PT85057B - PROCESS OF PREPARATION OF A BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIER - Google Patents
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Abstract
Description
A presente invenção refere-se a um processo de preparação de um modificador de resposta biológica para tratamento de seres humanos e animais que compreende cultivar células de bactérias de uma estirpe de microrganismos que não es, tá presente na microflora do paciente a tratar e que tem um antígeno bacteriano comum que não reage cruzadamente ou que reage pouco com organismos que constituem a microflora normal do paciente a tratar, colherem-se as células cultivadas, dissociar-se a endotoxina com um detergente adequado, submeter-se o concentrado celular a rompimento suficiente para produzir vesículas de membrana com um diâmetro médio não inferior a 180 nm, separarem-se as referidas vesículas de membrana e ribossomas livres do material celular restante no li sado celular e ressuspenderem-se as referidas vesículas e ri bossomas num tampão adequado.The present invention relates to a process for the preparation of a biological response modifier for the treatment of humans and animals, which comprises culturing bacteria cells from a strain of microorganisms that are not present in the microflora of the patient to be treated and which have a common bacterial antigen that does not cross-react or that reacts poorly with organisms that constitute the normal microflora of the patient to be treated, harvest the cultured cells, dissociate the endotoxin with a suitable detergent, subject the cell concentrate to sufficient disruption to produce membrane vesicles with an average diameter of not less than 180 nm, separate said free membrane vesicles and ribosomes from the cell material remaining in the cell lysate and resuspend said vesicles and rysomas in a suitable buffer.
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-2MEMORIA descritiva-2 Descriptive MEMORY
A presente invenção refere-se em geral à preparação de um produto farmacêutico com propriedades imuno-moduladoras. Mais particularmente, a invenção refere-se à preparação de um modificador de resposta biológica (MRB), definido como um age_n te que modifica a relação entre uma doença e um hospedeiro por modificação da resposta biológica do hospedeiro à doença resultando daí efeitos terapêuticos. Os MRB podem ser divididos em duas categorias: (1) agentes biológicos ou químicos que podem estimular ou alterar de outro modo um ou mais dos mecanismos de resistência do hospedeiro e (2) produtos celulares purificados que demonstram efeitos directos numa doença particular. 0 primeiro grupo de MRB, incluído na presejn te invenção, consiste em agentes que activam, aumentam ou mo dificam de outro modo a reactividade imunológica do hospedei ro e são geralmente referidos como imuno-moduladores.The present invention relates in general to the preparation of a pharmaceutical product with immunomodulatory properties. More particularly, the invention relates to the preparation of a biological response modifier (MRB), defined as an agent that modifies the relationship between a disease and a host by modifying the biological response of the host to the disease, thereby resulting in therapeutic effects. MRBs can be divided into two categories: (1) biological or chemical agents that can stimulate or otherwise alter one or more of the host's resistance mechanisms and (2) purified cellular products that demonstrate direct effects on a particular disease. The first group of MRB, included in this invention, consists of agents that activate, increase or otherwise hinder the host's immune reactivity and are generally referred to as immunomodulators.
Pode usar-se um MRB isolado, ou em combinação com outros agentes, para aumentar a resistência a patogenes ou a recuperação da invasão de patogenes, modificar ou induzir to lerância a enxertos de tecido estranho, para aumentar a rejeição ou estabilização do tumor e para inibir a recorrência de tumores após outras formas de terapia, para restaurar mecanismos normais que auxiliam a supressão, ou que promovem de outro modo uma resposta imune normal.MRB alone, or in combination with other agents, can be used to increase resistance to pathogens or recovery from invasion of pathogens, modify or induce tolerance to foreign tissue grafts, to increase tumor rejection or stabilization and to inhibit the recurrence of tumors after other forms of therapy, to restore normal mechanisms that assist suppression, or that otherwise promote a normal immune response.
Desenvolveu-se uma grande variedade de imuno-moduladç) res/imuno-adjuvantes desde cerca de 1900. A grande maioria destes agentes são de origem microbiana (bactérias/fungos) sendo os mais populares derivados dos géneros Corynebacteria, Mycobacteria e Nocardia (organismos CMN). Os vários imuno-adjuvantes são compreendidos de células viáveis intactas, células mortas, paredes de células, várias fracçães de paredes de células, endotoxina, vários tipos de polissacáridos, ou fracçães subcelulares como por exemplo ácido ribonucleico ou ribossomas. Embora todos estes agentes tenham demonstrado actividade potenciadorg/moduladora/adjuvante imune em cultura de tecidos animais e humanos, contra doenças infecciosasA wide variety of immunomodulators / immunoadjuvants has been developed since about 1900. The vast majority of these agents are of microbial origin (bacteria / fungi) and the most popular are derived from the genera Corynebacteria, Mycobacteria and Nocardia (CMN organisms) ). The various immunoadjuvants are comprised of intact viable cells, dead cells, cell walls, various cell wall fractions, endotoxin, various types of polysaccharides, or subcellular fractions such as ribonucleic acid or ribosomes. Although all of these agents have demonstrated immune enhancing / modulating / adjuvant activity in animal and human tissue culture, against infectious diseases
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-3e neoplásicas, são-lhes atribuídas, universalmente inconsistências na produção e composição e têm toxicidade moderada a severa. Em relação ao tratamento de neoplasias, nenhuns des. tes agentes tem até agora sido útil no tratamento da doença estabelecida. Além disso, estes agentes demonstram tipicamente a perda de actividade com o uso repetido (anergia), desvio imune, reacçães de hipersensibilidade, desenvolvimento de condiçães inflamatórias crónicas, e/ou desenvolvimento de várias outras condiçães indesejáveis.-3e neoplastics, they are attributed, universally inconsistencies in production and composition and have moderate to severe toxicity. Regarding the treatment of neoplasms, none of the des. These agents have so far been useful in the treatment of established disease. In addition, these agents typically demonstrate loss of activity with repeated use (anergy), immune deviation, hypersensitivity reactions, development of chronic inflammatory conditions, and / or development of several other undesirable conditions.
Devido à incapacidade de definir quimicamente estesDue to the inability to chemically define these
I agentes dada a sua impureza e/ou complexidade, e numa tentativa para reduzir a variabilidade das respostas imunes e coni plicaçães tóxicas, certos investigadores extraíram várias fracçães específicas destas fontes ou sintetizaram vários componentes demonstrando actividade imunológica. Exemplos de fracçães específicas que foram investigadas incluem tripépti do de muramilo duma fracção da parede celular, proteína A de estafilococos, vários polissacáridos, fracção de ARN (1) e fracção ribossómica (2-5).I agents given their impurity and / or complexity, and in an attempt to reduce the variability of immune responses and toxic complications, certain researchers have extracted several specific fractions from these sources or synthesized various components demonstrating immunological activity. Examples of specific fractions that have been investigated include muramyl tripeptide from a cell wall fraction, staphylococcal protein A, various polysaccharides, RNA fraction (1) and ribosomal fraction (2-5).
Em relação à fracção ribossómica, o mecanismo de acção difere de acordo com a fonte de ribossomas. Embora a maioria das vacinas ribossómicas necessitem de adjuvante pa) ra terem actividade, as vacinas ribossómicas preparadas a partir de Staphylococçus aureus e Neisseria meninqitis não o necessitam (2). Em adição, as vacinas ribossómicas preparadas a partir de Mycobacterium tuberculosis (3) e Salmonella typhimurium (4) parecem induzir uma resposta celular mediada, enquanto que as preparadas a partir de Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyoqenes medeiam uma resposta humoral (5). Mesmo se a fracção ribossómica extraída for, tejo ricamente, o agente activo, existe considerável controvérsia em muitos casos sobre se outros componentes celulares (ARN, proteína, endotoxina, parede celular) presentes como contaminantes, são responsáveis pela reactividade imune observada.In relation to the ribosomal fraction, the mechanism of action differs according to the source of ribosomes. Although most ribosomal vaccines need an adjuvant to be active, ribosomal vaccines prepared from Staphylococçus aureus and Neisseria meninqitis do not need it (2). In addition, ribosomal vaccines prepared from Mycobacterium tuberculosis (3) and Salmonella typhimurium (4) appear to induce a mediated cellular response, whereas those prepared from Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyoqenes mediate a humoral response (5). Even if the extracted ribosomal fraction is, theoretically, the active agent, there is considerable controversy in many cases about whether other cellular components (RNA, protein, endotoxin, cell wall) present as contaminants, are responsible for the observed immune reactivity.
As vacinas de fracçães celulares conhecidas podem al-Vaccines of known cell fractions may
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-4gumas vezes ser adequadas para o tratamento profilático ou terapêutico de doenças infecciosas. Contudo, elas são, por várias razães, inadequadas para uso como imuno-moduladores gerais não sensibilizantes para o tratamento da doença neoplásica. A presença de paredes celulares, endotoxina, ou componentes fracamente degradáveis resulta frequentemente em toxicidades semelhantes às obtidas com os organismos intactos. Além disso, as respostas imuno-desviantes e imunes complexas indesejáveis podem ser eliminadas dado que essas vacinas são tipicamente derivadas de organismos que são parte de ou que facilmente efectuam reacções cruzadas (antígenos comuns) com a própria microflora do hospedeiro. Essas vacinas contêm também tipicamente fracçães com características físicas e/ou químicas que podem ser boas para a actividade potenciante imune geral.-4Sometimes suitable for prophylactic or therapeutic treatment of infectious diseases. However, they are, for various reasons, unsuitable for use as general non-sensitizing immunomodulators for the treatment of neoplastic disease. The presence of cell walls, endotoxin, or poorly degradable components often results in toxicities similar to those obtained with intact organisms. In addition, unwanted complex immune-deviant and immune responses can be eliminated since these vaccines are typically derived from organisms that are part of or that easily cross-react (common antigens) with the host's own microflora. Such vaccines also typically contain fractions with physical and / or chemical characteristics that may be good for general immune enhancing activity.
Urban et al (6) referiram a capacidade de poli-ribossomas (agregados de ribossomas), obtidos de um organismo ba£ teriano específico, de suprimirem o desenvolvimento de fibrossarcomas SaD2 cutâneos em ratos DBA/2. As fracçães de poli-ribossomas foram obtidas de culturas celulares por lise osmótica ou mecânica das células (dependendo do tipo de bactérias), seguida de centrifugação diferencial. Embora □ efeito no tumor murino SaD2 fosse positivo, o mecanismo da resposta biológica induzida não pôde ser determinado a partir dos dados. Embora a toxicidade fosse significativamente baixa, o processo descrito por Urban, et al., resultava numa variação extrema no perfil do polissoma (distribuição de tamanhos) e num rendimento de produto muito baixo. Não se cori seguia consistência de qualidade, estabilidade e eficácia.Urban et al (6) reported the ability of poly-ribosomes (aggregates of ribosomes), obtained from a specific bacterial organism, to suppress the development of cutaneous SaD2 fibrosarcomas in DBA / 2 rats. The poly-ribosome fractions were obtained from cell cultures by osmotic or mechanical lysis of the cells (depending on the type of bacteria), followed by differential centrifugation. Although □ effect on SaD2 murine tumor was positive, the mechanism of the induced biological response could not be determined from the data. Although the toxicity was significantly low, the process described by Urban, et al., Resulted in an extreme variation in the polysome profile (size distribution) and in a very low product yield. There was no consistency in quality, stability and effectiveness.
Kirsh, et al. (7) referiram uma estimulação e modulação imune por meio da encapsulação de antígenos específicos ou modificadores de resposta biológica em lipossomas. Utiliza ram-se lipossomas contendo medicamentos para o tratamento do cancro metastático (8). Contudo, o tratamento da doença ne£ plásica (cancro) com modificadores de resposta biológica is£ lados ou encapsulados em lipossomas, tem até agora sido desejoKirsh, et al. (7) reported immune stimulation and modulation through the encapsulation of specific antigens or biological response modifiers in liposomes. Liposomes containing drugs were used to treat metastatic cancer (8). However, the treatment of neoplastic disease (cancer) with biological response modifiers isolated or encapsulated in liposomes has so far been a desire.
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-5corajante, embora □ MRB encapsulado seja superior em eficácia ao MRB não encapsulado, a limitação do benefício terapêu tico pode ser devido ao facto da activação imune estar limitada ao macrófago. As células tumorais desenvolvem raramente, se alguma vez, resistência à morte pelos macrófagos, quando comparadas com as células Iciller naturais e oélulas-T citotóxicas. 0 nómero de macrófagos nestes casos foram de. masiadamente baixos para mediarem efectivamente, por si próprios, a destruição de grandes massas de tumores.-5 courageous, although □ encapsulated MRB is superior in efficacy to non-encapsulated MRB, the limitation of the therapeutic benefit may be due to the fact that immune activation is limited to the macrophage. Tumor cells rarely, if ever, develop resistance to death by macrophages when compared to natural Iciller cells and cytotoxic T-cells. The number of macrophages in these cases was. too low to effectively mediate, on their own, the destruction of large masses of tumors.
Constitui um objecto da presente invenção apresentar I um modificador de resposta biológica aperfeiçoado.It is an object of the present invention to provide an improved biological response modifier.
Constitui outro objecto da invenção apresentar um modificador de resposta biológica aperfeiçoado que exibe toxicjÍ dade e desvio imune mínimos.It is another object of the invention to present an improved biological response modifier that exhibits minimal toxicity and immune deviation.
Outro objectivo da invenção é apresentar um modificador de resposta biológica aperfeiçoado que é susceptível de fabrico com qualidade, estabilidade e eficácia consistentes.Another objective of the invention is to present an improved biological response modifier that is capable of manufacturing with consistent quality, stability and effectiveness.
Ainda outro objectivo da invenção consiste em aprese_n tar um processo de preparação do modificador de resposta bio lógica precedente que tenha qualidade consistente e elevado rendimento.Yet another object of the invention is to provide a process for preparing the preceding biological response modifier that has consistent quality and high yield.
