PT92379B

PT92379B - METHOD FOR SYNTHESIS OF POLYPEPTIDIC DERIVATIVES

Info

Publication number: PT92379B
Application number: PT9237989A
Authority: PT
Inventors: Daniel J Capon; Steven Shak; Rebecca H R Ward
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1988-11-23
Filing date: 1989-11-22
Publication date: 1995-09-12
Also published as: PT92379A

Abstract

The present invention relates to a method for the synthesis of new CD4 conjugates and of a non-protein polymer such as polyethylene glycol, which exhibit improved physicochemical and therapeutic characteristics, one of the most marked being a longer half-life. The conjugates are useful in the treatment of HIV infections. Said method involves the covalent crosslinking of CD4 and a hydrophilic, non-proteinaceous polymer, in particular polyethylene glycol or methoxypolyethylene glycol.

Description

MEMÓRIA DESCRITIVADESCRIPTIVE MEMORY

Resumoresume

O presente invento diz respeito a um método para a síntese de novos conjugados de CD4 e de um polímero não proteico tal como polieti leno-glicol , os quais revelaram características físico-qulmicas e terapêuticas melhoradas, sendo uma das mais marcantes uma mais extensaThe present invention relates to a method for the synthesis of new conjugates of CD4 and a non-protein polymer such as polyethylene glycol, which revealed improved physico-chemical and therapeutic characteristics, one of the most striking being a more extensive one

GENENTECH INCGENENTECH INC

MÉTODO PARA A SÍNTESE DE DERIVADOS POLIPETIDICOS semi-vida. Os conjugados são úteis no tratamento de infecções por HIV.METHOD FOR THE SYNTHESIS OF POLYPETIDIC DERIVATIVES half-life. Conjugates are useful in the treatment of HIV infections.

referido método consiste em se proceder à ligação cruzada, de um modo covalente, de CD4 um polímero hidrofílico, não proteinãceo, em especial polietil eno-glicol ou metoxipolietileno-glicol.said method consists of cross-linking, in a covalent way, CD4 a hydrophilic, non-proteinaceous polymer, in particular polyethyleno-glycol or methoxypolyethylene-glycol.

Este requerimento diz respeito a derivados polipeptidicos, em particular ao antigeneo de diferen ciação celular CD4 e ao seu uso como agente terapêutico para o tratamento de infecções por HIV.This requirement concerns polypeptide derivatives, in particular the CD4 cell differentiation antigen and its use as a therapeutic agent for the treatment of HIV infections.

A alteração imunologica anormal primária resultante de uma infecção por HIV é a depleção progressiva e o enfraquecimento funcional dos linfócitos T que exprimem a glicoprotéina de superfície celular de CD4.The primary abnormal immunological alteration resulting from an HIV infection is the progressive depletion and functional weakening of the T lymphocytes that express the CD4 cell surface glycoprotein.

( H. Lane et al., Ann. Rev. Immunol . 3:477 /19857). CD4 é uma g1icoprotéina não polimorfica que possui homolofia com a superfámilia de genes das imunoglobulinas (P. Maddon et al., Cell £2:93 /19857). Juntamente com o antigeneo de superfície CD8, o CD4 dilimita dois grupos distintos de células T periféricas maduras (E. Reinherz et al ., Cell 19:821 /19807) que se distinguem pela sua capacidade de interacção com antigenes alvo nominais no contexto dos antigeneos complexos maiores de histocompatibi1 idade (MHC) da classe I e da Classe II, respectivamente (S. Swein, Proc. Natl. Acod. Sei. 78:7101 /19817; E. Englemen et al., J. Immunol. 127:2124 /198117; H. Spitz et al., J. Immunol. 129:1563 /19827; W. Biddison et al., J. Exp. Med. 156:1065 /19827; e D. Wilde et al., J. Immunol. 131:2178 /19837). Na sua maior parte, as células T CD4 apresentam o fenótipo de células T auxi1iador/indutor. (E. Reinhertz, supra), apesar de também terem sido identificadas células T CD4 caracterízados como citotóxicas/supressoras (Y. Thomas et al., J. Exp. Med. 154:459 /1981.7; S. Meuer et al., Proc. Natl. Acod. Sei. USA 79:4395 /19827; e A. Krewsky et al.,(H. Lane et al., Ann. Rev. Immunol. 3: 477/19857). CD4 is a non-polymorphic glycoprotein that is homologous to the immunoglobulin gene superfamily (P. Maddon et al., Cell £ 2: 93/19857). Together with the CD8 surface antigen, CD4 delimits two distinct groups of mature peripheral T cells (E. Reinherz et al., Cell 19: 821/19807) that are distinguished by their ability to interact with nominal target antigens in the context of antigens major class I and class II histocompatibility complexes (MHC), respectively (S. Swein, Proc. Natl. Acod. Sci. 78: 7101/19817; E. Englemen et al., J. Immunol. 127: 2124 / 198117; H. Spitz et al., J. Immunol. 129: 1563/19827; W. Biddison et al., J. Exp. Med. 156: 1065/19827; and D. Wilde et al., J. Immunol 131: 2178/19837). For the most part, CD4 T cells exhibit the helper / inducer T cell phenotype. (E. Reinhertz, supra), although CD4 T cells characterized as cytotoxic / suppressive have also been identified (Y. Thomas et al., J. Exp. Med. 154: 459 / 1981.7; S. Meuer et al., Proc Natl. Acod. Sci. USA 79: 4395/19827; and A. Krewsky et al.,

Proc. Natl. Acod. Sei. USA 79:2365 /19827). A perda da função auxi1iadora/indutora das células T CD4 é provavelmente, a razão fundamental das profundas deficiências na imunidade humoral e celular que levam ao aparecimento de infecções oportunistas e malignizações características do síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA) (H. Lane supra).Proc. Natl. Acod. Know. USA 79: 2365/19827). The loss of CD4 T helper / inducer function is probably the fundamental reason for the profound deficiencies in humoral and cellular immunity that lead to the appearance of opportunistic infections and malignancies characteristic of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) (H. Lane supra).

Estudos da infecção por HIV-I de células T CD4 e CD8 fraccionadas, de dadores normais e de doentes com SIDA, mostraram que a depleção das células T CD4 é resultado da capacidade do HIV-I para infectar selectivamente, replicar e, por último destruir este grupo de linfócitos T (D. Klatzman et al., Science 225:59 /19847)- A possibilidade de CD4 ser, por si próprio, um componente essencial do receptor celular para HIV-I foi indicado, pela primeira vez, pela observação de que anticorpos monoclonais contra CD4 bloqueiam a infecção por HIV-1 e a indução de sincícios (A. Dalgleish et al., Nature /Condon7 312:767 /19847; J. McDougal et al.,Studies of HIV-I infection of fractionated CD4 and CD8 T cells, normal donors and AIDS patients have shown that CD4 T cell depletion is a result of HIV-I's ability to selectively infect, replicate and ultimately destroy this group of T lymphocytes (D. Klatzman et al., Science 225: 59/19847) - The possibility that CD4 itself is an essential component of the cell receptor for HIV-I was indicated, for the first time, by observation that monoclonal antibodies against CD4 block HIV-1 infection and the induction of syncytia (A. Dalgleish et al., Nature / Condon7 312: 767/19847; J. McDougal et al.,

J. Immunol. 135:3151 /19857). Esta hipótese foi confirmada pela demonstração de que um complexo molecular é formado entre CD4 e gp120, a g1icopróteina maior do involucro de HIV-1 (J. McDougal et al., Science 231:382 /19867; e pela descoberta de que o tropismo de HIV-1 pode ser dado por células humanas não permissivas que exprimem estávelmente um cDNA de CD4 (P.J. Immunol. 135: 3151/19857). This hypothesis was confirmed by the demonstration that a molecular complex is formed between CD4 and gp120, the major glycoprotein of the HIV-1 envelope (J. McDougal et al., Science 231: 382/19867; and by the discovery that tropism of HIV-1 can be given by non-permissive human cells that stably express a CD4 cDNA (P.

Maddon et al., Cell 47:333 /19867). Para além disso, as propriedades neurotrópicas de HIV-1 que se reflectem na alta incidência de disfunção do sistema nervoso central em indivíduos infectados por HIV-1 (W. Snider et al., Ann. Neurol. 14:403 /19837) e, a capacidade de detectar HIV-1 no tecido cerebral e no líquido cerebroespina 1 de doentes com SIDA (G. Shaw et al., Science 227:177 /19857; L. Epstein, AIDS Res. £:447 /19857; S. Kornig, Science 233: 1089 /19867; D. Ho et al., N. Engl. J. Med. 313:1498 /19857; J. Levy et al., Lancet J£:586 /19857), parecem ter explicação na expressão de CD4 em células de origem neuronal, glial e monocitica/macrofógica (P. Maddon, Cell 4/:444 /19867; J. Funke et al., J. Exp. Med. 165:1230 /19867; B. Tourvieille et al., Science 234:610 /19867).Maddon et al., Cell 47: 333/19867). In addition, the neurotropic properties of HIV-1 that are reflected in the high incidence of central nervous system dysfunction in HIV-1 infected individuals (W. Snider et al., Ann. Neurol. 14: 403/19837) and, the ability to detect HIV-1 in brain tissue and cerebrospinal fluid 1 in AIDS patients (G. Shaw et al., Science 227: 177/19857; L. Epstein, AIDS Res. £: 447/19857; S. Kornig , Science 233: 1089/19867; D. Ho et al., N. Engl. J. Med. 313: 1498/19857; J. Levy et al., Lancet J. (586/19857), seem to have an explanation in the expression of CD4 in cells of neuronal, glial and monocytic / macrophage origin (P. Maddon, Cell 4 /: 444/19867; J. Funke et al., J. Exp. Med. 165: 1230/19867; B. Tourvieille et al ., Science 234: 610/19867).

