PT839185E

PT839185E - Screening methods for enzymes and enzyme kits

Info

Publication number: PT839185E
Application number: PT96925351T
Authority: PT
Inventors: Jay M Short; Barry Marrs; Jeffrey L Stein
Original assignee: Diversa Corp
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 2007-01-31

Description

DESCRIÇÃODESCRIPTION

PROCESSOS DE RASTREIO PARA ENZIMAS E KITS DE ENZIMAS A presente invenção tem por objecto o domínio da preparação e da avaliação de bibliotecas de clones que contêm ADN derivado de uma forma microbiana e proteínas, por exemplo, bibliotecas de enzimas. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto bibliotecas de expressão recombinante de enzimas e bibliotecas de enzimas recombinantes, em que as enzimas recombinantes são geradas a partir de ADN obtido de microrganismos. A indústria tem reconhecido a necessidade de novas enzimas para uma ampla variedade de aplicações industriais. Como resultado, tem-se feito um rastreio de uma variedade de microrganismos para verificar se esses microrganismos têm ou não uma desejada actividade de enzima. Se esse microrganismo tem uma determinada actividade de enzima, a enzima é então recuperada a partir do microrganismo.The present invention relates to the preparation and evaluation of libraries of clones containing DNA derived from a microbial form and proteins, for example enzyme libraries. More particularly, the present invention relates to recombinant enzyme expression libraries and recombinant enzyme libraries, wherein the recombinant enzymes are generated from DNA obtained from microorganisms. The industry has recognized the need for new enzymes for a wide variety of industrial applications. As a result, a screening of a variety of microorganisms has been performed to ascertain whether or not such microorganisms have a desired enzyme activity. If that microorganism has a certain enzyme activity, the enzyme is then recovered from the microorganism.

Os conjuntos de microrganismos de ocorrência natural muitas vezes englobam uma desconcertante fileira de diversidade fisiológica e metabólica. De facto, estimou-se, até à data, que menos do que um por cento dos organismos mundiais foram sujeitos a cultura. Tem-se sugerido que uma grande fracção desta diversidade está longe de ser reconhecida, devido a dificuldades no enriquecimento e no isolamento de microrganismos em culturas puras. Por isso, tem sido difícil ou impossível identificar ou isolar enzimas válidas das mesmas amostras. Estas limitações sugerem a necessidade de abordagens alternativas para caracterízar o potencial fisiológico e metabólico, isto é, activídades de interesse de microrganismos até agora não postos em cultura, 1 que até à data, foram apenas caracterizados por análises de fragmentos do ARNr amplificado por RCP (reacção em cadeia de polimerase), recuperados sob o ponto de vista de clones a partir de misturas de ácidos nucleicos ligados.Clusters of naturally occurring microorganisms often encompass a bewildering array of physiological and metabolic diversity. In fact, it has been estimated to date that less than one percent of the world's organisms have been subjected to culture. It has been suggested that a large fraction of this diversity is far from being recognized due to difficulties in enrichment and isolation of microorganisms in pure cultures. Therefore, it has been difficult or impossible to identify or isolate valid enzymes from the same samples. These limitations suggest the need for alternative approaches to characterize the physiological and metabolic potential, i.e., activities of interest of hitherto uncultured microorganisms, 1 which to date have only been characterized by PCR analyzes amplified by PCR ( polymerase chain reaction), recovered from the clones point of view from blends of bound nucleic acids.

McCormick (Methods in Enzymology, páginas 445-449, 1987) e Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 2, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, páginas 8.50-8.51, 1989) descrevem um processo designado por selecção de irmãos. Este processo é dirigido ao problema do isolamento dos genes a partir de uma biblioteca de sequências de ADN. A selecção de irmãos é um processo de fraccionamento sequencial de uma amostra heterogénea, que pode ser aplicado ao isolamento de uma sequência, gene ou de uma família de genes a partir de uma biblioteca completa. As fracções da biblioteca que são positivas para uma determina actividade, são ainda sub-fraccionadas até se obter um único clone positivo.McCormick (Methods in Enzymology, pages 445-449, 1987) and Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 2, Cold Spring Harbor, New York, pages 8.50-8.51, 1989) disclose a process known as sibling selection. This process addresses the problem of gene isolation from a library of DNA sequences. Sibling selection is a sequential fractionation process of a heterogeneous sample, which can be applied to the isolation of a sequence, gene or a family of genes from a complete library. Fractions of the library that are positive for a given activity are further sub-fractionated until a single positive clone is obtained.

De acordo com um dos aspectos da presente invenção, providencia-se uma nova abordagem para a obtenção de enzimas para a sua posterior utilização. De acordo com a presente invenção, as enzimas recombinantes são geradas a partir de microrganismos e são classificadas pelas várias características da enzima. A presente invenção também tem por objecto, uma biblioteca de expressão recombinante, que é constituída por uma multiplicidade de clones, que são capazes de expressar enzimas recombinantes. A biblioteca de expressão é produzida pela recuperação de ADN a partir de um microrganismo, clonagem desse ADN num vector de expressão apropriado, que é então utilizado para transfectar ou transformar um hospedeiro apropriado para a expressão de uma proteína recombinante. 2According to one aspect of the present invention there is provided a novel approach for obtaining enzymes for their subsequent use. According to the present invention, the recombinant enzymes are generated from microorganisms and are classified by the various characteristics of the enzyme. The present invention also provides a recombinant expression library which is comprised of a multiplicity of clones which are capable of expressing recombinant enzymes. The expression library is produced by recovering DNA from a microorganism, cloning said DNA into an appropriate expression vector, which is then used to transfect or transform an appropriate host for the expression of a recombinant protein. 2

Assim, por exemplo, o ADN genómico pode ser recuperado quer de um organismo resultante de uma cultura, quer de um organismo não resultante de uma cultura e pode ser utilizado para produzir uma biblioteca de expressão recorabinante apropriada para subsequente determinação da actividade da enzima. Essa biblioteca de expressão recombinante pode ser preparada sem uma pré-avaliação do organismo a partir do qual se prepara a biblioteca para a actividade enzimática.Thus, for example, genomic DNA can be recovered either from a resulting organism of a culture or from an organism not resulting from a culture and can be used to produce a suitable recombinant expression library for subsequent determination of enzyme activity. Such a recombinant expression library may be prepared without a pre-evaluation of the organism from which the library is prepared for the enzymatic activity.

Tendo preparado uma multiplicidade de clones de expressão recombinante a partir de ADN isolado de um organismo, rastreiam-se os polipéptidos expressos por es ses clones quanto à actividade enzimática e às característi cas especificas da enzima, de modo a identificar e classificar os clones recombinantes que produzem polipéptidos que têm as características da enzima especificada. A presente invenção também tem por objecto um processo para o rastreio de clones, comportando ADN de um microrganismo não resultante de cultura no que respeita a uma proteína especificada, por exemplo, actividade da enzima, processo esse que compreende: rastreio de uma proteína específica, por exemplo, actividade da enzima numa biblioteca de clones preparados por (i) recuperação do ADN a partir de uma população de ADN, derivada de pelo menos um microrganismo não resultante de cultura; eHaving prepared a multiplicity of recombinant expression clones from DNA isolated from an organism, the polypeptides expressed by these clones are screened for enzyme activity and the specific characteristics of the enzyme in order to identify and classify the recombinant clones which produce polypeptides having the characteristics of the specified enzyme. The present invention also provides a method for the screening of clones comprising DNA from a non-cultured microorganism with respect to a specified protein, for example enzyme activity, which process comprises: screening a specific protein, for example, enzyme activity in a library of clones prepared by (i) recovering DNA from a DNA population, derived from at least one non-cultured microorganism; and

(íi) transformação de um hospedeiro com o ADN recuperado, para produzir uma biblioteca de clones 3 que são avaliados quanto à proteína específica, por exemplo, a actividade da enzima. A biblioteca é produzida a partir de ADN, que é recuperado sem cultura de nenhum organismo, particularmente, quando o ADN é recuperado de uma amostra ambiental contendo microrganismos, que não foram nem podem ser resultantes de cultura.(ii) transforming a host with the recovered DNA to produce a library of clones 3 that are evaluated for the specific protein, e.g. enzyme activity. The library is produced from DNA, which is recovered without culture from any organism, particularly when the DNA is recovered from an environmental sample containing microorganisms, which have not been and can not be cultured.

Preferencialmente, o ADN está ligado a um vector, particularmente, em que o vector compreende ainda as sequências reguladoras da expressão que podem controlar e regular a produção de uma actividade de enzima detectãvel a partir do ADN ligado. 0 factor f (ou factor de fertilidade) na E. coli, é um plasmido que efectua uma transferência de alta-frequência de si próprio durante a conjugação e uma transferência menos frequente do próprio cromossoma bacteriano. Para se conseguir produzir e propagar de forma estável fragmentos de ADN grandes a partir de amostras microbianas mistas, um enquadramento particularmente preferido consiste em utilizar um vector de clonagem, contendo uma origem do factor f de replicação para gerar bibliotecas genómicas que podem ser replicadas com um elevado grau de fidelidade. Quando integrado com o ADN proveniente de uma amostra ambiental mista não resultante de cultura, isto torna possível conseguir grandes fragmentos genómicos sob a forma de uma "biblioteca de ADN ambiental".Preferably, the DNA is linked to a vector, particularly wherein the vector further comprises the expression regulatory sequences that can control and regulate the production of an enzyme activity detectable from the bound DNA. The factor f (or fertility factor) in E. coli is a plasmid which effects a high-frequency transfer of itself during conjugation and a less frequent transfer of the bacterial chromosome itself. In order to achieve stable production and propagation of large DNA fragments from mixed microbial samples, a particularly preferred embodiment is to use a cloning vector containing a source of replication factor f to generate genomic libraries which can be replicated with a high degree of fidelity. When integrated with DNA from a non-cultured mixed environmental sample, this makes it possible to achieve large genomic fragments in the form of an " environmental DNA library ".

Preferencialmente, o ADN de estrutura helicoidal dupla obtido a partir de populações de ADN não resultantes de cultura seleccionam-se por: 4 conversão do ADN genómico de estrutura helicoidal dupla num ADN de estrutura helicoidal simples; recuperação do ADN de estrutura helicoidal simples convertido, que se liga especif icamente, tal como, por hibridação, a uma sonda de sequências de ADN; e conversão do ADN de estrutura helicoidal simples, recuperado, num ADN de estrutura helicoidal dupla. A sonda pode estar directa ou indirectamente ligada a uma fase sólida, por meio do qual se separa do ADN de estrutura helicoidal simples, que não está híbridizado ou, de algum modo, ligado especificamente à sonda. O processo pode também incluir a libertação do ADN de estrutura helicoidal simples da referida sonda, depois da recuperação do referido ADN de estrutura helicoidal simples híbridizado ou de alguma forma ligado e a amplificação do ADN de estrutura helicoidal simples libertado antes para converte-lo em ADN de estrutura helicoidal dupla. A presente invenção também tem por objecto um processo de rastreío de clones que comportam ADN de um microrganismo não obtido em cultura para uma proteína especificada, por exemplo, enzima, a actividade que compreende o rastreio da actividade do produto da proteína de um cluster de genes especificado na biblioteca de clones preparada por: (i) recuperação do ADN de uma população de ADN derivada de, pelo menos, um microrganismo não resultante de cultura; e (ii) transformação de um hospedeiro com o ADN recuperado para produzir uma biblioteca de clones com os rastreios ou as análises para a proteína especificada, por exemplo, actividade de enzima. A biblioteca é produzida a partir do 5 ADN do conjunto de genes, que é recuperado sem a cultura de um organismo, particularmente, quando os conjuntos dos genes de ADN são recuperados de uma amostra do ambiente contendo microrganismos que não são nem podem ser postos em cultura.Preferably, double stranded DNA obtained from non-cultured DNA populations is selected by: converting the double stranded genomic DNA into single stranded DNA; recovering the single-stranded converted helical DNA, which binds specifically, such as by hybridization, to a probe of DNA sequences; and conversion of recovered single stranded DNA into double-stranded DNA. The probe may be directly or indirectly attached to a solid phase, whereby it separates from the single helical structure DNA, which is not hybridized or in any way specifically bound to the probe. The process may also include the release of single stranded DNA from said probe upon recovery of said hybridized or otherwise linked single stranded DNA and the amplification of single stranded DNA released prior to conversion into DNA of double helical structure. The present invention also provides a method of screening for clones comprising DNA from a microorganism not obtained in culture for a specified protein, for example, enzyme, the activity comprising screening the protein product activity of a gene cluster specified in the clone library prepared by: (i) recovering DNA from a population of DNA derived from at least one non-cultured microorganism; and (ii) transforming a host with the recovered DNA to produce a library of clones with the screenings or analyzes for the specified protein, e.g., enzyme activity. The library is produced from the DNA of the gene pool, which is recovered without the culture of an organism, particularly when the sets of the DNA genes are recovered from an environment sample containing microorganisms which are neither nor can be put into culture.

