PT87557B

PT87557B - Processo para a preparacao de dna de cadeia dupla

Info

Publication number: PT87557B
Application number: PT87557A
Authority: PT
Inventors: Eugen Uhlmann; Friedrich Hein
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-05-23
Filing date: 1988-05-23
Publication date: 1992-09-30
Also published as: ATE95563T1; EP0292802A3; DK277888A; EP0292802A2; JP2661959B2; DE3884669D1; DE3717436A1; PT87557A; ES2059432T3; EP0292802B1; JPS63304989A; DK175230B1; DK277888D0

Description

A invenção refere-se a u® prooeeao eficaz para a preparação de fragmentos de DKa e de genes que, devido ao método de trabalho fácil e raoional permite tsmbém a síntese de sequdnoiaa de DKA oo* grande comprimento.

método corrente para a preparação de DKA de cadela dupla consiste en ae sintetizar quimicamente ollgonuoleétidoe de cadela simples, ooalesoentes entre ai, e ae transformara* estes por melo do emparelhamsnto natural das bsses, por aoção da DHA-Ligase, na forma biheliooidal (H. G. Khorana (1979) Solenoe 203, 614-625). Uma alternativa ao método de Khorana é o chamado prooeeao fill-in, no qual ae utiliza a propriedade de reparação da DKA-polimeraae. Neste prooeeao empregam-se dois oligonuoleétidoe de cadela aiaplea, sintetizados quimicamente, que possuem a* conjunto» nos eeue extreraoa 3*, uma curta região de eequênolas de nucleétldoa complementares (J. J. Rosei et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 9226-9229). 0 primeiro método tem a

- 1 deavantagem de ae ter aempre de sintetizar por via química ae duas cadelas do DMA de cadela dupla, tendo de aintctlzar-β· pelo menos trde oligOHUCledtldoe, em geral contudo um maior número de ollgonuoledtldos, e ligá-los por via enzimática. 0 dispêndio elntátloo 4 na verdade reduzido no processo fill-in em compa* raçdo oom o método de Khorana, mas empregam-se pelo menoe dois ollgonuoledtidos. grande problema 4, alám diaao» a complemsntaçSo doe dela ollgonuoledtldoa em relaçfic a uma eatrutura híbrida definida. Quanto male compridos eSo os ollgonuoledtldoe utlllsadoe maior 4 o perigo da conetruçlo de híbrido· erradoe.

processo de acordo com a invençflo para a preperaçfio de MIA de oadela dupla nfio eet4 sujeito a eeta desvantagem. Be acordo oom a lnvençfo efectua-se a aínteee de um DMA de oadela elmplee com uma estrutura de gancho de cabelo-(halrpln) num dos extremos ou em ambos oe extremos, preenchem-se oa nucleá tidos complementares e ebre-ee e estrutura de gancho de cabelo, ou estruturas de gancho de cabelo ou cindea-ee estas.

A figura iluetra uma forma de eoneretlzaçfo especial da lnvençdot (1) representa uma oadela elmplee de D»A com uma estrutura de gancho de cabelo no extremo 3* na qual, na zona das baeee emparelhadae (aeeinalede por traçoe perpendiculares), ae encontra uma poslçlo de corte para um enzima de reetrlçdo (assinalada por uma pequena eeta).

(2) representa a oadela de BMa obtida apde o corte oom o enzima de reetrlçdo, que apresenta no extremo 3* ume ourta aequdnola com baaea emparelhadas (traçoe perpendiculares) e com 0 extremo aguçado oaraoteríetioo para o enzima de reetrlçdo.

(3) representa uma outra cadeia elmplee de BNA com uma estrutura de gancho de cabelo no extreno 3*, que contém no extremo 5* bases que elo oonpleaentaree &e do extremo aguçado de (2).

(4) repreeenta o produto de ligação de (2) e (3).

(5) repreeenta a oadela dupla preenchida obtida a partir de (4).