Para além de determinar a susceptibilidade à infecção por HIV-1, CD4 parece estar envolvido na manifestação de efeitos litopãticos na célula hospedeiro injectada. Descobriu-se que anticorpos contra CD4 inibem a fusão de células T CD4 não infectadas com células infectadas por HIV-1 in vitro; para além do mais, as células polinucleadas gigantes produzidas por este acontecimento morrem pouco tempo de se formarem devido à depleção da população de células CD4 (J. Lifson et al., 232:1 123 /19867 ). A formação de sincícios requere também a expressão de gp120 e pode ser provocada cocultivando linhas celulares positivas para CD4 com linhas celulares que exprimem o gene env de HIV-1 na ausência de outras protéinas virais, reguladoras ou estruturais (J. Sodroski et al., Nature 322:470 /19867; J. Lifson et al., Nature 323:725 /19867 ). Deste modo, mediando quer a infecção quer HIV-1 quer a eventual morte celular, a interacção entre gp120 e CD4 constitui um dos muitos pontos criticos de entrada no ciclo da vida virai susceptível de intervenção terapêutica (H. Mitsuya et al., Nature 325:773 /19877).In addition to determining susceptibility to HIV-1 infection, CD4 appears to be involved in the manifestation of lithopathic effects in the injected host cell. Antibodies to CD4 have been found to inhibit the fusion of uninfected CD4 T cells with HIV-1 infected cells in vitro; moreover, the giant polynucleated cells produced by this event die shortly before they form due to the depletion of the CD4 cell population (J. Lifson et al., 232: 1 123/19867). The formation of syncytia also requires the expression of gp120 and can be caused by co-culturing CD4 positive cell lines with cell lines that express the HIV-1 env gene in the absence of other viral, regulatory or structural proteins (J. Sodroski et al., Nature 322: 470/19867; J. Lifson et al., Nature 323: 725/19867). Thus, mediating both HIV-1 infection and eventual cell death, the interaction between gp120 and CD4 is one of the many critical points of entry into the viral life cycle susceptible to therapeutic intervention (H. Mitsuya et al., Nature 325 : 773/19877).

A sequencia conhecida do precursor de CD4 prediz um peptideo de sinal hidrofóbico, uma região extracelular de aproximadamente 370 aminoácidos, uma região altamente hidrofóbica com significativa similitude com o domínio ligado à menbrana da cadeia beta de MHC da classe II e uma sequência de 40 resíduos intracelular altamente corfegado (P. Maddon, Cell 42.:93 /19857). 0 domínio extracelular de CD4 consiste em quatro regiões contíguas cada uma delas possuindo semelhanças estruturais e de aminoácidos com os domínios variável e de ligação (V-J) das cadeias leves de imunoglobulinas bem como com regiões relacionadas noutros membros da superfámilia de genes das imunoglobu1inas. Estas regiões estruturalmente similares, de CD4 são designadas por domínios V₁, V?, ^V3·^{e v}4-6-The known sequence of the CD4 precursor predicts a hydrophobic signal peptide, an extracellular region of approximately 370 amino acids, a highly hydrophobic region with significant similarity to the MHC beta II chain-linked domain and a sequence of 40 intracellular residues highly corfegado (P. Maddon, Cell 42.:93 / 19857). The CD4 extracellular domain consists of four contiguous regions each having structural and amino acid similarities with the variable and binding (VJ) domains of immunoglobulin light chains as well as related regions in other members of the immunoglobulin gene superfamily. These structurally similar CD4 regions are called V ₁ , V ?, ^V 3 · ^ev 4-6- domains

Uma estrâtegia de sucesso no desen volvimento de drogas para tratamento de muitas anomalias mediodas por receptores foi a identificação de antagonistas que bloqueiam a ligação do ligando natural. Uma vez que CD4 se une, normalmente, aos sitios de reconhecimento do involucro de HIV-1, parece ser um candidato para o sequestramento terapêutico destes sítios de HIV, desta forma bloqueendo a infecciosidade virai. Contudo, o CD4 nativo é uma protéina de membrana celular que está fixa na dupla camada lipidica celular.A successful strategy in the development of drugs to treat many mediocre anomalies by receptors has been the identification of antagonists that block the binding of the natural ligand. Since CD4 normally joins the HIV-1 envelope recognition sites, it appears to be a candidate for the therapeutic sequestration of these HIV sites, thereby blocking viral infectivity. However, native CD4 is a cell membrane protein that is attached to the cell lipid double layer.

A propriedade de fixação às membranas da CD4 nativa não ê desejável do ponto de vista do seu fábrico, purificação e uso clínico e, por isso , fcram feitas variantes da sequência de aminoácidos de CD4 nos quais o dóminio transmembrana sofrem uma deleção. Estes variantes de CD4 são solúveis em água e provou-se que eram supressoras da replicação de HIV em culturas celulares in vitro¹,'. (Ver, por exemplo, Smith et al., 238:1704-1707 /T9877; Fisher et al., Nature 331:76-78 /19887; Hussey et al., Nature 331: :78-82 /19887; Deen et al., Nature 331:82-84 /19887).The property of attachment to the native CD4 membranes is not desirable from the point of view of its manufacture, purification and clinical use and, therefore, variants of the amino acid sequence of CD4 have been made in which the transmembrane doom undergoes a deletion. These CD4 variants are water soluble and have been shown to suppress HIV replication in cell cultures in vitro ¹ , '. (See, for example, Smith et al., 238: 1704-1707 / T9877; Fisher et al., Nature 331: 76-78 / 19887; Hussey et al., Nature 331:: 78-82 / 19887; Deen et al., Nature 331: 82-84 / 19887).

Foram desoitas fusões cadeias leves de imunoglobulinas com CD4 (Traunecker et al., Nature 331 :84-86 /19887).CD4 immunoglobulin light chain fusions have been neglected (Traunecker et al., Nature 331: 84-86 / 19887).

A modificação covalente de certas protéinas com polietileno glicol (PEG) ou copolímeros de polioxietileno e po1ioxipropileno mostrou aumentar in vivo a semi-vida no plasma, reduzir a imunogenieidade e/ou aumentar a solubilidade em água. Ver, por exemplo, Abuchowiski et al., J. Biol. Chem 252:3582-3586 /19777. Abuchowski et al., Câncer Treatment Rep. 63 :1 127-1 132 /19797; Pyata et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29:113-127 /19807; Naci et al., J. Appl. Biochem. 6j91-102 /19847; e U.S. 4.609.546. Contudo, a modificação convalente de protéinas com PEG leva, frequentemente à perda de actividade biológica. Como afirma Harris, Rev. Macromol. Chem. Phys.The covalent modification of certain proteins with polyethylene glycol (PEG) or polyoxyethylene and polyoxypropylene copolymers has been shown to increase plasma half-life in vivo, reduce immunogenicity and / or increase water solubility. See, for example, Abuchowiski et al., J. Biol. Chem 252: 3582-3586 / 19777. Abuchowski et al., Cancer Treatment Rep. 63: 1 127-1 132/19797; Pyata et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29: 113-127 / 19807; Naci et al., J. Appl. Biochem. 6j91-102 / 19847; and U.S. 4,609,546. However, convalescent protein modification with PEG often leads to loss of biological activity. As Harris, Rev. Macromol. Chem. Phys.

25(3) :325-373 (1985), parece não haver regras gerais, no que diz respeito à produção excessiva de protéina desactivada uma vez que os efeitos variam muito de sistema para sistema .25 (3): 325-373 (1985), there seems to be no general rules, regarding the excessive production of deactivated protein, since the effects vary greatly from system to system.