Alternativamente, o ADN do conjunto de genes com uma estrutura helicoidal dupla, obtido a partir de uma população de ADN não resultante da cultura, é seleccionado por conversão do ADN do conjunto de genes genómicos, de estrutura helicoidal dupla em ADN de estrutura helicoidal simples; recuperação do ADN de policistron, de estrutura helicoidal simples, do conjunto de genes, ADN de estrutura helicoidal simples que se liga especificamente, por exemplo, por híbridação, a uma sequência sonda de polinucleótidos; e conversão do ADN de estrutura helicoidal simples do conjunto de genes, recuperado, em ADN de estrutura helicoidal dupla.Alternatively, the DNA of the set of genes having a double helical structure, obtained from a population of non-cultured DNA, is selected by converting the DNA from the set of genomic genes, from double helical structure to single helical structure DNA; retrieval of polycysteon DNA, single helical structure, set of genes, single stranded DNA that specifically binds, for example, by hybridization, to a polynucleotide probe sequence; and converting the single helical structure DNA from the recovered gene pool into double stranded DNA.

Este e outros aspectos da presente invenção, estão descritos com referência a enquadramentos preferidos, particulares e serão evidentes para os especialistas na matéria a partir dos ensinamentos aqui dados.This and other aspects of the present invention are described with reference to particular preferred embodiments and will be apparent to those skilled in the art from the teachings given herein.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra uma visão global dos processos utilizados para construir uma biblioteca ambiental a partir de uma amostra mista de picoplâncton, tal como descrito no exemplo 3. A figura 2 é uma representação esquemática de um enquadramento de vários terços de características químicas de uma enzima, que podem ser utilizados na presente invenção, tal como descrito no exemplo 4. 6 A figura 3 é uma representação esquemática de um outro enquadramento de vários terços de características químicas de uma enzima, que podem ser utilizados na presente invenção, tal como se descreve no exemplo 4. A figura 4 é uma representação esquemática de um outro enquadramento de várias fileiras de características químicas de uma enzima, que podem ser utilizadas na presente invenção, tal como se descreve no exemplo 4. A figura 5 é uma representação esquemática ainda de outro enquadramento de várias fileiras de características químicas da enzima, que podem ser utilizadas na presente invenção, tal como se descreve no exemplo 4. A figura 6 mostra os resultados óptimos de pH produzidos pela enzima ESL-001-01, nas experiências descritas no exemplo 5 . A figura 7 mostra os resultados óptimos de temperatura produzidos pela enzima ESL-001-01, nas experiências descritas no exemplo 5. A figura 8 mostra os resultados de tolerância do dissolvente orgânico produzidos pela enzima ESL-001-01, nas experiências descritas no exemplo 5.Brief Description of the Drawings Figure 1 shows an overview of the processes used to construct an environmental library from a mixed sample of picoplankton, as described in Example 3. Figure 2 is a schematic representation of a multi-thirds characterization chemical compositions of an enzyme which may be used in the present invention as described in Example 4. Figure 3 is a schematic representation of another embodiment of several thirds of chemical characteristics of an enzyme which may be used in the present invention, as described in example 4. Figure 4 is a schematic representation of another embodiment of several rows of chemical characteristics of an enzyme, which may be used in the present invention, as described in example 4. Figure 5 is a cross- schematic representation of yet another embodiment of several rows of chemical zima, which may be used in the present invention, as described in example 4. Figure 6 shows the optimum pH results produced by the enzyme ESL-001-01 in the experiments described in example 5. Figure 7 shows the optimal temperature results produced by the enzyme ESL-001-01 in the experiments described in example 5. Figure 8 shows the tolerance results of the organic solvent produced by the enzyme ESL-001-01 in the experiments described in example 5.

Descrição Detalhada de Enquadramentos PreferidosDetailed Description of Preferred Frames

De acordo com um aspecto preferido da presente invenção, as enzimas recombinantes caracterizam-se tanto pelas características físicas como químicas e essas características químicas são preferencialmente classificadas por fileiras de tal maneira que essas enzimas recombinantes que têm uma 7 caracteríscica química era comum, são então classificadas por outras características químicas, que podem ou não ser mais selectivas ou características químicas específicas, etc., tal como se indica com mais detalhe mais à frente.According to a preferred aspect of the present invention, the recombinant enzymes are characterized by both the physical and chemical characteristics and these chemical characteristics are preferably sorted by rows in such a way that those recombinant enzymes which have a chemical characteristic were common, are then classified by other chemical characteristics, which may or may not be more selective or specific chemical characteristics, etc., as indicated in more detail below.

Tal como indicado aqui antes, as enzimas recombinantes são também preferencialmente classificadas pelas características químicas e uma ou mais fileiras das enzimas que são classificadas pelas características químicas, podem também ser classificadas pelas características físicas ou vice-versa.As indicated hereinbefore, recombinant enzymes are also preferably classified by chemical characteristics and one or more rows of the enzymes which are classified by chemical characteristics, may also be classified by physical characteristics or vice versa.

Tal como se utiliza aqui, a expressão "característica química" de uma enzima recombinante, refere-se ao substrato ou à funcionalidade química, segundo a qual a enzima actua e/ou à reacção catalítica realizada pela enzima; por exemplo, a reacção catalítica pode ser hidrólise (hidrolases) e a funcionalidade química pode ser o tipo de ligação segundo a qual a enzima actua (as esterases clivam as ligações de éster) ou pode ser pelo título particular de estrutura, segundo a qual a enzima actua (uma glicosidase actua nas ligações glicosídicas). Assim, por exemplo, uma enzima recombinante que actua nas ligações glicosídicas, pode, por exemplo, ser classificada quimicamente de acordo com o sistema de fileiras, tal como: fileira 1: hidrolase; fileira 2: ligações acetal; fileira 3: glicosidase.As used herein, the term " chemical characteristic " of a recombinant enzyme refers to the substrate or chemical functionality according to which the enzyme acts and / or to the catalytic reaction performed by the enzyme; for example, the catalytic reaction may be hydrolysis (hydrolases) and the chemical functionality may be the type of bond according to which the enzyme acts (the esterases cleave the ester bonds) or may be by the particular title of the structure, according to which the enzyme acts (a glycosidase acts on the glycosidic bonds). Thus, for example, a recombinant enzyme which acts on the glycosidic linkages may, for example, be chemically classified according to the row system, such as: row 1: hydrolase; row 2: acetal linkages; row 3: glycosidase.

Tal como se utiliza aqui, uma ''característica física" no que respeita a uma enzima recombinante, significa uma propriedade (diferente de uma reacção química), tal como, prestabilidade da temperatura; temperatura óptima para uma reacção catalítica; tolerância a dissolventes orgânicos; selectividade para iões metálicos; sensibilidade a detergentes, etc.As used herein, a " physical feature " in respect of a recombinant enzyme, means a property (other than a chemical reaction) such as temperature rendering; optimum temperature for a catalytic reaction; tolerance to organic solvents; selectivity for metal ions; sensitivity to detergents, etc.

Num enquadramento da presente invenção, no qual se utiliza uma abordagem de fileiras para a classificação das enzimas recombinantes por características químicas e/ou físicas, as enzimas em uma ou mais das fileiras de características químicas, podem também ser classificadas por uma ou mais características físicas e vice-versa. Num enquadramento preferido, as enzimas são classificadas tanto pelas características físicas como pelas químicas, por exemplo, os substratos individuais segundo os quais elas actuam, assim como, pelas características físicas.In one embodiment of the present invention, in which a row approach is used for the classification of recombinant enzymes by chemical and / or physical characteristics, enzymes in one or more of the rows of chemical characteristics may also be classified by one or more physical characteristics and vice versa. In a preferred embodiment, the enzymes are classified by both physical and chemical characteristics, for example, the individual substrates under which they act, as well as physical characteristics.

Assim, por exemplo, como um exemplo representativo da forma pela qual uma enzima recombinante pode ser classificada de acordo com a presente invenção, uma enzima recombinante que é uma protease (nesta ilustração, a fileira 1 é hidrolase; a fileira 2 é amida (ligação de péptido), que pode ainda ser classificada na fileira 3 como o último sítio na sequência de amínoácidos em que ocorre a clivagem; por exemplo, anião, catião, hidrofõbico grande, hidrofóbico pequeno. Cada uma das enzimas recombinantes, que tenha sido classificada pela cadeia lateral na fileira 3, pode também ainda ser classificada pelas características físicas do tipo das indicadas aqui antes.Thus, for example, as a representative example of the manner in which a recombinant enzyme can be classified according to the present invention, a recombinant enzyme which is a protease (in this illustration, row 1 is hydrolase; row 2 is amide of peptide), which may further be classified in row 3 as the last site in the amino acid sequence where cleavage occurs, for example, anion, cation, hydrophobic, large hydrophobic, small, each of the recombinant enzymes which has been classified by side chain in row 3, may also be further classified by the physical characteristics of the type indicated hereinbefore.

Desta forma, é possível seleccionar da biblioteca recombinante enzimas que têm uma característica química específica em comum, por exemplo, todas as endopeptidases (que actuam nas ligações internas dos péptidos) e que têm uma característica física específica em comum, por exemplo, todas actuam de uma forma óptima, a um pH dentro de um intervalo especificado.In this way, enzymes having a common specific chemical characteristic can be selected from the recombinant library, for example all endopeptidases (which act on the internal bonds of the peptides) and which have a specific physical characteristic in common, for example, all of them act from an optimal form, at a pH within a specified range.

Tal como se indicou aqui antes, uma biblioteca de enzimas recombinantes preparada a partir de um microrganismo, 9 é classificada preferencialmente pelas características químicas numa abordagem em fileiras. Esta classificação pode ser realizada por uma análise inicial dos polipéptidos recombinantes gerados pela biblioteca, num rastreio de baixa selectividade, por exemplo, a reacção catalítica realizada pela enzima. Isto pode conseguir-se de uma forma conveniente por meio do rastreio de uma ou mais das seis classes IUB; oxireductases; transferases; hidrolases; liases; isomerases; ligases.As indicated hereinbefore, a library of recombinant enzymes prepared from a microorganism is preferably classified by the chemical characteristics in a row approach. This classification can be performed by an initial analysis of the recombinant polypeptides generated by the library, in a screening of low selectivity, for example the catalytic reaction performed by the enzyme. This can be conveniently achieved by screening one or more of the six IUB classes; oxireductases; transferases; hydrolases; lyases; isomerases; ligases.

As enzimas recombinantes que se determinam que são positivas para uma ou mais das classes IUB, podem então voltar a ser avaliadas quanto a uma actividade mais específica da enzima.Recombinant enzymes which are determined to be positive for one or more of the IUB classes may then be re-evaluated for a more specific activity of the enzyme.

Assim, por exemplo, se se faz o rastreio da biblioteca recombinante em relação à actividade de hidrolase, então os clones recombinantes que são positivos para a actividade de hidrolase podem ser novamente rastreados para uma actividade de hidrolase mais especializada, isto é, o tipo de ligação na qual a hidrolase actua. Assim, por exemplo, as enzimas recombinantes que são hidrolases, podem ser novamente rastreadas para encontrar essas hidrolases que actuam numa ou mais funcionalidades químicas especificadas, tais como: (a) amida (ligações de péptido) , isto é, proteases; (b) ligações de éster, isto é, esterases e lipases; (c) acetais, isto é, glicosidases, etc.Thus, for example, if the recombinant library is screened for hydrolase activity, then the recombinant clones which are positive for the hydrolase activity can be screened again for a more specialized hydrolase activity, i.e., the type of binding in which the hydrolase acts. Thus, for example, recombinant enzymes which are hydrolases, can be screened again to find such hydrolases that act on one or more specified chemical functionalities, such as: (a) amide (peptide bonds), i.e., proteases; (b) ester linkages, i.e., esterases and lipases; (c) acetals, i.e. glycosidases, etc.

