PT93757A - Metodo para produzir um complexo activador plasminogenio de pro-uroquinase pura ligada covalentemente por meio de uma ponte de dissulfureto, a albumina do soro humano - Google Patents

Description

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Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 0 presente invento refere-se a um método para produzir um complexo activador plasminogénio de pro-uroquina se pura ligada covalentemente por meio de uma ponte de dissu fureto a albumina do soro humano*

Esta invenção refere-se ao uso de pro-uroqui-nase como agente trombolftico para dissolver coágulos de fi-brina em pacientes humanos. A pro-uroquinase (pro-UK) é um precursor (ji-mogenio), de cadeia simples, 55K- dalton, da uroquinase de cadeia dupla (UK). A pro-UK é descrito em Husain e outros U.S. Re. 32.221, aqui incorporado para referência. A activação da pro-UK de cadeia simples, por meio da sua conversão enzimá-tica na forma de uroquinase de cadeia dupla, é uma caracte-ristica da família serina-protease a qual ela pertence, é conhecido que a pro-UK tem um rápido tempo de eliminação (cerca de 5 a 8 minutos) do plasma quando injectada intravenosamente. Este tempo de eliminação á em certa medida mais curto do que o do ser derivado activo, de grande peso molecular, a UK de dupla cadeia. A presente invenção refere-se a um complexo activador plasminogénio de pro-UK pura covalentemente ligada a albumina do soro humano (HSA), que de forma marcada retar-30 da a eliminação da pro-UK do plasma mas ao mesmo tempo preserva as suas propriedades fibrinoléticas. No sentido aqui usado, "pro-UK·' significa naturalmente pro-UK efectiva ou de recombinaçêo, qualquer pro-enzima mutante de substituição da pro-UK, ou qualquer cadeia simples, derivado biologicamente 35 activo ou fragmento de pro-UK que contenha um resíduo de cis - 1 62*152

Gurewich—-Albumina CIP tina disponível para obter a permuta tiol-dissulfureto com a cisteína livre da HSA, como a seguir é descrito com maior detalhe. No sentido aqui usado, "ΗΒΑ11 significa naturalmente HSA efectiva ou de recombinação. No sentido aqui usado, "pu-ro*' significa que o complexo antes de ser usado é substancialmente (95$ ou mais em peso) livre de outros materiais, por exenplo, outros componentes do sangue ou de cultura de tecidos. 10 Dado que o complexo da invenção tem in vivo

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 uma semi-vida muito mais longa do que a própria pro-UK, a sua utilidade na terapêutica trombolítica é maior. Mais ainda, o complexo da invenção pode ser usado na prevenção da trombose assim como na prevenção de longa duração das doen-15 ças cardiovasculares, tais como a arteriosclerose, que, como é bem conhecido, está associada a uma actividade fibrinoli-ticamente diminuída. 0 complexo pro-UKíHSA da invenção, por causa 2o da sua melhorada semi-vida ,in vivo, pode ser administrado em uso terapêutico por injecção intravenosa. Isto representa um melhoramento sobre o uso terapêutico da própria pro-UK, a qual, devido à sua curta semi-vida in vivo, tem que ser administrada por contínua infusão intravenosa, o que complica 25 grandemente a terapia, especialmente fora dum hospital.

Outras caracteristicas e vantagens da invenção tornar-se-ão patentes a partir da descrição que se segue das suas realizações preferidas e a partir das reivindica-30 ções. São descritos primeiramente os desenhos

Desenhos A Fig. 1 (a) é um diagrama esquemático da to-35 talidade da cadeia simples da molécula de pro-UK (Holmes e S2.152

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i outros, Biotecnologia (1985)» 1» 923-929); a Fig 1 (b) é uma ilustração diagramatica de pro-UK de cadeia simples covalen-temerrte ligada a albumina· 5 A Fig. 2 mostra a cromatogra.fia de filtragem da mistura de incubação pro-UK/HSA (4 h a 3720). Fracções de 0,5 ml foram colhidas e analisadas para avaliação do conteúdo de proteína e da actividade fibrinolítica (0). 10 A Fig. 3 é um zimograma de pro-UK incubada em amortecedor (faixa 2), em albumina do soro humano (HSA) (faixa 3), em plasma CBS (faixa 4), em plasma CBS e HSA (faixa 5), e um plasma (faixa 6). As faixas 7 a 10 são de pro-UK incubada com HSA depois de ter passado através de uma coluna 15 (UK)-Sephadex.

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 A Fig. 4 é um zimograma do complexo purificado (faixas 2,3), do complexo purificado incubado como((HSA) durante 1 hora (faixa 4), e do complexo purificado passado através de uma colunac( (HSA)-Sephadex. A amostra na faixa 3 foi fervida durante 2 minutos em amorteeêdor SDS antes da electroforese em vez de ser tratada pelo procedimento Standard envolvendo a incubação em amortecedor SDS a 37SC durante 30 minutos. 25 A Fig. 5 é um zimograma de pro-UK incubada com HSA purificada sob pH5 (2), pH 9 (4), e sob pH 7,5 (3) com Zn++ (6), CA++ (7), Zn++, CA++ (6) e com uma razão pro--UK/HSA dez vezes mais alta (9). 30 A fig. 6 é um zimograma de pro-UK incubada em amortecedor (faixa 2), em plasma durante 0 h (faixa 3), 1 h (faixa 4), 2 h (faixa 5), e 6 h (faixa 6), e de UK em a-morteeedor (faixa 7), em plasma durante 0 h (faixa 8) e 6 h (faixa 9) e em urina concentrada (faixa 10). -3- 35 10 15

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A Fig. 7 é um zimograma de DFP e HSA com tra tamento de cloramina T (que não afecta a formação do complexo) e BSA com tratamento de DTT (qtie restaura a sua capacidade para formar complexos com pro-UK.), com pro-UK em amortece dor (faixa 1), pro-UK+HSA (faixa 2), pro-UK+HSA tratada com amortecedor (faixa 3)» pro-UK + HSA tratada com DFP (faixa 4) pro-UK+HSA tratada com amortecedor (faixa 5), pro-UK+HSA tratada com cloramina T (faixa 6), pro-UK em amortecedor mostrar do a presença de um dímero (faixa 7), pro-UK+BSA mostrando sómente o mesmo dímero de pro-UK (faixa 8) e pro-UK+BSA trata da com DTT (para restaurar a forma tiol) mostrando a virtual eliminação do dímero e a presença do complexo pro-UK:BSA(faixa 9). As Fig. 8A e 8b são zimogramas que mostram o efeito da PDI no curso do tempo de obtenção do complexo: sómente com pro-UK em amortecedor (faixa 1) com pro-UK recombi-nante (0,5/>g/ml) incubada com mercaptalbumina (40 mg/ml) durante tempos de incubação de 0 min. (faixa 2), 15 min. (faixa 3)» 30 min. (faixa 4)» 1 h (faixa 5)* 2 h (faixa 6), e 4 h (faixa 7) na Fig. 8A, e as mesmas misturas, respectivamente, incubadas em presença da PDI (920/7 g/ml) na Fig. 8B. A Fig. 9 é um zimograma que mostra o efeito da PDI na resposta em dose de complexo: sómente com pro-UK en amortecedor (faixa l), e com pro-UK (10/7g/ml) incubada com mercapt albumina (40 mg/ml) durante 6 h com concentrações de PDI em /7g/ml de 0 (faixa 2), 23 (faixa 3)» 230 (faixa 4)* 4β0 (faixa 5), 690 (faixa 6) e 920 (faixa 7)· A Fig. 10 é um zimograma do complexo de pro--UK formado com rec-HSA de E. coli. das em A Fig. 11 é um zimograma de amostras prepara· SDS a 37^0 cie pro-UK (0,5/>g/ml) incubadas (37SC) em -4- 1 62,152