A invenção permite una série de coneretlzaçães que eerão, en seguida· esclarecidas nale detalhadamente ou definidas nas rslvlndleaçães da patente. Deste atodo, quando no que ee segue· ee referlren fomes de apresentação Isolada nuna forna en que· por exenplo· se citar apenas una estrutura de gancho de cabelo· esta forna de expreseão será apenas una simplificação e de nodo algun exolulré uns variação ou oonblnação eon outras forni» de apresentação.

Una concretização preferencial da invenção consiste en sintetizar en primeiro lugar un oligonucleétido que possui no seu extreno 3* una curta repetição invertida na aequãnoia. Isto leva a que este oligonucleétido ee dobre no eeu extreno 3*» tonando assln a forna definida de una estrutura de gancho de oabelo. Por exenplo· o oligonucleétido (l) da figura· tona a estrutura de gancho de cabelo apresentada na Tabela 1 en anexo. 0 extreno 3' hlbrldlzado deste nodo funciona então oono prlmer para 0 preenchimento da segunda cadela de WA« Desoobrlu-se que eatee híbridos con una estrutura de gancho de cabelo são extraordinariamente estáveis e ee formen preferencial mente. A Invenção possibilita assln a eíntese de eetruturae de DIA de cadela dupla con 0 comprimento desejado, sendo apensa neoeeeérlo sintetizar una única cadela elnples de oligonucleétido ou de pollnucleétido. 0 comprimento da cadela dupla está pratieanente limitado apenas pelas possibilidades de síntese da oadela slnples· que continua» e eer desenvolvidas. Para a síntese da cadela slnples referem-se todoa os métodos conhecidos, e» particular com vantagem 0 método dos triésteres do écido fosfórico os o método da foefite.

Conforme o caso, podem preparar-se polinucleétidos compridos de cadeia simples por lig&çfio de fragmentos, Oa oligonuoleÓtldos ou pollnucleótidos podem derivar-se da cadeia de DBA ©edificante ou nSo codiftoante e empregar-se na forma 5* *

-hidróxi ou de fosfato.

preenchimento para se obter a cadeia dupla de DBA efectua-se de acordo com métodos em si conhecidos, líuma concretização particular da InvençSo podem ainda empregar-se contudo primer* mutagénicoc, por meio doo quais» partindo de um único oligonucleótido sintetizado e do correspondente primer* se podem obter as variações desejadas da sequência de DBA. Obtêm-se deste modo» sem o que seria necesaário uma clonegem em fagos de cadeia simples» oerca de 50 j» de tratantes. De acordo oom este método podem fazer-ee as mutações - troca de bssss, ellmlnaçfio ou ineerçSo - desejadas. Uma revisão dos métodos conhecidos encontra-se em &. Smith (1985)> Annu. Rev. Gsnet. 19. 425-462.

Pode também empregar-se a mutagénese de false lnoorporaçSo (M. Sing et al. (1986) Prot. Bngln. 1, 75*76) bem oomo a mutagénese de satureçSo (K. Derbyshire et al. (1986) Gene 46, 145-152).

Uma vez que a estrutura de gancho do cabelo nio é apropriada pera o acoplamento oom um outro fragmento de DBA, por exemplo oom um vector» abre-se esta estrutura ou olnde-se oom a ajuda de um enzima de restriçSo. Prevêem-se posições de reeonhseimento adequadas, neste caeo» na síntese ds cadeia simples. Bvidentemeats que também ae podem modificar, por um processo em si conhecido» os extremos resultantes da abertura da estruture em gancho de cabelo» por exemplo por degraçSo ou por enchimento podem tomar-se côncavos, ou podem modificar-se por meio de adaptadores ou de agentes de llnoagem. Beste contexto, o processo de acordo oom a InvençSo permite também uma ? .ptaçSo às

várias necessidades. Por exemplo, podem lntrodurir-se tcrbáw poslçdes de reconhecimento para enzimaa de reatriçSo dc classe IXB, os chamados shifters* (W. Szybaleki (1985) Cene 40, 169” -173)· Por aolo de corte do DMA de cadela dupla com estes enzimes reaovea-se de novo as posiçdes de reconhecimento, de aedo que oe fragmentos poseea ser combinados nas poaíçffea desejadas, λ introduçlo de uaa ou aals poslçBes de reconhecimento para ua enzima de restriçío antes da repetiçSo invertida permite tnmhám wes análise de restriçfo para confirmar ee se obteve a estrutura pretendida.

