PT95421B - Processo para a determinacao da proporcao de uma proteina de fusao numa mistura de proteina de fusao e de produto de degradacao proteolitica - Google Patents
Processo para a determinacao da proporcao de uma proteina de fusao numa mistura de proteina de fusao e de produto de degradacao proteolitica Download PDFInfo
- Publication number
- PT95421B PT95421B PT9542190A PT9542190A PT95421B PT 95421 B PT95421 B PT 95421B PT 9542190 A PT9542190 A PT 9542190A PT 9542190 A PT9542190 A PT 9542190A PT 95421 B PT95421 B PT 95421B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- mixture
- amylase
- fusion protein
- protein
- alpha
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 title description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 abstract description 11
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 abstract 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 abstract 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 abstract 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710171801 Alpha-amylase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001746 Pancreatic alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010029785 Pancreatic alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
DESCRIÇÃO
Na fermentação de estreptomicetas recombinantes para a preparação de uma proteína de fusão com uma parte de Tendamistato, verifica-se uma degradação proteolítica da proteína segregada por proteases que se obtêm na fermentação juntamente com a proteína de fusão. Por actuação das proteases, obtém-se como componente da proteína de fusão a Tendamistato como produto da degradação, essencialmente. Porque se sabe que a Tendamistato é um inibidor de péptido da alfa-amilase do pâncreas, a formação do produto total de uma cultura de estreptomicetas, ou seja, o teor de proteína de fusão, incluindo o produto de degradação, e determinado pelo ensaio de inibidor de alfa-amilase.
No entanto, é inconveniente o grande intervalo de tempo que ê necessário para determinar o teor de proteína de fusão pura o qual é importante para o intervalo
- 1 cie tempo da colheita da amostra ou para isolamento do produto. Assim, a determinação da proteína de fusão de acordo com o processo de electroforese com dodecil-sulfato de sódio (SDS) necessita de pelo menos oito horas e, de acordo com o ensaio de rádio-imunidade de insulina pelo método (RIA) , precisa de cerca de vinte e quatro horas. A presente invenção pretende proporcionar um meio auxiliar para evitar esse inconveniente.
Reivindica-se um processo para a determinação da proporção da proteína de fusão numa mistura de proteína de fusão e de produtos de degradação proteolítica que se caracteriza pelo facto de se diluir a mistura constituída pela proteína de fusão e pelo produto de degradação proteolítica com alhumina de soro de vitelo, se misturar uma parte da mistura diluída com solução de alfa-amilase, se incubar a 57°O durante um intervalo de tempo maior ou igual a trinta minutos, se adicionar reagente de alfa-amilase e se me dir espectrofotometricamente a reactividade da solução de alfa -amilase, se misturar a outra parte da mistura diluída com rea gente de alfa-amilase, se tratar a solução de alfa-amilase depois de mistura e se medir espectrofotometricamente a cinética (decurso da reacção), se compararem todos os valors medidos com padrões de proteína de fusão, Tendamistato, produto de degradação e reacção de alfa-amilase inibida e, a partir da comparação, determinar-se o teor de proteína de fusão existente na mistura.
Neste método, de acordo o qual se po de determinar o teor de proteína de fusão Intacta presente em mistura com produto de degradação, em menos do que duas horas, com uma margem de erro de + 10%, utilizam-se as diferentes constantes de velocidade da reacção de proteína de fusão purificada, produto de degradação e de Tendamistato com alfa-amilase.
- 2 Em seguida, esclarece-se a presente invenção mais completamente por meio de um exemplo.
Oentrifuga-se ou filtra-se o caldo do fermentador para separar os microrganismos, assim como os componentes do meio insolúveis, 0 sobrenadante da centrifugação ou o filtrado corresponde à mistura acima definida de proteína de fusão e de produto de desagregação proteolítica. Esta mistura é neutralizada com H01 ou com NaOH - sempre que o seu valor de pH seja diferente de 7 de + 1,5 - e, em segui da, dilui-se com solução de albumina de soro de vitelo a 0,1% na proporção de 1 : 100 e ensaia-se a mistura diluída num pro cesso em duas fases relativamente à inibição de alfa-amilase.
Na primeira fase, mistura-se 0 ,1 ml da mistura diluída com 0»4 ml de solução de alfa-amilase. Prepara-se a solução de alfa-amilase por dissolução de 8 mg de alfa-amilase de pâncreas de poreo fornecido pela firma Merck, Darmstadt, Número de Encomenda 16 512 em 1 litro de solução que contém 100 milimoles de tampão de Hepes (pH 7), mM de CaÇlg, assim como 0»4% de albumina de soro de vitela. Além disso, adiciona-se 0,1 ml de solução a 0,1 % de albumina de soro de vitala como controlo da reacção não inibida, assim como 0,1 ml de solução de tendamistate pura com a concentração de 1 mg por litro de solução a 0,1 % de albumina de soro de vitela como padrão inibidor com respectivamente 0,4 ml de solução de alfa-amilase.