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5 em amortecedor duante 0 h (faixa 1) e 6 h (faixa 2); e em plasma durante 0 h (faixa 3), 1 h (faixa 4), 4 h (faixa 5) e 6 h (faixa 6); e em plasma esgotado de plasminogénio contendo aprotinina (20 KlU/ml) durante 0 h (faixa 7), 1 h (faixa 8), 4 h (faixa 9) e 6 h (faixa 10). 10 A Fig· 12 são zimogramas das seguintes amostras: pro-UK (0,5yVg/ml) incubada (3720) em amortecedor(faixa 1), e com CBS-HSA (40 mg/ml) (faixa 2), incubada em plasma desprovido de HSA (faixa 3)» incubada em plasma desprovido de HSA suplementado com HSA (faixa 4), plasma antes pré--incubado com pro-UK (faixa 5) e depois da passagem por uma coluna Sephanose UK-Ab (não mostradas 4 fracções, faixas 6--9) · 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 A Fig. 13 é um zimograma (10$ SDS-PAGE) das seguintes diferentes formas de UK (0,5/,/g/inl) pré-incubada (6 h) com mercaptalbumina (40 mg/ml); HMW-UK em amortecedor (faixa 1), HMW-UK+HSA (faixa 2), 1MW-UK em amortecedor (faixa 3), 1MW-UK+HSA (faixa 4), ree.-pro-UK+HSA (faixa 5),mutan-de de substituição da pro-UK em amortecedor (faixa 6), mutan-te de substituição da pro-UK+HSA (faixa 7) · A Fig. 14 são manchas de imunidade acidentai 3 25 (Western immunoblots) usando UKíAb, pro-UK (0,3//g/ml) incubada (3720) 7 h em amortecedor (faixa 1), pro-UK incubada com BSA não tratada (40 g/ml) (faixa 2), pro-UK incubada com CBS-HSA (faixa 3), sómente CBS-HSA (faixa 4) e misturas que são as mesmas das faixas 1 a 4» respectivamente, proces-30 sadas sob condiÇpes redutoras (faixas 5-8)·

A Fig. 15 é um zimograma de pro-UK incubada em amortecedor (faixa 1), com 0,5 min de glutationa oxidada (GSSG) (faixa 2), com 5 mM de GSSG (faixa 3)> e incubada em plasma (faixa 4), com 0,5 mM GSSG (faixa 5)» e com 5 mM GSSG -5- 35

62.152 Gurewihc—Albumina OIP WW199IY7 1 (faixa 6). 5 A Fig. 16 é um zimograma de pro-UK incubada em amortecedor (faixa 1) com 10-¾ (2), 3xlO-^M (3), 6xlO~^M (4)» 10-¾ de DTNB (5)» e incubada em plasma (6) com 10-¾ (7), 3xlO-3M (8), 6xlO-3M (9), e 10-¾ de DTNB (10).

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 A Fig.17 são zimogramas mostrando o efeito díi concentração do pH e da HSA na formação do complexo. Com só-10 mente pro-UK em amortecedor (faixa 1), com pro-UK (5//g/ml) incubada (3720) durante 24 h com mer.captalbumina (40 mg/ml) sob pHf (faixa 2), sob pH 7,0 (faixa 3), sob pH 7,4 (faixa k] , sob pH 8,0 (faixa 5), sob pH 8,5 (faixa 6), e com indicadores de MW como Standard (faixa 7), e com pro-UK (5>Ug/ml), 15 incubada (372C) durante 24 h com HSA de concentração 80 mg/ ml (faixa 8), 20 mg/ml (faixa 9) e 10 mg/ml (faixa 10). Faixas 8-10 incubadas sob pH 8,0. 20 25 30 A Fig. 18 são zimogramas da actividade da UK associada com CBS-HSA, com CBS-HSA de plasma pré-incubada (20 h) com pro-UK (0,5//g/ml) (faixa 1), com CBS-HSA de plasma enriquecida (mas não pré-incubada) com pro-UK (5yUg/ml) (faixa 2), e com complexo de UK imunopreeipitado de CBS-HSA isolado do plasma fresco (faixa 3). A Fig. 19A é um gráfico de dois conjuntos de dados. 0 número fracionário das fracções obtidas pela filtração gel do plasma numa coluna calibrada G-75 é marcado no eixo dos X para ambos os conjuntos de dados, e a absorção a 280 nm é marcada no eixo dos Y com círculos brancos enquanto que a área de diisolução em nm2 obtida nos testes em placa de fibrina e marcada no eixo dos Y com círculos pretos. A Fig. 19B é um zimograma de imunoprecipita-dos de UK obtidos do conjunto das fracções identificadas com« -6- 35 62.152

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1 A, B, C e D na Fig. 11A. 5 10 15

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Caracterização 0 complexo pro-UK: albumina da invenção exibe as seguintes características: 1) é mais estável em dodeci!. sulfato de sódio (SDS) a 37SC do que a 10020; 2) é instável sob condições redutoras; 3) a formação do complexo á favorecida quando a HSA á primeiro tratado com ditiotreitol (DTT) em ordem a restaurar a forma tiol; 4) A formação do complexo á catalizada por proteína dissulfureto-isomerase (PDl), e 5) a formação do complexo á inibida por DTNB e glutationa oxida-da. Estas caracteristicas indicam uma ligação dissulfuraâa entre um resíduo livre de cisteína na albumina e um resíduo de cistina na pro-UK. Com base em experiências nas quais não se verificou a formação do complexo quer com o mutarrt e de substituição da pro-UK resultante da perda dos radicais 11-135 quer com LMW-UK, crê-se que a cistina da pro-UK responsável pela ligação dissulfurada do complexo está na cadeia A, sendo muito provávelmente uma do par de cistinas do grupo NHg--terminal da extremidade da pro-UK. 25 30

Quando a HSA purificada á armazenada por longos períodos, a sua capacidade para formar complexos com pro--UK á eventualmente perdida devido à oxidação da cisteína livre, o que impossibilita a permuta dissulfurada. Contudo a sua capacidade para formar complexos com pro-UK pode ser restaurada por meio de tratamento com DTT. Este último tratamento á processado sob pH ácido de maneira a deixar intactas as ligaçpes estruturais dissulfuradas na HSA·

Metodologias

Sumário da metodologia São descritos a seguir em detalhe dois métodos para produzir a composição trombolítica da invenção. Em cada um dos métodos, a pro-UK e a albumina são primeiro puri- -7- 35 62*152

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1 ficadas individualmente e em seguida combinadas por meio duma ligação dissulfurada (ver Fig. IA e 1B).