Se se previrem, de acordo coa a InvençSo, estruturas de gancho de cabelo ea aabos os extremos, introduzem-ee por convenldnola várias posiçSee de reconhecimento para enzimea de restriçío. pois pode entío preparar-se ua fragmento de gene que se pode introduzir adequedamente numa construçSo de vector.

A aodifioaçSo da estrutura sa gancho de cabelo pode taabáa efectuar-se por aolo de abertura coa uaa nuolease espeoífloa para cadeias simples como a nuolease ttung Boan* ou a nuclsass 81.

comprimento da repetiçSo invertida» que conduz por isso & cadeia dupla» á variável o compreende de preferdncia 8 a 60 baooo» ea especial 12 a 32 bsees, correspondentes a 4 a 30 eaparelhaaontos de bases» ea especial a 6 a 16. 0 número daa bases nSo emparelhadas na zona do loop da estrutura ea ganche da cabelo á também variável e á de preferdncia 0 (llgaçSo covalento directa) a 6.

8o se construir uaa estrutura em gancho de cabelo coa poslçSoo de corto por enxlaos do restriçfio oorrootaaente situadas (1). produzem-se extremos aguçados apés clsSo da estrutura sa gancho de cabelo coa este enzima (2)» que podea ser utilizados para s llgaçSo coa ua outro ollgonuoleétldo (3). Una dupla cedeis curta eventualmente restante na zona do llgaçSo do polinuoleétido comprido obtido (4) pode remover-je, conforme o

- 5 oaao, por deanaturaçSo tárnlca, ao oaao de se pretender efectuar «aa autagáneae neata regido.

Uaa outra conoretlaaçSo vantajosa da InvençSo consiste ao faoto de reaultar uaa aaroaçSo do enchimento para a eadeia dupla. Por eate prooeaao aSo partloularmente acessível· fragmento· de DIA aarcadoe ea vária· posições. Oa fragaentos de DIA seroados, altaaeate reaotlvoa, obtidoa deate aodo, aSo átele ~ apõa deanaturaçSo - eoao eondas de hlbridaçSo ou aondaa geaátleaa.

Verlfloa-ae aaela que o prooeaao de aoordo coa a InvençSo pode aer executado de uaa aaneira extraordinariamente versátil, permitindo a aínteae de fragaentoe de DIA de cadela dupla da grande coapriaento, coa ua número mínlao de paeaca reaoolonala.

Oa exeaploa seguintes destinas*·· a ilustrar a InvençSo aala ea poraenor. Salvo lndloaçSo ea contrário oa dados percentuais referidos eSo ponderais.

Ixaaploa

1. Sfnteae química de ua ollgoBuoleátldo de cadeia elaples

Io exemplo do ollgonuoleõtldo 1 (Tabela l) Ilustra*·· a aínteae doa componente· do DIA, Para · aínteae ea fase cálida utillaa-ae o nuoleásldo exlatente no extremo 3*, no oaao presente a tiaidlaa (nuoleátldo nt 130), ligado de aodo oovalente a ua suporte atravás da funçSo 3·-hidroxilo. 0 material de suporte á CPG (Controlled Pore Glace) fuaolonallsado ooa grupos amlnoalquilo de cadela comprida.

loa paaaoa sintáticos subsequentes utilisa-ee o eoaponente baae eoao ^-cienoetildialquilamida do áoldo 5^,*0-diaetoxitritilnueleds^do-^P-foefárioo, encontrando*·· a adenlna aa forma do derivado I -bensoilo, a oltoalna na foraa do deri*