As enzimas recombinantes que tenham sido classificadas pela ligação química na qual elas actuam, podem ser novamente rastreadas para determinar uma sua actividade mais especializada, tal como, o tipo de substrato no qual elas actuam. 10Recombinant enzymes which have been classified by the chemical bond in which they act, can be screened again to determine their more specialized activity, such as the type of substrate on which they act. 10

Assim, por exemplo, as enzimas recombina.n.tes que tenham sido classificadas como actuando nas ligações de éster (lipases e esterases), podem ser novamente rastreadas para determinar a sua capacidade para gerar compostos opticamente activos, isto é, a capacidade para actuar em substratos específicos, tais como, meso-ãlcoois, meso-diácidos, álcoois quirálicos, ácidos quirálicos, etc.Thus, for example, recombinant enzymes which have been classified as acting on ester linkages (lipases and esterases), can be screened again to determine their ability to generate optically active compounds, i.e., the ability to act on specific substrates, such as meso-alcohols, meso-diacids, chiral alcohols, chiral acids, etc.

Por exemplo, as enzimas recombinantes que tenham sido classificadas como actuando nos acetais, podem ser novamente rastreadas para classificar essas enzimas recombinantes por meio de um tipo específico de substrato sobre o qual elas actuam, por exemplo, (a) açúcar Pl, tal como, glicose, galactose, etc., (b) polímero de glicose (exo-, endo- ou ambos), etc.For example, recombinant enzymes which have been classified as acting on acetals may be screened again to classify such recombinant enzymes by means of a specific type of substrate on which they act, for example (a) P1 sugar, such as, glucose, galactose, etc., (b) glucose polymer (exo-, endo- or both), etc.

Fileiras de EnzimasRows of Enzymes

Assim, como um exemplo representativo mas não limitativo, dão-se a seguir fileiras de enzimas representativas: FILEIRA 1. As divisões têm por base a reacção catalítica realizada pela enzima, por exemplo, hidrólise, redução, oxidação, etc. Serão utilizadas as seis classes da IUB: oxiredutase, transferases, hidrolases, líases, isomerases e ligases. FILEIRA. 2: As divisões baseiam-se na funcionalidade química que sofre reacção, por exemplo, ésteres, amidas, di-ésteres de sulfato, mono-ésteres de sulfato, aldeídos, cetonas, álcoois, acetais, cetais, alcanos, olefínas, anéis aromáticos, anéis heteroaromátícos, oxigénio molecular, enóis, etc. 11Thus, as a representative but non-limiting example, representative rows of enzymes are followed: ROW 1. The cleavages are based on the catalytic reaction performed by the enzyme, for example, hydrolysis, reduction, oxidation, etc. The six classes of IUB will be used: oxiredutase, transferases, hydrolases, lyases, isomerases and ligases. ROW. The divisions are based on the chemical functionality undergoing reaction, for example esters, amides, sulfate di-esters, sulfate monoesters, aldehydes, ketones, alcohols, acetals, ketals, alkanes, olefins, aromatic rings, heteroaromatic rings, molecular oxygen, enol, etc. 11

As lipases e as esterases clivam ambas a ligação éster; a distinção resulta do facto do substrato natural estar agregado a uma membrana (lipases) ou disperso em solução (esterases). FILEIRA 3: As divisões e subdivisões baseiam-se nas diferenças entre as estruturas individuais do substrato, que estão ligadas de forma covalente à funcionalidade que sofre a reacção, tal como defi nido na fileira 2 Por exemplo, hidrólise de acetal é a parte acetal da glicose ou da galactose; ou é o acetal do anómero de α ou β? Estes são os tipos de distinções feitos na fileira 3. As divisões baseiam-se na especificidade do substrato, que é única para cada reacção particular da enzima; haverá diferentes distinções de substratos consoante a enzima é, por exemplo, uma protease ou uma fosfatase. FILEIRA 4; As divisões baseiam-se em qual dos dois produtos enantioméricos possíveis a enzima produz. Isto é uma medida da capacidade da enzima para reagir selectivamente com um dos dois enantiómeros (resolução cinética) ou a capacidade da enzima para reagir com um composto difuncional meso para gerar selectivamente um dos dois produtos enantioméricos da reacção.Lipases and esterases both cleave the ester linkage; the distinction results from the fact that the natural substrate is either membrane-bound (lipases) or dispersed in solution (esterases). ROW 3: The divisions and subdivisions are based on the differences between the individual substrate structures which are covalently linked to the functionality undergoing the reaction, as defined in row 2. For example, acetal hydrolysis is the acetal part of the glucose or galactose; or is the acetal of the α or β anomer? These are the types of distinctions made in row 3. Divisions are based on substrate specificity, which is unique for each particular reaction of the enzyme; there will be different distinctions of substrates depending on whether the enzyme is, for example, a protease or a phosphatase. ROW 4; The divisions are based on which of the two possible enantiomeric products the enzyme produces. This is a measure of the ability of the enzyme to selectively react with one of the two enantiomers (kinetic resolution) or the ability of the enzyme to react with a difunctional meso compound to selectively generate one of the two enantiomeric reaction products.

FILEIRA 5/FILEIRA ORTOGONAL/FILEIRA DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS A quinta fileira é ortogonal em relação às outras fileiras. Baseia-se das propriedades físicas das enzimas mais do que nas reacções químicas per se: a quinta fileira forma 12 uma segunda dimensão com a qual se classificam as enzimas. A quinta fileira pode ser aplicada a qualquer uma das outras fileiras, mas será na maioria das vezes aplicada à terceira fileira.ROW 5 ORTHOGONAL ROW / ROW OF PHYSICAL CHARACTERISTICS The fifth row is orthogonal to the other rows. It is based on the physical properties of the enzymes rather than on the chemical reactions per se: the fifth row forms a second dimension with which the enzymes are classified. The fifth row can be applied to any of the other rows, but will most often be applied to the third row.

Assim, de acordo com um dos aspectos da presente invenção, produz-se uma biblioteca de expressão aleatoriamente a partir do ADN de um microrganismo, em particular, o ADN genómico ou o ADNc do microrganismo e as proteínas recombinantes ou os polipéptidos produzidos por essa biblioteca de expressão, são rastreados para classificar as enzimas recombinantes pelas diferentes características das enzimas. Num enquadramento preferido, as proteínas recombinantes são rastreadas quanto a uma ou mais características químicas particulares e as enzimas identificadas como possuindo essas características, são então novamente rastreadas quanto a mais características químicas específicas e assim este novo rastreio pode ser repetido uma ou mais vezes. Além disso, num enquadramento preferido, as enzimas recombinantes são também rastreadas para serem classificadas por uma ou mais características físicas. Desta maneira, as enzimas recombinantes, geradas a partir do ADN de um microrganismo, são classificadas tanto pelas características químicas como pelas físicas e portanto é assim possível seleccionar enzimas recombinantes de um ou mais organismos diferentes, que tenham uma ou mais características químicas em comum e/ou uma ou mais características físicas comuns. Além disso, dado que essas enzimas são enzimas recombinantes, é possível produzir essas enzimas em quanoidades desejadas e com a pureza desejada. A abordagem em fileiras da presente invenção, não está limitada a uma abordagem em fileiras em que, por exemplo, as fileiras sejam mais restritivas. Por exemplo, a abordagem em 3 fileiras, é também aplicável à utilização de uma abordagem em fileiras em que, por exemplo, a primeira fileira é constituída por enzimas que "degradam a madeira". A segunda fileira química pode então, por exemplo, ser do tipo de enzima que é uma enzima que "degrada a madeira".Thus, according to one aspect of the present invention, a random expression library is produced from the DNA of a microorganism, in particular the genomic DNA or cDNA of the microorganism, and the recombinant proteins or polypeptides produced by that library are screened to classify the recombinant enzymes by the different characteristics of the enzymes. In one preferred embodiment, the recombinant proteins are screened for one or more particular chemical characteristics and the enzymes identified as having those characteristics are then re-screened for further specific chemical characteristics and thus this re-screening can be repeated one or more times. In addition, in a preferred embodiment, the recombinant enzymes are also screened to be classified by one or more physical characteristics. In this way, recombinant enzymes, generated from the DNA of a microorganism, are classified by both chemical and physical characteristics and therefore it is thus possible to select recombinant enzymes from one or more different organisms having one or more chemical characteristics in common and / or one or more common physical characteristics. In addition, since such enzymes are recombinant enzymes, it is possible to produce such enzymes in desired amounts and with the desired purity. The row approach of the present invention is not limited to a row approach in which, for example, the rows are more restrictive. For example, the 3-row approach is also applicable to the use of a tiered approach in which, for example, the first row consists of enzymes that " degrade wood ". The second chemical row may then, for example, be of the enzyme type which is an enzyme that " degrades the wood ".

Do mesmo modo, a primeira fileira ou qualquer outra fileira pode ser de características físicas e a fileira seguinte pode ser de características químicas específicas.Likewise, the first row or any other row may be of physical characteristics and the next row may be of specific chemical characteristics.

Assim, a presente invenção aplica-se de uma forma geral para providenciar enzimas recombinantes e bibliotecas de enzimas recombinantes, em que as várias enzimas estão classificadas pelas diferentes características químicas e/ou físicas.Thus, the present invention generally applies to providing recombinant enzymes and recombinant enzyme libraries, wherein the various enzymes are classified by different chemical and / or physical characteristics.

Os microrganismos a partir dos quais as bibliotecas recombinantes podem ser preparadas, incluem microrganismos procarióticos, tais como, Eubacteria e Archaebacteria e microrganismos eucariótícos inferiores, tais como, fungos, algumas algas e protozoários. Os microrganismos podem ser microrganismos de cultura ou microrganismos sem ser de cultura obtidos de amostras ambientais e esses microrganismos podem ser extremófilos, tal como, termõfilos, hipertermófilos, psicrófilos, psicrotróficos, etc.Microorganisms from which recombinant libraries can be prepared include prokaryotic microorganisms such as Eubacteria and Archaebacteria and lower eukaryotic microorganisms such as fungi, some algae and protozoa. The microorganisms may be cultured microorganisms or non-cultured microorganisms obtained from environmental samples and such microorganisms may be extremophiles such as thermophiles, hyperthermophiles, psychrophiles, psychrotrophs, etc.

Preferencialmente, a biblioteca é produzida a partir de ADN, que é recuperado sem a cultura de um organismo, particularmente, quando o ADN é recuperado de uma amostra ambiental contendo microrganismos que não são nem podem ser de cultura. Fontes de ADN de microrganismo como material inicial da biblioteca a partir da qual se obtém o ADN, estão particularmente contemplados nas amostras ambientais, tal como, amostras microbianas a partir de gelo do Árctico e do 14Preferably, the library is produced from DNA, which is recovered without the culturing of an organism, particularly when the DNA is recovered from an environmental sample containing microorganisms that are neither, nor can be, cultured. Sources of microorganism DNA as the starting material of the library from which the DNA is obtained are particularly contemplated in the environmental samples, such as microbial samples from Arctic ice and 14

Antárctico, água ou fontes de terras permanentemente geladas, materiais de origem vulcânica, materiais do solo ou fontes de plantas em áreas tropicais, etc. Assim, por exemplo, o ADN genómico pode ser recuperado, quer a partir de organismos que não são de cultura e que não podem ser de cultura e que se utilizam para produzir uma biblioteca apropriada de clones para a determinação subsequente da actividade da enzima.Antarctic, permanently chilled water or land sources, volcanic materials, soil materials or plant sources in tropical areas, etc. Thus, for example, genomic DNA can be recovered either from non-cultured and non-cultured organisms and used to produce an appropriate library of clones for the subsequent determination of enzyme activity.