Outros objectos da invenção tornar-se-ão aparentes para os especialistas a partir da descrição seguinte quando relacionada com os desenhos anexos, em que:Other objects of the invention will become apparent to those skilled in the art from the following description when related to the accompanying drawings, in which:
a Figura 1 é uma micrografia electrónica apresentando um modificador de resposta biológica da invenção com uma ampliação de aproximadamente 82000x;Figure 1 is an electron micrograph showing a biological response modifier of the invention with a magnification of approximately 82000x;
a Figura 2 é um gráfico que ilustra um teste à célula killer” natural humana, por comparação após administração do modificador de resposta biológica da invenção e após a administração de interferão de leucócito;Figure 2 is a graph illustrating a test to the natural human killer cell, by comparison after administration of the biological response modifier of the invention and after administration of leukocyte interferon;
a Figura 3 é um gráfico que apresenta um ensaio padrão que demonstra as propriedades bactericidas do MRB da invenção ;Figure 3 is a graph showing a standard assay that demonstrates the bactericidal properties of the MRB of the invention;
a Figura 4 é uma comparação entre o ensaio de citotoFigure 4 is a comparison between the cytotoxicity assay
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-6xicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) após adminis tração do modificador de resposta biológica da invenção e após administração de interferão de leucócito;-6 antibody dependent cell toxicity (ADCC) after administration of the biological response modifier of the invention and after administration of leukocyte interferon;
a Figura 5 é um gráfico que ilustra a indução de interleuquina 1 (IL-1) utilizando o modificador de resposta biológica da invenção;Figure 5 is a graph illustrating the induction of interleukin 1 (IL-1) using the biological response modifier of the invention;
a Figura 6 ê um gráfico ilustrando, na actividade de células killer naturais (NK), o efeito de depleção de várias populaçães de células mononucleares do sangue periférico humano. (Este estudo demonstra a perda de actividade das células NK apés remoção de células NK mas não após remoção das células-B ou células-T quando se utiliza o modificador de resposta biológica da invenção. A remoção de monócitos (não representada) também elimina o efeito, sugerindo que a actividade das células NK é mediada pela população de monócitos- macrófagos );Figure 6 is a graph illustrating, in natural killer cell (NK) activity, the depletion effect of various populations of human peripheral blood mononuclear cells. (This study demonstrates loss of NK cell activity after removal of NK cells but not after removal of B-cells or T-cells when using the biological response modifier of the invention. Removing monocytes (not shown) also eliminates the effect, suggesting that the activity of NK cells is mediated by the monocyte-macrophage population);
a Figura 7 ilustra os resultados de estudos da utilização in vivo da invenção em carcinoma de células escamosas da próstata da ratazana (R3327A) (crescimento rápido);Figure 7 illustrates the results of studies of the in vivo use of the invention in rat prostate squamous cell carcinoma (R3327A) (rapid growth);
a Figura 8 ilustra os resultados de estudos in vivo do carcinoma prostático da ratazana (R3327H) (crescimento lento);Figure 8 illustrates the results of in vivo studies of rat prostatic carcinoma (R3327H) (slow growth);
a Figura 9 ilustra os resultados de estudos in vivo do adenocarcinoma bilateral prostático da ratazana (R3327CF) mostrando também resultados em relação a outros tratamentos;Figure 9 illustrates the results of in vivo studies of bilateral rat prostatic adenocarcinoma (R3327CF) also showing results in relation to other treatments;
a Figura 10 é um resumo dos dados obtidos do tratameri to de pacientes com cancro terminal ilustrando a eficácia das células mononucleares do sangue periférico do paciente para matar células alvo de tumores específicos 24 horas após admi nistração in vivo do produto da invenção. Os resultados são comparáveis com a activação in vitro das células mononucleares do sangue periférico humano com interleuquina II;Figure 10 is a summary of the data obtained from the treatment of terminal cancer patients illustrating the efficacy of the patient's peripheral blood mononuclear cells to kill targeted tumor cells 24 hours after in vivo administration of the product of the invention. The results are comparable with the in vitro activation of human peripheral blood mononuclear cells with interleukin II;
a Figura 11 é uma série de gráficos apresentando ensaios de células killer naturais comparando, com interferão alfa, a eficácia de preparaçães obtidas a partir de microrgaFigure 11 is a series of graphs showing natural killer cell assays comparing, with alpha interferon, the efficacy of preparations obtained from microorganisms
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-7nismos Pseudomonas, E.. coli, Enterobacter aeroqenes e £_. chloacae; e a Figura 12 é uma série de gráficos apresentando ensaios de células killer naturais, comparando, com interferão, a eficácia de preparações obtidas a partir de microrganismos Eruiinia chrysanthemi e Flavobacterium.-7 Pseudomonas, E .. coli, Enterobacter aeroqenes and £ _. chloacae; and Figure 12 is a series of graphs showing natural killer cell assays, comparing, with interferon, the efficacy of preparations obtained from microorganisms Eruiinia chrysanthemi and Flavobacterium.
Geralmente, o modificador de resposta biológica da in venção compreende vesículas de membranas naturais e ribossomas num tampão de suspensão. As vesículas consistem em mate rial de membrana celular endógeno a um organismo seleccionado. Os ribossomas são também endógenos ao organismo selecci onado. 0 modificador de resposta biológica é essencialmente livre de endotoxina, células intactas, paredes celulares e fragmentos de membranas celulares. 0 organismo seleccionado é aquele que nãe prevuca uma respesta imune-desviante significativa e é não-patogénicç nc Hcmem, e é aquele em que as v_e sículas de membranas sãq susceptíveis de serem formadas a partir de material de membrana celular e em que as vesículas são facilmente endocitosadas pela linha celular monócito/macrófago. 0 modificador de resposta biológica tem um diâmetro médio superior a 170 nm na análise de tamanho de partícula.Generally, the biological response modifier of the invention comprises vesicles of natural membranes and ribosomes in a suspension buffer. Vesicles consist of cell membrane material endogenous to a selected organism. Ribosomes are also endogenous to the selected organism. The biological response modifier is essentially free of endotoxin, intact cells, cell walls and fragments of cell membranes. The selected organism is one that does not prevent a significant immune-deviant response and is non-pathogenic in Hcmem, and is one in which the membrane particles are likely to be formed from cell membrane material and in which the vesicles are easily endocytosed by the monocyte / macrophage cell line. The biological response modifier has an average diameter greater than 170 nm in the particle size analysis.
A invenção é susceptível de activar directamente célu las da linha celular monócíto-macrófago. A activação do monócito-macrófago, ou células da linha celular monócito-macró fago resulta na indução de actividades bactericidas mediadas por monócito-macrófago (Figura 3) e na indução de citotoxici dade de tumor (Tabela 3), níveis alterados de vários glóbulos brancos envolvidos na função imune (por exemplo monócitos, neutrófilos (Tabela 4))e indução in vivo no Homem de citotoxicidade de tumores alvo (K562, Raji, Co38), (Figura 10), in dução de citotoxicidade mediada por células killer” naturais (Figura 2), indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (Figura 4), e indução da libertação de interleuquina I (IL-1) (Figura 5) e possivelmente interleuquina II (IL-II) (Figura 10).The invention is capable of directly activating cells of the monocyte-macrophage cell line. Activation of the monocyte-macrophage, or cells of the monocyte-macrophage cell line results in the induction of monocyte-macrophage-mediated bactericidal activities (Figure 3) and in the induction of tumor cytotoxicity (Table 3), altered levels of various white blood cells involved in immune function (eg monocytes, neutrophils (Table 4)) and in vivo induction of target tumor cytotoxicity in humans (K562, Raji, Co38), (Figure 10), induction of natural killer cell-mediated cytotoxicity ( Figure 2), induction of antibody-dependent cellular cytotoxicity (Figure 4), and induction of interleukin I (IL-1) release (Figure 5) and possibly interleukin II (IL-II) (Figure 10).
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-8Para melhor precisão, definem-se os seguintes termos utilizados nesta especificação e reivindicações anexas:-8 For better accuracy, the following terms used in this specification and appended claims are defined:
'*Não-tóxico'’ significa estar num nivel de toxicidade que é tolerável pelo mamífero hospedeiro que recebe a terapia do modificador de resposta biológica.'* Non-toxic' ’means being at a level of toxicity that is tolerable by the host mammal receiving biological response modifier therapy.
Não-imunogénico significa provocar uma resposta imu nogénica suficientemente baixa ou mesmo nenhuma resposta, tal que não provoca respostas inflamatórias crónicas e de hi persensibilidade imuno-desviantes indesejadas, significativas no hospedeiro mamífero.Non-immunogenic means eliciting a sufficiently low immunogenic response or no response at all, such that it does not elicit significant chronic inflammatory responses and unwanted immuno-deviant immensity in the mammalian host.
Diâmetro mádio significa o diâmetro médio medido por Análise de Distribuição do Tamanho de Partículas, MSD, num dispositivo de determinação do tamanho de partículas BI-90 (Brookhaven Instrument Corp.). Esta medição envolve uma ponderação da intensidade do processo de determinação dos tamanhos médios e é explicada com maior detalhe no Manual de Operação do instrumento, capítulo 6, aqui incorporado como referência.Mean diameter means the mean diameter measured by Particle Size Distribution Analysis, MSD, on a BI-90 particle size determination device (Brookhaven Instrument Corp.). This measurement involves weighting the intensity of the process of determining average sizes and is explained in more detail in the instrument's Operation Manual, chapter 6, incorporated here as a reference.
Substancialmente não-patogénica no homem'.’ significa raramente ou nunca associada com doenças em humanos de saúde normal. Dado que a maior parte dos microrganismos são susceptíveis de causar infecção oportunista nas circunstâncias adequadas como por exemplo em pessoas em que o sistema imuno lógico esteja comprometido, esta definição exclui apenas os organismos que causam tipicamente infecções não-oportunistas.Substantially non-pathogenic in man '.' Means rarely or never associated with diseases in humans of normal health. Since most microorganisms are likely to cause opportunistic infection in the right circumstances, such as in people where the immune system is compromised, this definition excludes only those organisms that typically cause non-opportunistic infections.
Essencialmente livre de endotoxina, células intactas, paredes celulares e fragmentos de membranas celulares signi fica uma actividade biológica e nível suficientemente baixo dessas fracçães para manterem uma característica não-tóxica como aqui definida.Essentially free of endotoxin, intact cells, cell walls and fragments of cell membranes signifies a biological activity and sufficiently low level of these fractions to maintain a non-toxic characteristic as defined herein.
Resposta imuno-desviante significa uma resposta imu ne que é dirigida para fora da doença a tratar. Por exemplo, o fenómero do ataque antigénico original pode obrigar o sistema imunológico a responder de acordo com as challenge” históricas ou a responder à microflora vulgar quando chal-Immuno-deviant response means an immune response that is directed out of the disease to be treated. For example, the phenomena of the original antigenic attack may compel the immune system to respond according to historical challenges ”or to respond to ordinary microflora when chal-
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-9lenged por um antigénio que è semelhante aos possuídos pela challenge histórica ou pela microflora vulgar. Além disso, a activação policlonal pode provocar respostas anamnésicas mal dirigidas e não específicas. Partículas fracamente degradáveis podem resultar na diversão da linha celular de monócito-macrófago (isto é, reacção a corpos estranhos, hipersensibilidade crónica)impedindo a acção dessa linha celular em resposta à doença. Uma resposta imuno-desviante 'Significativa é aquela que atenua de tal modo o efeito da resposta imune desejada que é inaceitável para fins mádicos.-9lenged by an antigen that is similar to those possessed by the historical challenge or by the common microflora. In addition, polyclonal activation can cause poorly directed and non-specific anamnesic responses. Weakly degradable particles can result in the diversion of the monocyte-macrophage cell line (i.e., reaction to foreign bodies, chronic hypersensitivity) preventing the action of that cell line in response to disease. A Significant immuno-deviant response is one that so attenuates the effect of the desired immune response that it is unacceptable for medical purposes.
Vesículas de membrana natural significa vesículas de membrana preparadas a partir de membranas que são derivadas de células vivas ou mortas naturais.Natural membrane vesicles means membrane vesicles prepared from membranes that are derived from natural living or dead cells.
Embora não haja evidência científica para clarificar as razães para a eficácia observada do modificador de respojs ta biológica da invenção, é óbvio que o modificador de resposta biológica da invenção possui certas características es, pecíficas. Assim, é óbvio que o modificador de resposta bio lógica da invenção contém duas classes de partículas distintas, nomeadamente vesículas de membranas naturais e ribossomas. Os ribossomas podem existir como monémeros ou como polímeros maiores, mas o diâmetro médio da população de ribossomas é inferior ao diâmetro médio da população de vesículas de membrana. As quantidades relativas das duas populaçães pa recem afectar a eficácia do produto como determinada por ensaios padrão de células NK conduzidos in vitro. Além disso, obviamente, as populaçães relativas afectam o diâmetro médio medido da população total de partículas. Crê-se que é neces. sário um diâmetro médio superior a 170 nm para se conseguir a eficácia pretendida. Abaixo deste valor, a eficácia do produto, medida em ensaios de células NK padrão, diminui significativamente.Although there is no scientific evidence to clarify the reasons for the observed effectiveness of the biological response modifier of the invention, it is obvious that the biological response modifier of the invention has certain specific characteristics. Thus, it is obvious that the biological response modifier of the invention contains two distinct particle classes, namely vesicles of natural membranes and ribosomes. Ribosomes can exist as monemers or as larger polymers, but the average diameter of the ribosome population is less than the average diameter of the membrane vesicle population. The relative quantities of the two populations appear to affect the product's effectiveness as determined by standard NK cell assays conducted in vitro. In addition, of course, relative populations affect the measured average diameter of the total particle population. It is believed that it is necessary. An average diameter greater than 170 nm is required to achieve the desired efficiency. Below this value, the product's effectiveness, measured in standard NK cell assays, decreases significantly.
Observou-se também que o tamanho das vesículas na poptj lação de vesículas tem um efeito na eficácia do modificador de resposta biológica da invenção. Assim, numa forma preferida da invenção, essencialmente todas as vesículas excedem 110 nm em diâmetro e o diâmetro médio da população de vesícuIt was also observed that the size of the vesicles in the vesicle population has an effect on the effectiveness of the biological response modifier of the invention. Thus, in a preferred form of the invention, essentially all vesicles exceed 110 nm in diameter and the average diameter of the vesicle population
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-10las é de pelo menos 180 nm e é preferivelmente cerca de 210 nm. Verificou-se que preparações com diâmetros inferiores a estes valores têm eficácia inferior à desejável em ensaios z-10las is at least 180 nm and is preferably about 210 nm. It was found that preparations with diameters below these values have less than desirable efficacy in z tests
in vitro de células NK. E também óbvio que as preparações contendo apenas vesículas de membrana e preparações contendo apenas ribossomas apresentam níveis de eficácia inferiores aos desejados, sugerindo um possível sinergismo na presença das duas populações.in vitro NK cells. It is also obvious that preparations containing only membrane vesicles and preparations containing only ribosomes have lower than desired levels of effectiveness, suggesting a possible synergism in the presence of the two populations.
A Figura 1 é uma micrografia electrónica ampliada aproximadamente 82000x, mostrando o aspecto da secção transversal das vesículas de membrana e mostrando também ribossomas livres com vários tamanhos de partícula (isto é, monómeros e pequenos polímeros). As vesículas produzidas foram me didas por dois processos: (1) medida directa da secção transversal circularizada observada em micrografias electrónicas; e (2) matematicamente, usando medição de coeficientes de difusão de partículas obtidos por análise de dispersão de luz utilizando um instrumento analisador de partículas BI90 (Brookhaven Instrument Corp.).Figure 1 is an electron micrograph enlarged approximately 82000x, showing the cross sectional aspect of the membrane vesicles and also showing free ribosomes with various particle sizes (i.e., monomers and small polymers). The vesicles produced were measured by two processes: (1) direct measurement of the circularized cross-section observed in electron micrographs; and (2) mathematically, using measurement of particle diffusion coefficients obtained by light scattering analysis using a BI90 particle analyzer (Brookhaven Instrument Corp.).
Numa forma preferida da invenção, as vesículas de mem brana e os ribossomas associados são derivados de (isto é ejn dógenos a) bactérias qram-neqativas, Serratia marcescens. Serratia marcescens é um organismo bem conhecido e dispõem-se de muitas estirpes de várias procedências. Estão dispjçj níveis sessenta estirpes na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. Este organismo dá origem a uma fonte particularmente adequada para a produção do produto apresentando um elevado nível de actividade imuno-moduladora/ /imuno-terapêutica quando comparada com outras fontes bacterianas, e é praticamente isenta de toxicidade.In a preferred form of the invention, the membrane vesicles and the associated ribosomes are derived from (i.e., dogenous) chemical-negative bacteria, Serratia marcescens. Serratia marcescens is a well-known organism and many strains are available from various sources. Sixty strains are available at the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. This organism gives rise to a particularly suitable source for the production of the product with a high level of immuno-modulating / immuno-therapeutic activity when compared to other bacterial sources. , and is virtually free of toxicity.
As estirpes de Serratia marcescens específicas actua_l mente utilizadas no desenvolvimento dos dados apresentados a seguir foram:The specific strains of Serratia marcescens currently used in the development of the data presented below were:
Serratia 2000 (SM2000) Cell Technology (Boulder, Colo, rado, USA), variantes de estirpes pigmentadas e não pigmenta das interiormente;Serratia 2000 (SM2000) Cell Technology (Boulder, Colo, rado, USA), variants of pigmented and non-pigmented strains within;
) 66 328) 66 328
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-11Serratia MSC de origem desconhecida obtida de cultura armazenada no Metropolitan State College (Denver, Colorado, USA);-11SERP MSC of unknown origin obtained from a culture stored at Metropolitan State College (Denver, Colorado, USA);
Serratia marcescens ATCC N2 60; eSerratia marcescens ATCC No. 60; and
Serratia marcescens CU de origem desconhecida de cultura armazenada na Universidade do Colorado (Boulder, Colora do, USA).Serratia marcescens CU of unknown culture origin stored at the University of Colorado (Boulder, Colorado, USA).