Incubam-se as trâs misturas reaccionais a 57°O durante ^.JO minutos. De cada mistura incubada, misturam-se 20 microlitros com 1 ml de reagente de alfa-amila se (WAE Obemie, Bad Soden), que é previarnente temperada a 57°0 Imediatamente depois da mistura, determinam-se fotometricamente as taxas de reacção V, ao comprimento de onda previarnente indicado de 405 nanómetros durante cerca de cinco minutos e
- 5 regista-se a extenção ΔΕ em função io tempo (t). A velocidade de reacção V varia linearmente com o reagente de alfa -amilase utilizado.
Gomo se mostra na Figura 1, essa ve locidade é igual, no caso da mistura de proteína de fusão e de produto de degradação, a 0,10 A E por minuto, para a reacção de controlo 0,5 A E por minuto e para a reacção de tendamistate 0,16 Δ E por minuto. Gomo a velocidade de reacção V é directamente proporcional à concentração de inibidor 0, pode determinar-se a concentração de inibidor G^ da mistura de proteína de fusão e produto de degradação pox1 meio dos seguintes sistemas de equações:
VG = -m0G + VE V^, = —mO|j + * nas quais
Vç é a velocidade da reacção da mistura (G) ,
Yrj é a velocidade da reacção da solução de tendamistate (Τ),
Vg é a velocidade da reacção da solução de controlo (Κ),
Oq é a concentração de proteína de fusão + produto de decom posição (mg/1) na mistura,
Οφ é a concentração de Tendamistato na solução de Tendamistate.
Gomo se escolheu 0^ = 1 mg/1, resulta do sistema de equações para
- VG °’5 ” θ’1
Cq = = = 1,45 mg/1
VK - VT 0,5 - 0,16
- 4 Ha segundo fase, misturam-se 150 mi crolitros, da mistura diluída 1 5 100 da proteína de fusão e do produto de degradação com 800 microlitros de reagentes de alfa-amilase (WAK Chemie, Bad Soden) e aquece-se a 37°O· Igualmente, misturam-se 150 microlitros de solução de albumina de soro de vitela a 0,1%, como controlo, com 800 microlitros de reagente de alfa-amilase e aquece-se a 37°0. Realiza-se a reaeção da mistura por adição de 50 microlitros de solução de alfa-amilase, como se indicou na operação 1 muito embora com uma concentração de alfa-amilase igual a 2,5 mg/litro - inicia-se a reaeção e regista-se o progresso da reaeção (cinética) fotometricamente durante cerca de dez minutos a 405 nm θ regista-se a extinção (A E) em função do tempo (Figura 2).
Em presença de inibidores, a velocidade de reaeção diminui continuamente a partir do início da reaeção. 0 progresso da reaeção da solução de albumina de soro de vitala (controlo) é linear; a velocidade de reac ção de Vg. é igual a 0,26 A E por minuto nesta reaeção. Da Figura 2, conclui-se que a velocidade de reaeção para â mistura de proteína de fusão a de produto de degradação, entre o quinto e o sexto minuto, e igual a 0,02 A E por minuto
As velocidades de reaeção determina das a partir do progresso da reaeção na fase 2, e são representadas graficamente em escala semilogarítmica em função nas velocidades de reaeção e da concentração determinada de C& da mistura da proteína de fuáão e de produ to de degradação (Figura 3)· Obtem-se uma linha recta cuja inclinação constitui uma medida do teor de proteína de fusão na mistura constituída por proteína de fusão e produtos de degradação. Compara-se este valor com o aumento das curvas padrão (reatas) que foram obtidos de acordo com 0 mesmo método a partir de produto de degradação puro e de proteína de fusão pura.