No primeiro método, a albumina é tratada com 5 DTT sob pH 6,0 para restaurar a forma tiol de acordo com o método tornado conhecido em Peters,; T. Advances In Protein Chemistry (Progressos na química das Proteínas), 161-245 (1985)· 0 DTT é em seguida removido por meio de diálise antes da união do pro-UK e da albumina na presença de PDI. 10

No segundo método, pro-UK e mercaptalbumina purificadas são combinadas durante a incubação sob pH 8,0 (3720). 15

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Materiais e métodos

Purificação da Pro-UK

No primeiro método a seguir descrito, a pro--UK, purificada a partir do meio de cultura duma linhagem de células de rim humano, foi obtida por Collaborative Research Inc. (Bedford, MA). Para evitar traços de contaminantes de UK, a pro-UK foi incubada com 20//M de dansil-Glu-Gly-Arg clorometil acetona (GGAck) durante 30 min. a 37°C em 0,1M HEPES, 0,2 mg/ml BSA, 0,001% Tween, pH 7,4, como préviamente descrito em Pannell e outros, Blood, 62,: 22-26 (1987). No segundo método também descrito a seguir, preparação de pro-UK foram passadas através duma coluna Sephadex G-75 (1x45 cm), equilibrada e eluted com lOmM de acetato de sodio, 0,1 NaCl, e 0,0015¾ Tween, pH 0,8, em ordem a remover os dímeros da pro · -UK. A pro-UK foi em seguida tratada como acima descrito para evitar traços de contaminantes de UK.

Purificação da Albumina A purificação de albumina do soro humano de plasma de banco foi levada a cabo em conformidade com proce-Ί dimentos conhecidos. Uma coluna de Cibacron Blue-Sepharose -8- 35 1 5 10 15

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n (CBS) foi equilibrada com 0,63% de citrato trisódico e 0,9% de NaCl, e 10 ml de plasma de banco foi aplicada à coluna. Quando a absorvência a 280nm era menor do que 0,02, a HSA fo . .eluída com Q,2M de tiocianato de sódio, dialisada contra á-gua destilada, e secada por congelamento.

Preparação de plasma sem plasmenogénio Plasma livre de plasmenogénio foi preparado por separação em fornada (de uma só vez), a qual foi levada a cabo excitando 1 ml de Lys-agarose préviamente equilibrada em 0,005 M KEPES e 0,15 M NaCl (pH 7,4) com 5 ml de plasma durante 2 b a 420. Depois da centrifugação, a parte sobrena-dante foi recolhida e analisada do seu conteúdo de plasmenogénio usando uma técnica Standard de dissolução do coágulo. Zimografia e Método das manchas (Blotting) A electroforese de gel de dodecil sulfato--poliacrilamida de sódio (SDS PAGE) foi executada da forma descrita por Laemmli usando um gel de poliacrilamida a 7,5%· As amostras foram preparadas sem redução e aquecidas a 37SC durante 37 min. numa amostra de amortecedor (0,06 M tris-HOl, pH 6,8, 2% SDS) antes da electroforese excepto quando especificado outra coisa. A zimografia foi levada a cabo lavando os gels com 2,5% de Triton x 100 e subsequentemente cobrindo os gels em placas de agar fibrina plasmenogénio como descrito por Wun e outros. Método das manchas ocidental (Western Blotting) foi levado a cabo baseado em procedimentos descritos por Towbin e Pluskal e outros, com algumas modificações Standard. 0 gel de poliacrilamida e quatro papéis de filtro foram equilibrados em amortecedor de mancha (39 mM de glici-na, 48 mM de tris, 20% de metanol, 0,0375% de SDS). A membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) foi pré-molhada em metanol durante alguns segundos e em seguida equilibrada em agua destilada durante 10 minutos. A assemblagem das manchas foi preparada segundo uma configuração de sandwich e a trens·· -9- 35

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1 ferência electroforética levada a cabo com o aparelho de mancha semi-seca 1KB Multipore durante 1 h usando uma densidade de corrente de 0,8 mA/cm . Depois da transferencia, a membrana de PVDF foi lavada em primeiro lugar durante 10 min. com TTBS (lOOmM de tris, 0,15 M NaOl, 0,1% de Tween-80, pH 7,5) e em seguida durante 1 h com TTBS com 3% de BSA. 10

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Na obtenção de dados usando o primeiro método das manchas de imunidade foi executado depois duma incubação principal com anticorpos de coelho anti-UK (10//g/ml) ou com Ab monoclonal Junto a HSA (diluição de 1:500) em TTBS 0,25% BSA (3720), e uma incubação secundária, com uma diluição a 1:1000 em TTBS 0,25% BSA de fosfatase alcalina IgG conjugada (Sigma) de cabra anti-coelho ou coelho anti-rato durante 1 h (372C). Na obtenção de dados usando 0 segundo método, foi empregada uma solução de 13//g/ml dec<(UK) em TTBS (com 0,25% de BSA) na incubação principal (2 h a 3720) e fosfatase alcalina conjugada diluída a 1:500 em TTBS 0,25% BSA na incubação secundária (2 h a 372C). A reacção de cor empregou uma solução de sal 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato-toluidínico (0,15 mg/ml) e cloreto p-nitro azul tetrazálio (0,3 mg/ml) em amortecedor de carbonato (0,1 M de carbonato de sódio, 1 mH de MgCl2, pH 9,8). A membrana de PVDF foi lavada entre cada incubação tres vezes durante 10 minutos com TTBS. Uma subsequente lava gem de 15 min. em amortecedor de carbonato foi levada a cabo antes da reacção de cor. 30 Testes de Enzima A actividade amidolítica de pro-UK/UK foi me dida usando métodos Standard com substracto de Kabi S2444 a 372C. 0 reagente amortecedor foi 0,1M tris-HGl, 0,1 M NaCl, 0,1 mg/ml BSA, lQQ/o/ml aprotinina, pH 8,8; e 0 substracto 35 foi 0,75 mM. A reacção foi parada com salina/5% ácido acéti- -10- 10 15

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eo (1:1) e a absorvência lida a 405 nm. A aotividade do acti vador plasmenogénio foi medida ou com as placas Standard de agar fibrina ou com Glu-plasmenogénio e substrato Kabi S2251 Formação e purificação do complexo ργο-UK:Albumina Método 1 A forma tiol da HSA ou BSA foi regenerada pa ra se aproximar do teórico 1 SH por molécula (mercaptalbumi-na) por meio de tratamento com 10 mM de ditiotreitol (DTT) sob pH 6,0 (50 mM de MES, 0,15 M de NaCl) de acordo com o mé todo descrito por Peters, T. Adv. Prot. Chem., 37:161-245 (19Ô5)· As ligações estruturais dissulfuradas são preservadas sob pH 5-7* 0 DTT foi eliminado por meio de diélise. 0 complexo pro-UK:albumina foi preparado por incubação de pro--UK (5//g/ml) na presença de PDI (920//g/ml) ou com BSA a 3720 durante pelo menos 4 b em 0,1 M de amortecedor HEPES (pH 8,0). Subsequentemente, 200//1 da mistura foi aplicada a uma coluna Sephadex G-75 (1x45 cm), equilibrada e eluted com 0,1 M HEPES, pH 7,5, 0,15 M NaOl, 0,001$ Tween 80, 20 KlU/ml aprotinina. Fracções de 0,5 ml foram coibidas e analisadas no seu conteúdo de proteína (absorvência a 280) e aotividade fibrinolítica. 0 complexo, sob condições não redutoras, migra para um peso molecular aparente de 2 100 KDa, comparado com indicadores Standard. Contudo, sob as condições usuais, o complexo migra para trás dos dímeros da pro-UK. 0 verdade! ro peso molecular do complexo pro-UK: HSA crê-se que seja 2 12o KDa. Foram reunidas três fracções correspondendo a “ 120 kDa. Deve notar-se que poderia ter sido utilizada na fase de incubação PDI imobilizada em vez de PDI em solução. Método 2 -11- 1 62.152