As bactérias e muitos eucariotos têm um mecanismo coordenado para a regulação dos genes cujos produtos estão envolvidos em processos relacionados. Os genes estão agrupados, em estruturas referidas como "grupos de genes" (gene clusters) num único cromossoma e são transcritos em conjunto sob o controlo de uma única sequência reguladora, incluindo um único promotor que inicia a transcrição de todo o conjunto. O conjunto de genes, o promotor e as sequências adicionais que funcionam na regulação em conjunto, são referidas como um "operão" e podem incluir até 20 ou mais genes, normalmente, de 2 a 6 genes. Assim, um agrupamento de genes é um grupo de genes adjacentes que ou são idênticos ou estão relacionados, normalmente no que respeita à sua função.Bacteria and many eukaryotes have a coordinated mechanism for the regulation of genes whose products are involved in related processes. Genes are clustered, in structures referred to as " gene groups " (gene clusters) on a single chromosome and are transcribed together under the control of a single regulatory sequence, including a single promoter that initiates the transcription of the whole set. The set of genes, the promoter, and the additional sequences that function in the regulation together are referred to as " operon " and may include up to 20 or more genes, usually 2 to 6 genes. Thus, a gene cluster is a group of adjacent genes which are either identical or related, usually with respect to their function.

Algumas famílias de genes consistem em membros idênticos. O agrupamento é um pré-requisito para manter a identidade entre os genes, embora os genes agrupados não sejam necessariamente idênticos. Os agrupamentos de genes variam de extremos em que se gera uma duplicação com os genes relacionados adjacentes, até casos em que centenas de genes idênticos permanecem numa fileira em tandem. Algumas vezes não se vê nenhum significado discernível numa repetição de um gene em particular. Um exemplo principal disto, são os genes de insulina expressos em duplicado nalgumas espécies, em que um único gene de insulina é adequado noutras espécies de mamíferos. 15 É importante investigar ainda mais os agrupamentos de genes na medida em que o comprimento total do agrupamento é necessário para a expressão das proteínas que dele resultam. Além disso, os agrupamentos de genes sofrem uma reorganização contínua e assim a capacidade para criar bibliotecas heterogéneas de agrupamentos de genes a partir de, por exemplo, baterias ou outras fontes procarióticas, é válida na determinação de fontes de novas proteínas, incluindo particularmente proteínas, por exemplo, enzimas, tal como, por exemplo, as policetido-sintases que são responsáveis pela síntese de policétidos com uma vasta fileira de actividades úteis. Outros tipos de proteínas que são produtos de agrupamentos de genes estão também contemplados, incluindo, por exemplo, antibióticos, antivirais, agentes anti-tumor e proteínas reguladoras, tal como, a insulina.Some gene families consist of identical members. Grouping is a prerequisite for maintaining identity between genes, although the pooled genes are not necessarily identical. Gene clusters range from extremes where duplication is generated with adjacent related genes, to cases where hundreds of identical genes remain in a tandem row. Sometimes no discernible meaning can be seen in a repetition of a particular gene. A prime example of this are insulin genes expressed in duplicates in some species, wherein a single insulin gene is suitable in other species of mammals. It is important to further investigate gene clusters insofar as the total cluster length is necessary for the expression of the resulting proteins. In addition, gene pools undergo a continuous reorganization and thus the ability to create heterogeneous libraries of gene pools from, for example, batteries or other prokaryotic sources, is valid in determining sources of new proteins, particularly including proteins, for example enzymes, such as, for example, polyketide synthases which are responsible for the synthesis of polyketides with a wide range of useful activities. Other types of proteins that are gene clustering products are also contemplated, including, for example, antibiotics, antivirals, antitumor agents and regulatory proteins, such as insulin.

Os policétidos são moléculas que são uma fonte extremamente rica de bioactividades, incluindo antibióticos (tais como, tetraciclinas e eritromicinas), agentes anti-cancro (daunomicina), imunossupressores (FK506 e rapamicina) e produtos veterinários (monensina). Muitos policétidos (produzidos pelas policetido-sintases) são válidos como agentes terapêuticos. As policetido-sintases são enzimas multifuncionais que catalizam a biossíntese de uma enorme variedade de cadeias de carbono, que diferem no comprimento e nos modelos de funcionalidade e na ciclização. Os genes de policetido-sintase caem nestes agrupamentos de genes e pelo menos um tipo (designado por tipo 1) de policetido-sintases têm genes e enzimas com uma grande dimensão, complicando a manipulação genética e os estudos in vitro destes genes/proteínas. A capacidade para seleccionar e combinar os componentes desejados de uma biblioteca de genes de policétidos e genes 16 de biossíntese de pós-policétidos para a geração de novos policétidos para estudo, é apelativa. Utilizando os processos da presente invenção, facilita-se a clonagem de novas policetido-sintases, particularmente, quando se utilizam vectores à base de factor f, que facilitam a clonagem dos agrupamentos de genes.Polyketides are molecules that are an extremely rich source of bioactivities, including antibiotics (such as tetracyclines and erythromycins), anti-cancer agents (daunomycin), immunosuppressants (FK506 and rapamycin) and veterinary products (monensin). Many polyketides (produced by polyketide synthases) are valid as therapeutic agents. Polyketide synthases are multifunctional enzymes that catalyze the biosynthesis of a huge variety of carbon chains, which differ in length and functionality models and in cyclization. Polyketide synthase genes fall into these gene pools and at least one type (designated as type 1) of polyketide synthases have large genes and enzymes, complicating the genetic manipulation and in vitro studies of these genes / proteins. The ability to select and combine the desired components of a library of polyketide genes and post-polyketide biosynthesis genes for the generation of novel polyketides for study is appealing. Using the processes of the present invention, it is expedient to clone new polyketide synthases, particularly when using factor f-based vectors, which facilitate the cloning of gene clusters.

Preferencialmente, o ADN do agrupamento de genes está ligado a um vector, particularmente, em que o vector compreende ainda sequências de expressão reguladoras, que podem controlar e regular a produção de uma proteína detectãvel ou de uma actividade de uma fileira relacionada com a proteína a partir dos agrupamentos de genes ligados. A utilização de vectores que têm uma capacidade excepcionalmente grande de introdução de ADN exógeno, é particularmente apropriada para ser utilizada com esses agrupamentos de genes e está descrita, a título de exemplo aqui, como incluindo o factor f (ou o factor de fertilidade) de E. coli. Este factor f da E. coli é um plasmido que afecta a transferência a frequência elevada de si próprio durante a conjugação e é ideal para se conseguir e propagar estavelmente fragmentos de ADN grandes, tais como, os agrupamentos de genes resultantes de amostras de micróbios misturados. 0 termo "derivado" ou "isolado" significa que o material é retirado do seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele ocorrer naturalmente) , Por exemplo, um polinucleótido ou um polipéptido de ocorrência natural presente num animal vivo não está isolado, mas o mesmo polinucleótido ou polipéptido separados de algum ou de todos os materiais que coexistem no sistema natural, está isolado. 17Preferably, the DNA of the gene pool is linked to a vector, particularly wherein the vector further comprises regulatory expression sequences, which can control and regulate the production of a detectable protein or a protein-related row activity from clusters of linked genes. The use of vectors having an exceptionally large capacity for introducing exogenous DNA is particularly suitable for use with such gene pools and is described, by way of example herein, as including the factor f (or the fertility factor) of E. coli. This E. coli factor f is a plasmid which affects high frequency transfer of itself during conjugation and is ideal for stably achieving and propagating large DNA fragments, such as clusters of genes resulting from mixed microbe samples . The term " derived " or " isolated " means that the material is withdrawn from its original environment (e.g., the natural environment if it occurs naturally). For example, a naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in a living animal is not isolated, but the same polynucleotide or polypeptide is separated from some or all of the materials that coexist in the natural system, is isolated. 17

Tal como se indicou aqui antes, a biblioteca de expressão pode ser produzida a partir de amostras ambientais, caso em que o ADN pode ser recuperado sem ser necessário a cultura de um organismo ou o ADN pode ser recuperado a partir de um organismo de cultura.As indicated hereinbefore, the expression library can be produced from environmental samples, in which case the DNA can be recovered without the need for the culture of an organism or the DNA can be recovered from a culture organism.

Na preparação da biblioteca de expressão, o ADN genómico pode ser recuperado quer a partir de um organismo de cultura ou de uma amostra ambiental (por exemplo, do solo) por meio de vários processos. 0 ADN recuperado ou isolado é então fragmentado em dimensões apropriadas, para a produção de uma biblioteca de expressão e para providenciar com uma probabilidade razoável, que os genes desejados serão expressos e rastreados sem a necessidade de rastrear um número excessivo de clones. Assim, por exemplo, se o fragmento médio do genoma produzido por corte é de 4,5 kpb, para um genoma de 1,8 Mpb, devem ser rastreados cerca de 2.000 clones para se conseguir uma probabilidade de 90 % de obtenção de um gene particular. Nalguns casos, em particular, quando o ADN é recuperado sem cultura, o ADN é amplificado (por exemplo, por RCP) após o corte. 0 ADN dimensionado é clonado num vector de expressão apropriado e transformado num hospedeiro apropriado, preferencialmente, um hospedeiro bacteriano e, em particular, E. coli. Embora a E. coli seja o preferido, pode-se utilizar uma grande variedade de outros hospedeiros para a produção de uma biblioteca de expressão. 0 vector de expressão que é utilizado ê, preferencialmente, um que inclua um promotor que é conhecido por funcionar no hospedeiro seleccionado, no caso do promotor genómico original não funcionar no hospedeiro. 18In the preparation of the expression library, the genomic DNA can be recovered either from a culture organism or from an environmental sample (e.g. from the soil) by various methods. The recovered or isolated DNA is then fragmented into appropriate dimensions for the production of an expression library and to provide with reasonable probability that the desired genes will be expressed and screened without the need to trace an excessive number of clones. Thus, for example, if the average cut genome fragment is 4.5 kbp, for a 1.8 Mpb genome, about 2,000 clones should be screened to achieve a 90% probability of obtaining a gene private. In some cases, in particular, when the DNA is recovered without culturing, the DNA is amplified (e.g., by PCR) after the cut. The sized DNA is cloned into an appropriate expression vector and transformed into an appropriate host, preferably a bacterial host and, in particular, E. coli. Although E. coli is preferred, a wide variety of other hosts can be used for the production of an expression library. The expression vector that is used is preferably one that includes a promoter which is known to function in the selected host in the event that the original genomic promoter does not function in the host. 18

Como exemplos representativos de vectores de expressão que podem ser utilizados para preparação de uma biblioteca de expressão, podem mencionar-se fagos, plasmidos, fagemidos, cósmidos, fósmidos, cromossomas bacterianos artificiais, cromossomas artificiais à base de Pl, cromossomas artificias de fungos e quaisquer outros vectores específicos para os hospedeiros específicos de interesse (tais como, bacilos, aspergilos, fungos, etc.). O vector pode também incluir um marcador de um tipo conhecido na técnica para facilitar a purificação. A seguir desenvolve-se um processo geral para a produção de bibliotecas de expressão a partir quer de organismos de cultura quer de organismos que não resultam de culturas.As representative examples of expression vectors that can be used to prepare an expression library, there may be mentioned phage, plasmids, phagemids, cosmids, phosphates, artificial bacterial chromosomes, artificial Pl-based chromosomes, fungal artificial chromosomes, and any other vectors specific for the specific hosts of interest (such as bacilli, aspergillos, fungi, etc.). The vector may also include a label of a type known in the art to facilitate purification. There follows a general process for the production of expression libraries from either culture organisms or non-crop organisms.

