PT92371A - Defective wing medfly sex selection - Google Patents
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Description
TITULAR: HAWAII MEDFLY BIOTECHNOLOGY PARTNERS EPÍGRAFE: "UM MÉTODO PARA REDUZIR A POPULAÇÃO DE MOSCAS MEDITERRÂNICAS FÉRTEIS"
MEMÓRIA DESCRITIVA
INTRODUÇÃO
Campo Técnico A presente invenção refere-se à produção de moscas mediterrânicas machos esterilizadas, sem moscas fêmeas, utilizando para tal lesões genéticas para separação.
Antecedentes Técnicos da Invenção A mosca Mediterrânica da fruta (mosca mediterrânica), Ceratitis capitata (Wiedemann), é uma das principais pestes agrícolas das regiões temperadas e sub-tropicais de todo o mundo. A mosca mediterrânica ataca cerca de 150 variedades de colheitas de frutos cultivados. É encontrada em todo o mundo, numa vasta variedade de climas. A prática de controlo corrente na maioria das áreas, consiste no uso de "sprays" para atrair, i.e., um produto atraefcivo tal como o 1 > hidrolisado de levedura misturado com um insecticida tal como o malatião. Em adição, o "United States Department of Agriculture" utilizou o método de libertação de insectos estéreis (SIRM) na Califórnia e no Texas e participou em, ou consultou o SIRM na América Central e noutros locais no mundo. 0 SIRM teria uma maior utilização mundial se não existissem vários problemas actuais e potenciais. As fêmeas libertadas, apesar de estéreis, picarão e partirão os frutos, enquanto tentam desovar, permitindo a entrada de organismos degradados e causando danos consideráveis, por vezes até graves. 0 grande número de fêmeas estéreis libertadas em conjunto com machos estéreis, em que não há separação, pode monopolizar as fecundações com machos libertados, necessários para o controlo estéril de fêmeas férteis selvagens. Existem provas de que as fêmeas estéreis se acasalam mais facilmente com machos estéreis (acasalamento intra estirpe), do que com machos selvagens (acasalamento inter estirpe). Como as fêmeas libertadas são superiores em número às fêmeas selvagens num rácio de 50 para 1, serão as primeiras a estar implícitas na maioria dos acasalamentos por machos libertados. Este decréscimo na possibilidade de acasalamentos, entre machos estéreis e fêmeas férteis nativas, reduz enormemente a' eficácia do SIRM.
Seria, portanto, interessante proporcionar um método eficaz de separação d,os machos estéreis das fêmeas estéreis. Um método sexual genético iria não só ajudar a evitar os problemas acima descritos, como também poderia adiccionar vários benefícios de interesse a um programa do SIRM. As tecnologias de esterilização poderiam inclinar-se no sentido de maximizar os machos estéreis, independentemente do efeito nas 2 i
fêmeas, de modo a que a competitividade dos machos fosse mais fácil de melhorar. Poderia ser proporcionado, nalguns programas, um marcador genético capaz de identificar libertações inadvertidas de machos férteis, como resultado de uma falha acidental, para esterilizar e reduzir as oportunidades de falhas inexplicáveis de alguns programas.
Literatura Relevante
Foram desenvolvidos métodos genéticos de selecção sexual, em várias espécies de insectos, incluindo mosquitos (Curtis et al., (1976) Mosquito News 36:492-498; Seawright et al., (1978) Science 200:1303-1304) e moscas (McDonald (1971) Science 172:489., Robinson and van Heemert (1981) Theoretical and Applied Genetics 59:23-24). Vários cientistas estão presentemente a tentar desenvolver um sistema genético de selecção sexual para capitata (Robinson and van Heemert (1982) Genetica 58:229-237).
Robinson and van Heemert (1981) demonstraram um modelo para selecção sexual genética em Drosophila melanogaster utilizando genes letais condicionais e deslocações do autossoma Y. Ver também Robinson (1984) Genetica 62:209-215.