2 rado I -bensoilo, a guanina na foraa do derivado I -iaobutirilo

Tratam-ee 25 mg do suporte polimérico, que contém ligada 0,2 jumol de 5'-0-dimetoxitritiltimidina, sucessivamente, oom os seguintes agentes»

â) acetonitrilo

B) écido trioloroaoético a 3 $ em diclorometano

C) acetonitrilo

D) 5 jamol da correspondente fosfite de nucleésido-3 ’-0, e 25 jumol de tetrasole en 0,15 ml de acetonitrilo anidro

E) acetonitrilo

E) anidrido acético a 20 $ em tetrahidrofurano com 40 $ de lutldina e 10 $ de dimetilaminopiridina

0) aoetonitrilo

H) iodo a 3 % em lutidina/égua/tetrahidrofurano na proporção volumétrica l0tli40

Gomo fosfite” entende-se o monoéster A-cianoetílioo do écido 2»-desoxirlbose-3^,-monofosférico, encontrando-se a terceira valência saturada por meio de um grupo diisopropilamino. Os rendimentos dos passos reaoolonais individuais, podem determinar-se, apés de cada reacçSo de destritilação B), por via espeotrofotométrioa por melo da medição da absorção do catião dimetoxltrltilo, ao comprimento de onda de 496 nm·

Terminada a síntese procede-se à cisão do grupo dimetoxltrltilo como descrito em A) a 0). Por tratamento com amoníaoo separa-se o ollgonuoleétldo do suporte e eliminam-se ao mesmo tempo os grupos /-cianoetilo. Um tratamento durante 16 horas dos ollgémeros com amoníaoo concentrado a 50 0, efectua a cisão dos grupos amlnoprotectores das bases, de modo quantitativo. 0 produto bruto assim obtido purlfioa-se por meio de eleetroforeae de gel em poliaorllamida.

2, Corte do ollgonuoledtiâo 1 con o enzlaa de reatrlQSo FcoRI ou δ«»96Ι

Dleaolve-ae uaa quantidade (0,5 pg) de oligo- ! nuoledtldo 1 (0®^ * °»°X5) ea 6 pl de ígua e 2 pl (5x) de teaplà KooM (50 aM Trle-BCl, pH 7,5l clorato de aagndelo 50 aXl XeCl 250 aX) e aquece-ee eeta aoluçSo durante 5 alnutoe e 95°C. Ápde arrefeelaento a 57°C edlolonaa-ee 2 pl de SooHI (40 ualdedee) ou 2 pl de Sea95X · lncuba-ee durante 12 horae e 37°0. Oolocea-se entfio ee nleturee de dlgestSo «obre ua gel analítico de 10 % de pollaorllealde/7X ureia e prooede-ee 1 ’ aaa eeperepSo per eleotroforeee. Oa ollfonaoledtldoe obtidos separam-ee, ea relaçXo e ua aareador, coa uaa velocidade de ί elulqSo de 150 (ollgonucledtldo 1, nfio cortado)· 105 (ollgonuoledtldo 1» cortado coa SooSX) · 95 (oligoauoledtldo 1» cortado oca B«96I).

5· Foraaqlc dc DIA dc cabeça dupla c produçffo dc extreaoa pendente·ι propereçlo da eequdnola do DMA I.

foaea-ee 0,5 naol do ollgoimeledtldo 1 ea 25 pl de dgaa e 5 pl (lOx) de taapSo pera traasleoçdee-Xlek (0,5 X Trie~&3l, >8 7,5» clorato de aegadelo 0,1 Xt DDf 0,1 Xi 500 pg/ al <e B8à) e equeoea-ee durante 5 alnutoe e 95*0» Apds arrefecer a eoluçlo atd i teaperatura ambiente» adloionaa-ee 20 pl de uaa aelaçSe de dXSX (contendo dAf?, WP, <GfP e dOIP, 2,5 aX de eeda) bea seao 2 pl de DMA-poliaeraae (fragmento de Qenow, 10 naldadee) e lnoube-ee durante 1 hora I teaperatura ambiente·