Dados recentes sugerem que resíduos de lisina parecem ter um papel critico na ligação de gp120. Peterson and Leed descobriram que um segmento de oito aminoácidos em CD4 é crítico para a ligação de gp120 (aa 42-49; Ser-Fen-Leu-Tre-Lis-G1i-Pro-Ser /Cell, 54:65, 19887). Por exemplo, não só a delecção deste segmento impede a ligação de gp120, mas também substituições de Asn para Lis 46,Recent data suggest that lysine residues appear to play a critical role in gp120 binding. Peterson and Leed found that an eight amino acid segment on CD4 is critical for the binding of gp120 (aa 42-49; Ser-Fen-Leu-Tre-Lis-G1i-Pro-Ser / Cell, 54:65, 19887). For example, not only does deleting this segment prevent gp120 from binding, but also replacements from Asn to Lis 46,

Ser para Leu51 e Pro para Gli48 impedem a ligação de gp120. Subsquentemente, Clayton et al., também mostraram que substituições de aminoácidos que removem resíduos de lisina nesta região de CD4 alteram grandemente a ligação de gp120 (Nature, 335:363, 1988). Por exemplo, substituições de Pro para Lis50, Ser para Leu51 e Pro para Gli48 impedem a ligação de gp120.Ser for Leu51 and Pro for Gli48 prevent the binding of gp120. Subsequently, Clayton et al., Also showed that amino acid substitutions that remove lysine residues in this CD4 region greatly alter the binding of gp120 (Nature, 335: 363, 1988). For example, substitutions of Pro for Lis50, Ser for Leu51 and Pro for Gli48 prevent the binding of gp120.

Descobrimos que formos truncados de CD4 possuem uma curta semi-vida no plasma in vivo em comparação com protéinas séricas e uma bioacessibi1idade imcompleta após injecção subcutânea ou intramuscular. Isto torna-se indesejável no contexto da terapia com CD4, a qual pode depender da pronta e contínua acessbi1 idade in vivo de CD4 circulante para ligar a HIV, a gp120 de HIV ou a células infectadas com HIV presentes no doente. Embora seja possível administrar CD4 por infusão contínua, isto torna-se incoveniente e caro para o doente e limita as concentrações, num estado constante, que podem ser alcançadas num paciente. Deste modo, um dos objectivos deste invento é fornecer novas moléculas de CD4 que exibam uma semi-vida biologica mais extensa .We found that CD4 truncations have a short plasma half-life in vivo compared to serum proteins and an incomplete bioaccessibility after subcutaneous or intramuscular injection. This is undesirable in the context of CD4 therapy, which may depend on the prompt and continuous in vivo accessibility of circulating CD4 to bind HIV, HIV gp120 or HIV-infected cells present in the patient. Although it is possible to administer CD4 by continuous infusion, this becomes inconvenient and expensive for the patient and limits the concentrations, in a constant state, that can be achieved in a patient. Thus, one of the objectives of this invention is to provide new CD4 molecules that exhibit a longer biological half-life.

Outro objectivo deste invento é melhorar a capacidade de inibição da replicação do HIV por CD4 quer in vivo quer in vitro e o bloqueio da ligação de gp120 à CD4 da superfície celular pela mesma CD4.Another objective of this invention is to improve the ability to inhibit HIV replication by CD4 either in vivo or in vitro and to block the binding of gp120 to CD4 from the cell surface by the same CD4.

E um oujro objectivo aumentar a bioacessibi1 idade de CD4.A further objective is to increase CD4 bioaccessibility.

E um objectivo adicional deste invento a melhoria das características fisico-quimicas de CD4, incluindo por modificação da sua solubi1 idade, pi e peso molecular.An additional object of this invention is to improve the physico-chemical characteristics of CD4, including by modifying its solubility, pi and molecular weight.

Ainda outro objectivo, ê a melhoria das características imunologicas de CD4 para, particularmente, reduzir a imunogenicidade de forma a prevenir reacções imunologicas adversas e a sua remoção mediada imunologicamente.Yet another objective is to improve the immunological characteristics of CD4 to, in particular, reduce immunogenicity in order to prevent adverse immunological reactions and their immunologically mediated removal.

Nós descobrimos que os objectivos precedentes são possíveis de ser conseguidos por conjugação de um polímero não proteico a CD4 pelo que um derivado de CD4 é preparado sendo solúvel em água e exibindo outras caracteristicas desejadas. Nas variantes preferidas o polímero é polietileno glicol (PEG) o qual é ligado covalentemente a um grupo amino de uma variante da sequência de aminoácidos de CD4 da qual foi excluída a região transmembronar.We have found that the foregoing objectives are possible to be achieved by conjugating a non-protein polymer to CD4 whereby a derivative of CD4 is prepared by being soluble in water and exhibiting other desired characteristics. In the preferred variants the polymer is polyethylene glycol (PEG) which is covalently linked to an amino group of a variant of the CD4 amino acid sequence from which the transmembrane region has been excluded.

Noutra variante, um polímero não proteico, em particular PEG, ê ligado covalentemente a um carbohidrato de uma g1icoprotêina como CD4, pelo que é obtido um derivado polipeptidico solúvel em água.In another variant, a non-protein polymer, in particular PEG, is covalently attached to a glycoprotein carbohydrate such as CD4, whereby a water-soluble polypeptide derivative is obtained.

-9A CD4 é definida como CD4 nativa de comprimento total ou qualquer outro polipeptideo que possua as características de ligação a gp120 de CD4 nativo e que inclua um domínio de ligação a gp120 de CD4, juntamente com variantes da sequência de aminoácidos de CD4 nativo que são capazes de se ligar a gp120.-9A CD4 is defined as full-length native CD4 or any other polypeptide that has the characteristics of native CD4 gp120 binding and that includes a CD4 gp120 binding domain, along with variants of the native CD4 amino acid sequence that are capable of binding to gp120.

As variantes da sequência de amino ácidos de CD4 que são úteis são facilmente identificáveis por determinação da sua capacidade de ligação a gp120 de acordo com métodos analíticos conhecidos per se e descritos nos exemplos. Em geral, tais variantes pertencem a um ou ambos de dois grupos. Um dos grupos inclui variantes de CD4 na qual pelo menos o domínio transmembronar é inactivado de modo que se torna incapaz de se inserir na membrana celular. Tipicamente, isto é conseguido por deleção do domínio transmembronar e, opacionalmente inclui a deleção do domínio citoplasmático e de toda a sequência extracelular localizada abaixo do primeiro dos dois domínios de CD4 semelhantes à região variável. 0 segundo grupo inclui fusões de CD4 com protéinas do plasma que possuem semi-vidas no plasma mais extensos tais como albumina, transferrina ou ímunoglobulinas. Os polipeptídeos de CD4 possuem na extremidade N uma lisina (a sequência nativa), uma aspargina ou outros resíduos apropriados no lugar de lisina. As variantes de CD4 são descritas em petições anteriores.The variants of the CD4 amino acid sequence that are useful are easily identifiable by determining their ability to bind to gp120 according to analytical methods known per se and described in the examples. In general, such variants belong to one or both of two groups. One group includes CD4 variants in which at least the transmembrane domain is inactivated so that it is unable to insert itself into the cell membrane. This is typically achieved by deletion of the transmembrane domain and optionally includes the deletion of the cytoplasmic domain and the entire extracellular sequence located below the first of the two CD4 domains similar to the variable region. The second group includes fusions of CD4 with plasma proteins that have longer plasma half-lives such as albumin, transferrin or immunoglobulins. The CD4 polypeptides have at the N-terminus a lysine (the native sequence), an asparagine or other appropriate residues in place of lysine. The CD4 variants are described in previous applications.

A CD4 é expressa em culturas de células de mamíferos recombinantes e isolada da Natureza como uma g1icoprotéina, a qual é definida como um polipeptideo que possui um carbohidrato na sua composição. Tipicamente, nas gl icoprotéinas, o carbohidrato é um ramo polissacarídico que contém fucosa, N-acetiIglucosamina, galactosa, manosa, ácido N-acetilneuraminico (ácido siálico) e outros resíduos de açucares. 0 carbohidrato é substituidoCD4 is expressed in recombinant mammalian cell cultures and isolated from Nature as a glycoprotein, which is defined as a polypeptide that has a carbohydrate in its composition. Typically, in glycoproteins, carbohydrate is a polysaccharide branch that contains fucosa, N-acetylglucosamine, galactose, manosa, N-acetylneuraminic acid (sialic acid) and other sugar residues. The carbohydrate is replaced

-10nos sítios de glicolização ligados à extremidade N (asp X tre/ser, onde X é um resíduo qualquer)ou, noutros polipeptideos, em sítios ligados à extremidade 0 (tipicamente serina) ou em ambos os sítios ligados às extremidades N e 0. A composição em carbohidrato de CD4 truncada de células CHO recombinantes é a que se segue (há dois sítios ligados à extremidade N; a distribuição proporcional de cada açúcar entre os dois sítios não é conhecida actualmente).-10 at the glycolysis sites linked to the N-end (asp X tre / ser, where X is any residue) or, in other polypeptides, at sites linked to the 0-end (typically serine) or at both sites linked to the N and 0-ends. The truncated CD4 carbohydrate composition of recombinant CHO cells is as follows (there are two N-linked sites; the proportional distribution of each sugar between the two sites is not known at present).