Saul (1982) Ann. Entomol. Soc. Am. 75:480-483 e Saul (1984) Ibid 77:280-283 descreve a mutação com boas prespectivas para utilizar na selecção sexual genética da mosca dos frutos, Mediterrânica. Para revisão genética da mosca dos frutos mediterrânica, ver Saul, Agric. Zoology Rev. (1986) 1:73-108. - 3 -
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A selecção sexual genética da mosca da fruta mediterrânica é proporcionada através da utilização de um mutante asa em v e de uma translocação do autossoma Y envolvendo o locus asa em v de tipo selvagem. É feito o acasalamento de machos do fenótipo de asa normal resultante duma translocação do autossoma Y . com fêmeas tendo a mutação asa em v e, em seguida, o acasalamento da descendência de machos com fêmeas do fenótipo de asa em v. A propagação da descendência daí resultante, que exibia o traço asa em v nas fêmeas, e asas normais nos machos, produziu uma cadeia seleccionada compreendendo machos de fenótipo de asas tipo selvagem, e fêmeas do fenótipo asa em v atrofiado. As moscas daí resultantes podem ser esterilizadas por irradiação e, quando libertadas para o ambiente, as fêmeas separam-se dos machos pela sua incapacidade de voar.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ESPECÍFICAS
Os métodos para selecção sexual genetica da Ceratitis Capitata (mosca mediterrânica) e as moscas mediterrânicas resultantes, são efectuados para controlar a quantidade de moscas mediterrânicas num ambiente sujeito à sua infestação. 0 método envolve a obtenção de conjuntos de moscas mediterrânicas machos e fêmeas para reprodução, em que os machos têm o fenótipo de asa normal, e inclui uma translocação do autossoma Y envolvendo um braço do autossoma contendo os genes ap e dc com cromossoma Y, onde o gene halelo tipo selvagem do fenótipo do gene de mutação de asa em v, está envolvido numa translocação com o cromossoma Y. 0 macho do fenótipo de asa normal contendo a translocação cromossomal Y, é acasalado com fêmeas de asa em v homozigótica, As linhas podem ser então propagadas, e reproduzidas ao longo de uma pluralidade de gerações, em que a descendência apenas contém machos com o fenótipo de asa normal e fêmeas com o fenótipo de asa em v. A descendência contendo moscas de ambos os sexos, pode ser esterilizada, de acordo com modos convencionais, por exemplo, radiação gama, empregando uma dose completa de pelo menos 10, normalmente 15 Krads. 0 mutante de asa em v pode ser obtido numa variedade de formas. Em particular, a selecção de rotina de "stocks" de laboratório pode revelar o mutante de asa em v. Alternativamente, os "stocks" de moscas podem ser mutagenizados por técnicas Standard, que incluem, não sendo no entanto limitadas pelo seguinte:
As moscas mediterrânicas podem ser irradiadas com dosagens na medida de cerca de 2 a 8 Krad para induzir mutações, seguidas por acasalamento e selecção da descendência para o fenótipo de asa em v. As larvas podem ser submetidas a uma vasta variedade de mutagénios tais como a nitrosoguanidina, metanosulfonato de metilo, formalina, e outros, e as moscas daí resultantes são seleccionadas para o fenótipo de asa em v.
Alternativamente, os embriões podem ser transformados com elementos transponíveis do tipo P, que incluem um marcador selectivo. A introdução do elemento do tipo P no embrião pode ser feita por injecção, uaando-se solução de cloreto de potássio tamponada por fosfato, tendo cerca de 50 a 500 pg/ml de DNA do elemento do tipo P. Os embriões que contém o elemento do tipo P são detectados pela resistência a um meio selectivo. A resistência pode ocorrer face a um agente citotoxico , tal como um antibiótico, metotrexato, metal pesado ou outra toxina. Os elementos transponíveis do tipo P estão disponíveis para utilização com alguns dí-pteros. Através da transformação de um número suficiente de embriões, pode seleccionar-se a descendência para a mutação de asa em v. Isolando-se o DNA genómico e seleccionando-o para fragmentos acarretando o transposão , pode definir-se o locus no qual o gene proporcionando o fenótipo de asa em v está presente. (M. G. Kidwell, 1986, P-M Mutagenesis in: Drosophila, A Practical Approach, ed. D.B. Roberts, IRL Press, Washington, D.C.)