ORGANISMOS DE CULTURAORGANIZATIONS OF CULTURE

Obtenção da biomassa Isolamento do ADN (CTAB)Isolation of DNA (CTAB)

Corte do ADN (agulha com uma dimensão 25) ADN cego (Feijão mungo Nuclease)DNA Cutting (needle with a dimension 25) Blind DNA (Mung bean Nuclease)

Metilato (Metilase de Eco RI)Methylate (Eco RI Methylase)

Ligação aos ligantes de Eco RI (GGAATTCC)Binding to Eco RI ligands (GGAATTCC)

Ligantes de Cut back (Endonuclease de Restrição de Eco RI) Fraccionamento da dimensão (Gradiente de Sacarose)Cut back binders (RI Eco Restriction Endonuclease) Dimensional fractionation (Sucrose Gradient)

Ligação ao vector lambda (Lambda ΖΑΡ II e gtll)Lambda vector binding (Lambda ΖΑΡ II and gtll)

Embalagem (extracto de embalagem de lambda in vitro) Colocação em placa num hospedeiro de E. coli e amplificaçãoPackaging (in vitro lambda packaging extract) Plaque placement in an E. coli host and amplification

ORGANISMOS NÃO PROVENIENTES DE CULTURASNON-CULTURAL ORGANISMS

Obtenção das célulasObtaining cells

Isolamento do ADN (Vários Processos) ADN cego (Feijão mungo Nuclease) 19DNA Isolation (Various Processes) Blind DNA (Mung Bean Nuclease) 19

Ligação ao adaptador contendo um sítio de Not I e conjugação com pérolas magnéticasAdapter binding containing a Not I site and conjugation with magnetic beads

Ligação do adaptador não conjugado à outra extremidade do ADN Amplificação do ADN numa reacção que permita com elevada confiança e utilização das sequências adaptadoras como iniciadoresBinding the unconjugated adapter to the other end of the DNA Amplification of the DNA in a reaction that allows with high confidence and use of the adapter sequences as primers

Corte do ADN com Not IDNA Cutting with Not I

Fraccionamento das dimensões (Gradiente de Sacarose ou Coluna de Sefacril)Fractionation of dimensions (Sucrose Gradient or Sefacril Column)

Ligação ao vector lambda (Lambda ΖΑΡ II e getll)Binding to lambda vector (Lambda ΖΑΡ II and getll)

Embalagem (extracto de embalagem de lambda in vitro)Packaging (in vitro lambda packaging extract)

Colocação em placa num hospedeiro de E. coli e amplificação 0 ADN da sonda utilizada para a recuperação selectiva do ADN de interesse a partir do derivado de ADN de pelo menos um microrganismo não resultante de cultura, pode ser uma sequência de uma região de codificação de comprimento completo ou uma sequência parcial da região de codificação de ADN para uma enzima de actividade conhecida, um marcador filogenético ou outras sequências de ADN identificadas. A biblioteca original de ADN pode ser sondada, preferencialmente, utilizando misturas de sondas que compreendem, pelo menos, uma porção da sequência de ADN, que codifica a actividade especificada. Estas sondas ou bibliotecas de sondas são, preferencialmente, ADN de estruturas helicoidal simples e ADN microbiano, cujas sondas tenham preferencialmente sido convertidas sob a forma de estruturas helicoidais simples. As sondas que são particularmente apropriadas são as derivadas de enzimas que codificam ADN com uma actividade similar ou idêntica à actividade da enzima especificada que vai ser rastreada. O ADN da sonda deve ter pelo menos cerca de 10 bases e, preferencialmente, pelo menos, 15 bases. Num enquadramento, 20 toda a região de codificação pode ser utilizada como uma sonda. As condições para a hibridação nas quais o ADN é isolado seiectivamente pela utilização de pelo menos uma sonda de ADN, serão estabelecidas para providenciar uma hibridação severa de, pelo menos, cerca de 50 % de identidade da sequência, mais particularmente, uma severidade que providencie uma identidade da sequência de pelo menos cerca de 70 %.Placing on a plate in an E. coli host and amplification The probe DNA used for the selective recovery of the DNA of interest from the DNA derivative of at least one non-cultured microorganism may be a sequence of a coding region of or a partial sequence of the DNA coding region for an enzyme of known activity, a phylogenetic marker or other identified DNA sequences. The original DNA library may be probed, preferably, using mixtures of probes comprising at least a portion of the DNA sequence, encoding the specified activity. These probes or probes libraries are preferably DNAs of single helical structures and microbial DNA, which probes have preferably been converted into single helical structures. Probes which are particularly suitable are those derived from enzymes encoding DNA with activity similar to or identical to the activity of the specified enzyme to be screened. The probe DNA should have at least about 10 bases, and preferably at least 15 bases. In one embodiment, the entire coding region may be used as a probe. Conditions for hybridization in which the DNA is separately isolated by the use of at least one DNA probe will be established to provide for a severe hybridization of at least about 50% sequence identity, more particularly, a severity that provides a sequence identity of at least about 70%.

As técnicas de hibridação para a sondagem de uma biblioteca de ADN microbiano para isolar o ADN de potencial interesse, são bem conhecidas na técnica e qualquer uma delas está descrita na literatura e são apropriadas para serem utilizadas aqui, particularmente aquelas que utilizam uma sonda de ADN ligada em fase sólida, ligada directa ou indirectamente, para facilitar a separação da parte restante do ADN derivado dos microrganismos.Hybridization techniques for probing a microbial DNA library to isolate the DNA of potential interest are well known in the art and any of them are described in the literature and are suitable for use herein, particularly those using a DNA probe bound, directly or indirectly bound solid phase to facilitate separation of the remaining part of the DNA derived from the microorganisms.

Preferencialmente, o ADN da sonda está "marcado" com um parceiro de um par de ligação específica (isto é, um ligando) e o outro parceiro do par está ligado a uma matriz sólida para facilitar a separação do alvo da sua fonte. O ligando e o parceiro de ligação específico podem ser seleccionados a partir de, em qualquer orientação, o seguinte: (1) um antigénío ou hapteno e um anticorpo ou um seu fragmento de ligação específico; (2) biotina ou iminobiotina e avidina ou estreptavidína; (3) um açúcar e uma sua lecitina específica; (4) uma enzima e um seu inibidor; (5) uma apoenzima e cofactor; (6) oligonucleótidos homopoliméricos complementares; e (7) uma hormona e um seu receptor. A fase sólida selecciona-se, preferencialmente, entre: (1) um vidro ou uma superfície polimérica; (2) uma coluna cheia de pérolas polimérícas; e (3) partículas magnéticas ou paramagnéticas. A biblioteca de clon.es preparada como se descreveu antes pode ser rastreada directamente para uma desejada actividade enzimática sem a necessidade de expansão da cultura, amplificação da cultura ou quaisquer outros processos suplementares. Contudo, num enquadramento preferido, considera-se desejável amplificar o ADN recuperado a partir de clones individuais, por meio de, por exemplo, RCP.Preferably, the probe DNA is " labeled " with one partner of a specific binding pair (i.e., one ligand) and the other partner of the pair is attached to a solid matrix to facilitate separation of the target from its source. The ligand and the specific binding partner may be selected from, in any orientation, the following: (1) an antigen or hapten and an antibody or a specific binding fragment thereof; (2) biotin or iminobiotin and avidin or streptavidin; (3) a sugar and its specific lecithin; (4) an enzyme and an inhibitor thereof; (5) an apoenzyme and cofactor; (6) complementary homopolymer oligonucleotides; and (7) a hormone and a receptor thereof. The solid phase is preferably selected from: (1) a glass or a polymeric surface; (2) a column filled with polymeric beads; and (3) magnetic or paramagnetic particles. The cloned library prepared as described above can be screened directly for a desired enzymatic activity without the need for culture expansion, culture amplification or any other supplemental processes. However, in a preferred embodiment, it is considered desirable to amplify the recovered DNA from individual clones by, for example, PCR.

Além disso, é opcional mas desejável, realizar uma amplificação do ADN alvo que tenha sido isolado. Neste enquadramento, o ADN isolado selectivamente é separado do ADN da sonda após isolamento, ã então amplificado antes de ser utilizado para transformar os hospedeiros. O ADN de estrutura helicoidal dupla, seleccionado para incluir pelo menos numa sua porção uma sequência pré-determinada de ADN, pode ser transformado numa estrutura helicoidal simples, submetido a amplificação e novamente transformado em anéis para providenciar números amplificados de ADN de estrutura helicoidal dupla seleccionado. Hã numerosas metodologias de amplificação que são agora bem conhecidas na técnica. O ADN seleccionado é então utilizado para preparar uma biblioteca para rastrear por transformação um organismo apropriado. Os hospedeiros, particularmente, os identificados aqui especificamente como preferidos, são transformados pela introdução artificial dos vectores contendo o ADN alvo por inoculação em condições que conduzem a essa transformação.In addition, it is optional but desirable to perform amplification of target DNA that has been isolated. In this embodiment, the selectively isolated DNA is separated from the probe DNA after isolation, then amplified before being used to transform the hosts. Double stranded DNA, selected to include at least a portion thereof in a predetermined sequence of DNA, can be transformed into a single helical structure, amplified, and further transformed into rings to provide amplified DNA numbers of double helical structure selected . Numerous amplification methodologies are now well known in the art. The selected DNA is then used to prepare a library to appropriately screen for transformation. The hosts, particularly those specifically identified herein as preferred, are transformed by the artificial introduction of the vectors containing the target DNA by inoculation under conditions that lead to such transformation.

Como exemplos representativos de vectores de expressão que podem ser utilizados, podem-se mencionar partículas virais, baculovírus, fagos, plasmidos, fasmidos, cosmidos, fosmidos, cromossomas bacterianos artificiais, ADN virai (por exemplo, vacinia, adenovírus, poxvírus impuro, vírus da pseudo-raiva e derivados de SV40). Os cromossomas artificiais 22 à base de Pl, os plasmidos de fungos, os cromossomas artificiais de fungos e quaisquer outros vectores específicos para hospedeiros específicos de interesse (tais como, bacilos, aspergilos, fungos, etc.). Assim, por exemplo, o ADN pode ser incluído em qualquer um de uma grande variedade de vectores de expressão para expressar um polipéptido. Esses vectores incluem sequências de ADN cromossómicas, não cromossómicas e sintéticas. Os especialistas na matéria conhecem um grande número de vectores apropriados e esses vectores estão comercialmente disponíveis. Os vectores que se seguem são dados a título de exemplo: bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SK, pBluescript KS, pNHSA, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK2 2 3-3, pKK233-3, pDR540, pRITS (Pharmacia); eucaríóticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Contudo, qualquer outro plasmido ou vector pode ser utilizado desde que seja replicãvel e viável no hospedeiro.As representative examples of expression vectors that may be used, there may be mentioned viral particles, baculoviruses, phages, plasmids, phasmids, cosmids, phosmids, artificial bacterial chromosomes, viral DNA (e.g., vaccinia, adenovirus, impure pox virus, pseudo-rabies and SV40 derivatives). Pl-Artificial 22 chromosomes, fungal plasmids, fungal artificial chromosomes, and any other specific vectors specific to specific hosts of interest (such as bacilli, aspergillos, fungi, etc.). Thus, for example, DNA may be included in any of a wide variety of expression vectors to express a polypeptide. Such vectors include chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences. Those skilled in the art will recognize a large number of suitable vectors and such vectors are commercially available. The following vectors are given by way of example: bacterial: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SK, pBluescript KS, pNHSA, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS (Pharmacia); eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). However, any other plasmid or vector can be used so long as it is replicable and viable in the host.