Composição de carbohidratos de rCD4Composition of rCD4 carbohydrates

Res i duoRes i duo

FucosaFucosa

N-aceti lglucosaminaN-acetylglucosamine

Ga 1actosaGa 1actosa

ManosaManosa

Acido N-acetilneuraminico ^aMédia±S.D. (n=2)N-acetylneuraminic acid ^at Medium ± SD (n = 2)

Moles por mole de rCD4^a Moles per mole of rCD4 ^a

0,54±0,03 6,3 ±0,11 4,0 ±0,12 7,1 ±0,25 2,7 ±0,050.54 ± 0.03 6.3 ± 0.11 4.0 ± 0.12 7.1 ± 0.25 2.7 ± 0.05

Ter-se-à em conta que CD4 de outros hospedeiros diferentes pode conter diferentes açucares ou pode variar nas proporções relativas dos açucares mostrados acima. Está incluída nesta âmbito, a mudança, adição ou deleção de sítios de glicolização por mutagenese dirigida a um sítio do polipeptideo de CD4 de forma a aumentar o número ou modificar a localização dos componentes carbohidrato-polímero. Também se terá em conta que o polímero não proteico que é conjugado o CD4 exclui oligossacorídeos que podem estar presentes na molécula nativa ou inicial de CD4,It will be taken into account that CD4 from other different hosts may contain different sugars or may vary in the relative proportions of the sugars shown above. Included in this scope is the change, addition or deletion of glycolysis sites by mutagenesis directed to a CD4 polypeptide site in order to increase the number or modify the location of the carbohydrate-polymer components. It will also be taken into account that the non-protein polymer that is conjugated to CD4 excludes oligosaccharides that may be present in the native or initial CD4 molecule,

i.e. o polímero é estranho ou heterologo a CD4.i.e. the polymer is foreign or heterologous to CD4.

-11Vulgarmente, ο polímero não proteico é um polímero sintético hidrofilico, i.e., um polímero não encontrado de outra forma, na Natureza. Contudo, polímeros existentes na Natureza e produzidos por métodos recombinan tes ou in vitro são úteis, pois são polímeros que são isolados da Natureza. Polímeros hidrofilicos de polivinil pertencem ao âmbito deste invento, tais como álcool polivinílico e polivinilpirrolidona. Particularmente úteis são éteres de polialcileno tais como polietileno glicol, polipropileno glicol, ésteres de polioxietileno ou metoxipolietileno glicol; polioxialcilenos tais como polIoxietileno , polioxipropileno e blocos de polímeros de polioxietileno e polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbomeros; polissacarídeos com ou sem braços que incluem os monomeros sacaridicos D-monosa, D- e L- galactosa, fucosa, frutosa, D-xilosa, L-aralinosa, ácido D-glucurónico, ácido- siálico, ácido D- galacturônico, ácido D-manurónico (isto é, ácido polimanurónico ou ácido alginico), D-g1ucosamina, D-ga1actosamina, D-glucosa e ácido neuraminico incuindo homopolissacarídeos e heteropolissacarídeos tais como lactosa, amilopectina, amido, hidroxietil amido, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinos, glicogenes ou a subunidade polissacarídica de mucopolissacarideos ácidos, e.g. ácido hialurónlco; polímeros de alcóois de açúcar tais como polissorbitol e polimanitol; heparina; poliaminas tais como polisserina as polialanina. Quando o polissacarideo for o da glicolização nativa ou o utilizado na glicolização na expressão recombinante de CD4, o sítio de substituição está vulgarmente localizado noutro sítio de glicolização que não o ligado às extremidades N ou 0 de CD4 ou duma variante da sequência de aminoácidos de CD4, na qual um sítio ligado às extremidades N ou 0, adicional ou substituido, foi introduzido na molécula. Podem ser empregues misturas de tais polímeros ou o polímero homogeneo. 0 polímero antes de ser ligado necesssita ser, e preferenciaImente, é solúvel em água mas o conjugado final é, obrigatoriamente, solúvel em água. Para além disso, o polímero não deve ser-11 Commonly, the non-protein polymer is a synthetic hydrophilic polymer, i.e., a polymer not otherwise found in nature. However, polymers existing in Nature and produced by recombinant or in vitro methods are useful, as they are polymers that are isolated from Nature. Hydrophilic polyvinyl polymers fall within the scope of this invention, such as polyvinyl alcohol and polyvinylpyrrolidone. Particularly useful are polyalkylene ethers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylene esters or methoxypolyethylene glycol; polyoxyalkylene such as polyoxyethylene, polyoxypropylene and polyoxyethylene and polyoxypropylene polymer blocks (Pluronics); polymethacrylates; carbomeres; polysaccharides with or without arms that include the saccharide monomers D-monosa, D- and L-galactosa, fucosa, fructo, D-xylosa, L-aralinosa, D-glucuronic acid, sialic acid, D-galacturonic acid, D- manuronic (i.e., polymanuronic acid or alginic acid), D-g1ucosamine, D-ga1actosamine, D-glucose and neuraminic acid including homopolysaccharides and heteropolysaccharides such as lactose, amylopectin, starch, hydroxyethyl starch, starch, dextran sulfate, dextran, dextran , glycogenes or the polysaccharide subunit of acidic mucopolysaccharides, eg hyaluronic acid; polymers of sugar alcohols such as polysorbitol and polymanitol; heparin; polyamines such as polyserine and polyalanine. When the polysaccharide is that of native glycolation or that used in glycolation in recombinant CD4 expression, the substitution site is commonly located in another glycolization site other than that linked to the N or 0 ends of CD4 or a variant of the CD4 amino acid sequence , in which an additional or substituted site attached to the N or 0 ends was introduced into the molecule. Mixtures of such polymers or the homogeneous polymer can be employed. The polymer before being bound needs to be, and preferably, is soluble in water but the final conjugate is, necessarily, soluble in water. In addition, the polymer should not be

altamente imunogenico quando conjugado com CD4, nem deve possuir viscosidade que seja incompatível com infusões ou injecções intravenosas se se tiver a intenção de o administrar por essas vias.highly immunogenic when conjugated to CD4, nor should it have a viscosity that is incompatible with infusions or intravenous injections if it is intended to be administered by these routes.

De preferência, o polímero contém openes um único grupo que reage com CD4. Isto ajuda a evitar a ligação entre moléculas de CD4. Contudo, faz parte deste âmbito a optimização das condições de reacção de modo a reduzir a ligação, ou a purificação dos produtos da reacção por filtração através de gel ou redes cromatográficas de forma a recolher derivados substancialmente homogéneos.Preferably, the polymer contains a single group which reacts with CD4. This helps to prevent binding between CD4 molecules. However, it is part of this scope to optimize the reaction conditions in order to reduce the binding, or to purify the reaction products by filtration through gel or chromatographic networks in order to collect substantially homogeneous derivatives.

peso molecular do polímero varia entre cerca de 100 a 500000 e, de preferência é cerca de 1000 a 20 000. 0 peso molecular escolhido depende da natureza do polímero e do grau de substituição. Geralmente, quanto maior for o grau de substituição, tanto maior é o peso molecular que pode ser utilizado. Os pesos moleculares cptimos serão determinados por experimentação em protina. Vulgarmente, o peso molecular do conjugado do polímero CD4 excederá cerca de 70 000 embora moléculas possuindo pesos moleculares mais baixos sejam apropriados.The molecular weight of the polymer ranges from about 100 to 500,000, and preferably about 1000 to 20,000. The molecular weight chosen depends on the nature of the polymer and the degree of substitution. Generally, the greater the degree of substitution, the greater the molecular weight that can be used. The optimal molecular weights will be determined by protein experimentation. Ordinarily, the molecular weight of the CD4 polymer conjugate will exceed about 70,000 although molecules having lower molecular weights are appropriate.

polímero é geralmente ligado covalentemente a CD4 através de um agente de ligação multifuncional que reage com o poliméro e com um ou mais resíduas de açúcar ou aminoácidos de CD4. Contudo, pertence ao âmbito deste invento ligar directamente o polímero a CD4 fazendo reagir um derivado do polímero com CD4 ou vice-versa. Também incluindo neste âmbito estão complexos associados não covalentes de CD4 e do polímero. Tais complexos são produzidos mais convenientemente, por associação não covalente com CD4 de polímeros carregados electronegativamente tais comoThe polymer is generally covalently linked to CD4 through a multifunctional linker that reacts with the polymer and with one or more sugar residues or CD4 amino acids. However, it is within the scope of this invention to directly bind the polymer to CD4 by reacting a derivative of the polymer with CD4 or vice versa. Also included in this scope are non-covalent associated complexes of CD4 and polymer. Such complexes are most conveniently produced by non-covalent association with CD4 of electronegatively charged polymers such as

-13sulfato de dextrano, heporina, heparano, sulfato de condroítina e outros glucosaminogl icanos, ou de polímeros anjotéricos contendo domínios electronegetivos. 0 pi alcalino de CD4 facilita a formação de tais complexos, os quais são produzidos quando se misturam soluções ou suspensões dos polímeros e CD4, seguido de remoção dos sais ou secagem, com o objectivo de acelerar a associação entre o polímero e CD4.-13 dextran sulfate, heporin, heparan, chondroitin sulfate and other glucosaminoglycans, or anjoteric polymers containing electronegetative domains. The alkaline pi of CD4 facilitates the formation of such complexes, which are produced when mixing solutions or suspensions of the polymers and CD4, followed by removal of the salts or drying, in order to accelerate the association between the polymer and CD4.