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0 complexo pro-UK :HSA foi preparado incubando 5/^fi/ml de pro-UK com 40 mg/ml de HSA a 3720 durante 4 h em amortecedor 0,1 M HEPES (pH 7,4) e aplicando em seguida 200jjl da mistura a uma coluna Sephadex G-75 equilibrada e eluída com 0,1 M HEPES, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,01# Tween 80, 20 KlU/ml aprotinina. Foram colhidas Xracções de 0,5 ml e a-nalisadas no seu conteúdo de proteína (testes de proteína Standard) e actividade fibrinolítica (placas de fibrina) como é mostrado na Fig. 2.(Foram juntas as fracções 30-31-32). 0 complexo pro-UKϊ HSA foi reconhecido por meio dum anticorpo de UK policlonal insolubilizadoí* como mos trado pelo experimento ilustrado na Fig. 3* Quando o complexo pro-UK:HSA purificado foi incubado durante lha 37SC com um anticorpo anti-HSA, a banda de dissolução de 120 kDa vista na zimografia foi substituída por uma banda de mais alto peso molecular, que se pensa representar o complexo com os anticorpos de HSA a ele ligados (Fig. 4)· De maneira semelhante o complexo purificado ligado a uma colunai(HSA)-Se-pharose. Estas verificações corroboram a composição do complexo.

Condições preferidas para a formação do complexo pro-UK:albumina A capacidade para a HSA ou BSA formar um complexo com pro-UK decresce quando a HSA ou BSA ficam armazenadas durante longos períodos de tempo, devido à oxidação da cisteína livre. Testes de HSA comercial, que não era fresca, por meio da titulação, com 5>5-dithiobis (2-nitrobenzoato) (DTNB), da cisteína livre disponível (sob condições naturais) revelaram 1 cisteína livre por cerca de 10 moléculas de HSA comercial. Em contraste, HSA purificada de fresco como descrito acima no método 2, continha 1 cisteína livre por cerca de 2 moléculas de HSA. Portanto é recomendado o tratamento da HSA ou BSA com DTT (pH 6,0) antes da incubação para a for- -12- 35 10 15

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mação do complexo. Um pH de cerca de 8,0 é preferido para a for mação do complexo, como é mostrado na Fig. 5. A formação do complexo pro-UK:HSA verificou-se com pH 7,5 (faixa 3), mas não com pH 5 (faixa 2) ou pH p (faixa 4)· A adição de C.á++ (5 mM) (Fig. 5» faixa 7) ou de Zn++ (50 M) (faixa 6) e de 0a++ +

Zn++ (faixa 8) não teve efeito, mas CuTT (5-10 M) inibiu a formação do complexo. Pados Experimentais Formação expontânea no plasma, do complexo pro-UK{Albumina Foi verificado que o complexo pro-UK':HSA se forma expontâneamente no plasma normal e mostrado que o HSA do plasma normal purificado está associado com a pro-UK. Por|-tanto á de crer que o complexo pro-UK;HSA exista na natureza. Nestas experiências, a pro-UK foi incubada com plasma livre de plasmenogénio, e o peso molecular da actividade do a-ctivador plasmenogénio determinada por zimografia. Pro-UK foi pintada a plasma (500 ng/ml) e in cubada a 372C durante uma a seis horas. Em dada altura uma parte da actividade enzimática migrou para um peso molecular aparente de cerca de 100 kPa (peso molecular verdadeiro de cerca de 120 kDa), como é mostrado no zimograma da Fig. 6. Este zimograma mostra pro-UK (faixas 2-6) e UK (8-9) em amor tecedor e incubadas em plasma durante 0 (faixas 3,8), 1(4), 2(5), ou 6 horas (6,9), A geração no plasma desta nova banda de alto peso molecular (HMW) foi um fenómeno lento e dependente do tempo. Cerca de 10$ da actividade enzimática foi en contrada a 2 120 k33a (tomado como verdadeiro) depois de 6 ho ras de incubação no plasma, embora a quantificação por meio de zimografia seja no melhor dos casos uma estimativa grosseira. A formação de dímeros de pro-UK não se verificou como -13- 35

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1 e demonstrado pela ausência duma banda de dissolução de HMW quando a pro-UK foi incubada em amortecedor. Além disso, quando se formaram dímeros de pro-UK, eles migraram para o cimo do complexo (ver Figs. 7, 8b, 9, 10). As descobertas indicam que a pro-UK se liga a uma proteína do plasma de ~ 65k dalton para formar um composto de 2 120 k dalton.

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Um complexo de MW similar feito de UK de duas cadeias e dum inibidor de UK, PAI-3 tinha sido anterior 10 mente observado na urina e no plasma. Contudo, este complexo pode ser excluído como explicação para as descobertas acima, pelas seguintes razões: (1) a pro-UK não forma um complexo com PAI-3» e (2) no plasma a pro-UK é estável e não é acti-vada para a formação de UK de duas cadeias nas concentrações 15 usadas nas experiências. Finalmente, a formação do complexo não foi impedida pela adição de um inibidor a UK (GluGlyArg clorometil cetona), um inibidor ao plasmenogénio (aprotini-na 20 Kiu/ml) ou tornando o plasma livre de plasmenogénio· Alem disso, a activação da pro-UK durante a incubação e for-20 mação dum complexo UK:PAI 1 (activador plasmenogénio inibido -1) não condiz com as descobertas visto que o último migra para 2 95KD e simultaneamente é acompanhado por outros complexos inibidores para 2 125 KD e 2 155 (Kruithof, E.K.O. e outros; Blood, 6^ J 907-913 (1984)), assim como por um quarto complexo para o cimo do gel o qual reage coinofg^roacro-globulina-Ab. Além do mais, para reduzir a possibilidade de activação da pro-UK durante a incubação, foram executadas exj-periências adicionais nas quais aprotinina (20 KlU/ml) foi juntada ao plasma desprovido de plasmenogénio. Estes proce-30 dimentos não inibiram a formação do complexo de ~ 120 KD (Fig. 11, faixas 7-10).

Contudo não foi gerado nenhum complexo activador de alto peso molecular quando a pro-UK foi incubada com plasma desprovido de HSA (plasma CBS), como é mostrado -14- 35 62.152

Gurewich—Albumina CIP Í2JBU990.

5 10 15 na

Pig. 3. Estas verificações demonstram que o complexo obsei-n plasma é composto por pro-UK unida em complexo com vado no HSA.