Apde 2» 5» 10, 20 e 50 alnutoe podes fetlrar-se amostras de

1,5 pl, de aode a eeguir o decurso da reeoçfo por aelo de eleetreforeeo aaa gel nativo dc pelleerllastda a 10 %. Coao aereedor utlliae-ee pBH322, cortado ooa Xepl. Para a preparaqlo doe extreaoa pendentes equeoea-ee 25 pl da eoluçlo reaoolonal da DMA-poliaeraee, durante 5 alnutoe e 95*0, teapera-ee a 57°0 a dilul-ee 5x coa 15 pl de taapSo DooHI. Apde adiçSo de — 8 —

12,5 jal da IsCl 0,2 M, de 37.5 pl d· água, da 5 pl da EcoRI a 5 pl HindIII (en cada oaeo 100 unidades da ensina), incuba-se durante 15 horas e 37°C. Purifica-se a alstura por elaotroforaaa sobre ua gal da pollaerllaalda a 10 % (aaa urala). A fracção (banda) prinolpal, que aa separa ooao ua fragmento da 99 parta ί da basta, aa relação ao aaroador pB&322, oorta-aa antão a elui-se apás homogeneização coa taapão da bicarbonato da trli etllaaánlo 0,2 V. Por aalo da daaaallnlsação atraráa da uaa ooluna da ^Saphadaz 0 50, obtáa-ae o fragmento da DIa purificado correspondente 1 sequánela da DIA I (Tabela 2).

4. Preparação da ua fragmento da DIA autante (Sequánela da DIA XI) trlpleto TOT, codlflcanta para a elsteína, do oligonuoleátido 1 (lucleátldo n> 58-60) poda tranef oraar-ee, por acção do primar mutagánloo

5» CTTGTCAGTaGAATAGTTAC 3· nua trlpleto TCT, codlflcanta para e eerine (aer).

Para tal, transformasse aa prlaalro lugar 1 naol do primar, por reacção coa qulnaee, no correspondente fosfato* -5».

Dissolve-ee o primar (θ^δΟ “ · pl de taapão HBPIS, aqueoe-ee aata aolução durante 5 alnutoe a 95 0 a arrefeoe-ae aa galo. Apás adição de 9 pl de ATP 2,5 a» (pH 7), do 2 pl da DTT 0,1 H, da 3 pl da água s de 1 pl da qulnaee da pollnuoleátldo T4 (10 uni adaa), incuba-ee durante 2 horas a 3*^0 a deaesliniza-se aa seguida atraváe de uaa ooluna da Saphadaz β 50,

Para a formação da cadela dupla, hibridizaa-se 0,2 naol do ollgonuolcátldo 1 eoa 1 naol do primar tratado ooa qulnaae, coao descrito no exemplo 3 e sujeita-ss a reacção ooa DMA-poliaeraaa. Ántee do oorta ooa oa enzlaae da restrição XoolI a HindIII liga-ee, por acção da DlA-llgase, a oadala da

BMâ acabada de foraar oo» o prioer outagénico. Para tal, adlelona-se 1 pl (lOx) de ttaplo de ligase (660 ®M Tris-HCl, pi 7,5» olorato de magnésio 50 mM, EDT 50 mM e ATP 10 mM), bem oomo 1 ul de DlA-ligase T4, à reacção de pollmeraae, e incuba-se ' o durante 1,5 horas a 57 C, 0 tratamento subsequente efeetut-se como desorlto no exemplo 3. Apés purificação por electroforeee» olona-se o fragmento de DMA, oomo descrito so exemplo 5. Uma ves que a mutagéneae destrói uma poslçlo de corte Real, podem distinguir-ss oe mutantss (Codifioantee para Ser) do plasmídeo tipo nativo (Codifioante para Cye), por melo de análise de restrlçlo oom Real. A partir do plasmídeo híbrido «rutado obtém-se, por melo de digeetío oom EcoRI-HindlII, um fragmento de DMA correspondente a eequdnola de DMA II (Tabela 5).