Outro método envolve a utilização de DNA do "stock" de translòcaçãpí/je do "stock" de asa em v homozigptico. 0 DNA é isolado pelo método de Poustka e Lehrach, Trends in Genetics (1986) 2:174-179. 0 DNA é clonado para um património cosmídico de 40 kb de grande inserção. Os clones são sondados com o total de DNA de cromossoma Y de mosca mediterrânica, isolado por um seleccionador de células activado por fluorescência baseado na fluorescência do cromossoma Y. 0 património é re-sondado com o total de DNA genómico de mosca mediterrânica ou com o DNA do cromossoma x mais o autossoma contendo o gene de asa tipo selvagem^ complementar ao mutante tipo V, que pode ser obtido por selecção de células, activada por fluorescência. Os clones que hibridizam para ambas as sondas contêm os pontos de junção da deslocação. - 6 - .lESSSS»
Utilizando-se clones identificados como tendo os pontos de junção da translocação , o cromossoma autossoma do mutante de asa em v é levado da junção para o gene de asa em v, através das técnicas descritas em Poustka e Lehrach, supra. Os clones obtidos no procedimento são utilizados para transformar moscas de tipo selvagem.
Os clones que são específicos para a mosca mediterrinica mutante de asa em v são transformados em larvas tipo selvagem, de acordo com o procedimento descrito em Rubin e Spaulding, Nucleic Acids Res. (1983) 11:6341-6351, Ver também Thomas et al., Nature (1986) 324:34-38; Song et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1987) 84:6820-6824., e Patente Norte-Americana N9 4, 745, 051. As larvas transformadas resultantes multiplicam-se, acasalam-se e a sua descendência é seleccionada para o fenótipo de asa em v. 0 acasalamento é repetido até se obter uma mosca mediterrânica fêmea estável honozigptica , para o fenótipo de asa em v.
De particular interesse é um mutante possuindo expressão génica condicional ou dependente da temperatura. Isto é, o fenótipo de asa em v pode ser variável a uma temperatura e uniformemente extremo a uma temperatura diferente. 0 mutante de asa em v, utilizado na presente invenção, proporciona cerca de 10 a 20% de moscas mediterrânicas com vestígios de asas, quando criadas a temperatura ambiente, enquanto que 100% das moscas têm asas curtas e são absolutamente incapazes de voar quando criadas a 30°C.
As larvas podem crescer num recipiente de comida de larvas convencional. Os meios nutrientes convencionais incluem normalmente uma - 7 - base de farelo de trigo com sacarose, levedura, um fortificante vitamínico, assim como outros aditivos. Os adultos podem ser alimentados com sacarose, hidrolisado de levedura, hidrolisado de caseína, e como é apropriado, aminoácidos essenciais, ex: L-metionina.
As pupas são irradiadas para esterilidade, um dia antes da eclosão adulta. A esterilidade pode ser obtida por irradiação numa dose total de cerca de 18 Krads de irradiação gama, numa atmosfera de nitrogénio. As moscas da fruta estéreis resultantes podem ser então introduzidas no ambiente a proteger, de acordo com métodos convencionais. Preferivelmente, as moscas podem ser colocadas num contentor aberto, donde as fêmeas estão impossibilitadas de voar, ficando agarradas às paredes do contentor, enquanto os machos podem abandonar livremente o contentor. Os machos estéreis podem então competir com os machos de tipo selvagem, pelas fêmeas férteis, de modo a diminuir substancialmente a população de moscas mediterrânicas.