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20

Formação dum complexo de pro-UK com CBS-HSA Quando pro-UK (5/Vg/ml) foi incubada (3790) durante pelo menos 4 h com CBS-HSA purificada de fresco (40 mg/ml em 0,1 M HEPES, pH 7*4)» e a mistura examinada por meio de SDS-PAGE e de zimografia, formou-se com consistência uma banda de ~ 120 kD (Fig. 12, faixa 2). Em contraste,quando a pro-UK foi incubada em plasma desprovido de CBS, não se formou nenhum complexo (Fig. 12, faixa 3)* 0 reenchimento do plasma desprovido de CBS com CBS-HSA restaura a formação do complexo (Fig. 2, faixa 4)· A passagem do plasma contendo 0 complexo (Fig. 2, faixa 4) sobre uma coluna Sepharose UK-Ab removeu 0 complexo (Fig· 2, faixas 6-9)· A formação do complexo foi também observada quando a pro-UK foi incubada com preparações comerciais de HSA e BSA, desde que elas tenham sido pré-tratadas com DTT en ordem a restaurar a forma tiol.

Sensibilidade do complexo à dissolução em m 25 30 0 complexo que se formou depois de incubaçãc da pro-UK com CBS-HSA foi isolado por filtração gel numa Se-phadex G-75 e em seguida analisadas por meio de SDS-PAGE. Quando a amostra foi fervida, ocorreu a completa dissolução do complexo, enquanto que a 372C foi vista sómente uma dissociação parcial (<50%) nos zimogramas do gel (não são mostra»υ dos os dados).

Formação do complexo por diferentes formas de UK com HSA e os efeitos da DFP e da clo-ramina T na formação do complexo -15- 35 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 βχ. - 89/07 20 25 30

62.152 Guerwich—Albumina CIP A possibilidade do complexo ter sido de facto composto por UK e um inibidor purificado ;juntamente com HSA na coluna CBS, foi investigada, visto ter-se verificado que a HMW-UK também formava um complexo quando incubada com HSA (Fig. 13, faixa 2) o que não se viu quando a HMW-UK foi incubada em amortecedor (faixa 1). 0 complexo migrou até ~ 120 kD correspondendo ao complexo formado quando a pro-UK foi incubada em plasma (Fig* 13, faixa 5)· Contudo, a incubação de LMW-UK (Aboquinase) com HSA falhou na indução de um complexo (Fig. 13, faixas 3 e 4). Além disso, não se formou nenhum complexo quando um mutante de substituição da pro-UK (sem os resíduos 11-135) foi incubado com HSA (Fig. 13, faixs 7)· Estas observações levaram a conclusão de que o complexo não estava com um inibidor da UK e que a formação do complexc implicava a cadeia A da UK e não a metade protease da cadeia B.

Para além disso excluir um complexo AKíini-bidor, a CBS-HSA foi préviamente tratada com DFP em ordem a evitar quaisquer contaminantes de urina protease. Este tratamento falhou na inibição da formação do complexo com pro-UK (Fig. 7, faixa 4, comparada com as faixas 2 e 3). Segundo, para excluir um contaminante de serpina, a preparação de HSA foi tratada com cloramina T, que está provado inactivar as serpinas (Stief e outros, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369 J1337 -1348 (1988))· Este tratamento também falhou na inibição da formação do complexo, levando à conclusão de que o complexo observado pro-UK ou HMW UK não era formado com um inibidor (Fig.7, faixa 6 comparada com o controle de HSA não tratada, faixa 5)·

Evidência de que o complexo é de ligação dissulfurada 0 método das manchas de imunidade ocidental (Western immunoblotting) usando uma UK-Ab policlonal mostrou 16- 35 1 62.152

Gurewich—Albumina CIP

/ uma banda de ~ 120 kD quando a pro-UK foi incubada com CBS--HSA (Fig. 14, faixa 3) , mas não quando a pro-UK foi incubada em amortecedor (Fig* 14» faixa 1) ou com BSA não préviamente tratada com DTT (Fig. 5» faixa 2), 0 controle de CBS--HSA não deu uma reacção visível com o anticorpo (Fig* 14» faixas 4 e 5)· 0 complexo de ~ 120 kD dissociou-se sob condições redutoras, sugerindo que era de ligação dissulfurada (Fig. 14, faixa 7)· 10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20

Evidencia adicional indica que o complexo pro-UKίalbumina é de ligação dissulfurada. Primeiro, a formação do complexo foi inibida quando um reagente sulfidrilo como glutationa oxidada ou DTNB foi adicionado à mistura reagente do método 2, como segue. Glutationa oxidada foi adicionada ao plasma e permitida a reacção durante 2 h a 37-0· Os resultados são mostrados no zimograma da Fig. 15· As faixas 1-3 do zimograma mostram a pro-UK eucubada em amortecedor.

Um decrescimento na formação do complexo pro-UK:HSA ocorreu com a glutationa, o qual era dependente da sua concentração. As faixas 2 e 5 são com 0,5 mM de glutationa adicionada e as faixas 3 e 6 com 5,0 mM de glutationa adicionada. A glutationa não inibiu a actividade fibri-nolítica da pro-UK, como é mostrado nas três primeiras fai-25 xas. Esta resposta à glutationa indica que a cisteína livre da albumina está envolvida no complexo, e que portanto a pro--UK e a HSA estão ligadas por uma ponte dissulfurada. Be modo semelhante, experiências com DTNB, que reage com a cisteína livre, mostraram que o DTNB inibiu a formação do complexo. A 30 Fig. 16 é um zimograma de pro-UK incubada em amortece dor (faixas 1-5) e com HSA (faixas 6-10) com 0,0 M (falmas 1,6), lmM (faixas 2,7), 3 mM (faixas 3,8), 6mM (faixas 4,9), e 10 mM do DTNB (faixas 5,10). 35

Segundo, preparações comerciais de HSA ou -17- 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

62.152 Gurewich—Albumina CIP MR.t99Qy nXJj/ de BSA formam poucos ou nenhuns complexos com pro-UK. Isto é ilustrado na (Figura 7» faixa 8) que mostra sómente um dímerc de pro-UK, e na (Figura 14, faixa 2). Além disso, a formação de complexo com CBS-HSA preparadas de fresco, decresce com o tempo de armazenamento. Contudo, a capacidade para/formar con plexos com pro-UK por todas estas preparaçpes pode ser restaurada quando elas foram tratadas com DTT. Este efeito numa preparação comercial de BSA está ilustrado na (Figura 7, faixa 9)· 0 efeito do tratamento com DTT sob pH 5-7 é de restaurar a forma tiol sem dissociar as ligações estruturais dissul furadas, como descrito por Peters T.Adv.Prot.Chem. ^2 1 161--245(1985)). Para isso, as descobertas indicam que uma tiol cisteína disponível na HSA ou na BSA é necessária para a formação do complexo com a pro-UK.

Terceiro, a titulação com DTNB revelou que antes do tratamento com DTT, a HSA comercial tinha 0,1 cis-teínas disponíveis comparado com 0,6 depois do tratamento. Un número comparável foi obtido com CBS-HSA preparadas de fresco. Verificou-se, portanto, uma correlação positiva entre os cisteínas disponíveis no preparado de HSA e a formação do complexo com pro-UK.