5. Conetruçlo de vectoree que contêm oa fragmentos de ΓΝΑ alntétloos, bem como eua tr&nsforaaçío e ampllfloaçlo

Abre-se o vector pVCie ueual no mercado, de acordo oom processos conheoidos, com os enzimas de restrlçlo EcoRI e HindlII, segundo as instruções do fabricante. A mistura de digeetío separa-se, pelo proceaao conhecido, por melo de eleotrq. forsse sobre um gel de agaroae a 1 %» e revelam-se os fragmentos de oleio por ooloraçlo oom brometo de etídlo. A banda do veotor (cerca de 2,6 RB) remove-ee do gel de agaroee e isola-ee da agaroae por eleotroelulçlo» extreeçlo com fenol e preolpitaçlo oom etanol.

Ligam-se 1C fmol do veotor aberto com EooRI-HindlII, oom 100 fmol do fragmento de DMA aintétioo de aoordo oom s sequência de BHA I ou oom o fragmento de DMA do exemplo 4, que eontém oe extremos pendentes correspondentes aos enzimas de restrlçlo EooRI e HindlII, em 20 jal de templo de ligase, sa presença de DIA-ligase T4, duraste a solte, â temperatura ambiente. Obtém-se um plasmídeo híbrido, oom o qual ae transforma a R. coli. Rara tal, trata-aa a estirpe E. ooli K12 coa

cloreto de oélolo e adiciona-ee-lbe a eoluçSo do pleeoídeo híbrido. ?or adição de iaopropil-^-D-tiogalacto-piranéeido (IPTO), 5-broao-’4-oloro-3*indolil-^*D-galaoto-piranéeido (Xgnl) e aaploilina. pode· revelar-ee aa colónias contidas no vector de Inserção, após colocação ea placae. Apéa eapllficação ' ebrea-se ae células e iaolaa-ee oe vectores híbridos de acordo oo· aétodoe conhecidoe. A partir deetee poden iaolar-ee, por digestão oos oe enslaae Inlolalaente utlllsadoe EooRI e HindHI, os íragaentoe genéticos correspondentes àe sequências de DMA I ou II. As sequências de nueleétldos verificaa-ee pelo a aétodoe ' geralnente conhecidos de sequenciação de DMA.

6. Síntese de u» ©ene para Uala-Caloitonlna-Gly(33)

Slntetisa-ae o ollgonuoleétido con a sequência de DMA III, eoio descrito no exeeplo 1. Hlbrldlsam-se então 0,5 naol deste ollgonucleétldo, ooao descrito no exeeplo 3, e constról-se s cadeia dupla de DMA oo· DMA-pollmerase (fragaento de Xlenow). Apés desnaturação do ensina por tratanento térmico, auasnta-ee a concentração de MaPl até 100 aM e, por nelo de corte eo· os enslaae de restrição Sphl e EcoRI (100 unidades de oada), prepara-ee o gene con extratos aguçados.

A purificação e a clonagea do gene de oaloltonlna pode» efeetuar-se por prooeseoe ea ei oonheoldoa (por exeaplo ooao se propãe no registo de patente aleaão P 36 32 037.4).

Tabela 1: Oligonucleétido 1

5» agtaagcttcacgagtattttccggaaatgcagattctggctgttagtgg 51 60 ?0 80 90 1 taaotattgtactgacaagaaacctgctgctatcaattggattgagggcc 101 110 120 130

GTGAATTCGCTTTTGCGááTTCACGGCCCT 3»

Estrutura ea gancho de cabelo

Sau96I EooRI

5» AGTAAGCTT gagggcogtgaattcgot t:: s: 1111:111111 T

3» TCCCGGCACTTAAGCGT

111111 > 11:111111 i « Eaparelhaaento de bases I » Posição de oorfce

Sequência de I

LEU HIS GLU TYR PHE PRO GLU IffiT GLH ILE LEU AG CTT CAC GAG TAT ITT CCG GAA ATG CAG ATT CTG

A GTG CTC ATA AAA GGC CTT TáC GTC TAA GAC ala val ser glt asm tyb cys thb asp lys lys pro