Os exemplos que se seguem são oferecidos como forma de ilustração e não como meio de limitação.
MATERIAIS E MÉTODOS 0 mutante de asa em v a. Descrição 0 "stock" de asa em v foi produzido a partir de uma única - 8 -
I mosca fêmea após uma selecção de rotina de "stocks" de laboratório. Após ser produzido um grupo de moscas usado para reprodução, os cruzamentos revelaram que este mutante aparentemente espontâneo é um autossómico recessivo localizado no mesmo cromossoma que os genes ap e dc. b. Expressão dependente da temperatura
As moscas de asa em v homozigpticas criadas a temperatura ambiente (22-25eC) apresentam uma vasta gama de expressões fenotípicas, de uma pequena percentagem de moscas com asas essencialmente de tipo selvagem, de 10 a 20%vcom apenas vestígios de asa. A 30°C, 100% das moscas têm apenas asas curtas e estão totalmente incapacitadas de voar.
CONDIÇÕES DE CRIAÇÃO PARA A INDUÇÃO DE TRANSLOCAÇÕES 0 "stock" usado nas irradiações é derivado de um "stock" Standard de laboratório mantido no Departamento de Entomologia, Universidade de Hawaii, durante 20 a 50 gerações de cultura de laboratório. Todas as experiências foram efectuadas a 23*0 (média 22-27°C) e 67-75% (RH) de humidade relativa. 0 alimento das larvas consistia de 250 g de sacarose, 250 g de levedura Torula, 500 g de farelo de trigo e 10 g de fortificante vitamxnico Vanderzant para insectos (U.S. Biochemical C0.), 1 1 de água destilada contendo 15 ml de HC1 conc. e 10 ml de uma solução contendo 750 mg de metiloparabeno e 1 g de ácido ascórbico dissolvido em 95% de etanol. Os adultos foram - 9 - alimentados com uma mistura de 72 g de sacarose, 12 g de hidrolisado de levedura enzimática, 12 g de hidrolisado de caseína enzimática, 250 mg de L-metionina. Deixou-se a mistura absorver a humidade do ar durante 12 horas antes de usar.
IRRADIAÇAO E ISOLAMENTO DE TRANSLOCAÇÕES
As translocações foram produzidas pela irradiação, por 24-48 horas, de moscas macho velhas no ar com uma dose de 4800 rads no "Hawaii Research Irradiator" (fonte 60-cobalto). 0 esquema de acasalamento para isolar as translocações do autossoma Y, seguiu-se ao plano usado por Saul (1984). Após a irradiação, os machos foram retidos por 1 dia e depois acasalados em massa com fêmeas de asa em v virgens. Cada descendente macho deste acasalamento foi acasalado com várias fêmeas de asa em v. Estes cruzamentos, que originaram descendentes sugestivos da translocação pretendida, i.e., todos os machos do tipo selvagem e as fêmeas de asa em v, foram poupados e propagados. Foi provado que uma linha (# 28) das primeiras 102 linhas de machos tem a translocação de autossomas Y exibindo a herança de ligação Y do halelo de asa em v de tipo selvagem. Linhas adicionais estão ainda a ser investigadas. - 10 -
RESULTADOS
GRUPOS DE MOSCAS USADOS PARA REPRODUÇÃO
Uma linha apenas produziu machos asa em v+ e fêmeas de asa em v de uma série de 102 F1 acasalamentos par. Esta linha (#28) foi reproduzida durante 4-5 gerações e é estável. Quando criada a temperatura ambiente, a linha#28 produz 100% de machos de tipo selvagem com asas normais e fêmeas que têm todas asas v, mas com a gama de expressões características deste fenótipo. Quando criados a 30°, os machos são novamente 100% de tipo selvagem. No entanto, as fêmeas têm 100% asas curtas e são totalmente incapazes de voar. Isto significa que, quando são criadas a uma temperatura mais alta, mas a uma tal temperatura de criação que é facilmente mantida para a libertação em massa, os machos estéreis poderão dispersar, imediatamente após o aparecimento de moscas adultas, para o meio ambiente onde podem ser inteiramente eficazes para o programa SIRM. As fêmeas, após a eclosão, estarão incapacitadas de dispersar para além dos locais de libertação e, portanto, não poderão acasalar com os machos libertados, nem danificar os frutos nas árvores. Isto leva a uma remoção essencialmente completa dos efeitos nocivos de libertação em massa das moscas fêmeas.