Um tipo de vector particularmente preferido para ser utilizado na presente invenção, contém uma origem de replicação do factor f. 0 factor f (ou facto da fertilidade) na E. coli, é um plasmido que efectua uma transferência de elevada frequência de si próprio durante a conjugação e uma transferência menos frequente do próprio cromossoma bacteriano. Um enquadramento particularmente preferido consiste em utilizar vectores de clonagem, referidos como "fosmidos" ou vectores de cromossomas bacterianos artificiais (CBA). Estes derivam do factor f de E. coli e são capazes de integrar de forma estável grandes segmentos do ADN genómico. Quando integrados com o ADN de uma amostra ambiental que não provém de cultura, isto torna possível conseguir fragmentos genómicos grandes sob a forma de uma "biblioteca de ADN ambiental" estável. 23 0 ADN derivado de microrganismos pode ser inserido num vector por uma variedade de processos. Em geral, insere-se a sequência, de ADN num sítio de endonuclease de restrição apropriado, por processos conhecidos na técnica. Esses e outros processos estão dentro do âmbito dos especialistas nesta matéria. A sequência de ADN num vector de expressão, está operacionalmente ligada a uma sequência de controlo de expressão apropriada (promotor) para a síntese directa do ARNm. Os promotores bacterianos particularmente designados incluem lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL e trp. Os promotores eucarióticos incluem CMV (citomegalovírus) imediato precoce. A timidina cinase de VSH, SV40 precoce e tardio, os LTRs de retrovírus e metalotioneína-1 de rato. A selecção dos vectores e promotores apropriados, está bem dentro do nível dos técnicos da especialidade. O vector de expressão também contém um sítio de ligação do ribossoma para a tradução inicial e um terminador de transcrição. O vector pode também incluir as sequências apropriadas para a expressão de amplificação. As regiões do promotor podem ser seleccionadas por qualquer gene desejado utilizado vectores de CAT (cloranfenicol transferase) ou outros vectores como marcadores seleccionãveis.A particularly preferred vector type for use in the present invention contains an origin of replication of factor f. The factor f (or fact of fertility) in E. coli is a plasmid which effects a high frequency transfer of itself during conjugation and a less frequent transfer of the bacterial chromosome itself. A particularly preferred embodiment is to employ cloning vectors, referred to as " plasmids " or artificial bacterial chromosome vectors (BACs). These are derived from E. coli factor f and are capable of stably integrating large segments of genomic DNA. When integrated with DNA from an environmental sample that does not come from culture, this makes it possible to achieve large genomic fragments in the form of an " environmental DNA library " stable. DNA derived from microorganisms can be inserted into a vector by a variety of processes. In general, the DNA sequence is inserted into an appropriate restriction endonuclease site by methods known in the art. These and other processes are within the scope of those skilled in the art. The DNA sequence in an expression vector is operably linked to an appropriate expression control sequence (promoter) for the direct synthesis of the mRNA. Particularly designated bacterial promoters include lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL and trp. The eukaryotic promoters include early CMV (cytomegalovirus). Early, late SVS, SV40 thymidine kinase, retrovirus LTRs and rat metallothionein-1. Selection of the appropriate vectors and promoters is well within the skill of the art. The expression vector also contains a ribosome binding site for the initial translation and a transcription terminator. The vector may also include the sequences suitable for expression of amplification. Promoter regions may be selected by any desired gene using CAT vectors (chloramphenicol transferase) or other vectors as selectable markers.

Além disso, os vectores de expressão contêm, preferencíalmente, um ou mais genes marcadores seleccionãveis, para providenciar um traço fenotípico para a selecção das células hospedeiras transformadas, tais como, di-hidrofolato redutase ou resistência â neomicina para a cultura de células eucarióticas ou tal como a resistência à tetraciclina ou à ampicilina na E. coli. 24In addition, expression vectors preferably contain one or more selectable marker genes to provide a phenotypic trait for the selection of transformed host cells, such as dihydrofolate reductase or neomycin resistance for the culture of eukaryotic cells or such such as tetracycline or ampicillin resistance in E. coli. 24

Geralmente, os vectores de expressão recombinante incluirão origens de replicação e ma rcadores seleccionáveis, que permitem a transformação da célula hospedeira, por exemplo, o gene de resistência à ampicilina de E. coli e S. cerevísíae, o gene TRP1 e um promotor derivado de um gene altamente expresso para a transcrição directa de uma sequência estrutural a jusante. Esses promotores podem derivar de operões que codificam enzimas glicolíticas, tais como, 3-xosfoglicerato cinase (FGC), factor a, fosfatase ácida ou proteínas de choque térmico, entre outras. A sequência estrutural heteróloga junta-se na fase apropriada com as sequências de iniciação da tradução e as sequências de terminação e, preferencialmente, uma sequência líder capaz de direccionar a secreção da proteína traduzida no espaço periplãsmico ou no meio extracelular. 0 ADN seleccionado e isolado, tal como foi aqui descrito antes, ê introduzido num hospedeiro apropriado para preparar uma biblioteca, que é rastreada quanto à actividade de enzima desejada. 0 ADN seleccionado está preferencialmente num vector que inclui as sequências de controlo apropriados, nas quais o ADN seleccionado que codifica para uma enzima pode ser expresso, para detecção da actividade desejada. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de um fungo ou a célula de hospedeiro pode ser uma célula procariôtica, tal como, uma célula bacteriana. A introdução da estrutura da célula hospedeira, pode ser efectuada por transformação, transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediata por DEAE-dextrano, DMSO ou electroporação (Davis L., Dibner M., Battey I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). 25Generally, recombinant expression vectors will include replication origins and selectable markers, which allow transformation of the host cell, for example, the ampicillin resistance gene of E. coli and S. cerevisiae, the TRP1 gene and a promoter derived from a highly expressed gene for direct transcription of a downstream structural sequence. Such promoters may be derived from operons encoding glycolytic enzymes, such as 3-xosphoglycerate kinase (FGC), α-factor, acid phosphatase or heat shock proteins, among others. The heterologous structural sequence is joined at the appropriate stage with translation initiation sequences and termination sequences, and preferably a leader sequence capable of directing the secretion of the translated protein in the periplasmic space or the extracellular medium. The DNA selected and isolated, as described hereinbefore, is introduced into a suitable host to prepare a library, which is screened for the desired enzyme activity. The DNA selected is preferably in a vector which includes the appropriate control sequences in which the selected DNA encoding an enzyme can be expressed for the detection of the desired activity. The host cell may be a higher eukaryotic cell, such as a mammalian cell or a lower eukaryotic cell, such as a fungal cell or the host cell may be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. The introduction of the host cell structure can be effected by transformation, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, DMSO or electroporation (Davis L., Dibner M., Battey I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986)). 25

Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem mencionar-se: células bacterianas, tais como: E. coli, Bacillus, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células de fungo, tais como, levedura; células de insecto, tais como, Drosophila S2 e Spodoptera Sf9-, células de animais, tais como, OHC (ovários de hamster chinês) , CSO ou de melanoma de Bowes; adenovírus; células de plantas, etc. A selecção de um hospedeiro apropriado está compreendida dentro dc âmbito da competência dos especialistas na matéria a partir dos presentes ensinamentos.As representative examples of suitable hosts, there may be mentioned: bacterial cells, such as: E. coli, Bacillus, Streptomyces, Salmonella typhimurium; fungal cells, such as yeast; insect cells, such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9-, animal cells, such as, CHO (Chinese hamster ovary), CSO or Bowes melanoma; adenovirus; plant cells, etc. Selection of an appropriate host is within the purview of those skilled in the art from the present teachings.

As células hospedeiras são tratadas por engenharia genética (transduzidas ou transformadas ou transfectadas) com os vectores. As células hospedeiras transformadas geneticamente podem ser postas em cultura com meios nutrientes convencionais, modificados conforme apropriado para os promotores de activação, transformantes de selecção ou genes de amplificação. As condições de cultura, tal como, temperatura, pH e similares, são as utilizadas previamente com as células hospedeiras seleccionadas para expressão e serão evidentes para um técnico especialista na matéria.Host cells are engineered (transduced or transformed or transfected) with the vectors. Genetically transformed host cells may be cultured with conventional nutrient media, modified as appropriate for the activation promoters, selection transformants or amplification genes. Culture conditions, such as temperature, pH and the like, are those previously used with the host cells selected for expression and will be apparent to one skilled in the art.

As enzimas recombinantes na biblioteca que são classificadas conforme aqui descrito, podem ou não ser sequenciadas e podem ou não estar sob uma forma purificada. Assim, de acordo com a presente invenção, é possível classificar uma ou mais das enzimas recombinantes, antes ou depois de se obter a sequência da enzima ou antes ou depois de se purificar a enzima até a uma homogeneidade essencial. 0 rastreio das característícas químicas pode ser efectuado em clones de expressão individuais ou pode ser efectuado inicialmente numa mistura de clones de expressão para verificar se as misturas têm ou não uma ou mais 26 actividades enzimáticas específicas. Se a mistura tem uma actividade da enzima especificada, então os clones individuais podem ser novamente rastreados quanto à actividade dessa enzima ou para mais uma actividade específica. Assim, por exemplo, se uma mistura de clones tem uma actividade de hidrolase, então os clones individuais podem ser recuperados e rastreados para determinar quais desses clones têm actividade de hidrolase.Recombinant enzymes in the library that are classified as described herein, may or may not be sequenced and may or may not be in a purified form. Thus, according to the present invention, it is possible to classify one or more of the recombinant enzymes before or after the enzyme sequence is obtained or before or after the enzyme is purified to an essential homogeneity. Screening of the chemical characteristics can be performed on individual expression clones or can be performed initially on a mixture of expression clones to verify whether or not the mixtures have one or more specific enzyme activities. If the mixture has an activity of the specified enzyme, then the individual clones can be screened again for the activity of that enzyme or for a specific activity. Thus, for example, if a mixture of clones has a hydrolase activity, then individual clones can be recovered and screened to determine which of those clones have hydrolase activity.

Também se descrevem aqui kits de enzimas para serem utilizados posteriormente no rastreio e/ou na investigação. Assim, prepara-se um pacote ou um kit de reagentes, colocando no pacote ou no kit, por exemplo, embalagens apropriadas, pelo menos três enzimas recombinantes diferentes tendo cada uma delas pelo menos três enzimas recombinantes diferentes com pelo menos duas características enzimáticas em comum. Preferencialmente, uma característica comum é uma caracte-rística ou propriedade química e a outra característica comum, é uma característica ou propriedade física; contudo, é possível preparar kits que têm duas ou mais caracterí sticas ou propriedades químicas em comum e nenhuma característica ou propriedade física em comum e vice-versa.Enzyme kits are also described herein for use in screening and / or research. Thus, a package or kit of reagents is prepared by placing in the package or kit, for example suitable packaging, at least three different recombinant enzymes each having at least three different recombinant enzymes having at least two common enzyme characteristics . Preferably, a common feature is a feature or chemical property and the other common feature is a physical feature or property; however, it is possible to prepare kits having two or more characteristics or chemical properties in common and no common physical property or property and vice versa.

Dado que de acordo com a presente invenção é possível providenciar uma biblioteca de enzimas recombinantes a partir de um ou mais microrganismos, biblioteca essa que ê classificada por uma multiplicidade de propriedades químicas e/ou físicas, pode preparar-se uma variedade de kits ou de embalagens de enzimas, tendo uma variedade de características químicas e/ou físicas que podem ser formuladas para conter três ou mais enzimas recombinantes nas quais, pelo menos três e preferencialmente todas as enzimas recombinantes, têm em comum pelo menos uma característica química e têm em comum pelo menos uma característica física. 0 kit deve conter um 27 rótulo apropriado que especifica essas características comuns.Since according to the present invention it is possible to provide a library of recombinant enzymes from one or more microorganisms, which library is classified by a multiplicity of chemical and / or physical properties, a variety of kits or which contain a variety of chemical and / or physical characteristics which may be formulated to contain three or more recombinant enzymes in which at least three and preferably all recombinant enzymes have at least one chemical in common and have in common at least one physical characteristic. The kit should contain an appropriate label that specifies these common characteristics.

Por exemplo, pelo menos três enzimas recombinantes no kit têm em comum a característica química mais específica especificada no rótulo. O termo "rótulo", é utilizado no seu sentido mais lato e incluí inserções na embalagem ou literatura associada ou distribuída em conjunto com o kit ou com a embalagem. Assim, por exemplo, se o kit está rotulado para um substrato específico (um dos exemples anteriores da fileira 3) então, por exemplo, pelo menos três das enzimas do kit irão actuar nesse substrato.For example, at least three recombinant enzymes in the kit have the most specific chemical characteristic specified on the label in common. The term " label " is used in its broadest sense and includes inserts in the package or literature associated with or distributed in conjunction with the kit or the package. Thus, for example, if the kit is labeled for a specific substrate (one of the previous examples of row 3) then, for example, at least three of the enzymes of the kit will act on that substrate.