Quarto, quando PDI, que catalisa a permuta dissulfurada no tiol (Freedman, R.B., Cell, 52 J 1069-1072 (1989)? Gilbert, H.F., Biochem., 28 : 7298-7305 (1989) foi incluída na mistura de incubação a formação do complexo foi acelerada. Sem PDI, 4 h de incubação eram requeridos antes que os complexos fossem observados (Fig. 8A), mas na presença de PDI (920/Jg/ml) a formação de complexo ocorria após 1 h de encubação (Fig. 8B) · 0 efeito PDI era dependente da sua concentração como ilustrado na Fig. 9 na qual pro-UK (lO//g/ ml) foi incubada durante 6 h com uma preparação de mercaptal-bumina (40 mg/ml) com 0, 23, 230, 460, 680 ou 920 g/ml de PDI. Na presença de PDI, a formação de dímeros de pro-UK era -18- 35 62.152

Gurewich—Albumina CIP

r 1 também muito aumentada (Figs. 8A, 8B e 9) sugerindo que estes dímeros são de ligação dissulfurada. A grande quantidade de PDI requerido é consistente com a baixa eficiência desta enzima. 10 A formação de complexo foi inibida quando a amostra foi fervida durante 2 min. em SDS (Fig. 14, faixa 3)< Esta constatação é também consistente com um complexo de ligação dissulfurada o qual pode ser desestabilizado pela fervura. Além disso, na presença de Cu012 (l mM), que inibe a permuta dissulfurada, o complexo resistiu à fervura. A disso-ciação térmica das ligações dissulfuradas já tinha sido an-teriormerrte referida por Volkin e Klibanov para certos conjugados de ligação dissulfunada (Volkin e outros, J.Biol.Chem. 262 j 2945-2950 (1987)).

Mod. 71-10000 ex. - 89/07

Uma ligação dissulfurada entre uma cistina da pro-UK e uma cisteína singular de albumina criará uma cis-teína livre na ligação pro-UK-albumina. Esta cristeína livre 20 poderá reagir com uma cistina de outro molécula de pro-UK, ou com uma cisteína numa outra molécula de albumina. Sob certas circunstâncias, em vez de um complexo formado por uma molécula de pro-UK e uma molécula de albumina, poder-se-há formar um complexo de duas moléculas de pro-UK ligadas a uma molécu-25 la de albumina, ou de duas moléculas de albumina ligados a uma molécula de pro-UK. Estes complexos de três partes foram identificados e estão dentro do âmbito da presente invenção.

Efeito do pH e da concentração da HSA 30 Quando a incubação foi processada sob um pH entre 6 e 8,5, verificou-se que o pH óptimo para a formação do complexo era â volta de 8-8,5 (Fig. 17, faixas 1-6). A maior parte das experiências foram, portanto, levadas a cabo sob pH 8,0. Experiências dentro duma larga gama de razões en-35 tre as preparações de HSA e a pro-UK, revelaram que o factor -19-

62,152 Gurewich—Albumina CIP

/ 15

Mod. 71 -10000 ex. · 89/07 25 limitativo predominante da formação do complexo era a concentração de HSA, Isto é ilustrado na Fig. 17 (faixas 8-10) na qual 80, 20 e 10 mg/ml de HSA comercial tratada com DTT foran incubadas com pro-UK (5//g/ml). A elevação da concentração ds pro-UK não aumentou a formação do complexo* Além disso, a foi mação de complexo mesmo com este excesso de HSA tendeia para um patamar ao fim de cerca de 24 h. 0 efeito de ulterior purificação da HSA As descobertas anteriores sugeriram a possibilidade de que o complexo de pro-UK estivesse com um conta-minante menor, presente na preparação da HSA assim como na de BSA. Tentativas para remover um tal contaminante por meio da cromatografia das preparações da HSA com celulose DEAE ou pela passagem sobre Sepharose concanavalina-A não alteraram a reactividade das preparações com a pro-UK. Portanto, se o cor taminante responsável foi uma proteína menor, é pouco prová vel que tenha sido uma não-glicoproteina. Com poucas exce-pções (HSA, transtiretina, proteina de ligação retinol), as proteinas do plasma são todos glicoproteínas (Peters, T.,Adv., Prot. Chem., ££ ; 161-245 (1985))·

Reconhecimento do complexo por anticorpos 0 complexo de pro-UK que foi formado com USA tratada com DTT altamente purificado de acordo com o método 1 foi electro-eluído de secções de gel depois da SDS-PAGE, e en seguida outra vez submetido à SDS-PAGE. Manchas de imunidade com UK-Ab revelaram o complexo em ~ 120KD. Contudo, embora se tenha verificado que o complexo foi reconhecido pela HSA-Ab policlonal em numerosas experiências, ele não foi reconhecidc pela HSA-Ab monoclonal nesta experiência (dados não mostrados). A explicação para esta discrepância pode estar relacionada com o sítio essencial da HSA, reconhecido pelo anticorpo mo-clonal, sendo mascarado pelo complexo. Apesar de tudo, esta constatação negativa deixou aberta a possibilidade do comple- 20- 35

62.152 Gurewich—Albumina CIP

1 xo de pro-UK ter um contaminante menor de proteína de plasma da HSA ou BSA. Portanto, foram conduzidos estudos com rec-HS/ de E.Coli, livre de todos os contaminantes de proteína do plasma. 5 10 15

Mod. 71-100O0 ex. - 89/07

Formação do complexo de pro-UK com rec-HSA Rec-HSA e HSA natural (40 mg/ml), antes (-) e depois (+) de tratamento com DTT, foi cada uma incubada (6 h) com pro-UK (5/Jg/ml)· A análise zimográfica das misturas da incubação mostrou um complexo de 2 120 kD(C), tanto com a rec-HSA como com a HSA natural, cuja formação foi significativamente aumentada com o tratamento prévio com DTT(+] das preparações de HSA. 0 tratamento com DTT também promoveu a formação de complexos de mais alto peso molecular (θ') pos·· sívelmente envolvendo a cisteína singular da pro-UK unida em complexo com a HSA· Foram observados dímeros (d) da pro-UK migrando para cima do complexo de ~ 120 kD (Fig· 10). 20 25 30

Seoaracão do complexo de pro-UK do plasma por meio de croma-tografia de afinidade OBS Foi determinado que a pro-UK não ligada em complexo não podia ser purificada juntamente com HSA por meio de cromatografia de afinidade CBS depois de extensivo lavagem com 0,5 M de NaCl. Isto foi demonstrado por experiências nas quais pro-UK (5/^fi/ml) foi adicionada ao plasma imediata·· mente antes da cromatografia de afinidade CBS. Sob estas condições, a eluição HSA não teve actividade fibrinolítica de-tectável num zimograma (Fig. 16, faixa 2). A pro-UK livre é gradualmente lavada foram com 0,5 M NaCl, Por contraste,quando 0 plasma foi pré-incubado (37S0) com pro-UK (5//g/ml) durante 20 H, em ordem a permitir a formação do complexo, um zimograma da HSA purificada com OBS teve actividade fibrinolítica associada com ele. Isto foi mostrado por zimografia da HSA que mostrou bandas migrando para ~ 120 kD e para ~ 55 kD (Fig. 18, faixa 1). Visto ter sido mostrado a pro-UK livre -21- 35

62.152 Gurewich—Albumina CIP

1 não poder ser co-purifiçada, a banda de ~ 55 kD presumivelmente representou alguma pro-UK que se dissociou do complexo com HSA durante as preparações da amostra em SDS. 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25