De acordo com a presente invenção, é proporcionado um método de selecção sexual genética de moscas mediterrânicas, em que as fêmeas são produzidas com uma deficiência física que permite a separação automática de fêmeas e machos e impossibilita as fêmeas de afectar os - 11 frutos e de acasalar em larga escala com os machos estéreis. Através do uso de um mutante tendo um fenótipo de asa não-funcional, como a estirpe da fêmea, que é cruzada com uma estirpe do macho, tendo uma translocação de autossomas Y com o gene de tipo selvagem análogo ao gene do mutante de asa em v, pode produzir-se e esterilizar-se a descendência, com separação automática dos sexos. Desta forma pode conseguir-se através do uso do SIRM, uma proteção eficaz contra o dano causado pelas moscas mediterrânicas na comunidade.
Todas as publicações e pedidos de patentes citados nesta especificação estão aqui incorporados como referência, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especifica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.
Apesar da presente invenção ter sido descrita com algum detalhe como forma de ilustração e exemplo com fins de clareza de entendimento, será imediatamente evidente para os peritos nesta arte, à luz dos ensinamentos desta invenção, que podem ser feitas algumas alterações e modificações sem se partir do espírito ou âmbito das reivindicações anexas. 12
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES 1- Um método para reduzir a população de moscas mediterrânicas férteis numa região sujeita à infestação pelas mesmas, caracteri-zado pelo facto de compreender: o crescimento duma colónia de moscas mediterrânicas carac-terizadas por um fenotipo de fêmeas de asa-v homozigóticas, e um fenotipo de macho de tipo selvagem; e esterilização da mesma colónia; e libertação das moscas mediterrânicas esterilizadas para a mesma região.
- 2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, carac-terizado pelo facto de o macho de asas de tipo selvagem compreen- 13 der uma translocação do autossoma-y compreendendo o halelo tipo selvagem referido do gene fenotipo de asa-v.
- 3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caraç terizado pelo facto de compreender,a referida libertação, a colo cação de moscas mediterrânicas machos e fêmeas num receptáculo na dita região, do qual as moscas estão impossibilitadas de sair.
- 4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 2, caraç terizado pelo facto de a translocação de autossomas-y ser um resu_l tado da irradiação de moscas mediterrânicas de tipo selvagem.
- 5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caraç terizado pelo facto de a expressão do referido fenotipo asa-v estar condicional à temperatura,e de o referido crescimento estar a uma temperatura restrictiva para o fenotipo asa-v.
- 6- Um método de atribuição de sexos por via genética a moscas mediterrânicas por meio de um fenotipo asa-v, caracterizado pelo facto de compreender: a mutagenização de moscas mediterrânicas machos para prodç zir uma translocação de autossomas-y do gene fenotipo do tipo selvagem do gene fenotipo de asa-v referido; o acasalamento das referidas moscas mediterrânicas machos mutagenizadas com moscas mediterrânicas fêmeas de fenotipo asa-v Immozigóticas, e; o cruzamento da descendência resultante desse acasalamento para produzir uma linha estável de fêmeas fenotipos asa-v, e de machos de asas tipo selvagem. 14 J Lisboa, 22 de Novembro de 1989- 15 -
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