Os kits conterão, preferencialmente, mais do que três enzimas, por exemplo, cinco, seis ou mais enzimas e, num enquadramento preferido, pelo menos três, preferencialmente, uma maioria e, nalguns casos, todas as enzimas recombinantes no kit, terão pelo menos duas propriedades ou características das enzimas em comum, tal como se descreveu aqui antes.The kits will preferably contain more than three enzymes, for example, five, six or more enzymes and, in a preferred embodiment, at least three, preferably a majority, and in some cases all recombinant enzymes in the kit, will have at least two properties or characteristics of the enzymes in common, as described hereinbefore.

As enzimas recombinantes nos kits podem ter duas ou mais enzimas numa única embalagem ou enzimas individuais em embalagens individuais ou várias das suas combinações. A biblioteca pode ser rastreada para uma actividade de enzimas específica por processos conhecidos na técnica. Por exemplo, a actividade da enzima pode ser rastreada para uma ou mais das seis classes de IUB: oxireductases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. As enzimas recombinantes que se determina como sendo positivas para uma ou mais das classes de IUB, podem então ser rastreadas para mais actividades específicas das enzimas. 28Recombinant enzymes in the kits may have two or more enzymes in a single package or individual enzymes in individual packages or in various combinations thereof. The library can be screened for specific enzyme activity by methods known in the art. For example, enzyme activity can be screened for one or more of the six classes of IUBs: oxy-reductases, transferases, hydrolases, lyases, isomerases and ligases. Recombinant enzymes which are determined to be positive for one or more of the classes of IUB can then be screened for further enzyme-specific activities. 28

Alternativamente, a biblioteca pode ser rastreada quanto a uma actividade de enzima mais especializada. Por exemplo, em vez de um rastreio genérico quanto à actividade de hiarolase, a biblioteca pode ser rastreada para uma actividade mais especializada, isto é, o tipo de ligação na qual actua a hidrolase. Assim, por exemplo, a biblioteca pode ser rastreada quanto à certeza de que essas hidrolases actuam em uma ou mais funcionalidades químicas especificadas, tais como, (a) amida (ligações peptídicas), isto é, proteases; (b) ligações de éster, isto é, esterases e lipases; (c) acetais, isto é, glicosidases, etc.Alternatively, the library can be screened for more specialized enzyme activity. For example, instead of a generic screening for hiarolase activity, the library can be screened for a more specialized activity, i.e., the type of binding in which the hydrolase acts. Thus, for example, the library can be screened for the certainty that these hydrolases act on one or more specified chemical functionalities, such as, (a) amide (peptide bonds), i.e., proteases; (b) ester linkages, i.e., esterases and lipases; (c) acetals, i.e. glycosidases, etc.

Os clones que se identificam como tendo a actividade da enzima especificada, podem então ser sequenciados para identificar a sequência de ADN que codifica uma enzima, que tem a actividade especifiçada. Assim, de acordo com a presente invenção, é possível isolar e identificar: (i) o ADN que codifica uma enzima que tem uma actividade de enzima especificada, (ií) enzimas que têm essa actividade (incluindo a sua sequência de aminoácidos) e (iíi) produz enzimas recombinantes com essa actividade. O rastreio da actividade da enzima pode ser efectuado em clones de expressão individuais ou pode ser inícialmente efectuado numa mistura de clones de expressão para verificar se as misturas têm ou não uma ou mais das actividades das enzimas especificadas. Se a mistura tem uma actividade de enzima especifica, então os clones individuais podem ser novamente rastreados quanto a essa actividade de enzima ou quanto a mais actividades específicas. Assim, per exemplo, se uma mistura de clones tem uma actividade de hidrolase, então os clones individuais podem ser recuperados e rastreados para determinar quais desses clones têm actividade de hidrolase. 29 umaClones which are identified as having the activity of the specified enzyme may then be sequenced to identify the DNA sequence encoding an enzyme having the specified activity. Thus, in accordance with the present invention, it is possible to isolate and identify: (i) DNA encoding an enzyme having a specified enzyme activity, (i) enzymes having that activity (including its amino acid sequence) and ii) produces recombinant enzymes with this activity. Screening for enzyme activity may be performed on individual expression clones or may be initiated initially in a mixture of expression clones to verify whether or not the mixtures have one or more of the activities of the specified enzymes. If the mixture has a specific enzyme activity, then the individual clones can be screened again for that enzyme activity or for more specific activities. Thus, for example, if a mixture of clones has a hydrolase activity, then the individual clones can be recovered and screened to determine which of those clones have hydrolase activity. One

As bibliotecas de expressão podem ser rastreadas para ou mais características químicas seleccionadas. As características químicas seleccionadas representativas, estão descritas a seguir, mas estas características não limitam a presente invenção. Além disse, as bibliotecas de expressão podem ser rastreadas para algumas ou para todas as características. Assim, algumas das características químicas aqui especificadas podem ser determinadas em todas as bibliotecas, em nenhuma das bibliotecas ou apenas em algumas das bibliotecas.Expression libraries can be traced to or more selected chemical characteristics. The representative selected chemical characteristics are described below, but these features do not limit the present invention. In addition said, expression libraries can be traced to some or all of the features. Thus, some of the chemical characteristics specified here may be determined in all libraries, in any of the libraries or only in some of the libraries.

As enzimas recombinantes podem também ser analisadas e classificadas pelas propriedades físicas. Por exemplo, as enzimas recombinantes podem ser classificadas pelas seguintes propriedades físicas: pH óptimo <3 3-6 6-9 9-12 >12 temperatura óptima >90 °C 75- 90 °C 60- 75 °C 4 5- 60 °C 30- 45 °c 15 - 30 °c 00- 15 °c 30 estabilidade da temperatura semi-período de vida a:Recombinant enzymes can also be analyzed and classified by physical properties. For example, recombinant enzymes can be classified by the following physical properties: pH optimum <3 3-6 6-9 9-12> 12 optimal temperature> 90 ° C 75-90 ° C 60-75 ° C 4 5 - 60 ° C 30-45 ° c 15 - 30 ° C 00 - 15 ° c 30 semi-life temperature stability a:

90 °C 75 °C 60 °C 45 °C tolerância a dissolventes orgânicos miscíveis em água (DMF) 90 % 75 % 45 % 30 % imiscíveis em água hexano tolueno selectividade do ião metálico EDTA - 10 mM Ca+2 - 1 mM Mg+2 - 100 μΜ Mn+2 - 10 μΜ Co+3 - 10 μ Μ sensibilidade ao detergente neutro (tritão) aníõníco (dexoxicolato) catíónico (CHAPS) 3190 ° C 75 ° C 60 ° C 45 ° C tolerance to water miscible organic solvents (DMF) 90% 75% 45% 30% water immiscible hexane toluene selectivity of metal ion EDTA - 10 mM Ca + 2 - 1 mM Mg +2 - 100 μΜ Mn + 2 - 10 μΜ Co + 3 - 10 μΜ sensitivity to anionic (tritone) anionic (dexoxicolate) cationic detergent (CHAPS) 31

As enzimas recombinantes das bibliotecas da presente invenção, podem ser utilizadas para uma variedade de fins e a presente invenção, providenciando uma pluralidade de enzimas recombinantes classificadas por uma pluralidade de diferentes características das enzimas, permite um rastreio rápido das enzimas em relação a uma variedade de aplicações. Assim, por exemplo, o conjunto dos kits de enzimas, conforme descritos, que contêm uma pluralidade de enzimas que são capazes de operar numa ligação especifica ou num substrato específico, em condições específicas, permite assim o rastreio de enzimas quanto a uma variedade de aplicações. Como exemplos representativos dessas aplicações, podem mencionar-se: 1. Lipase/Esterase a. Hidrólise enatio-selectiva de ésteres (lípi- dos)/tioésteres 1) Resolução de misturas racémicas 2) Síntese de ácidos activos sob o ponto de vista óptico ou de álcoois de meso-diésteres b. Sínteses selectívas 1) Hidrólise regio-específica de ésteres de hidratos de carbono 2) Hidrólise selectiva de álcoois secundários cíclicos c. Sínteses de ésteres activos sob o ponto de vista óptico, lactonas, ácidos, álcoois 1) Trans-esterificação de ésteres activados/não activados 2) Inter-esterificação 32 3) Lactonas activas sob o ponto de vista õptico a partir de hidroxi-ésteres 4) Abertura de anel regio-selectivo e enantio-selectivo de anidridos d. Detergentes e. Gordura/conversão de óleo f. Ripening do queijoThe recombinant enzymes of the libraries of the present invention may be used for a variety of purposes and the present invention, providing a plurality of recombinant enzymes classified by a plurality of different characteristics of the enzymes, enables rapid screening of the enzymes for a variety of applications. Thus, for example, the set of enzyme kits as described which contain a plurality of enzymes that are capable of operating on a specific binding or a specific substrate under specific conditions thus enables the screening of enzymes for a variety of applications . As representative examples of such applications, there may be mentioned: 1. Lipase / Esterase a. Enantioselective hydrolysis of esters (lipids) / thioesters 1) Resolution of racemic mixtures 2) Synthesis of optically active acids or alcohols of meso-diesters b. Selective syntheses 1) Regiospecific hydrolysis of carbohydrate esters 2) Selective hydrolysis of cyclic secondary alcohols c. Synthesis of optically active esters, lactones, acids, alcohols 1) Transesterification of activated / non-activated esters 2) Interesterification 32 3) Optically active lactones from hydroxy esters 4 ) Regioselective and enantioselective ring opening of anhydrides d. Detergents e. Fat / oil conversion f. Cheese Ripening

XXX 2. Protease a. Sínteses de éster/amida b. Sínteses de péptidos c. Resolução de misturas racémicas de ésteres de aminoácidos d. Sínteses de aminoácidos não naturais e. Hidrólise de detergentes/proteínas 3. Glicosidase/Glicosil transferase a. Sínteses de açúcar/polímero b. Clivagem de ligações glicosílicas para formar mono, di e oligossacáridos c. Sínteses de oligossacáridos complexos d. Sínteses de glicósidos utilizando UDP/galactosil transferase e. Transglicosilação de dissacáridos, fluoretos de glicosilo, galactósidos de arilo f. Transferência de glicosilo nas sínteses de oligossacáridos g. Clivagem diastereo-selectiva de p-glicosil- sulfóxidos h. Glicosilações assimétricas 33 i . j ·XXX 2. Protease a. Ester / amide syntheses b. Peptide syntheses c. Resolution of racemic mixtures of amino acid esters d. Unnatural amino acid syntheses e. Hydrolysis of detergents / proteins 3. Glycosidase / Glycosyl transferase a. Sugar / Polymer Synthesis b. Cleavage of glycosylic bonds to form mono, di and oligosaccharides c. Synthesis of complex oligosaccharides d. Glycoside syntheses using UDP / galactosyl transferase e. Transglycosylation of disaccharides, glycosyl fluorides, aryl galactosides f. Glycosyl transfer in oligosaccharide syntheses g. Diastereo-selective cleavage of Î²-glycosylsulfoxides h. Asymmetric Glycosylations 33 i. j

Tratamento de alimentos Tratamento do papelFood Processing Paper Processing

Fosfatase/Cinase a. Síntese/hidrólise de ésteres de fosfato 1) Fosforilação regio- e enantio-selectiva 2) Introdução de ésteres de fosfato 3) Síntese de percursores de fosfolípidos 4) Síntese controlada de polinucleótidos b. Molécula biológica activa c. Formação selectiva da ligação de fosfato sem grupos de protecçãoPhosphatase / Kinase a. Synthesis / hydrolysis of phosphate esters 1) Regio- and enantioselective phosphorylation 2) Introduction of phosphate esters 3) Synthesis of phospholipid precursors 4) Controlled synthesis of polynucleotides b. Active biological molecule c. Selective formation of the phosphate bond without protecting groups

Mono/Dioxigenase a. Oxifuncionalização directa de substratos orgânicos não activados b. Hidroxilação de alcanos, aromáticos, esteróides c. Epoxidação de alcenos d. Sulfoxidação enantio-selectiva e. Oxidações regio- e estereo-selectivas de Bayer-VilligerMono / Dioxygenase a. Direct oxifunctionalization of non-activated organic substrates b. Hydroxylation of alkanes, aromatics, steroids c. Epoxidation of alkenes d. Enantioselective sulfoxidation e.g. Regio- and Stereo-Selective Oxidation of Bayer-Villiger