Claims (1)
- Processo para a determinação da proporção de uma proteína de fusão numa mistura de proteína de fusão e de degradação proteolítica, caracterizado por se diluir a mistura da proteína de fusão e do produto da degradação com albumina de soro de vitelo, misturar-se uma parte da mistura diluída com solução de -i-amilass, incuba-se a 37°O durante um tempo igual ou maior do que 30 minutos, adicionar-se reagente de e(-amilase e se medir espectrofotometricamente a aetividade residual da solução de ^-amilase, se misturar a outra parte da mistura diluída com reagente de p(-amilase, depois da mistura se adicionar solução de Vç-amilase e se medir espectrofotometricamente a cinética da enzima (avanço da reacção), se comparar todos os valores determinados com padrões de proteína de fusão, tendamistato, produto de desagregação e reacção com <fc-amilase não inibida e, a partir da comparação destes valores, se determinar o teor de proteína de fusão na mistura.A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 27 de Setembro de 1989, sob o N2. P 39 32 180.0.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19893932180 DE3932180A1 (de) | 1989-09-27 | 1989-09-27 | Verfahren zum bestimmen des anteils eines fusionsproteins in einem gemisch aus fusionsprotein und proteolytischem abbauprodukt |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT95421A PT95421A (pt) | 1991-08-14 |
| PT95421B true PT95421B (pt) | 1997-07-31 |
Family
ID=6390270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT9542190A PT95421B (pt) | 1989-09-27 | 1990-09-26 | Processo para a determinacao da proporcao de uma proteina de fusao numa mistura de proteina de fusao e de produto de degradacao proteolitica |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0420075B1 (pt) |
| JP (1) | JPH03133398A (pt) |
| DE (2) | DE3932180A1 (pt) |
| DK (1) | DK0420075T3 (pt) |
| IE (1) | IE67452B1 (pt) |
| PT (1) | PT95421B (pt) |
-
1989
- 1989-09-27 DE DE19893932180 patent/DE3932180A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-09-22 DE DE59009123T patent/DE59009123D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-22 DK DK90118228T patent/DK0420075T3/da active
- 1990-09-22 EP EP90118228A patent/EP0420075B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-26 PT PT9542190A patent/PT95421B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-09-26 JP JP25436690A patent/JPH03133398A/ja active Pending
- 1990-09-26 IE IE346290A patent/IE67452B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59009123D1 (de) | 1995-06-29 |
| DK0420075T3 (da) | 1995-10-09 |
| IE67452B1 (en) | 1996-04-03 |
| EP0420075A1 (de) | 1991-04-03 |
| DE3932180A1 (de) | 1991-04-04 |
| EP0420075B1 (de) | 1995-05-24 |
| JPH03133398A (ja) | 1991-06-06 |
| PT95421A (pt) | 1991-08-14 |
| IE903462A1 (en) | 1991-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sinicropi et al. | Colorimetric determination of DNase I activity with a DNA-methyl green substrate | |
| Winn-Deen et al. | Development of a direct assay for alpha-amylase. | |
| Johnson et al. | Assay methods and standard preparations for plasmin, plasminogen and urokinase in purified systems, 1967-1968 | |
| Dorsey et al. | A heated biuret-Folin protein assay which gives equal absorbance with different proteins | |
| Lundblad et al. | The activation of antihemophilic factor (factor VIII) by activated Christmas factor (activated factor IX) | |
| Masson et al. | Combined enzymic-Jaffé method for determination of creatinine in serum. | |
| US4097338A (en) | Fluorimetric demonstration and determination of a reduced coenzyme or derivative in an aqueous system | |
| ChandraRajan et al. | Determination of inorganic phosphorus in the presence of organic phosphorus and high concentrations of proteins | |
| NL8201987A (nl) | Werkwijze voor het bepalen van de activiteit van plasminogeenactivator van het weefseltype, alsmede voor gebruik bij deze werkwijze geschikte combinatie van het "kit"-type. | |
| EP0657547B1 (en) | Method of assaying antithrombin iii activity | |
| Cory et al. | Differential reactivities of tyrosine residues of proteins to tyrosinase | |
| Hummel et al. | Interaction of Streptokinase and Human Plasminogen: III. PLASMIN AND ACTIVATOR ACTIVITIES IN REACTION MIXTURES OF STREPTOKINASE AND HUMAN PLASMINOGEN OR HUMAN PLASMIN OF VARIOUS MOLAR RATIOS | |
| Lee et al. | Evidence for an essential histidine residue in rabbit liver aryl sulfatase A | |
| US4056485A (en) | Stable colored reference standard for enzymatic determinations | |
| US5266472A (en) | Stabilization of the enzyme urate oxidase in liquid form | |
| Christensen et al. | Mechanism of reaction of human plasmin with α-N-benzoyl-l-arginine-p-nitroanilide: titration of the enzyme | |
| Taylor et al. | Control of conformation of α-chymotrypsin through chemical modification | |
| Zimmerman et al. | Immunochemical studies of L-amino acid oxidase | |
| US4812398A (en) | Reagent for measuring amylase activity and measuring method thereof | |
| Roscoe | Plasma chromogen and the endogenous creatinine clearance | |
| Ratnoff | The relative amidolytic activity of Hageman factor (factor XII) and its fragments: The effect of high-molecular-weight kininogen and kaolin | |
| Borders Jr et al. | Role of arginyl residues in yeast hexokinase PII | |
| Lee et al. | An improved purification procedure, an alternative assay and activation of mevalonate kinase by ATP | |
| JPH0414957B2 (pt) | ||
| Rick et al. | Pepsin (pepsin, gastricsin, pepsinogen, uropepsinogen) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19910402 |
|
| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19970415 |
|
| MM3A | Annulment or lapse |
Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES Effective date: 19981031 |