sítio de ligação covalente de CD4 são preferenciaImente, o grupo amino terminal da extremidade N e os grupos amino epsilon encontrados em resíduos de lisina, embora grupos amino, imino, carboxil, sulfidril, hidroxil e outros grupos hidroxilicos possam ser locais apropriados de substituição na molécula de CD4. 0 polímero pode ser ligado covalentemente directamente ao antigeneo CD4 sem o uso de um agente de ligação multifuncional (geralmente bifuncional). Exemplo de tais agentes de ligação incluem, 1,1-bis(diazoaceti1)-z-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo ésteres com ãcido 4-azidossalicilico, imidoesteres homobifuneionais inculuindo esteres de dissuccinimidi1 tais como 3,3'-ditiobis (succinimidi1-propionato) e maleimidos bifuncionais tal como bis-N-maleimido-1,8-ocfcana. Agentes derivantes tais como metil-3-/Tp-azido-feni1)ditiol7 propioimidato produzem intermediários fotactivãveis as quais são capazes de formar ligações na presença de luz. Em alternativa, matrizes reactivas solúveis em água tais como carbohidratos activados por bromido de cianogeneo e os sistemas nas patentes U.S. 3 959 080; 3 969 287,CD4 covalent binding sites are preferably the N-terminal amino group and the epsilon amino groups found in lysine residues, although amino, imino, carboxyl, sulfhydryl, hydroxyl and other hydroxyl groups may be appropriate replacement sites on the molecule of CD4. The polymer can be covalently linked directly to the CD4 antigen without the use of a multifunctional (generally bifunctional) binding agent. Examples of such binding agents include 1,1-bis (diazoacetyl) -z-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example esters with 4-azidosalicylic acid, homobifunctional imidoesters including dissuccinimidi1 esters such as 3.3 ' -ditiobis (succinimidi-propionate) and bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-ocfcan. Derivative agents such as methyl-3- / Tp-azido-phenyl1) dithiol7 propioimidate produce photactivable intermediates which are capable of forming bonds in the presence of light. Alternatively, reactive water-soluble matrices such as cyanogen bromide activated carbohydrates and the systems in U.S. patents 3,959,080; 3 969 287,

691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537, 4 055 635 e691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537, 4 055 635 and

330 440 são modificados apropriadamente para a ligação do polímero e CD4. A ligação covalente a grupos amino de CD4 é conseguida através de processor químicos conhecidos baseados em cloreto de cianúrico, carbonil diimidazol, grupos reactivos aldeído (alcoxido de PEG mais acetal dietílico de bromoacetaldeído; PEG mais DMSO e anidrido acético, ou cloreto de 330 440 are modified appropriately for the binding of the polymer and CD4. Covalent binding to amino groups of CD4 is achieved through known chemical processors based on cyanuric chloride, carbonyl diimidazole, reactive aldehyde groups (PEG alkoxide plus bromoacetaldehyde diethyl acetal; PEG plus DMSO and acetic anhydride, or chloride

-14PEG mais fenóxido de 4-hidroxibenzaldéido) esteres activos de succinimidi1, ditiocarbonato de PEG activado, PEG activado por 2,4,5-triclorofenilcloroformato ou p-nitrofenilcloroformato. Os grupos carboxílicos são derivados por ligação amino-PEG usando carbodiimida.-14PEG plus 4-hydroxybenzaldehyde phenoxide) active succinimidi1 esters, activated PEG dithiocarbonate, PEG activated by 2,4,5-trichlorophenylchloroformate or p-nitrophenylchloroformate. Carboxylic groups are derived by amino-PEG bond using carbodiimide.

Os polímeros são conjugados aos compos’tos ol igossacar id icos por oxidação química (metaperiodato) ou enzimática (glucosa ou galactosa oxidasa, de modo a produzir derivados aldeídicos do carbohidrato), seguida de reacção com hidrazida ou polímeros derivados por grupos amino, de modo idêntico ou descrito por Heitzmann et al., P.N.A.S., :3537-3541 ( 1974) ou Bayer et al., Methods in Enzymolojy, :310 ( 1979), para a marcação de oligossacarídeos com biotina ou avidina. Para além disso, outros métodos químicos ou enzimáticos que tenham sido usados até agora para ligação de polímeros e oligossacárideos podem ser apropriados. Oligossacarídeos são particularmente vantajosos para a CD4 devido aos carbohidratos estarem situados na região terminal C do domínio extracelular e, por isso, não estão envolvidos na ligação a HIV; isto irá ajudar na preservação da actividade de CD4 enquanto alcaçamos outros objectivos aqui propostos.The polymers are conjugated to the oligosaccharide compounds by chemical (metaperiodate) or enzymatic (glucose or galactose oxidase) oxidation, in order to produce aldehyde derivatives of the carbohydrate, followed by reaction with hydrazide or polymers derived by amino groups, so identical or described by Heitzmann et al., PNAS,: 3537-3541 (1974) or Bayer et al., Methods in Enzymolojy,: 310 (1979), for the labeling of oligosaccharides with biotin or avidin. In addition, other chemical or enzymatic methods that have been used so far for binding polymers and oligosaccharides may be appropriate. Oligosaccharides are particularly advantageous for CD4 because carbohydrates are located in the C-terminal region of the extracellular domain and, therefore, are not involved in HIV binding; this will help in the preservation of CD4 activity while we achieve other objectives proposed here.

Assim, uma vez que existem menos substituições do que sitios em aminoácidos para derivação, os produtos oligossacarídeos serão, em geral, mais homogéneos. Finalmente, os oligossacarídeos substituintes de CD4 podem ser modificados enzimaticamente para remover os açucares (digestão por neuraminidasa antes da derivação do polímero).Thus, since there are fewer substitutions than sites in amino acids for derivation, oligosaccharide products will, in general, be more homogeneous. Finally, CD4-substituting oligosaccharides can be modified enzymatically to remove sugars (digestion by neuraminidase before polymer derivation).

Os oligossacarídeos de outras glicoprotéinas que não CD4 ao substituídos cova 1entemente de preferência com PEG, do mesmo modo que em CD4 de forma a atingir os objectivos desta invenção no que diz respeito aos usos terapêuticos de tais glicoprotéinas.Oligosaccharides from glycoproteins other than CD4 to the one substituted cova preferably with PEG, as well as in CD4 in order to achieve the objectives of this invention with regard to the therapeutic uses of such glycoproteins.

-150 polímero terá um grupo que é directamente reactivo com uma cadeia lateral de aminoácidos ou com as extremidades N ou C de CD4 (ver exemplos abaixo), ou que é reactivo com o agente de ligação multifuncional.-150 polymer will have a group that is directly reactive with a side chain of amino acids or with the N or C ends of CD4 (see examples below), or that is reactive with the multifunctional linker.

De uma maneira geral são conhecidos polímeros que possuem tais grupos reactivos para a preparação de protéinas imobilizadas. Para se usarem tais processos químicos aqui, devem ser empregues polímeros solúveis em água diferentemente derivados no mesmo modo que os polímeros insolúveis utilizados até aqui na imobilização de protéinas. A activação por bromido de cianogéneo é um processo particularmente útil para ser usado na ligação de polissacarídeos a CD4.In general, polymers are known which have such reactive groups for the preparation of immobilized proteins. In order to use such chemical processes here, water-soluble polymers differently derived in the same way as the insoluble polymers used so far in protein immobilization must be employed. Cyanogen bromide activation is a particularly useful process to be used in binding polysaccharides to CD4.

Solúvel em água, quando diz respeito ao conjugado, significa que o conjugado é solúvel em fluidos fisiologicos tais como sangue, numa quantidade suficiente para lacançar concentrações eficazes terapeuticamente. Assim, isto exclui CD4 inso1ubi1izado pela matriz tal como pode ser usado em cromatografia de afinidade para purificar HIV ou gp120.Water soluble, when it comes to the conjugate, means that the conjugate is soluble in physiological fluids such as blood, in an amount sufficient to achieve therapeutically effective concentrations. Thus, this excludes CD4 unsubstituted by the matrix as it can be used in affinity chromatography to purify HIV or gp120.