GOT OTT AGT GGT AAC TAT TGT ACT GAC AAG AAA CCT

CÔA CAA TCA CCA TTG ATA ACA TGA CTG TTC TTT GGA

ALA ALA ILE ASM TRP ILB GLU GLY ARG

GCT GCT ATC AAT TGG ATT GAG GGC CGT G

CGA CGA TAG TTà ACC TAA CTC CCG GCA CTT AA

ÍOtífi-l¹ Sequência de PMA II

LBU	HIS	GLU	TYR	PHE	PRO	GLU	MET	GLM	ILE	LEU
AG CTT	CAC	GAG	TAT	TTT	CCG	gaa	ATG	CAG	ATT	CTG
A	GTG	CTC	ATA	AAA	GGC	CTT	TAC	GTC	TAA	GaG
ALA VAL	SEB	GLY	ASM	TYB	GER	THR	ASP	LYS	LYS	PRO
GCT GTT	AGT	GGT	AAC	TAT	TCT	ACT	GàC	AAG	AAA	CCT
CGA CAA	TCA	CCA	TTG	ATA	rk	TGA	CTG	TTC	TTT	GGA
4 La ala	ILB	ASM	TRP	ILB	GLU	GLY	ARG
GCT GCT	ATC	AAT	TGG	ATT	GaG	GGC	CGT	G
CGA COA	TAG	TTA ACC	TAA	CTC	CCG	GCA	CTT	AA

Tabela 4» Sequência de DMA III

1 5 10 Hat Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Vai Deu Oly Lye

5» TTTGCAWC ATO TGC TCT AAC CTG TOO ACT TGC GTT CTT GGT AAG

10 20 30 40

20 25

Leu Ser Gl> Glu Leu Hie Iya Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Aen

CTT TCT CAG GAA CTT CAT AAA CTG CaG aCC TAT OCO CGC ACT AAT

60 70 80 90

Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Stp Stp

ACC GGC TCT GGT ACC CCT GGT TAA TAG AATTCGCTTTTGCGAATTCTATT 5»

100 110 120 130 140

Claims

R £ I V I M D I CA Ç ff £ S

- 1· Prooeeeo para a preparaçfio de DBA de cadeia dupla» oaraoteriaedo por ae sintetizar por via quínica, de acordo oo» o eátodo doa triáeteree do ácido foafárico ou oo» o uátodo de foafite» uaa cadeia eiaplee da DBA co· u»a eatrutura de gsnoho da oabelo nu» doa extremos ou a» aaboa oe extreooa» ae preencher e cadeia de nuoleátidoe oomplenentares e ee abrir ou cindir (aeperar) a estrutura (ou estruturas) da gancho de oabelo*·

- 2*

Proceeeo de acordo co· a reivindicação 1* oaraoterlsado por oe preparar uaa oadela de DMA na qual» nuas posição vizinha à da estrutura de ·gancho de cabelo, exista uaa ou eaie posições de reconheolnento pera ua enzima de restrição, com o qual se possa cindir a estrutura de gancho de cabe- ί lo, !

. 5· Processo de acordo com a reivindicação 1, oaracterlB&do por ee abrir a estrutura de gancho de cabelo co· uaa núcleos· eepeoífloa para cadelas eiaples.

- 4· Processo ds acordo coa uma ou mais das reivindicação· anteriores, caracterizado por ee hibridizar o ® de cadela slaples coa ua Priaer autagdnieo de modo a obter-ee uaa autagtfneee pontual eepeoífloa.

- Çl Processo de acordo coa uaa ou mala das reivindicações anterior··, caracterizado por se eapregarea nuoleÕtldos aaroados no preenchimento da cadeia dupla.

- 6· Prooesso de acordo con uaa ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado por se partir do oligonueleõtido