As vesículas de membranas bacterianas e ribossomas d_e sejados podem ser conveniente e economicamente isolados de uma fonte adequada de células bacterianas de S_. marcescens, em fase estacionária ou em fase log por meio do processo da invenção, que é um procedimento simples, rápido e reprodutível. Utilizam-se reagentes que fornecem as condiçSes necessárias para a manutenção da integridade e conformação das fracçães específicas isoladas. Evitam-se quaisquer reagentes que possam por si próprios serem tóxicos (tolerados de forma inaceitável) ou que influenciem de qualquer forma ou alterem de outro modo uma resposta imune.The vesicles of bacterial membranes and desired ribosomes can be conveniently and economically isolated from a suitable source of S. bacterial cells. marcescens, in stationary or log phase by means of the process of the invention, which is a simple, fast and reproducible procedure. Reagents are used that provide the necessary conditions for maintaining the integrity and conformation of the specific isolated fractions. Any reagents that may themselves be toxic (tolerated unacceptably) or that influence in any way or otherwise alter an immune response are avoided.
procedimento de isolamento preferido envolve cultivar um lote de sementeira das células bacterianas num meio de cultura adequado a uma temperatura adequada (302C-40SC) para se obter uma cultura em fase logarítmica (uma dada fase do crescimento está relacionada com o rendimento e consistên cia do produto final assim como o está a densidade final das células viáveis por volume unitário do meio de cultura processado); arrefecer rapidamente a cultura em fase logarítmica para 0-42C; recolher as células bacterianas; lavar e suspender as células recolhidas para uma densidade especificada num sistema de tampão adequado que mantém um ambiente adequado para a formação e estabilidade das vesículas de mem brana e para a estabilidade da ribossomas; romber abrindo (lise) as células num dispositivo de rompimento de células adequado ou numa célula de pressão Francesa para produzir vje sículas de membrana com um diâmetro superior a cerca de 110 nm ou com 0,11 micron (o rompimento das células ocorre na presença de um detergente adequado para facilitar a dissociaThe preferred isolation procedure involves cultivating a bacterial cell sowing lot in a suitable culture medium at an appropriate temperature (302C-40SC) to obtain a culture in the log phase (a given growth phase is related to the yield and consistency of the final product as well as the final density of viable cells per unit volume of the processed culture medium); rapidly cool the culture in the log phase to 0-42C; collect bacterial cells; washing and suspending the harvested cells to a specified density in a suitable buffer system that maintains a suitable environment for the formation and stability of the membrane vesicles and for the stability of the ribosomes; rupture by opening (lysis) the cells in a suitable cell disruption device or in a French pressure cell to produce membrane particles with a diameter greater than about 110 nm or 0.11 micron (cell disruption occurs in the presence of a suitable detergent to facilitate dissociation
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-12ção da endotoxina); retirar dos lisados de células bactéria nas os detritos celulares, incluindo células intactas, fragmentos de paredes de células e grandes agregados de ribossomas e polissomas, depositar o lisado celular limpo contendo as vesículas e os constituintes celulares solúveis restantes, num material adequado de gradiente de densidade linear ou descontínuo, que seja não tóxico (tolerância aceitável); e não imunogénico; agregar as fracçães de vesícula e ribossoma adequadas embora minimizando a agregação de fracçães meno res inaceitáveis; remover assepticamente o material de gradiente de densidade; lavar a fracção agregada e em seguida ressuspender uniformemente as vesículas de membrana e ribossomas com rompimento mínimo, num sistema tampão adequado.-12 endotoxin action); remove bacterial lysates from cell debris, including intact cells, fragments of cell walls and large aggregates of ribosomes and polysomes, deposit the clean cell lysate containing the vesicles and the remaining soluble cell constituents, on a suitable density gradient material linear or discontinuous, which is non-toxic (acceptable tolerance); and not immunogenic; aggregate the appropriate vesicle and ribosome fractions while minimizing the aggregation of less unacceptable fractions; aseptically remove the density gradient material; wash the aggregate fraction and then resuspend the membrane vesicles and ribosomes evenly with minimal disruption, in a suitable buffer system.
Ao conduzir o procedimento de isolamento acima descri to, pode efectuar-se o arrefecimento rápido da cultura em fa se logarítmica para 0-4QC por qualquer meio adequado, como por exemplo, utilizando uma mistura de gelo seco-álcool, uma mistura de acetona-gelo, uma mistura de álcool-gelo, ou dispositivos especiais como por exemplo serpentinas de refrigera ção. Todos os passos posteriores são preferivelmente conduzidos a 0-42C. A colheita de células pode ser efectuada por centrifugação, ou podem usar-se em alternativa dispositivos de colheita/concentração de células. A limpeza de detritos celulares e o isolamento da fracção de vesículas específicas podem ser todas efectuadas por centrifugação.By conducting the isolation procedure described above, the culture in the log phase can be rapidly cooled to 0-4 ° C by any suitable means, such as using a dry ice-alcohol mixture, a mixture of acetone- ice, an alcohol-ice mixture, or special devices such as cooling coils. All subsequent steps are preferably carried out at 0-42C. Cell collection can be performed by centrifugation, or cell collection / concentration devices can be used instead. The cleaning of cellular debris and the isolation of the fraction of specific vesicles can all be carried out by centrifugation.
As fracçães de ribossoma e de vesícula de membrana também podem ser isoladas através da utilização de cromatografia de exclusão por tamanhos. Faz-se passar o lisado celular clarificado através de géis como por exemplo Sephadex G-25, G-50, G-100, G-200, Sepharose 2B, Sephacryl S-200, Sephacryl-500 Biogel P-30, Sepharose 4B, TSK HW-75F Fractogel (todas marcas registadas) ou quaisquer outros géis seroe lhantes com um limite de exclusão molecular de cerca de 5000 a 40.000.000 daltons. Carrega-se o lisado celular clarifica do numa coluna pré-saturada. As vesículas de membrana apare, cem no volume livre enquanto as outras proteínas, resíduosThe ribosome and membrane vesicle fractions can also be isolated using size exclusion chromatography. The clarified cell lysate is passed through gels such as Sephadex G-25, G-50, G-100, G-200, Sepharose 2B, Sephacryl S-200, Sephacryl-500 Biogel P-30, Sepharose 4B, TSK HW-75F Fractogel (all trademarks) or any other similar gels with a molecular exclusion limit of about 5000 to 40,000,000 daltons. The clarified cell lysate is loaded onto a pre-saturated column. The membrane vesicles appear, 100 in the free volume while the other proteins, residues
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-13celulares e detergentes são eluídos em volumes maiores. Por exemplo, carrega-se 1 ml de lisado clarificado numa coluna de 10 ml de Sephadex G-100 (TM) e elui-se com tampão. As ve. sículas de membrana aparecem no volume livre. Outras proteí. nas e produtos celulares eluem-se para volumes maiores. 0 produto pode ser feito passar repetidamente na coluna mas ca da passagem provoca pelo menos uma diluição dupla da amostra. 0 produto pode ser (se necessário) concentrado por ultra-fil tração ou por centrifugação.-13 cell phones and detergents are eluted in larger volumes. For example, 1 ml of clarified lysate is loaded onto a 10 ml column of Sephadex G-100 (TM) and eluted with buffer. The ve. membrane particles appear in the free volume. Other proteins. and cellular products elute to larger volumes. The product can be passed through the column repeatedly but each passage causes at least a double dilution of the sample. The product can be (if necessary) concentrated by ultrafiltration or by centrifugation.
As colunas e géis podem ser preparados de formas esté reis e livres de endotoxina como especificado pelos fabrica_n tes dos géis. Por exemplo, pode-se tratar o gel Sephadex (TM) em autoclave a 103 kPa em ciclo líquido durante 15 minu tos. Deixa-se arrefecer o material do gel para a temperatura ambiente, vaza-se numa coluna micro-limpa livre de endoto xina e empacotada a um caudal de 8-30 ml/hora. Pode verificar-se a contaminação por endotoxina do efluente da coluna pelo bem conhecido ensaio LAL.The columns and gels can be prepared in sterile and endotoxin-free ways as specified by the gel manufacturers. For example, you can treat the Sephadex (TM) gel in an autoclave at 103 kPa in a liquid cycle for 15 minutes. The gel material is allowed to cool to room temperature, poured onto an endotoxin-free micro-clean column and packaged at a flow rate of 8-30 ml / hour. Endotoxin contamination of the column effluent can be verified by the well-known LAL assay.
Um sistema tampão adequado para o isolamento das fraç_ çães de vesícula de membrana e ribossoma da invenção é constituído por MgSO^ 20 mM, NH^Cl 50 mM e Tris HC1 20 mM, pH 7,6; e para a suspensão final, pode usar-se este mesmo tampão ou solução isotónica salina tamponada com Tris ou fosfato. 0 sulfato de magnésio pode ser substituído por qualquer outra fonte de iões magnésio adequada, como por exemplo acetato de magnésio. Os componentes do sistema tampão e as suas concentraçães específicas podem variar desde que se mantenha a integridade da fracção de ribossoma e de vesícula de membrana isolada através do procedimento descrito. Pode substi. tuir-se o Tris-HCl por Trizma 7,1, Trizma 7,2 ou qualquer ou. tro agente tampão Tris adequado ajustado a pH de 7,0 a 7,6. Pode utilizar-se qualquer agente/sistema tampão que não alte re a integridade das vesículas de membrana ou ribossomas e que seja aceitavelmente tolerado pelos tecidos e organismo intacto, à concentração utilizada. 0 pH real do sistema tam pão deve ser compatível com a manutenção das vesículas e ri66 328A suitable buffer system for isolating the membrane and ribosome vesicle fractions of the invention consists of 20 mM MgSO4, 50 mM NH4Cl and 20 mM Tris HCl, pH 7.6; and for the final suspension, this same buffer or isotonic saline solution buffered with Tris or phosphate can be used. The magnesium sulfate can be replaced by any other suitable magnesium ion source, such as magnesium acetate. The components of the buffer system and their specific concentrations can vary as long as the integrity of the ribosome fraction and isolated membrane vesicle is maintained through the procedure described. You can replace it. replace Tris-HCl with Trizma 7.1, Trizma 7.2 or any other. another suitable Tris buffer agent adjusted to pH 7.0 to 7.6. Any buffering agent / system may be used which does not alter the integrity of the membrane vesicles or ribosomes and which is acceptably tolerated by the tissues and intact organism, at the concentration used. The actual pH of the breadboard system must be compatible with the maintenance of vesicles and ri66 328
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-14bossomas e dos tecidos em que o material é injectado.-14bosomes and the tissues in which the material is injected.
As células são lisadas de modo a causarem a fractura e corte da célula, de modo a produzir as vesículas de membra na. Pode utilizar-se qualquer técnica adequada que produza as vesículas de membrana desejadas. Verificou-se que era preferível efectuar a lise mecanicamente, por exemplo, num dispositivo de rompimento de células ou célula de pressão Francesa. A lise mecSnica conduzida é operada de modo a dar um corte suficiente para produzir as vesículas de membrana e ribossomas associados.The cells are lysed in order to cause the cell to fracture and cut, in order to produce the membrane vesicles. Any suitable technique that produces the desired membrane vesicles can be used. It was found that it was preferable to carry out the lysis mechanically, for example, in a cell disruption device or French pressure cell. The conducted mechanical lysis is operated in order to give a sufficient cut to produce the associated membrane vesicles and ribosomes.
Um procedimento de lise satisfatório consiste em utilizar um Micro fluidificador 110, Modelo 110T da Biotechnolo gy Development Corporation. A microfluidificação é a interacção dinâmica das duas correntes de fluídos bacterianos em microcanais definidos com precisão resultando na lise das bactérias e na produção de vesículas de membrana de dimensão uniforme. A suspensão bacteriana é transferida por bomba pa. ra a câmara de interacção do microfluidificador a uma pressão compreendida entre 69 MPa e 97 MPa, 6 a 12 vezes para as. segurar a lise das células e a forma adequada de tamanhos de vesículas. As condições óptimas são 76 MPa e nove passagens. Uma concentração celular adequada para microfluidificação (v£ lume celular; (volume celular + volume de tampão)) é de 0,16.A satisfactory lysis procedure is to use a Micro fluidizer 110, Model 110T from Biotechnolo gy Development Corporation. Microfluidification is the dynamic interaction of the two streams of bacterial fluids in precisely defined microchannels resulting in the lysis of bacteria and the production of uniformly sized membrane vesicles. The bacterial suspension is transferred by pa pump. for the microfluidizer interaction chamber at a pressure between 69 MPa and 97 MPa, 6 to 12 times for. insure cell lysis and the proper shape of vesicle sizes. The optimum conditions are 76 MPa and nine passes. A cell concentration suitable for microfluidification (cell volume; (cell volume + buffer volume)) is 0.16.
Quando se utiliza uma célula de pressão Francesa, a pressão de operação da célula deve originar um elevado grau de rompimento celular de modo a formar as vesículas de membra na adequadas. Uma pressão preferida é de cerca de 83 MPa, mas são também satisfatórias pressões na gama de 69 a cerca de 241 MPa.When using a French pressure cell, the operating pressure of the cell must cause a high degree of cell disruption in order to form the appropriate membrane vesicles. A preferred pressure is about 83 MPa, but pressures in the range of 69 to about 241 MPa are also satisfactory.
Uma célula de pressão Francesa satisfatória é o modelo n3. 343339, com capacidade até 276 MPa, vendida pela S.L.A satisfactory French pressure cell is model n3. 343339, with a capacity of up to 276 MPa, sold by S.L.
M. Instruments em Champagne, Illinois. Utiliza-se uma prensa hidráulica automática para pressurizar a célula, preferivelmente a um valor nominal de 83 MPa. Não se deixa oscilar a pressão mais do que cerca de +. 3,5 MPa. Pressões inferiores a 83 MPa (pressão da célula) resultam em lise substanci| 66 328M. Instruments in Champagne, Illinois. An automatic hydraulic press is used to pressurize the cell, preferably at a nominal value of 83 MPa. The pressure is not allowed to oscillate more than about +. 3.5 MPa. Pressures below 83 MPa (cell pressure) result in substantial lysis | 66 328
File NS. 46667NS File. 46667
-15almente inferior das células e aparecendo progressivamente mais vesículas inferiores a cerca de 110 nm. Abre-se a válvula de saída para permitir uma saída do lisado a um caudal de cerca de 20 ml por minuto. Contudo, também é aceitável um caudal de saída tão baixo como 1,0 ml/minuto (gama de 1 a 40 ml/minuto). 0 caudal deve produzir vesículas da gama especificada de dimensBes. A gama de concentração de células adequada para a passagem na célula de pressão Francesa é de 0,16 a 0,32 (volume celular : (Volume celular + volume de tampão)).-15% lower than cells and progressively more vesicles appearing below about 110 nm. The outlet valve is opened to allow the lysate to escape at a flow rate of about 20 ml per minute. However, an output flow rate as low as 1.0 ml / minute is also acceptable (range 1 to 40 ml / minute). The flow rate must produce vesicles of the specified range of dimensions. The cell concentration range suitable for passage in the French pressure cell is 0.16 to 0.32 (cell volume: (Cell volume + buffer volume)).