Estudos da ργο-UK intrínseca ao plasma Para determinar se a pro-UK intrínseca ao plasma poderia estar num complexo com HSA* aproximadamente 600 mg de HSA foi purificada de plasma fresco por cromatogra·· fia CBS com extensiva lavagem da coluna com 0,5 M NaCl. Esta preparação foi tratada com o anticorpo absorvente anti-UK Stíi-phylococcal proteína A anteriormente mostrado (Fig. 12, faixas 6-9) reconhecer a pro-UK no complexo. 0 imunoprecipitada foi fervido em amortecedor de amostra SDS em ordem a dissociar o complexo anticorpo antigene. Estas condições também a causam a dissociação do complexo pro-UK:HSA. Subsequente zimo-grafia revelou uma banda de dissolução de 2 55 KD indicando a presença de pro-UK no preparado de HSA (Fig. 18, faixa 3)· Visto ter sido mostrado que a pro-UK livre não pode seo co--purifiçada por meio da cromatografia de afinidade CBS, as descobertas sugerem que a pro-UK isolada do plasma na coluna CBS esteve num complexo com HSA. Portanto, as descobertas no plasma normal condizem com aquelas observadas quando plasma enriquecido com pro-UK foi incubado durante - 6 h. A possibi·· li da de de que a UK isolada por cromatograf ia de afinidade CBS era um complexo UK; inibidor, em vez de um complexo pro--UK: HSA, foi considerada improvável visto que a UK forma conjugados inibidores que são estáveis em SDS a 1002C (Krui-thof, Blood, 6^ i 907-913 (198A)j Cieplak e outros, Thrombos Haemostas., & 1 36-44 (1985); Stump e outros, J.Biol.Chem., 261; 12834-12841 (1986), e que por conseguinte migram em SDS·· -PAGE para -95KD·

Em ordem a investigar a proporção de pro-UK intrínseca ao plasma que está presente como complexo, 20 ml de plasma fresco (contendo 20 KlU/ml de aprotinina) foram su·· 22- 35 62.152

Gurewich—Albumina CIP 1 bmetidos a cromatografia numa coluna Sephadex G-75. Isto separou as proteínas do plasma em dois picos principais (Fig· 19A). As posições da pro-UK livre e do complexo de pro-UK: HSA foram determinadas calibrando a coluna com amostras de 5 plasma enriquecidas com pro-UK imediatamente antes da filtração gel e com amostras de plasma pré-incubadas (37PC durante 20 h) com pro-UK {5/Jg/til) de maneira a formar o complexo. A actividade fibrinolítica nas fracções recolhidas foi testada em placas de fibrina. A pro-UK livre foi encontrada nas frac-10 ções 112-119 correspondentes ao conjunto D, e o complexo pro* -UKíHSA foi encontrado nas fracções 95-100 correspondentes ao conjunto B (Flg. 19A). 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25

Depois disto, o plasma normal foi analisado nesta coluna por filtração gel. A actividade fibrinolítica intrínseca ao plasma foi testado por imunoprecipitação e zi-mografia. As fracções foram reunidas em 4 lotes como mostrado na Fig. 19A. Como mostrado na Fig. 19B, a actividade fibrinolítica foi detectável predominantemente no conjunto B que corresponde às fracções de alto peso molecular nas quais se verificòu'0 complexo de pro-UK ter sido eluído (Fig. 19A) , Uma pequena actividade de UK foi encontrada a um ainda mais alto MW (conjunto A) (Fig. 19B). Complexos pro-UK:HSA de mais alto peso molecular formaram-se também em algumas das experiências nas quais a pro-UK foi incubada com HSA purificada (ver Fig. 10), presumivelmente representando complexos com mais de uma molécula de HSA ou pro-UK. Não foi encontrada actividade de UK no conjunto de fracções D correspondendo ao MW da pro-UK livre. Portanto, toda a detectável actividade da UK no plasma foi verificado estar presente na forma de um complexo. Visto que o complexo se dissociou em SDS durante a preparação da amostra como é mostrado pela banda de ~ 55 kD no zimograma (Fig. 19B), o complexo observado é inconsistente "icomyum complexo UKíinibidor. As descobertas por conseguinte sugerem que a maior parte da pro-UK intrínseca ao -?3- 35 mr mr 12. m. 1990

10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 62.152

Gurewich—Albumina CIP 1 plasma normal está num complexo correspondente ao que se for ma com HSA· A longa semi-vida do complexo na circulação

Postula-se que o sítio da molécula de pro--UK que é identificado pelo receptor de UK no fígado é mascarado no complexo da invenção, tendo como resultado que a pro-UK ligada é provida com uma longa (várias horas a vários dias) semi-vida, em contraste com os 5-8 minutos de semi-vi-da da pro-UK livre. Visto que as propriedades fibrinolíticas da pro-UK não são comprometidos, espera-se que o complexo pro-UK:albumina fique bem colocado na terapêutica trombolíti·· ca· A invenção poderá reduzir substancialmente a dosagem de pro-UK requerida, e facilitar a sua administração pela eliminação da necessidade da sua constante infusão.

Utilização 0 complexo pro-UK:albumina da invenção pode ser usado terapêuticamente para as mesmas indicações que outros activadores plasmenogénios por exemplo, t-PA, UK, e pro-UK. 0 propósito é dissolver coágulos de sangue intravasculares (trombos). Indicações clínicas correntes incluem o enfarte do miocárdio, a trombose venosa profunda, e a embolia pulmonar. 0 complexo da invenção á misturado com uma substância transportadora biologicamente adequada, por exemplo, salina e administrado intravenosamente por injecção de dose u-nitária. 0 conplexo também pode ser vantajosamente misturado com t-PA, com o qual a pro-UK é sinérgica· Esta mistura pode também ser dada como uma simples injecção de dose unitária o que simplifica o tratamento e permite que o mesmo seja feito no domicílio. 0 t-PA iniciará a dissolução e será rápidamento eliminado enquanto que a pro-UK da acção prolongada completa·* rá o processo de dissolução* -24- 35 62.152

Gurewich.—Albumina CIP 1 Aâicionalmente, o complexo da invenção pode ser administrado com o propósito de elevar a actividade fi-brinolítica intrínseca do sangue e desta maneira ser usado na prevenção de longa duração de doença cardiovascular que e 5 sabido estar associada a uma actividade fibrinolética diminuída* Visto que há muito tempo se acredita ser a trombose parte da patogénese da arteriosclerose, injecções regulares do complexo da invenção a intervalos semanais ou mensais podem ser administradas para também prevenir a arteriosclero-10 se.

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

Finalmente, a forma enzimáticamente activa do complexo, entre a HMW-UK e a albumina, pode ter também certas aplicações clínicas. Visto que a HMW-UK é a forma en-15 zimética da pro-UK, ela reage com vários inibidores do plasma. Como resultado, este complexo não terá uma longa semi--vida até estes inibidores terem sido consumidos. Depois dis so, o complexo terá a vantagem sobre a HMVV ou LMW-UK duma semi-vida mais longa o que reduzirá o custo e facilita a ad-20 ministração.