Solúvel em ãgua, quando diz respeito ao polímero inicial significa que o polímero ou o seu intermediário reactivo usado na conjugação ê suficientemente solúvel em água para participar na reacção de derivação com a CD4.Soluble in water, when referring to the starting polymer means that the polymer or its reactive intermediate used in the conjugation is sufficiently soluble in water to participate in the derivation reaction with CD4.

grau de substituição de CD4 variará dependendo do número de sítios reactivos na protéina, de se usar toda a CD4 ou apenas um fragmento, de CD4 ser um produto de fusão de uma protéina heteróloga a CD4, do peso molecular, da hidrofi1icidade, de outras características do polímero e dos sítios particulares escolhidos. Em geral, o domínio CD4 do conjugado é subsituido por cerca de 1 a 10 moléculas do polímero enquanto qualquer sequência heterologaThe degree of CD4 substitution will vary depending on the number of reactive sites in the protein, whether all CD4 is used or just a fragment, whether CD4 is a fusion product of a protein heterologous to CD4, molecular weight, hydrophilicity, other characteristics of the polymer and the particular sites chosen. In general, the CD4 domain of the conjugate is substituted by about 1 to 10 molecules of the polymer while any heterologous sequence

que ê fundida a CD4 pode ser substituída por um número essencialmente ilimitado de moléculas do polímero de modo a não afectar significativamente e adversamente a actividade da parte da CD4. 0 grau óptimo de ligação ê determinado, faci lmente, experimentalmente fazendo variar o tempo, temperatura e outras condições de reacção de modo a alterar o grau de substituição, após o que é determinado em culturas celulares in vitro a capacidade dos conjugados para se ligarem a gp120 e/ou Inibirem a replicação de KIV.that the CD4 is fused can be replaced by an essentially unlimited number of molecules of the polymer so as not to significantly and adversely affect the activity of the CD4 part. The optimal degree of binding is easily determined experimentally by varying the time, temperature and other reaction conditions in order to change the degree of substitution, after which in vitro cell cultures determine the ability of the conjugates to bind to gp120 and / or Inhibit KIV replication.

Num caso preferênc1 a 1, o PEG é ligado a CD4 através de resíduos de lisina e do grupo amino terminal da extremidade N. Os nossos próprios estudos, consistentes com os conhecimentos acima descritos, sugerem que a modificação dos resíduos de lisina parece afectar desfavoravelmente a ligação a gp120. Foi observada uma grande redução da ligação a gp120 após acetilação de pelo menos 3 resíduos de lisina de CD4 com anidrido acético. Não foi detectada qualquer ligação a gp120 após acetilação de 4 resíduos de lisina. Por isso, ficamos surpreendidos ao verificar que os resíduos de lisina de CD4 podem ser modificados com sucesso por polímeros tais como PEG com apenas uma redução mínima da ligação a gp120.In a preferred case 1 to 1, PEG is bound to CD4 via lysine residues and the N-terminal amino group. Our own studies, consistent with the knowledge described above, suggest that the modification of lysine residues appears to adversely affect the connection to gp120. A large reduction in gp120 binding was observed after acetylation of at least 3 CD4 lysine residues with acetic anhydride. No binding to gp120 was detected after acetylation of 4 lysine residues. So we were surprised to find that CD4 lysine residues can be successfully modified by polymers such as PEG with only minimal reduction in gp120 binding.

peso molecular do polímero conjugado, isto ê, PEG varia entre cerca de 500 a 100000.molecular weight of the conjugated polymer, i.e., PEG ranges from about 500 to 100,000.

São tipicos pesos moleculares de 2000, 5000 ou 20000.Molecular weights of 2000, 5000 or 20000 are typical.

polímero, isto é, PEG é ligado a CD4 por uma larga variedade de métodos conhecidos per se para a modificação covalente de protéinas com polímeros não proteicos tais como PEG. Alguns destes métodos, contudo, não são apropriados para os nossos objectivos. 0 emprego do cloreto cianúrico leva a muitas reacções laterais, incluindo ligação entre protéinas. Para além disso, pode levar frequen-17-polymer, i.e., PEG is linked to CD4 by a wide variety of methods known per se for covalent modification of proteins with non-protein polymers such as PEG. Some of these methods, however, are not appropriate for our purposes. The use of cyanuric chloride leads to many side reactions, including binding between proteins. In addition, it may take

temente à inactivação de protéinas com grupos sulfohidri1icos. 0 emprego de carbonil diimidazol (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131 :25-33 /19837) requere pH altos ( 8,5), o que pode inactivar as protéinas. Para além disso, uma vez que o intermediário activado por PEG pode reagir com água, é necessário um muito grande excesso molar de PEG activado em relação à protéina. Por exemplo, nós descobrimos que a conversão de 80% de CD4 em CD4-PEG usando carbonil diimidazol requere um excesso molar de 1000 vezes de PEG activado e 12 hr de incubação. As altas concentrações de PEG usadas nos processos que empregam carbonil diimidazol também leva ao aparecimento de problemas com a purificação uma vez que tanto a cromatografia por filtração através de gel como a cromatografia de interacção hidrofóbica são afectadas adversamente. Para além disso, nós descobrimos que altas concentrações de 'PEG activado precipitam CD4 tendo como consequência uma reduzida modificação covalente, um problema per se foi verificado anteriormente (Davis, U.S. Patent 4179337). Por outro lado, o emprego de aldeídos (Royer, U.S. Patent 4002531) é mais eficaz pois requere apenas um excesso molar de PEG 40 vezes e 1 a 2 hr de incubação. Contudo, o dióxido de magnésio, sugerido por Ryer para a preparação do aldeído de PEG é problemático 'devido à tendência pronunciada do PEG para formar complexos com agentes oxidantes baseados em metal. (Harris et al., J. Polym. Sei., Polym. Chem. Ed. 22:341-352 /19847)- 0 uso para nós de uma oxidação moffatt utilizandodue to the inactivation of proteins with sulfohydric groups. The use of carbonyl diimidazole (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131: 25-33 / 19837) requires high pH (8.5), which can inactivate proteins. In addition, since the PEG-activated intermediate can react with water, a very large molar excess of activated PEG over the protein is required. For example, we found that converting 80% of CD4 to CD4-PEG using carbonyl diimidazole requires a 1000-fold molar excess of activated PEG and 12 hr of incubation. The high concentrations of PEG used in processes that employ carbonyl diimidazole also leads to problems with purification since both gel chromatography and hydrophobic interaction chromatography are adversely affected. In addition, we found that high concentrations of activated 'PEG precipitate CD4 resulting in reduced covalent modification, a problem per se that has been noted previously (Davis, U.S. Patent 4179337). On the other hand, the use of aldehydes (Royer, U.S. Patent 4002531) is more effective as it requires only a molar excess of PEG 40 times and 1 to 2 hr of incubation. However, the magnesium dioxide, suggested by Ryer for the preparation of the PEG aldehyde is problematic 'due to the pronounced tendency of PEG to form complexes with metal-based oxidizing agents. (Harris et al., J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 22: 341-352 / 19847) - The use for us of a moffatt oxidation using

DMSO e anidrido acético, obvia este problema. Para além disso, o borohidreto de sódio sugerido por Royer deve ser usado a um pH alto e tem uma tendência significativa para reduzir as ligações dissulfidicas. Em contraste, nós usamos cianoborohidreto de sódio o qual ê eficaz a pH neutro e possui uma muito pequena tendência para reduzir as ligações dissulfidicas .DMSO and acetic anhydride, obviate this problem. In addition, the sodium borohydride suggested by Royer should be used at a high pH and has a significant tendency to reduce disulfide bonds. In contrast, we use sodium cyanoborohydride which is effective at neutral pH and has a very small tendency to reduce disulfide bonds.

-18Os conjugados deste invento são separados dos materiais não reactivos iniciais por filtração através de gel. São ainda mais purificados por adsorção em anti-CD4 (anticorpos monoclonais 0KT4) ou numa matriz imobilizada de gp120, possuindo esta última a vantagem de só ligar conjugados nos quais o grau ou sítio de substituição não tenha resultado na inactivação da ligação a gp120. A CD4 subsituida com PEG é mais purificada por cromatografia de interacção hidrofóbica. De preferência, os conjugados são eluídos do meio de cromatografia hidrofóbica (alei 1 Sepharose) usando um gradiente decrescente de sal. Isto, bem como o processo de filtração através de gel descrito acima, resolve o conjugado tendo como base o grau de substituição, sendo possível desta forma obter CD4-PEG substâncialroite homogéneo no grau de subsitulção molar por PEG, ou seja CD4 manossubstituida ou d i sssubsti tu i da que sejam essencialmente livres de CD4 dissubstituida ou monossubstituida, respectivamente. Os derivados de CD4 são também purificados na rraior parte dos casos por cromatografia de troca iónica (adsorção de CD4 a uma resina de troca de catiões, seguida de eluição, da adsorção dos contaminantes a uma resina de troca de aniões).The conjugates of this invention are separated from the initial non-reactive materials by filtration through gel. They are further purified by adsorption on anti-CD4 (monoclonal antibodies 0KT4) or on an immobilized matrix of gp120, the latter having the advantage of only binding conjugates in which the degree or site of substitution has not resulted in the inactivation of binding to gp120. PEG-substituted CD4 is further purified by hydrophobic interaction chromatography. Preferably, the conjugates are eluted from the hydrophobic chromatography medium (alei 1 Sepharose) using a decreasing salt gradient. This, as well as the gel filtration process described above, resolves the conjugate based on the degree of substitution, making it possible to obtain homogeneous substance CD4-PEG in the degree of molar substitution by PEG, that is to say, substituted or dissubstituted CD4 which are essentially free of disubstituted or monosubstituted CD4, respectively. Derivatives of CD4 are also purified in most cases by ion exchange chromatography (adsorption of CD4 to a cation exchange resin, followed by elution, the adsorption of contaminants to an anion exchange resin).