Deve utilizar-se um detergente para dissociar endotoxinas e fragmentos de membranas para partículas mais pequenas, mais facilmente separáveis. Um detergente não tóxico particularmente adequado para uso no procedimento de lise ce lular é o desoxicolato de sédio. Uma gama de concentrações finais adequada (de desoxicolato) é de 0,15 a 0,3%. Deve utilizar-se um detergente não tóxico (bem tolerado).A detergent should be used to dissociate endotoxins and membrane fragments into smaller, more easily separable particles. A non-toxic detergent particularly suitable for use in the cell lysis procedure is sodium deoxycholate. A suitable final concentration range (of deoxycholate) is 0.15 to 0.3%. A non-toxic (well-tolerated) detergent should be used.
produto da invenção é essencialmente livre de paredes celulares; endotoxina biologicamente activa como revela do por vários ensaios biológicos e estudos de toxicidade humana; e fragmentos de membranas celulares. 0 produto é ta.m bém isento de células intactas. Para conseguir isto, são preferivelmente utilizados dois passos de centrifugação. A primeira centrifugação é feita do modo seguinte:product of the invention is essentially free of cell walls; biologically active endotoxin as revealed by various biological assays and human toxicity studies; and fragments of cell membranes. The product is also free of intact cells. To achieve this, two centrifugation steps are preferably used. The first centrifugation is done as follows:
(a) recolhem-se 20 ml de lisado de células bacterianas frio durante o processo lítico numa garrafa de policarbo nato com rotor Beckman N9 30, 0-1SC, micro-limpa, esteriliza da. 0 número dessas garrafas de centrifugação preparadas é determinado pela quantidade de produto final que se pretende produzir. Este volume de lisado representa um R mj_n vertical, em operação de 72 mm e um Rmax útil de 95 mm. Centrifugam-se os tubos num rotor Beckman N2 30 pré-arrefecido (0-42C) a 16000 rpm, usando aceleração normal, numa ultracentrífuga Beckman. 0 tempo de centrifugação deve originar um valor mé dio de S clarificado entre R . e R x de 600. Os temmm max pos de centrifugação que dão origem a valores médio de S de(a) 20 ml of cold bacterial cell lysate are collected during the lytic process in a polycarbonate bottle with Beckman N9 30, 0-1SC, micro-clean, sterilized. The number of such prepared centrifuge bottles is determined by the amount of final product to be produced. This volume of lysate represents a vertical R m j_ n , in operation of 72 mm and a useful R max of 95 mm. The tubes are centrifuged in a pre-cooled (0-42C) Beckman N2 30 rotor at 16000 rpm, using normal acceleration, in a Beckman ultracentrifuge. The centrifugation time should give an average value of S clarified between R. and R x of 600. The maximum centrifugation values that give mean values of S of
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-16lisado inferior a 600 resultam em perdas significativas de produto. Valores de S significativamente acima de 600 (por exemplo 900S) podem conduzir a uma contaminação do produto final com vários componentes celulares tóxicos. Desde que não ocorra contaminação do produto, os valores mais elevados de S darão um rendimento superior de produto. Uma gama seou ra e útil é de cerca de 600-800S (média). Utilizando um rotor Beckman N2 30, garrafas de policarbonato e um volume de lisado de 20,0 ml, obtém-se um lisado clarificado com 600S em média com W t de 3,55 x 10 (operação de 20 minutos a | 16.000 rpm + 3 minutos para atingir a velocidade com acelera ção normal). Este procedimento remove células viáveis intaç, tas e células mortas e todos os fragmentos celulares e comp_o nentes sub-celulares grandes incluindo agregados de polissomas grandes com um valor médio de S superior a 600. 0 proce dimento de centrifugação é efectuado a 0-4SC. 0 travão é li bertado a 500-1000 rpm e deixa-se que o rotor pare. Para evitar o turbilhão do conteúdo do tubo, o travão não deve ser libertado abaixo de 500 rpm. A libertação do travão a valores de rpm superiores a 1000 apenas prolonga o processo de produção. Podem utilizar-se outros rotores e centrífugas (por exemplo Sorvall Superspeed e um rotor SS-34, centrífugas Beckman Superspeed e rotores de capacidade equivalente ou superior), desde que a metodologia seja equivalente.-16 flats less than 600 result in significant product losses. S values significantly above 600 (eg 900S) can lead to contamination of the final product with various toxic cellular components. As long as there is no contamination of the product, the higher S values will give a higher product yield. A safe and useful range is around 600-800S (average). Using a Beckman N2 30 rotor, polycarbonate bottles and a volume of lysate of 20.0 ml, a clarified lysate with 600S is obtained on average with W t of 3.55 x 10 (20 minutes operation at | 16,000 rpm + 3 minutes to reach speed with normal acceleration). This procedure removes viable cells, dead cells and cells and all large cell fragments and subcellular components including large polysome aggregates with an average S value greater than 600. The centrifugation procedure is performed at 0-4Â ° C. The brake is released at 500-1000 rpm and the rotor is allowed to stop. To avoid swirling the contents of the tube, the brake must not be released below 500 rpm. Releasing the brake at rpm values above 1000 only prolongs the production process. Other rotors and centrifuges (eg Sorvall Superspeed and an SS-34 rotor, Beckman Superspeed centrifuges and rotors of equivalent or greater capacity) may be used, provided the methodology is equivalent.
(b) Todos os procedimentos são efectuados a 0-4QC. 0 lisado clarificado é recolhido cuidadosa e assepticamente (15-16 ml de volume total), com uma seringa fria, esteriliza da, não pirogénica e uma agulha espinhal 18G (ou equivalente). A ponta da agulha é mantida alguns milímetros abaixo da superfície do lisado durante a colheita e deve ter-se mui, to cuidado para não tocar as paredes laterais do tubo da gaj? rafa de centrifugação e para não perturbar o agregado. 0 li sado recolhido é feito passar imediatamente através de um filtro frio de 0,45 ytun (por exemplo Millex-HA, Millipore) e recolhido em tubo(s) frio(s), esterilizado(s), não pirogénico(s), de plástico/vidro, de preferência não ligante(s).(b) All procedures are carried out at 0-4 ° C. The clarified lysate is collected carefully and aseptically (15-16 ml of total volume), with a cold, sterile, non-pyrogenic syringe and an 18G spinal needle (or equivalent). The tip of the needle is kept a few millimeters below the surface of the lysate during collection and care must be taken to avoid touching the side walls of the tube. centrifugation screen and not to disturb the aggregate. The collected liquid is passed immediately through a cold filter of 0.45 ytun (for example Millex-HA, Millipore) and collected in cold, sterile, non-pyrogenic tube (s), plastic / glass, preferably non-binding (s).
Após o primeiro passo de centrifugação e após filtra-After the first centrifugation step and after filtering
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-17ção, o lisado é imediatamente depositado em gradientes de s_a carose em garrafas de centrifugação de policarbonato, micro-limpas, esterilizadas e frias. 0 diluente utilizado é o sistema tampão acima descrito. Os gradientes estratificados são em seguida submetidos ao segundo passo de centrifugação.-17tion, the lysate is immediately deposited in carose gradients in polycarbonate, micro-clean, sterilized and cold centrifugation bottles. The diluent used is the buffer system described above. The stratified gradients are then subjected to the second centrifugation step.
Os parâmetros de isolamento do produto são os seguintes :The isolation parameters of the product are as follows:
(1) rendimento básico do produto (1-1,2 mg do produto/1,0 ml de lisado clarificado depositado/gradiente).(1) basic product yield (1-1.2 mg of product / 1.0 ml of deposited clarified lysate / gradient).
Rotor Beckman NQ 50:Beckman NQ 50 rotor:
gradiente: 4-5 ml de sacarose a 15 /o em peso, deposi.gradient: 4-5 ml of sucrose at 15% by weight, afterwards.
tada sobre 3,0 ml de sacarose a 30% em peso em garrafas de policarbonato - interface aguçada. A sacarose é estéril e sem endotoxina como revelado por um ensaio quantitativo de Limulus.over 3.0 ml of 30% by weight sucrose in polycarbonate bottles - sharp interface. Sucrose is sterile and without endotoxin as revealed by a quantitative Limulus assay.
Volume da amostra: 1,0 ml de lisado clarificado/filtrado.Sample volume: 1.0 ml of clarified / filtered lysate.
Centrifugação: 0-42C, aceleração lenta; 38000 rpm durante 60 minutos em velocidade.Centrifugation: 0-42C, slow acceleration; 38000 rpm for 60 minutes at speed.
(2) para aumentar a quantidade de produto isolado por centrifugação, podem utilizar-se os seguintes rotores:(2) to increase the amount of product isolated by centrifugation, the following rotors can be used:
Rotor Beckman N9 30:Beckman N9 30 rotor:
gradiente: 11,0 ml de sacarose a 15% em peso (dependendo do volume de lisado depositado) depositada sobre 9,0 ml de sacarose a 30% em peso em garrafas de policarbonato - i_n terface aguçada. A sacarose é estéril e sem endotoxina como determinado por um ensaio quantitativo de Limulus.gradient: 11.0 ml of sucrose at 15% by weight (depending on the volume of lysate deposited) deposited on 9.0 ml of sucrose at 30% by weight in polycarbonate bottles - sharp terface. Sucrose is sterile and without endotoxin as determined by a quantitative Limulus assay.
Volume da amostra: 4-5 ml de lisado clarificado/filtrado.Sample volume: 4-5 ml of clarified / filtered lysate.
Centrifugação: 0-42C; aceleração lenta; 30000 rpm;Centrifugation: 0-42C; slow acceleration; 30,000 rpm;
120 minutos em velocidade. 0 tempo em velocidade (aproximadamente) é ajustado para maximizar o rendimento e minimizar a contaminação. Isto depende do volume de lisado depositado. 0 ponto de destravamento ocorre a 1000 rpm. (Não infe-120 minutes at speed. The speed time (approximately) is adjusted to maximize throughput and minimize contamination. This depends on the volume of lysate deposited. The unlock point occurs at 1000 rpm. (Do not
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File 46667 —18— rior a 500 rpm). Ver as instruções dos fabricantes para as recomendações de destravamento para as combinações específicas de centrífuga/rotor.File 46667 —18— greater than 500 rpm). See manufacturers' instructions for unlocking recommendations for specific centrifuge / rotor combinations.
Rotor Beckman Ne 14:Beckman Ne 14 rotor:
gradiente: 100 ml de camada de sacarose a 25% em peso em garrafas de policarbonato. A sacarose é estéril e sem endotoxina como determinado por um ensaio quantitativo de Limulus.gradient: 100 ml of 25% by weight sucrose layer in polycarbonate bottles. Sucrose is sterile and without endotoxin as determined by a quantitative Limulus assay.
Volume da amostra: 150 ml de lisado clarificado/filtrado.Sample volume: 150 ml of clarified / filtered lysate.
Centrifugação: 0-42C, aceleração lenta, 14000 rpm, horas em velocidade, destravamento a 500 rpm durante a d_e saceleração.Centrifugation: 0-42C, slow acceleration, 14000 rpm, hours at speed, unlocking at 500 rpm during deceleration.
Rotor Beckman NQ 10:Beckman NQ 10 rotor:
gradiente: 200 ml de uma camada de sacarose a 25% em peso em garrafas de policarbonato. A sacarose é estéril e sem endotoxina como determinado por um ensaio quantitativo de Limulus.gradient: 200 ml of a 25% by weight sucrose layer in polycarbonate bottles. Sucrose is sterile and without endotoxin as determined by a quantitative Limulus assay.
Volume da amostra: 200 ml de lisado clarificado/filtrado.Sample volume: 200 ml of clarified / filtered lysate.
Centrifugação: 0-4QC, aceleração lenta, 10000 rpm;Centrifugation: 0-4 ° C, slow acceleration, 10,000 rpm;
horas em velocidade, destravamento a 500 rpm durante a d.e saceleração.hours in speed, unlocking at 500 rpm during deceleration.
segundo procedimento de centrifugação permite o is_o lamento, através de agregação, da fracção de vesícula de mejn brana de dimensão especificada e da fracção de ribossoma residual, deixando fracçÕes menores, como fragmentos de ADN, fragmentos de ARN, fragmentos de proteínas, fragmentos de pa. redes de células e fragmentos de membranas, nas regiões supe. riores do gradiente descontínuo. 0 tempo específico de centrifugação nestes rotores é tal que o produto final não é significativamente contaminado por componentes celulares indesejáveis, Se não se puderem alterar os tempos de centrifu gação para reduzir a quantidade dos contaminantes acima mencionados, pode utilizar-se o seguinte procedimento de lavagem:second centrifugation procedure allows isolation, through aggregation, of the white mejn vesicle fraction of specified size and of the residual ribosome fraction, leaving smaller fractions, such as DNA fragments, RNA fragments, protein fragments, fragments of pa . networks of cells and fragments of membranes in the supe regions. discontinuous gradient. The specific centrifugation time in these rotors is such that the final product is not significantly contaminated by undesirable cellular components. If the centrifugation times cannot be changed to reduce the amount of the contaminants mentioned above, the following washing procedure can be used :
cç
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-19Por exemplo, para o rotor Beckman N9 30:-19For example, for the Beckman N9 30 rotor:
a. ressuspendem-se os agregados (do Rotor Beckman N9 30 ou rotor equivalente, ver acima) com 10 ml de tampão adequado por cada 12 tubos. Transferem-se os agregados ressuspensos para um recipiente esté ril, não pirogénico micro-limpo. Lavam-se em seguida os tubos de centrifugação com 2 ml de tampão adequado por cada 10 tubos. Combina-se em sje guida a lavagem com os agregados ressuspensos no recipiente adequado. Mistura-se a solução utilizando repetidamente uma pipeta (10 vezes com uma seringa de 10 ml) ou agitando durante alguns segundos .The. The aggregates (from the Beckman Rotor N9 30 or equivalent rotor, see above) are resuspended with 10 ml of suitable buffer for each 12 tubes. The resuspended aggregates are transferred to a sterile, non-pyrogenic micro-clean container. The centrifuge tubes are then washed with 2 ml of suitable buffer for every 10 tubes. The washing is then combined with the resuspended aggregates in the appropriate container. Mix the solution repeatedly using a pipette (10 times with a 10 ml syringe) or stir for a few seconds.
b. transferem-se, com o auxílio de uma pipeta, 5 ml dos agregados ressuspensos para um tubo centrifugador esterilizado, não pirogénico de policarbona to, com um rotor NB 30, contendo 15 ml de tampão adequado.B. transfer, with the aid of a pipette, 5 ml of the resuspended aggregates to a sterile, non-pyrogenic polycarbonate centrifuge tube, with an NB 30 rotor, containing 15 ml of suitable buffer.
c. centrifugam-se os tubos durante 25 a 40 minutos, com aceleração e travagem normais.ç. tubes are centrifuged for 25 to 40 minutes, with normal acceleration and braking.
Podem utilizar-se outros tipos de centrífugas e de r_o tores desde que a metodologia seja equivalente (por exemplo, o rotor Beckman 50.2 Ti conduz a um tempo de operação mais curto utilizando os mesmos gradientes de tamanhos). Podem utilizar-se gradientes lineares adequados em vez do gradiente descontínuo.Other types of centrifuges and rotors can be used provided the methodology is equivalent (for example, the Beckman 50.2 Ti rotor leads to a shorter operating time using the same size gradients). Suitable linear gradients can be used instead of the discontinuous gradient.
Lava-se a fracção de agregado isolada de acordo com o procedimento acima descrito e em seguida suspende-se num dos líquidos ou tampães de suspensão adequados acima descritos e filtra-se esterilmente com um filtro adequado de 0,45 ou 0,22 yjn. 0 líquido de suspensão pode ser qualquer produto farma ceuticamente adequado ou de preferência de qualidade de reagente sem fracções que possam contribuir para a precipitação, degradação, agregação ou inibição funcional da fracção suspensa.The isolated aggregate fraction is washed according to the procedure described above and then suspended in one of the appropriate suspension liquids or buffers described above and sterilized through a suitable 0.45 or 0.22 æm filter. The suspension liquid can be any pharmaceutically suitable or preferably reagent quality product without fractions that may contribute to precipitation, degradation, aggregation or functional inhibition of the suspended fraction.