Exemplos de regimes terapêuticos

Exemplo 1 25

Para um tratamento de emergência de trombos por injecção de dose unitária, cerca de 5-20 mg de complexo liofilizado de pro-UK: albumina é misturado com salina e colocado na câmara de uma seringa, a qual é usada para infecta:' o bolus no paciente intravenosa mente. 30 Exemplo 2

Para a dissolução rápida dos trombos das coronárias, cerca de 5-20 mg do complexo liofilizado pro-UK: albumina dissolvido em salina é administrado por via intravenosa juntamente com 2 mg de UK. A ultima serve para acelerar 35 o nício da dissolução. A longa semi-vida do complexo servirá -25- 10

15

Mod. 71 10000 ex. 89/07 20 62.152

Gurewich.—Albumina CIP para prevenir a repetição da trombose assim como para comple tar a dissolução dos trombos existentes·

Exemplo 3

Para o tratamento de trombos em veias profundas e êmbolos nos pulmões, cerca de 5-20 mg de complexo liofilizado de pro-UK:albumina dissolvido em salina á administrado por via intravenosa* Se necessário as injecções podem ser repetidas. A estas doses nenhuma activação plasmeno-génia não específica deverá ocorrer*

Exemplo L

Para o tratamento de trombos por injecção bolus das combinações sinárgicas de t-PA e complexo liofili zado pro-UK:albumina, cerca de 5-20 mg de t-PA á misturado com 5-20 mg de complexo pro-UK:albumina, eeadoinistrado como uma simples injecção bolus· 0 t-PA será eliminado rápidamen-te mas o complexo permanecerá na circulação para completar a dissolução dos trombos é evitar a repetição da trombose sem congro meter a especificidade. Exemplo 5 25

Alternativa mente, para a rápida dissolução dos trombos das coronárias, cerca de 5“20 mg do complexo lio filizado pro-UK:albumina á injectado juntamente com uma infusão de 30 mg/hr de t-PA liofilizado dissolvido em salina.

Exemplo 6 30 A excepcionalmente longa semi-vida do complexo pro-UK;albumina pode torná-lo útil para a prevenção de trombose. Esta aplicação utilizará pequenas doses, isto á, cerca de 1-5 mg por semana

Exemplo 7 35 0 activo complexo HMW-UK:albumina pode ser -26-

62·152 Gurewich—Albumina CIP

i usado como uma substituição mais económica para a HMW ou IMW-IIK. 5

Exemplo 8 Para o tratamento de trombos em veias profundas, cerca de 5-20 mg do complexo liofilifcââo pro-UK :HSA ó dissolvido em salina e administrado sozinho ou em combina· ção com t-PA·

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 10 Exemplo 9 Para o tratamento de angina instável ou a-meaça de enfarte do miocárdio, uma dose do complexo pro-UK: HSA (5-10mg) é injectado por via intravenosa. Para esta indicação, um activador plasmenogénio é parti ciai ar mente útil 15 visto esta condição clínica tender a prolongar-se por vários dias. 20 25 30

Exemplo 10 Para a prevenção de repetição de trombose, no seguimento de angioplastia transluminal percutânea ou no seguimento de terapia trombolítica aguda com outro activador plasmenogénio, uma relativamente pequena dose do complexo pro-UKJHSA da invenção será suficiente, isto é, menos do que 10 mg· Exemplo 11 Para a prevenção de doença cardiovascular a qual está muitas vezes associada com uma actividade fibri-nolítica diminuída, podem ser dadas injecções periódicas do complexo para aumentar a actividade fibrinolítica. Por exemplo, podem ser dadas injecções mensais de cerca de 1-5 mg de pro-UK em complexo com HSA· -27- 35

Claims (2)

1. 62.152 Gurewich—Albumina CIP 1 10
2. 12.ABR1990 n/ /*. õ iSn -REIVINDICAÇOES- 1&·- Método para produzir um complexo acti-vador plasminogéneo purificado, caracterizado por o referido complexo compreender pro-uroquinase pura, covalentemente ligada a albumina do soro humano por meio de uma ligação de dissulfureto entre um átomo de enxofre num radical aminoáci-do da dita pro-uroquinase e um átomo de enxofre num radical aminoácido da dita albumina do soro humano. 2ê·- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no referido complexo activador a referida ligação de dissulfureto estar entre um radical cisteina da dita albumina do soro humano e um radical cistina da dita pro-uroquinase. Mod. 71-10000 βχ. - 89/07 20 25 30 3^·- Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por no referido complexo activador o dito radical cistina da dita pro-uroquinase se encontrar na extremi dade do grupo amino terminal da pro-uroquinase na cadeia A. 4&·- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no referido complexo activador a formação da dita ligação de dissulfureto ter lugar na presença de uma proteina isomerase de dissulfureto. 5&·- Método de acordo com a reivindicação.J., caracterizado por o referido complexo activador ter a mesma estrutura molecular que o complexo da pro-uroquinase e albumina do soro humano que existe no sangue dos seres humanos saudáveis. 6&·- Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por no referido complexo activador a referida ligação de dissulfureto se encontrar entre o mesmo radical -28- 62,152 Gurewich—Albumina CIP

   1 cisteina da albumina do soro humano e o mesmo radical cisti-na da pro-uroquinase, como no complexo de pro-uroquinase e HSA que existe no sangue dos seres humanos saudáveis. 7&·- Método de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por no referido complexo activador a dita pro-uroquinase ser pro-uroquinase produzida recombinada mente * 10 8â.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no referido complexo activador a dita pro-uroquinase e a dita albumina do soro humano serem produzidas recombinadamente. Mod. 71 -10000 ex. · 89/07 15 9&·- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no referido complexo activador a referida pro-uroquinase ser um fragmento fibrinolíticamente acti vo de pro-uroquinase tendo um resíduo cisteina na extremidade do seu grupo amino terminal em cada uma das posições do 20 aminoacido 11, 31» 33» 39» 51» 53 ou 63 da cadeia péptida ds pro-uroquinase. 25 30 35 10&·- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por no referido complexo activador a referida pro-uroquinase ser uma forma fermentativa de uroquinase fibrinolíticamente activa contendo uma cadeia de aminoacido idêntica aos radicais de aminoacido 1 a 45 de uroquinase. llè,- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido complexo activador trombolé-tico compreendera incubação de albumina do soro humano pura de de pro-uroquinase pura sob condições e por um período de tempo suficiente para permitir a formação do dito complexo. 12â·- Método de acordo com a reivindicação -29- 10 15 Mod. 71 10000 ex. - 89/07 20 62.1.52 Gurewich—Albumina CIP 11, caracterizado por compreender, além disso, o prétratamen to da albumina do soro humano com ditiotreitol para restaurar a forma tiol da albumina do soro humano. 13¾ ·- Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado por compreender, além disso, a adição de proteina de dissulfureto isomerase durante a referida incubação. 14§.- Método de acordo com as reivindicaçõe anteriores caracterizado por se obter uma composição terapêutica trombolética compreendendo o complexo activador obti do pelo processo da reivindicação 1, combinado com uma substância portadora farmaceuticamente aceitável, e por a referi da composição sea administrada numa quantidade eficaz a um paciente humano. 15¾ ·- Método de tratamento ou prevenção de doença cardiovascular, tal como a arteriosclerose, num paciente humano, caracterizado por compreender a administração ao dito paciente de uma quantidade da dita composição terapêutica obtida de acordo com a reivindicação 14, suficiente para elevar o nível de actividade fibrinolítica no dito paciente. 25 Lisboa, 1? ABR. 1990 30 Por VASCULAR LABORATORY, INC,

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