Os conjugados deste invento são formulados em suportes fisiologicamente apropriados e filtrados esterilmente para uso terapêutico. A concentração de CD4 nas formulas terapêuticas não é critica, mas tipicamente é cerca de 1 a 20 mg/ml. Os conjugados opcionalmente, contêm um detergente não iónico tal como tween 20 ou 80, sais, tampões e outros excipientes. São armazenados em soluções aquosas ou liofili zadas.The conjugates of this invention are formulated on physiologically appropriate supports and sterile filtered for therapeutic use. The concentration of CD4 in the therapeutic formulas is not critical, but it is typically about 1 to 20 mg / ml. The conjugates optionally contain a non-ionic detergent such as tween 20 or 80, salts, buffers and other excipients. They are stored in aqueous or lyophilized solutions.

Os conjugados são administrados por injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intracerebroespina 1, aerosóis intrapulmonares ou intranasais, pensos térmicos, infusões intravesicu 1 ares , ou semelhante. AThe conjugates are administered by subcutaneous, intramuscular, intravenous or intracerebrospinal 1 injection, intrapulmonary or intranasal aerosols, thermal dressings, intravesical infusions, or the like. THE

dose será determinada de acordo com a prática clinica, mas uma dose inicial será de cerca de 10 a 300 ug/kg/1-3 vezes por semana. Uma das vantagens deste conjugado é o facto de serem administrados pouco frequentemente e de não necessitarem de ser continuamente inoculados com o objectivo de manter as doses terapêuticas in vivo.dose will be determined according to clinical practice, but an initial dose will be about 10 to 300 ug / kg / 1-3 times a week. One of the advantages of this conjugate is that it is administered infrequently and does not need to be continuously inoculated in order to maintain therapeutic doses in vivo.

Outras terapias para HIV são empregues concertadamente com estes conjugados por exemplo, CD4 não derivada solúvel, AZT, DDC, anticorpos neutra 1izantes, imunocitotoxinas, fragmentos de gp120 e vacinas de HIV.Other therapies for HIV are employed in conjunction with these conjugates for example, soluble non-derived CD4, AZT, DDC, neutralizing antibodies, immunocytotoxins, fragments of gp120 and HIV vaccines.

Exemplo 1Example 1

Preparação de CD4-PEG usando aldeídosPreparation of CD4-PEG using aldehydes

A. Preparação de PEG-aldeídoA. Preparation of PEG-aldehyde

A oxidação de derivados de PEG (metoxi PEG 2000, metoxi PEG 5000 e PEG 20000) a aldeídos foi levado a cabo usando a modificação de Swern do processo de oxidação de Moffatt. Resumidamente, uma mistura do derivado de PEG requerido (Sigma, 10-40 mmol) e de DMSO seco (Aldrich, 5-6χ vol/peso) foi aquecida a 50-60°C para executar a dissolução do PEG sólido, deixado arefecer até o próximo da temperatura ambiente e foi adicionada a anidrido acético (0,5 ml, mmol) em DMSO seco (30 ml) sob azoto. Apôs agitação durante 30-40 hr à temperatura ambiente, a mistura foi adicionada a 5 volumes de éter anidrico. No caso de PEG20000, a adição de éter seguida de agitação vigorosa foi suficiente para causar a precipitação do produto. No caso dos derivados metoxiThe oxidation of PEG derivatives (methoxy PEG 2000, methoxy PEG 5000 and PEG 20000) to aldehydes was carried out using Swern's modification of the Moffatt oxidation process. Briefly, a mixture of the required PEG derivative (Sigma, 10-40 mmol) and dry DMSO (Aldrich, 5-6χ vol / weight) was heated to 50-60 ° C to dissolve the solid PEG, allowed to cool to o close to room temperature and acetic anhydride (0.5 ml, mmol) in dry DMSO (30 ml) was added under nitrogen. After stirring for 30-40 hr at room temperature, the mixture was added to 5 volumes of anhydrous ether. In the case of PEG20000, the addition of ether followed by vigorous stirring was sufficient to cause the product to precipitate. In the case of methoxy derivatives

de PEG, a adição de éter seguida de vigorosa agitação produziu uma emulsão oleosa. A adição de acetato de etilo (aproximadamente 100 ml) causou precipitação do produto. Os precipitados foram colhidos por filtração através de um funil de vidro com filtro de cerâmica, lavados uma vez com éter após o que foram secos sob vacuo durante a noite. A síntese dos derivados de aldeído foi confirmada usando o teste de Schiff.of PEG, the addition of ether followed by vigorous stirring produced an oily emulsion. The addition of ethyl acetate (approximately 100 ml) caused precipitation of the product. The precipitates were collected by filtration through a glass funnel with a ceramic filter, washed once with ether after which they were dried under vacuum overnight. The synthesis of the aldehyde derivatives was confirmed using the Schiff test.

B. Preparação de PEG-CD4B. Preparation of PEG-CD4

Os adeídos de PEG foram ligados covalentemente a CD4 por metilação redutora de grupos amino usando cianoborohidreto de sódio. Resumidamente, CD4 recombinante (rCD4) (CD4 com aspargina N-terminal truncado no resíduo de aminoácido 368; 40 uM) foi incubada com aldeído de PEG (1-4 mM) e cianoborohidreto de sódio (Sigma, 20 mM) em tampão HEPES 0,1M, pH 7,2 durante 2 hr a 37°C.PEG adepts were covalently linked to CD4 by reducing methylation of amino groups using sodium cyanoborohydride. Briefly, recombinant CD4 (rCD4) (CD4 with N-terminal aspargine truncated at amino acid residue 368; 40 µM) was incubated with PEG aldehyde (1-4 mM) and sodium cyanoborohydride (Sigma, 20 mM) in HEPES 0 buffer , 1M, pH 7.2 for 2 hr at 37 ° C.

Nestas condições a molécula de CD4 é substituída com cerca de 1-4 resíduos de PEG. Em alternativa, concentrações mais altas de aldeído de PEG (por exemplo, 9,5 mM) conduzem a uma molécula de CD4 com cerca de 1-10 resíduos de PEG.Under these conditions, the CD4 molecule is replaced with about 1-4 PEG residues. Alternatively, higher concentrations of PEG aldehyde (for example, 9.5 mM) lead to a CD4 molecule with about 1-10 PEG residues.

C. Purificação de CD4-PEGC. Purification of CD4-PEG

Foi purificado CD4-PEG livre de aldeído de PEG residual e rCD4 não modificada por cromatografia em coluna.Residual PEG aldehyde-free CD4-PEG and unmodified rCD4 were purified by column chromatography.

Cromatografia de filtração através de gel foi levada a cabo usando a resina AcA34 numa coluna de 2,6x100 cm, utilizando tampão fosfato salino (PBS) a uma velocidade de 0,3 ml/min. . As misturas de reacção são aplicadas directamente na coluna, sem diluição ou qualquer outro tratamento.Gel filtration chromatography was carried out using the AcA34 resin on a 2.6x100 cm column, using phosphate buffered saline (PBS) at a rate of 0.3 ml / min. . The reaction mixtures are applied directly to the column, without dilution or any other treatment.

Cromatografia de interacção hidrofóbica foi levada a cabo usando uma resina de fenil Sepharose numa coluna HR5/5FPLC (Pharmacia). Sulfato de amónio saturado foi adicionado às misturas de reacção até atingir a concentração final de 1,2 e foi aplicado numa coluna equilibrada com sulfato de amónio 1,2/um terço de tampão fosfato salino (pH 7,2). A coluna foi eluída por um gradiente de concentração decrescente de sulfato de amónio. Nestas condições, a rCD4 corre através da coluna. 0 CD4-PEG elui, sequencialmente, durante a eluição do gradiente, das menos para as mais substituídas, de tal modo que CD4-PEG com diferentes graus de substituição são recolhidos livres de outros conjugados de CD4-PEG substituídos. Nos exemplos seguintes, a CD4-PEG é preparado usando rCD4 (N-terminal ASN ou N-terminal Lis), PEG (5000 p.m.) de acordo com o exemplo 1B usando aldeído de PEG a 9,5 mM.Hydrophobic interaction chromatography was carried out using a phenyl Sepharose resin on an HR5 / 5FPLC column (Pharmacia). Saturated ammonium sulphate was added to the reaction mixtures until reaching the final concentration of 1.2 and was applied to a column equilibrated with 1.2 ammonium sulphate / one third of phosphate buffered saline (pH 7.2). The column was eluted by a gradient of decreasing ammonium sulfate concentration. In these conditions, rCD4 runs through the column. The CD4-PEG elutes sequentially during the elution of the gradient, from the least to the most substituted, in such a way that CD4-PEG with different degrees of substitution are collected free of other substituted CD4-PEG conjugates. In the following examples, CD4-PEG is prepared using rCD4 (N-terminal ASN or N-terminal Lys), PEG (5000 p.m.) according to example 1B using 9.5 mM PEG aldehyde.

Exemplo 2Example 2

Ligação a gp120 de CD4-PEGBinding to CD4-PEG gp120

A capacidade de rCD4 e CD4-PEG para ligar a gp120 é medida num ensaio ELISA de competição. Resumidamente, placas de 96 poças são revestidas com rCD4 por incubação durante a noite. A gp120 é então incubada em vãrias concentrações molares de rCD4 ou CD4-PEG e a mistura de reacção é incubada nos poços revestidos com rCD4. Após lavagem, a quantidade de gp120 ligada aos poços revestidosThe ability of rCD4 and CD4-PEG to bind to gp120 is measured in a competition ELISA assay. Briefly, 96-well plates are coated with rCD4 by overnight incubation. The gp120 is then incubated at various molar concentrations of rCD4 or CD4-PEG and the reaction mixture is incubated in wells coated with rCD4. After washing, the amount of gp120 attached to the coated wells

com rCD4 foi determinada por incubação com um anticorpo anti-gp120 ligado a uma enzima. A capacidade de rCD4 e CD4-PEG para competir pela ligação a gp120 foi determinada por este ensaio. A capacidade de rCD4 para competir com gp120 (quer com um aminoácido ASN ou Lis N-terminal) quando modificada covalentemente com 1-10 moléculas PEG, foi reduzida três vezes, aproximadamente.with rCD4 was determined by incubation with an anti-gp120 antibody bound to an enzyme. The ability of rCD4 and CD4-PEG to compete for binding to gp120 was determined by this assay. The ability of rCD4 to compete with gp120 (either with an ASN or N-terminal Lys amino acid) when covalently modified with 1-10 PEG molecules, has been reduced approximately three times.

Exemplo 3Example 3

Semi-vida de CD4-PEGCD4-PEG half-life

A semi-vida em plasma de rCD4 e CD4-PEG foi determinada por injecção intravenosa de coelhos brancos da Nova Zelândia. Foram injectados intravenosamente 100 ug/kg de CD4-PEG (com um aminoácido N-terminal ASN ou Lis) e as concentrações de CD4 no plasma foram determinadas por ELISA a vários tempos após a injecção. A semi-vida terminal de rCD4 não derivado, em coelhos, foi de 15 min., aproximadamente. Em contraste, estudos de cinética e a análise de eluídos de filtração através de gel demonstram que CD4-PEG possui uma muito mais prolongada semi-vida com duas principais subpopulações. A semi-vida terminal de cerca de 60% do CD4-PEG foi de 4-8 hrs, mais cerca de 20% de CD4-PEG possui uma semi-vida terminal de 25-50 hrs. 0 material com semi-vida mais longa estava mais fortemente substituido, mas em contraste, possuia menos capacidade de ligação a gp120. Finalmente, demanstram-se que o CD4-PEG de semi-vida longa, estava presente no plasma de coelho passado um dia e ainda mantinha a capacidade para ligar à protéina de envolucro de HIV, gp120.The plasma half-life of rCD4 and CD4-PEG was determined by intravenous injection of New Zealand white rabbits. 100 µg / kg of CD4-PEG (with an N-terminal amino acid ASN or Lys) was intravenously injected and plasma CD4 concentrations were determined by ELISA at various times after injection. The terminal half-life of non-derivative rCD4 in rabbits was approximately 15 min. In contrast, kinetic studies and the analysis of filtration elutes through gel demonstrate that CD4-PEG has a much longer prolonged half-life with two main subpopulations. The terminal half-life of about 60% of CD4-PEG was 4-8 hrs, plus about 20% of CD4-PEG has a terminal half-life of 25-50 hrs. The material with a longer half-life was more strongly replaced, but in contrast, it had less binding capacity to gp120. Finally, it is shown that the long half-life CD4-PEG was present in rabbit plasma after one day and still retained the ability to bind to the HIV wrapping protein, gp120.

-23Exemplo 4-23Example 4

Cd4 modificada por dextrano ou sulfato de dextranoCd4 modified by dextran or dextran sulfate

Misturou-se dextrano ou sulfato de dextrano (2,5 g) em água (250 ml) com pH 10,7 ajustado com hidróxido de sódio, com brometo de cianogeneo (0,8 g em três aliquotas). Após 1 hr de agitação vigorosa (com o pH mantido a 10,5-11 por adição de hidroxido de sódio), a mistura é dializada contra uma solução 0,2 M de carbonato de sódio pH 9,0 a 4°C. As soluções activadas de dextrano ou sulfato de dextrano são então incubadas com rCD4 e a ligação ê levada a cabo durante 12-24 horas a 4°C.Dextran or dextran sulfate (2.5 g) was mixed in water (250 ml) with pH 10.7 adjusted with sodium hydroxide, with cyanogen bromide (0.8 g in three aliquots). After 1 hr of vigorous stirring (with the pH maintained at 10.5-11 by the addition of sodium hydroxide), the mixture is dialyzed against a 0.2 M solution of sodium carbonate pH 9.0 at 4 ° C. The activated dextran or dextran sulfate solutions are then incubated with rCD4 and binding is carried out for 12-24 hours at 4 ° C.

Exemplo 5Example 5

CD4 modificada por FicolCD4 modified by Ficol

Ficol (P.M. 400000; 1 g) em água (100 ml) é activado com brometo de cianogénio (0,5 g) como descrito acima. 0 Ficol activado é então ligado a CD4 a pH7-9, a 4°C durante 12-24 horas.Ficol (P.M. 400000; 1 g) in water (100 ml) is activated with cyanogen bromide (0.5 g) as described above. The activated Ficol is then bound to CD4 at pH7-9, at 4 ° C for 12-24 hours.

Claims

1 ³ . - Method for the synthesis of a water-soluble CD4 conjugate and a hydrophilic non-protein polymer, characterized in that it comprises the covalent cross-linking of CD4 with a hydrophilic, non-proteinaceous polymer.

2-. Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized in which the polymer is polyethylene glycol or methoxypropylene glycol.

3 ³ . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized in which the polymer is polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyoxyalkylene or a block of a copolymer formed by polyoxyethylene and polyoxypropylene.

4 ³ . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized in which the polymer is different from an oligosaccharide.

5 ³ . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized where the polymer is an oligosaccharide which is covalently linked to the CD4 antigen at a site other than the native glycosylation site attached to the N-terminus.

-256 ^a . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized in which the polymer is covalently linked to CD4 through a lysine residue or the N-terminal amino group of CD4.

7 ^a . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized which is replaced by about 1 to 10 moles of polymer.

8 ^a . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized in which CD4 is free from the transmembrane domain of CD4.

9 ^a . Method according to claim 8, characterized in that a conjugate is synthesized in which CD4 includes an immunoglobulin sequence.

10 ^a . Process for preparing a therapeutically effective dose of the conjugate of claim 1, characterized in that said conjugate is included in a sterile and physiologically acceptable solution.

11 ^a . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate of CD4 and polyethylene glycol or methoxypolyethylene glycol is synthesized.

12 ^a . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate of CD4 and polyethylene glycol or methoxypolyethylene glycol is synthesized which has a substantially homogeneous molar substitution by polyethylene glycol or methoxypolyethylene glycol.

13 ^â . Method according to claim 12, characterized in that a conjugate is synthesized which is replaced by about 1 to 10 moles of polyethylene glycol or methoxypropylene glycol per mole of CD4.

14 ³ . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized in which CD4 is covalently bound to the polymer.

15 ⁵ . Method according to claim 1, characterized in that a conjugate is synthesized in which CD4 is covalently linked to the polymer through a CD4-substituted oligosaccharide.

16 ³ . - Method for the purification of a conjugate of CD4 and polyethylene glycol, characterized by comprising the adsorption of the conjugate on a hydrophobic intercept resin and the elution of the conjugate with decreasing concentrations of salt.

17 ³ . - Method for the synthesis of a CD4 conjugate with a non-protein polymer substituted by aldehyde, characterized by comprising methylation with cyanohydride of a reaction mixture containing CD4 and the polymer.

18 ³ . - Method for the synthesis of a water-soluble conjugate of a glycoprotein and a non-protein polymer, characterized in that the polymer is bound

-27covalently to g 1 icoprotein via a glycoprotein oligosaccharide.

19 ³ . Method according to claim 18, characterized in that a conjugate is synthesized in which the polymer is polyalkylene glycol or polyoxyalkylene.

20 ⁵ . Method according to claim 18, characterized in that a conjugate is synthesized in which the polymer is soluble in water.

21 ³ . Method according to claim 18, characterized in that a conjugate is synthesized in which the polymer is only conjugated through an oligosaccharide.