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-2 0A quantificação do produto é feita com base no teor de ácido nucleíco que è determinado pelas seguintes fórmulas:-2 0 The product is quantified based on the nucleic acid content which is determined by the following formulas:
E260 = 0,0373 -D,0079 («260/A280)E 260 = 0.0373 -D, 0079 (« 260 / A 280 )
Microgramas de Acido Nucleico = Α26θ/Α Nucleic Acid micrograms = Α 26θ / Α
280280
Dilui-se uma amostra de 0,05 ml do concentrado de pro duto ressuspenso no tampão de ressuspensão adequado de modo a que o valor de A26Q esteja entre 0,4 e 0,5 para os objectivos de normalização. Determinam-se em seguida as absorvâncias a 280 nm, 260 nm, 225 nm e 215 nm usando o tampão de suspensão como solução controlo. Após se ter determinado o teor de ácido nucleico, dilui-se o produto para uma concentração final de 1,0 mg de ácido nucleico por 0,5 ml de tampão. Pode calcular-se aproximadamente o teor de proteína usando a seguinte fórmula:A 0.05 ml sample of the resuspended product concentrate is diluted in the appropriate resuspension buffer so that the A 26Q value is between 0.4 and 0.5 for standardization purposes. The absorbances at 280 nm, 260 nm, 225 nm and 215 nm are then determined using the suspension buffer as a control solution. After the nucleic acid content has been determined, the product is diluted to a final concentration of 1.0 mg of nucleic acid per 0.5 ml of buffer. Approximately the protein content can be calculated using the following formula:
microgramas de Proteína/ML = 144(A215-A225).micrograms of Protein / ML = 144 (A 215 -A 225 ).
rendimento médio de produto usando a centrifugação é de 1,0 a 1,2 mg por 1,0 ml de lisado clarificado, A razão média de absorvâncias Α,^θ drão de 0,0626. 0 valor médio de E/óO & óe ^»^232 com um desvio padrão de 0,0007.average product yield using centrifugation is 1.0 to 1.2 mg per 1.0 ml of clarified lysate, the average absorbance ratio Α, ^ θ standard of 0.0626. The average value of E / OO & Oe ^ »^ 232 with a standard deviation of 0.0007.
Não se conhece completamente ainda a razão para a ele vada eficácia funcional (descrita a seguir) de produto com vesículas com esta dimensão. Contudo, crê-se que é importari /A θ óe 1»7626 com um desvio pa.The reason for the high functional efficacy (described below) of a product with vesicles of this size is not yet fully understood. However, it is believed to be import / A θ óe 1 »7626 with a deviation pa.
te o tamanho das vesículas de membrana como especificado, no meadamente um diâmetro médio de pelo menos 180 nm, e essencialmente um tamanho mínimo de cerca de 110 nm (15).have the size of the membrane vesicles as specified, notably an average diameter of at least 180 nm, and essentially a minimum size of about 110 nm (15).
A composição da invenção é essencialmente livre de e_n dotoxinas biologicamente activa e fracçães de paredes célula res, reduzindo claramente os problemas de toxicidade. Por exemplo, o produto da invenção não induz necrose/ulceração cutânea ou morte em ratos com quatro dias de idade como se mostra a seguir na Tabela 1. Neste estudo, injectaram-se ra tos C57B1/6 de quatro dias de idade com a composição da invenção na região da nuca (pescoço) e observaram-se para a ve rificação do desenvolvimento de necrose e/ou morte. Em adi-The composition of the invention is essentially free of biologically active e dotoxins and cell wall fractions, clearly reducing toxicity problems. For example, the product of the invention does not induce skin necrosis / ulceration or death in four-day-old rats as shown below in Table 1. In this study, four-day-old C57B1 / 6 mice were injected with the composition of the invention in the nape of the neck (neck) and were observed for verifying the development of necrosis and / or death. In addition
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-21ção, estes animais demonstraram ganho de peso normal, outro indicador da ausência de contaminantes tóxicos-21, these animals showed normal weight gain, another indicator of the absence of toxic contaminants
TABELA 1TABLE 1
ENSAIO DERMONECROTICODERMONECROTIC TEST
-----------Necrose/Morte---------Invenção----------- Necrosis / Death --------- Invention
Os pesos médios para o grupo de 100 yU-g a tg e a 24 horas depois da injecção foram de 1,72 g e 2,94 g respectiva mente. Os pesos médios para o grupo de 200 y^g a tQ, 24 horas e 6 dias após a injecção foram de 1,57 g, 2,16 g e 4,5 g respectivamente.The average weights for the 100 yU-g group at tg and 24 hours after injection were 1.72 g and 2.94 g respectively. The average weights for the 200 µg cat Q group , 24 hours and 6 days after injection were 1.57 g, 2.16 g and 4.5 g respectively.
ensaio de hipersensibilidade à histamina em ratos CFW com 8 semanas de idade também evidenciou uma ausência de toxicidade devida à endotoxina.Histamine hypersensitivity assay in CFW rats at 8 weeks of age also showed an absence of toxicity due to endotoxin.
TABELA 2 ) ENSAIO DE HIPERSENSIBILIDADE À HISTAMINATABLE 2) HISTAMINE HYPERSENSITIVITY TEST
A. DOSAGEM.DEA. DOSAGE.DE
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File N2 46667 3 Mortes por número total de ratos tratados a seguir a um challenge i.p. com 0,5 mg de difosfato de histamina (Sigma) 90 minutos após a administração. A endotoxina (0,5 microgra mas) administrada i.p. resulta em 50% de mortes após o chal lenge com histamina (7). Ratos, ratazanas e cobaias demons tram tipicamente respostas hipotérmicas após a administração de endotoxina ou challenge infeccioso enquanto desenvolvem hipertermia (1-22C) após administração da composição da invenção.File N2 46667 3 Deaths by total number of rats treated following a challenge ip with 0.5 mg of histamine diphosphate (Sigma) 90 minutes after administration. Endotoxin (0.5 micrograms) administered ip results in 50% of deaths after chalenge with histamine (7). Rats, rats and guinea pigs typically demonstrate hypothermic responses after administration of endotoxin or infectious challenge while developing hyperthermia (1-22C) after administration of the composition of the invention.
Além disso, injecçães únicas ou repetidas em ratos, ratazanas, cobaias e seres humanos (mais do que cem pacientes) não resultou em anergia, pruridos, DIC (coagulação intravascular disseminada), artrite adjuvante, anafilaxia (hipersensibilidade), elevação de enzimas hepáticas, ou necrose ou ulceração dos locais de injecção, para uma gama de dosagens de 5 yvg a 10 mg (administrados uma a três vezes por se mana em seres humanos). A dose total máxima numa semana não ultrapassou 12 mg. Não ocorreu necrose hemorrágica bilateral dos rins quando se administrou intravenosamente a coelhos.In addition, single or repeated injections in rats, rats, guinea pigs and humans (more than 100 patients) did not result in anergy, itching, DIC (disseminated intravascular coagulation), adjuvant arthritis, anaphylaxis (hypersensitivity), elevation of liver enzymes, or necrosis or ulceration of the injection sites, for a dosage range of 5 yvg to 10 mg (administered one to three times a week in humans). The maximum total dose in one week did not exceed 12 mg. No bilateral hemorrhagic kidney necrosis occurred when rabbits were administered intravenously.
As vesículas de membrana no produto da invenção são fa cilmente endocitosadas por monócitos e macrófagos como se observa por microscopia de contraste de fase. Sabe-se que a endocitose resulta em alteração da membrana da célula e que a circularização da membrana na linha celular monócito-macró fago activa estas células.The membrane vesicles in the product of the invention are easily endocyted by monocytes and macrophages as seen by phase contrast microscopy. It is known that endocytosis results in alteration of the cell membrane and that the circularization of the membrane in the monocyte-macrophage cell line activates these cells.
As células da linha celular monócito-macrófago são quebradas artificialmente em várias categorias funcionais re presentando cada uma, uma célula progressivamente mais diferenciada. Estas categorias (a terminologia pode variar) são: monócito, macrófago normal ou residente, macrófago estimulado, macrófago não-tumoricida activado e macrófago tumoricida activado. Quanto mais diferenciada for a célula, menos refractária ela é a vários tipos de estimulação mas mais restrita se pode tornar em funçães efectoras. Pelo contrário, em estados de doença avançada e de doença crónica, a linha celular monócito-macrófago torna-se progressivamente mais reThe cells of the monocyte-macrophage cell line are artificially broken down into several functional categories, each representing a progressively more differentiated cell. These categories (terminology may vary) are: monocyte, normal or resident macrophage, stimulated macrophage, activated non-tumoricidal macrophage and activated tumoricidal macrophage. The more differentiated the cell, the less refractory it is to various types of stimulation but the more restricted it can become in effector functions. On the contrary, in states of advanced disease and chronic disease, the monocyte-macrophage cell line becomes progressively more reactive.
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File N° 46667 —2 3— fractária à estimulação tal como acontece com o sistema imuno lógico em geral. Fora destes estados, apenas se demonstrou que o macrófago tumoricida activado era directamente citotóxico contra as células de tumor.File N ° 46667 —2 3— fracture to stimulation as with the immune system in general. Out of these states, the activated tumoricidal macrophage was only shown to be directly cytotoxic against the tumor cells.
Mais especificamente, observou-se endocitose de produ. to monécito-macrófago em relação às células murinas. Recolheram-se da cavidade peritoneal monócitos normais e macrófa gos residentes de ratos adultos C57B1 saudáveis, sem quaisquer procedimentos manipulativos precedentes e sem heparina. A população inicial de células aderentes consistia em mais de 90% de células redondas tendo as restantes a morfologia típica dos macrófagos. As populações de células redondas consistiam em monócitos e grande número de células com a apa. rência de linfócitos de tamanho médio. Todas as células endocitavam produto e eram portanto membros da linha celular monécito-macrófago.More specifically, production endocytosis was observed. monocyte-macrophage in relation to murine cells. Normal monocytes and resident macrophages from healthy C57B1 adult rats were collected from the peritoneal cavity, without any previous manipulative procedures and without heparin. The initial population of adherent cells consisted of more than 90% of round cells with the rest having the typical macrophage morphology. The round cell populations consisted of monocytes and a large number of cells with the apa. of medium-sized lymphocytes. All cells endocyte product and were therefore members of the monocyte-macrophage cell line.
Alguns minutos após a adição in vitro do produto da invenção a uma população purificada virgem de monócito-macró fago residente (célula arredondada), começaram a aparecer nu merosas vesículas pequenas, que aumentavam em tamanho e núme ro com o tempo, logo abaixo das membranas das células. A aç. tividade fagocitótica variava em proporção directa com a co_n centração da composição da invenção adicionada, ocorria morte auto-fagocitótica precedida por vacuolização extrema com manutenção de uma morfologia redonda da célula, quando a ccm centração da composição da invenção excedia 50 por 3 ml de meio/10^ células. Não se observou nem actividade fagocítótica nem activação celular a seguir à adição de endotoxina ou paredes de células BCG a várias concentrações, a populações idênticas de células. As células epiteliais do rim e de melanoma B16 não apresentavam actividade fagocitótica na pre sença da composição da invenção ou na presença de endotoxina ou paredes de células de BCG. Existe uma possibilidade de haver um receptor específico para um componente das vesículas e/ou ribossomas da invenção que pode ser o responsável pela internalização rápida aparente da composição da invenção pelos monócitos-macrófagos residentes. São também possí.A few minutes after the in vitro addition of the product of the invention to a purified virgin population of resident monocyte-macrophage (rounded cell), mere small vesicles began to appear, which increased in size and number over time, just below the membranes. of the cells. The action phagocytic activity varied in direct proportion to the concentration of the added composition of the invention, auto-phagocytic death occurred preceded by extreme vacuolization with maintenance of a round cell morphology, when the concentration of the composition of the invention exceeded 50 by 3 ml of medium / 10 ^ cells. Neither phagocytic activity nor cell activation was observed following the addition of endotoxin or BCG cell walls at various concentrations to identical populations of cells. Epithelial cells of the kidney and melanoma B16 did not show phagocytic activity in the presence of the composition of the invention or in the presence of endotoxin or BCG cell walls. There is a possibility that there is a specific receptor for a component of the vesicles and / or ribosomes of the invention that may be responsible for the apparent rapid internalization of the composition of the invention by resident monocyte-macrophages. They are also possible.
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-24veis outras explicações envolvendo interacções físicas e/ou químicas não-específicas (como por exemplo hidrofobicidade).-24 possible other explanations involving non-specific physical and / or chemical interactions (such as hydrophobicity).
A Tabela 3 a seguir apresentada, resume os resultados de um estudo de citotoxicidade de monócito-macrófago resideri te, em que se administrou a composição da invenção in vitro, usando concentrações de 0 a 100 y^g em intervalos de 5 /xg,Table 3 below, summarizes the results of a monocyte-macrophage cytotoxicity study in which the composition of the invention was administered in vitro, using concentrations from 0 to 100 µg in 5 µg intervals,
5 a frascos de 25 cm contendo 10 células de melanoma B16 como alvos e monócitos-macrófagos residentes peritoniais do ra to como células efectoras. As razões de efector para alvo são indicadas na coluna da esquerda. As células foram fixadas em etanol a 95% e coradas com hematoxilina de Mayer 96 horas após o início do ensaio. Os resultados indicados com sinal + significam que era facilmente visível um crescimento macroscópico com 80-100% de confluência. Um sinal - indica que não era visível crescimento macroscópico com uma população de células alvo ausente ou significativamente reduzida confirmada microscopicamente.5 to 25 cm flasks containing 10 B16 melanoma cells as targets and peritoneal resident monocyte macrophages of the rat as effector cells. Effector to target ratios are indicated in the left column. The cells were fixed in 95% ethanol and stained with Mayer's hematoxylin 96 hours after the start of the assay. The results indicated with a + sign mean that macroscopic growth with 80-100% confluence was easily visible. A - sign indicates that macroscopic growth was not visible with an absent or significantly reduced target cell population confirmed microscopically.
TABELA 3TABLE 3
ENSAIO DE CITOXICIDADE DE TUMORTUMOR CYTOXICITY TEST
RAZÃO CRESCIMENTO VISÍVEL (CONFLUENTE) A 96 H0VISIBLE GROWTH REASON (CONFLUENT) AT 96 H0
A partir da tabela anterior, pode ver-se que coçcentra ções específicas muito significativas da composição da inveri ção (5, 15 e 50 yx,g) induzem directamente a diferenciação de monócitos-macrófagos residentes peritoneais para um estado citotóxico de tumor. Conseguem-se elevados níveis de citoto xicidade para razões de efector - alvo de 2:1 ou inferiores. 0s efeitos citocidas de tumor observados foram de extrema va cuolização, contracção celular e/ou aumento na densidade de fase, e foram observados apenas 8 horas após a adição da cojnFrom the previous table, it can be seen that very significant specific co-concentrations of the composition of the inversion (5, 15 and 50 yx, g) directly induce the differentiation of peritoneal resident monocyte-macrophages into a cytotoxic tumor state. High levels of cytotoxicity are achieved for effector - target ratios of 2: 1 or less. The cytocidal effects of the tumor observed were of extreme vacolization, cell contraction and / or increase in phase density, and were observed only 8 hours after the addition of the cojn.
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File NS 46667NS 46667 File
-25posição da invenção nas concentrações eficazes.-25position of the invention in effective concentrations.
Estudos anteriormente publicados mostraram que os macrófagos não tumoricidas activados necessitavam de uma exposição de 18 horas a linfoquinas antes de matarem células alvo com monócitos e macrófagos residentes não respondentes. A actividade citotóxica induzida em monócitos/macrófagos residentes pelo produto da invenção é muito rápida e única. 0 facto de as culturas terem sido incubadas durante quatro dias antes da terminação demonstra a indução rápida e eficaz da função de célula efectõra e controlo a longo termo da célula ) alvo como resultado da administração da composição da invenção.Previously published studies showed that activated non-tumoricidal macrophages required 18 hours of exposure to lymphokines before killing target cells with non-responding resident monocytes and macrophages. The cytotoxic activity induced in resident monocytes / macrophages by the product of the invention is very rapid and unique. The fact that the cultures were incubated for four days before termination demonstrates the rapid and effective induction of the effector cell function and long-term control of the target cell as a result of administering the composition of the invention.
A capacidade do produto da invenção para alterar os níveis de contagem de glóbulos brancos (WBC) e os níveis de neutrófilos, é apresentada na Tabela 4. A Tabela 4 indica os níveis de WBC e de neutrófilo para uma série de pacientes humanos em fase terminal observados antes e depois da adminis tração da composição da invenção. Indicam-se os níveis de dosagem. Administrou-se o produto uma vez por semana durante três semanas. Pode verificar-se dos exemplos da Tabela 4 que o tratamento específico com a composição da invenção aumenta significativamente o número de glóbulos brancos e de neutrófilos. Nota-se que a alteração do número de glóbulos brancos não aumenta necessariamente para todas as dosagens nem para todos os pacientes. (Não diminui). Contudo, alguns pacientes, como se mostra na Tabela 4, respondem à admi nistração da composição da invenção com um aumento significa tivo do número de glóbulos brancos e de neutrófilos.The ability of the product of the invention to change white blood cell count (WBC) levels and neutrophil levels is shown in Table 4. Table 4 indicates WBC and neutrophil levels for a series of terminally ill human patients. observed before and after administration of the composition of the invention. Dosage levels are indicated. The product was administered once a week for three weeks. It can be seen from the examples in Table 4 that the specific treatment with the composition of the invention significantly increases the number of white blood cells and neutrophils. It is noted that the change in the number of white blood cells does not necessarily increase for all dosages or for all patients. (It doesn't decrease). However, some patients, as shown in Table 4, respond to the administration of the composition of the invention with a significant increase in the number of white blood cells and neutrophils.
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-26TABELA 4-26TABLE 4
Neutrófilos 40-70%Neutrophils 40-70%
Os pacientes com baixo número de WBC antes da terapia entram na gama normal 24 horas depois da terapia.Patients with a low number of WBCs before therapy enter the normal range 24 hours after therapy.
A administração da composição da invenção também resulta no aumento de contagem mononuclear do sangue periférico humano (células killer naturais, células-T citotéxicas e/ou monócitos) e não resulta em trombocitopenia (dados não apresenta dos). 0 produto da invenção não tem assim um efeito citostá tico na espinal medula.Administration of the composition of the invention also results in increased mononuclear count of human peripheral blood (natural killer cells, cytotoxic T-cells and / or monocytes) and does not result in thrombocytopenia (data not shown). The product of the invention thus does not have a cytostatic effect on the spinal cord.
A função imunológica adequada requer a cooperação coordenada de vários tipos de células e a produção e libertação sequencial de numerosos produtos celulares. Sabe-se que as células da linha celular monócito-macrófago são fundamentais neste processo dado que as respostas a anticorpos óptimas (função de célula-B), imunidade mediada por células (função de célula-T), e possivelmente actividade de células ”killer naturais (NK), não ocorrem na sua ausência. Embora seja pos. sível elucidar várias vias celulares cooperativas em cultura de tecidos, não é possível determinar a multiplicidade de vias e de mecanismos de controlo operativo no paciente humano. Dado que, no paciente, os vários mecanismos efectoresAdequate immune function requires the coordinated cooperation of various types of cells and the sequential production and release of numerous cellular products. Monocyte-macrophage cell line cells are known to be critical in this process since optimal antibody responses (B-cell function), cell-mediated immunity (T-cell function), and possibly killer cell activity (NK) do not occur in their absence. Although it is pos. It is not possible to elucidate several cooperative cell pathways in tissue culture, it is not possible to determine the multiplicity of pathways and operative control mechanisms in the human patient. Since, in the patient, the various effector mechanisms
) 66 328) 66 328
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-27imunes específicos e/ou não específicos que ocorrem são essencialmente desconhecidos, um agente escolhido para potenciar/modificar a função imune deve aumentar quaisquer respos. tas em curso ou na ausência de respostas, diminuir o nível de resposta do sistema permitindo assim o reconhecimento, a£ tivação e selecção das funçães efectoras adequadas. 0 agente activador ideal não deve induzir respostas de hipersensibilidade anérgica ou aberrante, imuno-desviante dirigidas a si próprias ou a entidades de reacçOes cruzadas, ou promover ou dirigir a selecção de uma via efectora singular específica. 0 produto da invenção preenche estes requisitos já que não se observou nenhum destes fenómenos em níveis significativos du rante ensaios clínicos.-27 specific and / or non-specific immune that occur are essentially unknown, an agent chosen to enhance / modify immune function should increase any responses. in progress or in the absence of responses, decrease the level of response in the system thus allowing the recognition, activation and selection of the appropriate effector functions. The ideal activating agent should not induce anergic or aberrant, immuno-deviant hypersensitivity responses directed at themselves or cross-reactive entities, or promote or direct the selection of a specific single effector pathway. The product of the invention fulfills these requirements since none of these phenomena have been observed to a significant degree during clinical trials.
A Figura 2 ilustra a capacidade do modificador de res. posta biológica da invenção para estimular as células killer naturais humanas de forma comparável à do interferão de leucócito. 0 ensaio in vitro ilustra o grau de lise de célu las alvo (medido em termos de libertação de crómio radioacti vo das células alvo) por acção de células killer” naturais humanas para vários níveis de dosagem do produto da invenção e de interferão, apresentados nos gráficos respectivos. Os códigos de níveis de dosagem são dados abaixo de cada gráfico, representando o nível de dosagem zero o fundo ou nível de fuga de libertação de crómio das células alvo.Figure 2 illustrates the capacity of the res modifier. biological proposal of the invention to stimulate human natural killer cells in a manner comparable to that of leukocyte interferon. The in vitro assay illustrates the degree of lysis of target cells (measured in terms of the release of radioactive chromium from target cells) by the action of natural human killer cells for various dosage levels of the product of the invention and of interferon, shown in respective graphics. The dosage level codes are given below each graph, with the zero dosage level representing the background or escape level of chromium release from the target cells.
Os ensaios foram conduzidos de acordo com os descritos na literatura (8, 9). Marcaram-se células humanas K562 da linha de tumor mielóide com cromato de sódio radioactivo que serviram como células alvo. As células efectoras utilizadas foram células mononucleares de sangue humano periférico não depleccionadas. A mortalidade é calculada de acordo com a seguinte fórmula:The tests were conducted according to those described in the literature (8, 9). Human K562 cells from the myeloid tumor line were labeled with radioactive sodium chromate which served as target cells. The effector cells used were non-depleted peripheral human blood mononuclear cells. Mortality is calculated according to the following formula:
Libertação experimental-(menos) Libertação do controlo % de libertação = ---------------------x 100Experimental release- (less) Release control% release = --------------------- x 100
Libertação máxima-(menos)Maximum release - (less)
Libertação do controloRelease of control
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-28A libertação experimental é a contagem por minuto (CPM) de radioactividade na presença de produto e de células efectoras mais células alvo e a libertação do controlo é a contagem por minuto obtida com o uso de apenas células efectoras mais células alvo. A libertação máxima é obtida incubando uma alíquota de célula alvo em saponina, um detergente.-28The experimental release is the count per minute (CPM) of radioactivity in the presence of product and effector cells plus target cells, and the control release is the count per minute obtained using only effector cells plus target cells. Maximum release is achieved by incubating an aliquot of the target cell in saponin, a detergent.
Os resultados neste exemplo indicam que embora a indu ção de citotoxicidade de células killer naturais humanas na presença de monócitos não seja tão elevada como com o interferão, para razões relativamente inferiores de célula efeç. tora/célula alvo, ela ocorre definitivamente a um nível signi ficativo comparável ao da com interferão. A análise estatís tica de mais de 30 lotes de produtos demonstra que o produto da invenção é equivalente ou superior ao interferão de leucj5 cito na indução de citotoxicidade de células NK. A citotoxy cidade de células NK do produto é paralela à citotoxicidade induzida por interferão e depende de certas variáveis incluindo a idade e sexo do dador de sangue, processo de armazena gem das células e proporção dos tipos de células presentes.The results in this example indicate that although the cytotoxicity induction of human natural killer cells in the presence of monocytes is not as high as with interferon, for relatively lower ratios of cell effect. target cell / cell, it definitely occurs at a significant level comparable to that of interferon. Statistical analysis of more than 30 product batches demonstrates that the product of the invention is equivalent or superior to leukocyte interferon in inducing cytotoxicity of NK cells. The NK cell cytotoxicity of the product is parallel to the interferon-induced cytotoxicity and depends on certain variables including the blood donor's age and sex, cell storage process and proportion of cell types present.
Referindo agora a Figura 3, ilustram-se as propriedades bactericidas do modificador de resposta biológica da invenção. 0 gráfico da Figura 3 apresenta, em ordenadas, o lo gorltmo de Listeria monocytogenes em células peritoneais do rato. Em abcissas representa-se o tempo, em horas. A Listeria monocytogenes é uma bactéria que provoca meningite aguda em seres humanos com ou sem septicemia associada. 0 ensaio apresentado na Figura 3 é um ensaio padrão para a determinação da actividade bactericida. 0 controlo é proteose peptona que se sabe produzir macréfagos bactericidas mas que não é tolerado pelo Homem. 0 ensaio é descrito em Cruprinski, C.Referring now to Figure 3, the bactericidal properties of the biological response modifier of the invention are illustrated. The graph in Figure 3 shows, in ordinates, the Listeria monocytogenes logo in rat peritoneal cells. In abscissa, time is represented in hours. Listeria monocytogenes is a bacterium that causes acute meningitis in humans with or without associated septicemia. The assay shown in Figure 3 is a standard assay for determining bactericidal activity. The control is peptone proteose which is known to produce bactericidal macrophages but which is not tolerated by man. The test is described in Cruprinski, C.
Henson, P.M., e Campbell, P.A., 1984, J. Leukocyte Biol. 35:193.Henson, P.M., and Campbell, P.A., 1984, J. Leukocyte Biol. 35: 193.
As linhas no gráfico indicam a alteração no número de bactérias em cultura durante três horas quando são expostas a células colhidas das cavidades peritoneais do rato em vári as alturas e para vários passos pré-condicionantes diferen-The lines in the graph indicate the change in the number of bacteria in culture for three hours when they are exposed to cells harvested from the rat's peritoneal cavities at various heights and for several different preconditioning steps
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-29tes como se segue:-29tes as follows:
A. sem controlo de crescimento bacteriano, de células peritoneais ;A. without control of bacterial growth, of peritoneal cells;
B. injecção intraperitoneal de proteose peptona 14 dias antes da colheita;B. intraperitoneal injection of proteose peptone 14 days before harvest;
C. injecção intraperitoneal do produto da invenção 14 dias antes da colheita;C. intraperitoneal injection of the product of the invention 14 days before harvest;
D. injecção intraperitoneal do produto da invenção 7 dias antes da colheita;D. intraperitoneal injection of the product of the invention 7 days before harvest;
E. injecção intraperitoneal do produto da invenção 1 dia antes da colheita; eE. intraperitoneal injection of the product of the invention 1 day before harvest; and
F. injecção intraperitoneal de proteose peptona 1 dia antes da colheita.F. intraperitoneal injection of proteose peptone 1 day before harvest.
Como se pode ver na Figura 3, as linhas superiores, representando os controlos, indicam que as culturas cresceram constantemente. As situações em que as células foram cçi lhidas dos ratos após se terem injectado intraperitonealmente 0,2 mg do produto da invenção mostram que o crescimento diminui com diversos declives dependendo do tempo de injecção antes da colheita, coincidindo essencialmente com o controlo de proteose peptona na situação de 1 dia. Estes dados mostram que a actividade indutora bactericida do produto pe.r manece elevada mesmo 14 dias após uma única injecção. Assim, o efeito prolongado do modificador de resposta biológica da invenção na indução de macrófagos com actividade bactericida pronunciada demonstra a sua utilidade como agente terapêutico para infecções bacterianas.As can be seen in Figure 3, the upper lines, representing the controls, indicate that the cultures have grown constantly. The situations in which the cells were removed from the rats after 0.2 mg of the product of the invention were injected intraperitoneally show that growth slows with several slopes depending on the injection time before harvest, essentially coinciding with the control of peptone proteose in the 1 day situation. These data show that the bactericidal inducing activity of the product remains high even 14 days after a single injection. Thus, the prolonged effect of the biological response modifier of the invention on inducing macrophages with pronounced bactericidal activity demonstrates its usefulness as a therapeutic agent for bacterial infections.
Apresenta-se na Figura 4 a capacidade do modificador de resposta biológica da invenção para modular a actividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpos ADCC), Os procedimentos seguidos foram descritos na literatura (10, 11). Neste ensaio, utilizam-se monócitos de sangue humano periférico como células efectoras nas proporções de efector-alvo especificadas. As células alvo eram células murinas YAC marcadas com crómio e os anticorpos utilizado eram células an-Figure 4 shows the ability of the biological response modifier of the invention to modulate the cellular cytotoxicity activity dependent on ADCC antibodies). The procedures followed have been described in the literature (10, 11). In this assay, peripheral human blood monocytes are used as effector cells in the specified target effector ratios. The target cells were murine YAC cells labeled with chromium and the antibodies used were antigen cells
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-30ti-rato de coelho.-30 rabbit mouse.
Pode ver-se na Figura 4 que o nível de mortalidade, pe lo menos para razoes relativamente elevadas entre células efectoras e células alvo, é superior com o produto da invenção do que com o interferão para níveis de dosagem do produto de 15 y^g ou menos por mililitro, mas pareciam estar no nível de fundo para 20 ^ag/rnl (uma concentração que resulta em morte auto-fagocitótica da população de monécitos neste ensaio).It can be seen in Figure 4 that the level of mortality, at least for relatively high ratios between effector cells and target cells, is higher with the product of the invention than with interferon for product dosage levels of 15 µg or less per milliliter, but appeared to be at the bottom level at 20 µg / ml (a concentration that results in auto-phagocytic death of the monocyte population in this trial).
A capacidade do produto da invenção para estimular a libertação de interleuquina 1 (IL-1) é ilustrada na Figura 5. Os procedimentos de ensaio seguidos estão descritos na litera tura (12, 13). Prepararam-se células mononucleares de sangue periférico a partir de sangue retirado de sujeitos humanos a ensaiar. Incubaram-se as células com várias concentrações do produto da invenção. Após um período de incubação específico recolheram-se alíquotas do meio de cultura e ensaiaram-se num ensaio de blastogénese a várias diluições. Determinou-se a blastogénese pela contagem por minuto de timidina radioactiva (tritiada) absorvida por 106 timócitos murinos após 72 horas de incubação nos sobrenadantes da cultura recg lhida. Na Figura 5, indica-se o nível de fundo por círculos a cheio. Pode ver-se que, com a excepção da dose mínima de 1 /Ag/ml, ocorria estimulação significativa de libertação de IL-1. Encontram-se documentados na literatura os benefícios terapêuticos da libertação de IL-1 (14).The ability of the product of the invention to stimulate the release of interleukin 1 (IL-1) is illustrated in Figure 5. The test procedures followed are described in the literature (12, 13). Peripheral blood mononuclear cells were prepared from blood taken from human subjects to be tested. The cells were incubated with various concentrations of the product of the invention. After a specific incubation period, aliquots of the culture medium were collected and tested in a blastogenesis assay at various dilutions. Blastogenesis was determined by counting per minute of radioactive (tritiated) thymidine absorbed by 106 murine thymocytes after 72 hours of incubation in the supernatants of the harvested culture. In Figure 5, the bottom level is indicated by solid circles. It can be seen that, with the exception of the minimum dose of 1 / Ag / ml, significant stimulation of IL-1 release occurred. The therapeutic benefits of IL-1 release are documented in the literature (14).
Ilustra-se na Figura 6 o facto do efeito citotóxico contra alvos K562 ser devido às células killer naturais e não é afectado por células B ou T. Utilizaram-se células mg nonucleares do sangue humano periférico para a população efectora com as razões de efector/alvo especificadas. Pode verificar-se que, sem o produto da invenção ou na ausência de células killer naturais, o nível de fundo ou de fuga é inferior à libertação de 20% de crómio. Com uma população de células não reduzida, a administração do produto da invejo ção resulta numa estimulação evidente da citotoxicidade deIt is illustrated in Figure 6 that the cytotoxic effect against K562 targets is due to natural killer cells and is not affected by B or T cells. Peripheral human blood non-nuclear mg cells were used for the effector population for reasons of effector / specified target. It can be seen that, without the product of the invention or in the absence of natural killer cells, the background or leakage level is less than the release of 20% chromium. With an unreduced cell population, administration of the product of the envy results in an evident stimulation of the cytotoxicity of
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-31células killer naturais. A remoção de células B ou T da população com anticorpos monoclonais específicos não afecta significativamente o nível de citotoxicidade. Verifica-se que a remoção de células NK com anticorpos monoclonais elimina o efeito citotóxico. A remoção de monócitos com anticorpos monoclonais (não representada) também resulta em pej? da de citotoxicidade de células NK sugerindo que a célula NK é activada pela população de monócitos-macrófagos.-31 natural killer cells. The removal of B or T cells from the population with specific monoclonal antibodies does not significantly affect the level of cytotoxicity. It is found that the removal of NK cells with monoclonal antibodies eliminates the cytotoxic effect. Removal of monocytes with monoclonal antibodies (not shown) also results in pej? cytotoxicity of NK cells suggesting that the NK cell is activated by the monocyte-macrophage population.