Halogenoperoxidase a. Adição oxidante do ião de halogeneto aos sítios nucleofílícos b. Adição de ácidos hipo-halosos a ligações olefínicas c. Clivagem do anel de ciclopropanos d. Substratos aromáticos activados, convertidos em derivados orto e para. e. 1,3-dicetonas convertidas em derivados de 2- halogénio f. Oxidação do heteroãtomo dos substratos contendo enxofre e azoto g. Oxidação de acetatos de enol, alcinos e anéis aromáticos activados 7. Lignina peroxidase/Diarilpropano peroxidaseHalogenoperoxidase a. Oxidizing addition of halide ion to nucleophilic sites b. Addition of hypohalosic acids to olefinic bonds c. Cleavage of the cyclopropane ring d. Activated aromatic substrates, converted into ortho and para derivatives. and. 1,3-diketones converted to 2-halogen derivatives f. Oxidation of heteroatom from substrates containing sulfur and nitrogen g. Oxidation of enol acetates, alkynes and activated aromatic rings 7. Lignin peroxidase / Diarylpropane peroxidase

a. Clivagem oxidante das ligações C-C b. Oxidação de álcoois benzilicos em aldeídos c. Hidrosilação de átomos de carbono benzílicos d. Dimerízação de fenol e. Hidroxilação de ligações duplas para formar dióis f. Clivagem de aldeídos de lignina 8. Epóxido hidrolase a. Síntese de compostos bioactivos, puros sob o ponto de vista enantioméricos b. Hidrólise regio- e enantio-selectiva de epóxidos c. Epoxidação aromática e olefínica, por meio de mono-oxigenases para formar epóxidos d. Resolução de epóxidos racémicos e. Hidrólise de epóxidos de esteróides 9. Nitrilo hidratase/Nitrilase a. Hidrólise de nitrilos alifáticos para earboxiamidas 35 b. Hidrólise de nitrilos aromáticos, heterocíclicos, alifáticos insaturados nos ácidos correspondentes c. Hidrólise de acrilonitrilo d. Produção de aromáticos e carboxiamidas, ácidos carboxílicos (nicotinamida, picolinamida, isonicotinamida) e. Hidrólise regio-selectiva de dinitrilo acrílico f. oí-aminoácidos a partir de a-hidroxinitrilos 10. Transaminase a. Transferência de grupos amino para oxo-ácidos 11. Amidase/AcilaseThe. Oxidizing cleavage of C-C bonds b. Oxidation of benzylic alcohols in aldehydes c. Hydrosilation of benzylic carbon atoms d. Dimerization of phenol e. Hydroxylation of double bonds to form diols f. Cleavage of lignin aldehydes 8. Epoxide hydrolase a. Synthesis of enantiomeric pure bioactive compounds b. Regio- and enantioselective epoxide hydrolysis c. Aromatic and olefinic epoxidation by means of mono-oxygenases to form epoxides d. Resolution of racemic epoxides e. Hydrolysis of Steroid Epoxides 9. Nitrile Hydratase / Nitrilase a. Hydrolysis of aliphatic nitriles to carboxyamides 35 b. Hydrolysis of aromatic, heterocyclic, aliphatic unsaturated nitriles in the corresponding acids c. Hydrolysis of acrylonitrile d. Production of aromatics and carboxyamides, carboxylic acids (nicotinamide, picolinamide, isonicotinamide) and. Regio-selective hydrolysis of acrylic dinitrile f. α-amino acids from Î ± -hydroxynitriles 10. Transaminase a. Transfer of amino groups to oxo-acids 11. Amidase / Acilase

a. Hidrólise de amidas, amídinas e outras ligações C-N b. Resolução e síntese de aminoácidos não naturais A presente invenção será melhor descrita com referência aos exemplos que se seguem; contudo, o âmbito da presente invenção não está limitado por eles. A menos que seja especificado de outra forma, todas as partes são em peso.The. Hydrolysis of amides, amidines and other C-N bonds b. Resolution and Synthesis of Unnatural Amino Acids The present invention will be better described with reference to the following examples; however, the scope of the present invention is not limited thereto. Unless otherwise specified, all parts are by weight.

Exemplo 1Example 1

Produção da Biblioteca de Expressão A seguir descreve-se um processo representativo para a preparação de uma biblioteca de expressão para rastrear a abordagem de fileiras da presente invenção. 36Production of the Expression Library A representative process for the preparation of an expression library for tracking the row approach of the present invention is described below. 36

Fez-se a lise de 1 grama de uma mistura de células GU5L5 de Thennococcus e isolou-se o ADN por processos divulgados na literatura (Current Protocols in Molecular Biology, 2.4.1, 1987). Fez-se uma nova suspensão de aproximadamente 100 pg do ADN isolado num tampão TE e passou-se vigorosamente através de uma agulha de dimensão 2 5 até que os fragmentos cortados tivessem num intervalo de dimensão de 0,5-10,0 Kb (média de 3,0 Kb) . As extremidades do ADN foram "polidas" ou tornadas cegas com Feijão mungo nuclease (3 00 unidades, 3 7 °C, 15 minutos) e os sítios de restrição de EcoRI no ADN alvo protegidos com EcoRI metilase (200 unidades, 37 °C, 1 hora). Os ligantes de EcoRI [GGAATTCC] foram ligados ao ADN cego/protegido utilizando 10 pmole de extremidades de ligantes até 1 pmole de extremidade do ADN alvo. Cortaram-se novamente os ligantes com endonuclease de restrição de EcoRI (200 unidades, 3 7 °C, 1,5 horas) e a dimensão do ADN foi fraccionada por meio de um gradiente de sacarose (Maniatis T. , Fritsch E.F., e Sambrook J. , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982). O ADN alvo preparado foi ligado ao vector Lambda ΖΑΡ® II (Stratagene), embalado utilizando extractos de embalagem de lambda in vitro e fez-se crescer numa estirpe de E. coli XLl-Blue MRF', de acordo com o fabricante. Os fasmidos de pBluescript° foram retirados da biblioteca de lambda e cresceram em DH10B F' kan de E. coli, de acordo com o processo de Hay e Short (Hay e Short. J. Strategies, 5:16, 1992). Retiram-se as colónias resultantes com palitos esterilizados e utilizaram-se para inocular de forma isolada cada um dos microtubos de 11 placas microtituladoras com 96 microtubos (1.056 clones ao todo). Os microtubos continham 2 50 pL de meio LB com 100 pg/mL de ampicilina, 80 ug/mL de meticilina e glicerol a 10 % v/v (Amp./Met. de LB, glicerol). As células cresceram durante a noite a 37 °C sem agitação. Assim, constituiu-se a geração da "biblioteca fonte"; cada microtubo da biblioteca fonte 37 continha assim uma cultura concentrada de células de E. coli, cada uma das quais contendo um fasmido de pBluescript com uma inserção única de ADN.1 gram of a mixture of Thennococcus GU5L5 cells was lysed and the DNA isolated by methods disclosed in the literature (Current Protocols in Molecular Biology, 2.4.1, 1987). A further suspension of approximately 100 μg of the isolated DNA in a TE buffer was passed and vigorously passed through a 25 μm needle until the cut fragments had a size range of 0.5-10.0 Kb (mean of 3.0 Kb). The ends of the DNA were " polished " or blinded with Mung Bean Nuclease Bean (300 Units, 37 ° C, 15 minutes) and EcoRI methylase protected target DNA EcoRI restriction sites (200 units, 37 ° C, 1 hour). EcoRI ligands [GGAATTCC] were ligated to the blind / protected DNA using 10 Âμmol of ligand ends to 1 Âμmole of the target DNA end. The ligands were again cleaved with EcoRI restriction endonuclease (200 units, 37 ° C, 1.5 hours) and the size of the DNA was fractionated by means of a sucrose gradient (Maniatis T., Fritsch EF, and Sambrook J., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982). The prepared target DNA was ligated to Lambda? II vector (Stratagene), packed using in vitro lambda packaging extracts, and grown in a strain of E. coli XL1-Blue MRF ', according to the manufacturer. The phlogs of pBluescript ° were taken from the lambda library and grown in E. coli DH10B F 'kan, according to the Hay and Short process (Hay and Short, J. Strategies, 5:16, 1992). The resulting colonies were withdrawn with sterile toothpicks and used to inoculate each of the microtubes isolated from 11 microtiter plates with 96 microtubes (1,056 clones in total). The microtubes contained 250 μl LB medium with 100 μg / ml ampicillin, 80 μg / ml methicillin and 10% v / v glycerol (Amp./Met. LB, glycerol). Cells were grown overnight at 37 ° C without shaking. Thus, the generation of the " source library "; each microtube from the source library 37 thus contained a concentrated culture of E. coli cells, each containing a pBluescript phasmid with a single DNA insert.

Exemplo 2Example 2

Preparação de uma Biblioteca de ADN A seguir indicam-se os processos utilizados para gerar uma biblioteca de genes a partir de uma amostra da superfície exterior de um osso de baleia, encontrado a 1.240 metros de profundidade na bacia de Santa Catalina durante uma expedição de mergulho. ADN IsoladoPreparation of a DNA Library The following are the processes used to generate a gene library from a sample of the outer surface of a whalebone, found 1,240 meters deep in the Santa Catalina basin during a diving expedition . Isolated DNA

Utilizou-se o processo IsoQuick de acordo com as instruções do fabricante.The IsoQuick process was used according to the manufacturer's instructions.

Corte de ADN 1. Fez-se passar vigorosamente ADN através de uma agulha de fundo duplo de dimensão 25G e uma seringa de 1 cc, durante 500 vezes. 2. Analisou-se uma pequena quantidade (0,5 pg) num gel de agarose a 0,8 %, para ter a certeza que a maioria do ADN estava no intervalo de dimensão desejado (cerca de 3-6 kb) . ADN Cego 1. Adicionou-se: 38DNA Cutting 1. DNA was vigorously passed through a 25 g dimension double bottom needle and 1 cc syringe for 500 times. 2. A small amount (0.5æg) was analyzed on a 0.8% agarose gel, to make sure that most of the DNA was in the desired size range (about 3-6 kb). Blind DNA 1. 38

H20 até a um volume final de 405 pL 15 pL 10X do tampão de Feijão mungo 2,0 pL Feijão mungo nuclease (150 u/pL) 2. Incubou-se a 37 °C, durante 15 minutos. 3. Extraiu-se uma vez no seio de fenol/clorofõrmio. 4. Extraiu-se uma vez no seio de clorofórmio. 5. Adicionou-se 1 mL de etanol arrefecido em gelo, para precipitar. 6. Colocou-se em placa em gelo, durante 10 minutos. 7. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 30 minutos. 8. Lavou-se com 1 mL de etanol a 70 %. 9. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 10 minutos e em atmosfera anidra. ADN de Metilato 1. Fez-se uma nova suspensão, cuidadosamente, de ADN em 26 pL em TE. 2. Adicionou-se:H20 to a final volume of 405 μl 15 μl 10X of the Mung Bean Buffer 2.0 μl Mungo nuclease bean (150 μl / well) 2. Incubated at 37 ° C for 15 minutes. 3. Extract once in phenol / chloroform. 4. Extract once in chloroform. 5. Ice-cold ethanol (1 mL) was added to precipitate. 6. Plated on ice for 10 minutes. 7. Micro-centrifugation was performed at high speed for 30 minutes. 8. Washed with 1 mL of 70% ethanol. 9. Micro-centrifugation was performed at high speed for 10 minutes under anhydrous atmosphere. Methylate DNA 1. Carefully resuspended 26 pL DNA in TE. 2. To this was added:

4,0 uL 10X tampão de metilase de EcoRI 39 0,5 pL SAM (32 mM) 5,0 pL metilase de EcoRI (40 U/pL) Incubou-se a 37 °C, durante 1 hora.4.0 Âμl 10X EcoRI methylase buffer 39 0.5 Âμl SAM (32 mM) 5.0 Âμl EcoRI methylase (40 U / ