobulina anti-IgG

- quer o anti-complemento monoclonal de especificidade anti-C^d (ver antes, exemplo III).

Utiliza-se como referência negativa um gel neutro, sem reagente de Coombs.

Prepara-se a suspensão de hemácias do paciente a 1% e, como nos testes anteriores, deposita-se 50 ^Jll à superfície do gel. Efectua-se uma centrifugação durante 9 minutos a 430 g.

Em 150 testes efectuados, observou-se uma sensibilidade pelo menos igual e por vezes superior ã da mesma técnica praticada em tubo.

EXEMPLO VII - Diagnóstico do acidente hemolítico da transfusão sanguínea.

O processo de acordo com a presente invenção pode igualmente ser utilizado para o diagnóstico dos acidentes transfusionais de

% que dependerá a segurança de transfusões ulteriores.

Este diagnóstico efectua-se após eluição directa, quer dizer que o anticorpo responsável pelo acidente ê separado (eluído) das hemãcias incompatíveis transfundidas por erro, por um mecanismo físico-químico. Em particular, a requerente melhorou o processo de eluição a pH ácido (pH 3) descrito por Rekvig e Hannestd (Vox Sang. 33, 280-285, 1977), que evita a hemólise das hemãcias sensibilizadas.

A eluição realiza-se mediante contacto entre um volume de sedimento globular e 1,5 volume de tampão ãcido clorídrico/glicina a pH 2 de modo a melhorar o rendimento da eluição. Para evitar a hemólise das hemãcias tratadas a pH 2, adiciona-se EDTA ao tampão ácido clorídrico/glicina.

Facilita-se assim a identificação ulterior do anticorpo após neutralização do pH e recomplementação do eluato.

Os anticorpos eluídos são postos em evidência, muito melhor, pelo processo de gel-centrifugaçao do que pela técnica clássica em tubo.

Em particular, pôs-se em evidência os seguintes anticorpos eluídos :

anti-D, anti-C, anti-c, anti-K, anti-E, anti-e, antl-Fya, anti-Jka, anti-Fyb, anti-Jkb, anti-S, anti-s e anti-Lea.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a demonstração de uma aglutinação eritrocitária para a retenção selectiva de aglutinatos após cen trifugação em meio gelifiçado, caracterizado pelo facto de:

- o meio gelificado ser constituído por 2 geles de finura de reticulaçao diferentes,

- o meio gelificado conter um ou vãrios reagentes espe cificamente adaptados a cada tipo de ensaio,

- as condições de utilização de cada ensaio estarem particularmente adaptadas a este processo de centrifugação em meio gelificado.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o meio gelificado ser constituído por uma mistura de um dextrano cujas partículas têm um diâmetro compreendido entre 20 e 50 jim e por um outro dextrano cujas parti cuias têm um diâmetro compreendido entre 10 e 23 jjm.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca racterizado pelo facto de o meio gelificado conter um soro AB humano.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca racterizado pelo facto de o meio gelificado conter antiglobulinas.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 4, caracterizado pelo facto de o meio gelificado conter anticorpos anti-complemento monoclonais.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracte rizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ser um anticorpo de especificidade anti-Cgd e de alta afinidade.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, ca racterizado pelo facto de o anticorpo anti-Cgd ser produzido por um hibridoma induzido e seleccionado com vista ao referido

Ζ processo.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracte rizado pelo facto de a selecção do hibridoma ser efectuada mediante titulação para se obter um hibridoma produtor de anticor pos monoclonais de título muito elevado.

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9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo facto de a realização do ensaio compreender a adição de EDTA dissódico à suspensão de hemácias.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a concentração de EDTA dissódico estar compreendida entre 0,15 e 0,30%.

I

Lisboa, 26 de Março de 1991

RESUMO

PROCESSO PARA A DEMONSTRAÇÃO DA AGLUTINAÇÃO ERITROCITÁRIA DESTI NADO ÃS ANÁLISES DE COMPATIBILIDADE SANGUÍNEAS

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Descreve-se um processo para a demonstração de uma agiu tinação eritrocitãria para á retenção selectiva de aglutinatos apôs centrifugação em um meio gelificado constituído por 2 geles de dextrano de finura de reticulaçao diferente e contendo todos os reagentes especificamente adaptados a cada tipo de ensaio. 0 processo compreende a utilização, no gel, de um anticorpo anti-complemento monoclonal.

A invenção aplica-se ao domínio das análises de compati bilidade sanguíneas de pré-transfusão e de seguimento da gravidez assim como no diagnóstico de doenças e acidentes hemolíticos.