Referindo agora a Figura 7, apresenta-se um gráfico dos resultados de um estudo in vivo no carcinoma de células esca mosas prostáticas da ratazana (tumores de crescimento rápido). Pode ver-se que a administração do produto da invenção induz a regressão de carcinomas grandes, estáveis, de cresci, mento rápido, em ratazanas. Todos os controlos com tumores não tratados morreram num período de 14 meses enquanto todos os animais tratados sobreviveram e 4 de cada 6 animais tive ram uma regressão total dos seus tumores. Ao conduzir estes estudos verificou-se que uma injecção paralesional semanal de 1 miligrama era eficaz enquanto uma injecção semanal de 2 miligramas não o era. 0 carcinoma específico tratado era o tumor de Dunning suhlirihageni R3327A, um tumor não dependente de hormonas, com velocidade de crescimento moderada a rápida que é metastático em estados avançados de doença. 0 hospedeiro do tumor era Copenhagen X Fisher F^. Este sistema de tumor é um modelo do National Prostatic Câncer Group. A implantação foi efectuada no flanco esquerdo. 0 volume mé3 dio do tumor no primeiro tratamento era de 681 mm .Referring now to Figure 7, a graph of the results of an in vivo study on rat prostate scaly cell carcinoma (fast growing tumors) is presented. It can be seen that administration of the product of the invention induces regression of large, stable, fast-growing carcinomas in rats. All controls with untreated tumors died over a period of 14 months while all treated animals survived and 4 out of 6 animals had a complete regression of their tumors. In conducting these studies it was found that a weekly injection of 1 milligram was effective while a weekly injection of 2 milligrams was not. The specific carcinoma treated was Dunning suhlirihageni R3327A tumor, a non-hormone-dependent tumor, with moderate to rapid growth rate that is metastatic in advanced disease states. The tumor host was Copenhagen X Fisher F1. This tumor system is a model of the National Prostatic Cancer Group. The implantation was carried out on the left flank. The average tumor volume in the first treatment was 681 mm.
Referindo agora a Figura 8, ilustra-se um estado do produto da invenção relativamente ao carcinoma prostático de crescimento lento da ratazana. Os hospedeiros do tumor foram Copenhagen X Fisher F^. Este sistema representa outro modelo de tumor do National Prostatic Câncer Group. A implantação foi efectuada na flanco esquerdo. 0 tratamento consistiu em injecções paralesionais de 2 mg de sete em sete dias. 0 volume médio de tumor no início do tratamento era de 1138,8 mm ( < 2 cm ). 0 carcinoma específico era o tumor de Dunning súblinhagem R3327H, que é um adenocarcinona bemReferring now to Figure 8, a state of the product of the invention is illustrated with respect to rat slow-growing prostatic carcinoma. The tumor hosts were Copenhagen X Fisher F ^. This system represents another tumor model of the National Prostatic Cancer Group. The implantation was carried out on the left flank. The treatment consisted of 2 mg paralesional injections every seven days. The average tumor volume at the start of treatment was 1138.8 mm (<2 cm). The specific carcinoma was Dunning tumor R3327H, which is an adenocarcinone well
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-32diferenciado, demonstrando uma velocidade de crescimento mui. to lenta.-32 differentiated, demonstrating a very fast growth rate. so slow.
Na Figura 8, pode notar-se que o produto da invenção induzia a estabilização/regressão de carcinomas grandes esta belecidos de crescimento lento em ratazanas. Todos os animais de controlo, não tratados, com tumores, demonstraram uma doença progressiva, morte e perda de peso enquanto todos os animais tratados revelaram uma estabilização da doença, regressões lentas progressivas (indicadas pela patologia), peso normal e sem mortes. Neste caso, enquanto a injecção paralesional semanal de 2 mg era eficaz, uma injecção parale sional semanal de 1,0 mg não o era. Os dois sistemas de tumor acima referidos demonstraram a variância efectiva de dosagem esperada com tumores diferentes.In Figure 8, it can be noted that the product of the invention induced the stabilization / regression of large slow-growing carcinomas in established rats. All control animals, untreated, with tumors, showed progressive disease, death and weight loss while all treated animals showed stabilization of the disease, slow progressive regressions (indicated by the pathology), normal weight and no deaths. In this case, while the 2 mg weekly paralesional injection was effective, a 1.0 mg weekly parallel injection was not. The two tumor systems mentioned above demonstrated the effective dose variance expected with different tumors.
Referindo agora a Figura 9, apresenta-se um estudo de tumores do tipo adenocarcinoma, prostáticos bilaterais da ra tazana. Fazem-se comparações com um grupo de controlo com hospedeiros submetidos a orquiectomia, orquiectomia mais dosagem com o produto da invenção, esteróides mais dosagem com o produto da invenção e apenas dosagem com o produto da invenção. São feitas comparações com tumores do flanco esquejr do e flanco direito.Referring now to Figure 9, a study of adenocarcinoma tumors, bilateral prostate of the rat is presented. Comparisons are made with a control group with hosts undergoing orchiectomy, orchiectomy plus dosage with the product of the invention, steroids plus dosage with the product of the invention and only dosage with the product of the invention. Comparisons are made with tumors on the left and right flank.
Na Figura 9, pode ver-se que o produto da invenção in duziu a regressão de adenocarcinomas de crescimento moderada mente rápido, muito grandes (volume total superior a 5 cm ). Os animais tratados receberam injecçães paralesionais semanais de 1 mg apenas no tumor do flanco esquerdo. Os dados demonstram o efeito sistémico da terapia (regressão de lesões não tratadas contralaterais) utilizando o produto da in venção e a perda de inibição do efeito do modificador de res. posta biológica pelo esteróide, dexametasona. Não se verifi cou a inibição da resposta hipertérmica ou tumoral pela dexa metasona em pacientes humanos com tumores.In Figure 9, it can be seen that the product of the invention induced regression of moderately fast, very large growth adenocarcinomas (total volume greater than 5 cm). Treated animals received weekly paralesional injections of 1 mg in the left flank tumor only. The data demonstrate the systemic effect of therapy (regression of untreated contralateral lesions) using the product of the invention and the loss of inhibition of the effect of the res modifier. biological use by the steroid, dexamethasone. There was no inhibition of the hyperthermic or tumoral response by dexa metasone in human patients with tumors.
Conduziram-se estudos clínicos humanos in vivo utilizando o produto da invenção segundo regulamentos e procedimentos para ensaios de Fase I e Fase II promulgados pela ) 66 328In vivo human clinical studies have been conducted using the product of the invention according to regulations and procedures for Phase I and Phase II tests promulgated by) 66 328
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Food and Drug Administration dos Estados Unidos. Os estudos de Fase I foram efectuados com o fim de determinar a toxicidade, se existente, do produto da invenção. De acordo com os ensaios da Fase I, os pacientes estudados encontravam -se num estado de doença avançada, que se considerava terminal, e nos quais tinha falhado toda a terapia anterior. Estes pacientes receberam três a seis tratamentos em cada um dos níveis de dosagem indicados, administrados de 7 em 7 dias subcutaneamente num local afastado do tumor. Os ensaios de toxicidade não indicaram problemas de toxicidade significativos e revelaram que o produto era bem tolerado pelo Homem.United States Food and Drug Administration. Phase I studies were carried out to determine the toxicity, if any, of the product of the invention. According to Phase I trials, the patients studied were in a state of advanced disease, which was considered terminal, and in which all previous therapy had failed. These patients received three to six treatments at each of the indicated dosage levels, administered every 7 days subcutaneously at a site away from the tumor. Toxicity tests did not indicate any significant toxicity problems and revealed that the product was well tolerated by man.
Ao mesmo tempo, notou-se contudo um efeito terapêuti-At the same time, however, a therapeutic effect was noted
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desconhecido pri mário estávelunknown stable primary
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4,0, 6,0 pulmão estável4.0, 6.0 stable lung
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Os dados acima apresentados revelam uma taxa de respos. ta de 46$ em pacientes com doença avançada terminal, em que falhou toda a terapia anterior.The data presented above reveal a response rate. of 46 $ in patients with advanced terminal disease, in which all previous therapy failed.
nível de dosagem específica e o intervalo de tratamento escolhido para a terapia num paciente humano variaváspecific dosage level and the chosen treatment interval for therapy in a human patient will vary
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-36frequentemente de paciente para paciente. Os factores que influenciam o nível de dosagem e intervalo de tratamento inç luem características, tipo particular e extensão da doença, saúde geral do paciente, localização da doença, etc.. Isto não é essencialmente diferente de outros modificadores de resposta biológicos e os esquemas de dosagem mais benéficos podem ser determinados de acordo com técnicas usadas em rela ção a esses outros modificadores de resposta biológica e com outros produtos farmacêuticos em geral.-36 often from patient to patient. The factors that influence the dosage level and treatment interval include characteristics, particular type and extent of the disease, general health of the patient, location of the disease, etc. This is not essentially different from other biological response modifiers and treatment regimens. more beneficial dosages can be determined according to techniques used in relation to these other biological response modifiers and with other pharmaceutical products in general.
facto de a eficácia poder ser altamente significati va em certas doenças quando comparada com outros tratamentos disponíveis é evidenciado pelos dados apresentados na Tabela 6, a seguir, em relação ao tratamento do tumor do cérebro, por exemplo glioblastoma. Os dados da Tabela 6 indicam que para seis casos de tumores do cérebro, três mostraram diminuição no tamanho do tumor mesmo com tratamento limitado. Es. te facto indica claramente que o modificador de resposta bio lógica da invenção demonstra uma eficácia em relação a este tipo particular de tumor.The fact that the efficacy can be highly significant in certain diseases when compared to other available treatments is evidenced by the data presented in Table 6, below, in relation to the treatment of the brain tumor, for example glioblastoma. The data in Table 6 indicate that for six cases of brain tumors, three showed a decrease in tumor size even with limited treatment. Es. The fact clearly indicates that the biological response modifier of the invention demonstrates an efficacy with respect to this particular type of tumor.
TABELA 6TABLE 6
RESUMO DAS RESPOSTAS DE PACIENTES - TUMORES DO CEREBROSUMMARY OF PATIENT RESPONSES - BRAIN TUMORS
particularmente notável do fenómeno de degradação são as populações em partículas do produto da invenção que permanecemparticularly notable of the degradation phenomenon are the particulate populations of the product of the invention that remain
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-37intactas no sistema biológico apenas durante um certo período de tempo suficiente para activar a reacção imune, e em se guida se degradam rapidamente. Assim, evita-se o desenvolvi, mento de reacçães patofisiológicas crónicas graves, como resultado de activação imune crónica* A degradação é devida à presença de várias enzimas (por exemplo, RNases, proteases, lipases) em vários tipos de células (por exemplo monócitos, macrófagos, neutrófilos) e fluidos tissulares (por exemplo sangue, linfa). Esta degradação é mais rápida a temperaturas elevadas (por exemplo temperatura do corpo, 372C) e tor| na-se progressivamente mais lenta à medida que a temperatura diminui. A 37QC e concentração de soro de 95%, o produto de, grada-se (in vitro) em menos de cerca de dois minutos como determinado por análise de tamanho de partículas. A velocidade de degradação é dependente da concentração de enzimas e da temperatura. Quando ocorre a degradação, a eficácia da composição como agente imuno-modulador é significativamente diminuída.-37 intact in the biological system only for a period of time sufficient to activate the immune reaction, and then degrade rapidly. Thus, the development of serious chronic pathophysiological reactions is avoided as a result of chronic immune activation * Degradation is due to the presence of several enzymes (eg RNases, proteases, lipases) in various types of cells (eg monocytes , macrophages, neutrophils) and tissue fluids (eg blood, lymph). This degradation is more rapid at elevated temperatures (eg body temperature, 372C) and tor | it becomes progressively slower as the temperature decreases. At 37 ° C and serum concentration of 95%, the product is graded (in vitro) in less than about two minutes as determined by particle size analysis. The rate of degradation is dependent on the concentration of enzymes and temperature. When degradation occurs, the effectiveness of the composition as an immunomodulating agent is significantly decreased.
Referindo agora a Figura 10, apresenta-se a indução in vivo nos seres humanos da citotoxicidade de célula killer contra três tumores alvo diferentes. Para a maior parte dos indivíduos, as células mononucleares do sangue perifé . rico matarão células alvo de tumor K562 in vitro, em alguma extensão. Contudo, as células mononucleares de sangue periférico não matarão as linhas de célula de tumor de Raji e do Colon 38. 0 tratamento de pacientes por administração ín vivo de vários modificadores de resposta biológica, incluindo interleuquina II (IL-2) não revelou alterar o nível de morta lidade em relação às últimas duas células alvo. Apenas no tratamento in vitro de células mononucleares do sangue periférico com certos modificadores de resposta biológica, incluindo IL-2, induz estas células a matar outros tipos de células alvo de tumores diferentes de K562. Contudo, verificou-se que o modificador de resposta biológica da invenção é susceptível de alterar a capacidade das células mononucleares do sangue periférico para matar esses tumores alvo a seguir a um tratamento in vivo. Este facto sugere que a indução deReferring now to Figure 10, in vivo induction of killer cell cytotoxicity against three different target tumors is shown in humans. For most individuals, peripheral blood mononuclear cells. will kill K562 tumor target cells in vitro to some extent. However, peripheral blood mononuclear cells will not kill the Raji and Colon 38 tumor cell lines. Treatment of patients by in vivo administration of various biological response modifiers, including interleukin II (IL-2) has not been shown to alter the level of mortality in relation to the last two target cells. Only in the in vitro treatment of peripheral blood mononuclear cells with certain biological response modifiers, including IL-2, does it induce these cells to kill other types of tumor target cells other than K562. However, it has been found that the biological response modifier of the invention is capable of altering the ability of peripheral blood mononuclear cells to kill such target tumors following in vivo treatment. This fact suggests that the induction of
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-38célula LAK (célula T citotóxica) ocorre após administração do produto da invenção.-38 LAK cell (cytotoxic T cell) occurs after administration of the product of the invention.
A Figura 10 representa a medição da citotoxicidade de células killer em células mononucleares de sangue periférico obtidas de pacientes 24 horas após o tratamento com □ modificador de resposta biológica da invenção. Pode ver-se que resulta uma mortalidade significativa contra os três tipos de tumores alvo. Os dados demonstram activação in vivo significativa das células killer do paciente. 0 exame da população de células efectoras através de marcadores celulares específicos revela a presença de monócitos, células kil. ler naturais e células LAK activadas. Os aumentos em células killer naturais observadas em pacientes tratados (previ, amente discutido) e a presença de células killer naturais activadas neste ensaio demonstra a produção endógena de interferão nestes pacientes após tratamento com o produto da invenção. Em adição, a presença de células T citotóxicas aç, tivadas (células LAK) demonstra que o tratamento com o produ. to da invenção resulta na produção de IL—II endógeno. Outra característica única do produto da invenção é a de se poderem manter in vitro populações de células killer activadas in vivo, com concentrações muito baixas (2U IL-2/ml) de IL-2. Este facto contrasta com as elevadas concentrações de IL-2 (500-1000 U IL-2/ml) necessárias para manter in vitro células killer activadas IL-2 (células LAK).Figure 10 represents the measurement of killer cell cytotoxicity in peripheral blood mononuclear cells obtained from patients 24 hours after treatment with the biological response modifier of the invention. It can be seen that significant mortality results against the three types of target tumors. The data demonstrate significant in vivo activation of the patient's killer cells. Examination of the effector cell population using specific cell markers reveals the presence of monocytes, kil cells. read natural and activated LAK cells. The increases in natural killer cells observed in treated patients (previously discussed) and the presence of activated natural killer cells in this assay demonstrate the endogenous production of interferon in these patients after treatment with the product of the invention. In addition, the presence of activated cytotoxic T cells (LAK cells) demonstrates that treatment with the product. All of the invention results in the production of endogenous IL-II. Another unique feature of the product of the invention is that in vitro populations of killer cells activated in vivo can be maintained with very low concentrations (2U IL-2 / ml) of IL-2. This contrasts with the high concentrations of IL-2 (500-1000 U IL-2 / ml) necessary to maintain IL-2 activated killer cells (LAK cells) in vitro.
As células mononucleares de sangue periférico usadas foram obtidas a partir de sangue total recolhido de pacientes 24 horas após infecção com o modificador de resposta bio lógica da invenção. As injecções eram subcutâneas e variavam de um a quatro miligramas por dose, dadas 3 vezes por s_e mana. Efectuaram-se os ensaios antes e 24 horas depois da injecção. 0 nível de citotoxicidade obtido com células acti vadas in vivo compara-se favoravelmente com a actividade de células killer activadas com linfoquina in vitro (IL-2) obtidas após cultura de células mononucleares de sangue huma no periférico com IL-2.The peripheral blood mononuclear cells used were obtained from whole blood collected from patients 24 hours after infection with the invention's biological response modifier. The injections were subcutaneous and ranged from one to four milligrams per dose, given 3 times per week. Tests were performed before and 24 hours after injection. The level of cytotoxicity obtained with cells activated in vivo compares favorably with the activity of lymphokine-activated killer cells in vitro (IL-2) obtained after culturing human blood mononuclear cells in the peripheral with IL-2.
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-39A superioridade de vesículas de membrana e ribossomas derivados de organismos do tipo reivindicado, como Serratia marcescens, comparada com outras fontes, ê sugerida pelos da dos obtidos de ensaios comparativos com células killer” naturais (Figurasll e 12). Preparou-se o produto pelo processo acima descrito a partir dos organismos indicados. As vesículas preparadas a partir de cada um destes organismos enccntravam-se dentro dos parâmetros físicos e químicos acima estabelecidos.-39The superiority of membrane vesicles and ribosomes derived from organisms of the claimed type, such as Serratia marcescens, compared to other sources, is suggested by those obtained from comparative tests with natural killer cells ”(Figures 11 and 12). The product was prepared by the above described process from the indicated organisms. The vesicles prepared from each of these organisms were within the physical and chemical parameters established above.
facto de a fonte de um dado produto bacteriano influenciar o tipo e/ou grau de actividade biológica não é novo neste campo. Estirpes diferentes de BCG apresentam níveis específicos de activação imune em modelos animais e clinicamente. As vacinas de ribossomas (previamente discutidas) provocam a activação diferencial do sistema imunológico dependendo do organismo fonte e tem sido sugerida a superioridade de polirribossomas obtidos de Serratia quando comparadas com outras fontes (6). Na publicação citada, a administração de tampão isolado e polissomas bacterianos derivados de outras espécies bacterianas (Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium bovis (BCG), Mycobacterium smegmatis, e Propionibacterium acnes) eram pouco superior a um grupo de controlo de ratos que não receberam tratamento (aparecimento de tumor e morte em 60 dias). Por outro lado, ospolissomas obtidas de Serratia marcescens, em certas dosagens, demonstraram ausência de aparecimento de tumores em 60/ ou mais dos animais e supressão do desenvolvimento de tu mores nos restantes animais.The fact that the source of a given bacterial product influences the type and / or degree of biological activity is not new in this field. Different strains of BCG show specific levels of immune activation in animal models and clinically. Ribosome vaccines (previously discussed) cause differential activation of the immune system depending on the source organism and the superiority of polyribosomes obtained from Serratia has been suggested when compared to other sources (6). In the cited publication, the administration of isolated buffer and bacterial polysomes derived from other bacterial species (Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium bovis (BCG), Mycobacterium smegmatis, and Propionibacterium acnes) were slightly superior to a control group of rats that did not receive treatment (appearance of tumor and death in 60 days). On the other hand, ospolysomes obtained from Serratia marcescens, in certain dosages, demonstrated the absence of tumors in 60 / or more of the animals and suppression of tumor development in the other animals.
Dado que o modificador de resposta biológica da inveri ção é obtido a partir de um microrganismo que não é membro da microflora do paciente, ele não está associado com doenças infecciosas em indivíduos normais, e dado que o antigénio bacteriano comum aos microrganismos não é ou é fracamente sjj jeito a reacçães cruzadas com organismos que fazem parte da microflora normal, evitam-se respostas imunes inadequadas. Essas respostas incluem por exemplo imuno-desvio e o fenóme-Since the biological response modifier of the invertion is obtained from a microorganism that is not a member of the patient's microflora, it is not associated with infectious diseases in normal individuals, and given that the bacterial antigen common to microorganisms is not or is not weakly as a result of cross-reactions with organisms that are part of the normal microflora, inadequate immune responses are avoided. These responses include, for example, immuno-deviation and the
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File N9 46667 —4 Οπό da ofensa antigánica original que é vulgarmente observada com os imuno-potenciadores correntemente desenvolvidos (por exemplo BCG, Ç. parvum, fracções de parede celulares). Provavelmente devido a estas razões, os agregados de polirribossomas preparados a partir de E. coli, M. smegmatis e Streptococcus pneumoniae são fontes muito fracas para respos. tas biológicas, enquanto S_. marcescens, que não faz parte e não sofre reacçÕes cruzadas com a microflora do hospedeiro, é uma fonte excelente do modificador de resposta biológica.File N9 46667 —4 Οπό of the original antigenic offense that is commonly observed with currently developed immuno-enhancers (eg BCG, Ç. Parvum, cell wall fractions). Probably due to these reasons, polyribosome aggregates prepared from E. coli, M. smegmatis and Streptococcus pneumoniae are very weak sources for responses. biological tests, while S_. marcescens, which is not a part of and does not cross-react with the host's microflora, is an excellent source of the biological response modifier.
Deve notar-se que existem outros microrganismos que são adequados como fonte de vesículas de membrana e de ribos. somas utilizadas na invenção. A característica básica desse microrganismo deve ser a do microrganismo não ser membro da microflora do paciente. Além disso, o antigénio bacteriano comum do microrganismo não deve reagir ou deve pelo menos ter reacções cruzadas fracas com organismos que fazem parte da microflora normal. Assim, o organismo não deve provocar uma resposta imuno-desviante. 0 organismo deve ser tal que não cause ou cause raramente doença nos seres humanos. Finalmente, o microrganismo fonte deve ser aquele em que a mem brana celular forme vesículas na gama de dimensões adequadas.It should be noted that there are other microorganisms that are suitable as a source of membrane vesicles and ribs. sums used in the invention. The basic characteristic of this microorganism must be that the microorganism is not a member of the patient's microflora. In addition, the microorganism's common bacterial antigen must not react or at least have weak cross-reactions with organisms that are part of the normal microflora. Thus, the organism must not elicit an immune-deviating response. The organism must be one that does not cause or rarely causes disease in humans. Finally, the source microorganism must be one in which the cell membrane forms vesicles in the appropriate size range.
Exemplos de fontes de microrganismos diferentes de Serratia marcescens são: Erwinia chrysanthemi (Pectobacterium) ATCC 14092; e, em menor extensão, Enterobacter aeroggnes ATCC E13048. As preparações das estirpes acima meneio nadas apresentam actividade do tipo acima descrito em ligação com preparações de S.. marcescens. Mais particularmente, a Figura 11 mostra que E/ aerogenes demonstra eficiência signi ficativamente superior à da Pseudomonas, E.. coli e E,. cloacae, embora inferior à do interferão alfa para níveis de dosagem específicos. De modo semelhante a Figura 12 compara E_. chrysanthemi (eficaz) com Flavobacterium (não eficaz) e interferão. Podem usar-se outros microrganismos como fontes e processarem-se como acima descrito para produzirem ribossomas e vesículas do tamanho especificado. Usando os ensaios in vitro acima descritos, pode avaliar-se facilmente a sua eficá| 66 32ΘExamples of sources of microorganisms other than Serratia marcescens are: Erwinia chrysanthemi (Pectobacterium) ATCC 14092; and, to a lesser extent, Enterobacter aeroggnes ATCC E13048. The preparations of the strains mentioned above show activity of the type described above in connection with preparations of S. marcescens. More particularly, Figure 11 shows that E / aerogens demonstrate significantly higher efficiency than Pseudomonas, E .. coli and E ,. cloacae, although lower than that of interferon alpha for specific dosage levels. Similarly, Figure 12 compares E_. chrysanthemi (effective) with Flavobacterium (not effective) and interferon. Other microorganisms can be used as sources and processed as described above to produce ribosomes and vesicles of the specified size. Using the in vitro assays described above, their effectiveness can be easily assessed | 66 32Θ
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-41cia para determinar se são ou não úteis como modificadores de resposta biológica.-41cia to determine whether or not they are useful as biological response modifiers.
Dado que o modificador de resposta biológica da inven, ção está isento de células viáveis, células mortas, paredes celulares e endotoxina biologicamente activa, minimiza-se o reconhecimento devido a reactividade cruzada, eliminando-se os componentes que são fracamente degradáveis e os componentes que se sabe serem altamente tóxicos (por exemplo endotoxina) ou que podem resultar em situações inflamatórias cróni, cas, por exemplo artrite adjuvante, granulomas, ulcerações, são minimizados ou eliminados. Em adição, minimizando os componentes de superfície de células eliminam-se as variações em respostas imunes que se sabe estarem associadas com a estirpe do organismo e com variações fenotípicas.Since the biological response modifier of the invention is free of viable cells, dead cells, cell walls and biologically active endotoxin, recognition due to cross-reactivity is minimized by eliminating components that are poorly degradable and components that are poorly degradable. they are known to be highly toxic (for example endotoxin) or to result in chronic inflammatory conditions, for example adjuvant arthritis, granulomas, ulcerations, are minimized or eliminated. In addition, by minimizing cell surface components, variations in immune responses that are known to be associated with the organism strain and phenotypic variations are eliminated.
As vantagens do modificador de resposta biológica da invenção são numerosas. Activando células da linha de células monócito-macrófago, promove-se a cooperação celular necessária para a função imune óptima. A activação de células recentemente diferenciadas da linha celular monócito-macrófa go (monócito, macrófago normal/residente) promove funções efectoras múltiplas. A composição da invenção tem até agora demonstrado indução de múltiplos tipos de funções efectoras dependentes da condição do ensaio ou parâmetros do hospedeiro da doença.The advantages of the biological response modifier of the invention are numerous. Activating cells from the monocyte-macrophage cell line promotes the necessary cellular cooperation for optimal immune function. Activation of newly differentiated cells from the monocyte-macrophage cell line (monocyte, normal / resident macrophage) promotes multiple effector functions. The composition of the invention has so far demonstrated induction of multiple types of effector functions depending on the condition of the assay or parameters of the disease host.
Tornar-se-ão óbvios para o especialista várias modifi cações da invenção, em adição àquelas aqui apresentadas e descritas a partir dos ensinamentos da especificação. Entejn de-se que essas modificações caem no âmbito das reivindicações anexas.Various modifications of the invention will become obvious to the skilled person, in addition to those presented and described here from the teachings of the specification. It should be noted that these modifications fall within the scope of the appended claims.
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-42NOTAS-42NOTES
1) Millman, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 147:765-768, 1974, Infect. Immun., 14:929-933, 1976.1) Millman, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 147: 765-768, 1974, Infect. Immun., 14: 929-933, 1976.
2) Thamas, D.W., e Weiss, E., Infect. Immun., 6:355-363, 1972.2) Thamas, D.W., and Weiss, E., Infect. Immun., 6: 355-363, 1972.
3) Klun, D.L. e Youmans, G.P., RES 3. Recticuloendo Thel. Soc., 13:263-274, 1873.3) Klun, D.L. and Youmans, G.P., RES 3. Recticuloendo Thel. Soc., 13: 263-274, 1873.
4) Smith, R.A., e Bigley, N.3., Infec. Immun., 6:384-389, 1972.4) Smith, R.A., and Bigley, N.3., Infec. Immun., 6: 384-389, 1972.
5) Swendsen, C.L., e Bohnson, W», Infec. Immun., 14:345-354, 1976.5) Swendsen, C.L., and Bohnson, W., Infec. Immun., 14: 345-354, 1976.
6) Câncer Research, 40:1501-1505, 1980.6) Cancer Research, 40: 1501-1505, 1980.
7) Bergman, R.K., et al., Infection and Immunity, 18:352-355, 1977.7) Bergman, R.K., et al., Infection and Immunity, 18: 352-355, 1977.
8) West, W.H., Cannon, G.B., Kay, H.D., Bonnard, G.D. e Herberman, R.B. (1977) Natural cytotoxic reactiuity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. 3. Immunolaqy 118:355.8) West, W.H., Cannon, G.B., Kay, H.D., Bonnard, G.D. and Herberman, R.B. (1977) Natural cytotoxic reactiuity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. 3. Immunolaqy 118: 355.
9) deLandazuri, M.O., Silva, A., Alvarez, 3. e Herberman, R.B. (1979) Evidence that natural cytotoxicity and antibody-dependent cellular cytotoxicity are mediated in humans by the same effector cell populations. 3. Immunoloqy 123:252.9) deLandazuri, M.O., Silva, A., Alvarez, 3. and Herberman, R.B. (1979) Evidence that natural cytotoxicity and antibody-dependent cellular cytotoxicity are mediated in humans by the same effector cell populations. 3. Immunoloqy 123: 252.
10) Fuson, E.W., VJhitten, H.D., Ayers, R.B. e Lamon, E.W. (1978) Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by human lymphocytes. I. comparison of Igm- and IgG-induced cytotoxicity. 3. Immunoloqy 120:1726.10) Fuson, E.W., VJhitten, H.D., Ayers, R.B. and Lamon, E.W. (1978) Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by human lymphocytes. I. comparison of Igm- and IgG-induced cytotoxicity. 3. Immunoloqy 120: 1726.
11) Kay, H.D., Bonnard, W.H., West, W.H. e Heberman, R.B. (1977) A functional comparison of human Fc-receptor-bearing lymphocytes active in natural cytotoxicity and anti body-dependent cellular cytotoxicity. 3, Immunoloqy 123: :252.11) Kay, H.D., Bonnard, W.H., West, W.H. and Heberman, R.B. (1977) A functional comparison of human Fc-receptor-bearing lymphocytes active in natural cytotoxicity and anti body-dependent cellular cytotoxicity. 3, Immunoloqy 123: 252.
12) Conlon, P.3. (1983) A rapid Biologic assay for the deteç.12) Conlon, P.3. (1983) A rapid Biologic assay for the detection.
) 66 328) 66 328
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-43tion of Interleukin 1. 3. Immunoloqy 131-1280.-43tion of Interleukin 1. 3. Immunoloqy 131-1280.
13) Wood, D.D., Bayne, E.K., Goldring, M.B., Gowen, M., Hamerman, D., Humes, 3.L., Ihrie, E.3., Lipsky, P.E. e Staruch, M.3. (1985) The four biochemically distinct species of human Interleukin 1 all exhibit similar biologic activities. 3. Immunolooy 134:895.13) Wood, D.D., Bayne, E.K., Goldring, M.B., Gowen, M., Hamerman, D., Humes, 3.L., Ihrie, E.3., Lipsky, P.E. and Staruch, M.3. (1985) The four biochemically distinct species of human Interleukin 1 all exhibit similar biologic activities. 3. Immunolooy 134: 895.
14) Dinarello, C.A., 1984, Neui Enqland 3. of Med., 311-1413-1418.14) Dinarello, C.A., 1984, Neui Enqland 3. of Med., 311-1413-1418.
15) Kreuter, 3. e Haenzel, I., 1978, Infec. and Immun. 19: :667-675.15) Kreuter, 3. and Haenzel, I., 1978, Infec. and Immun. 19:: 667-675.
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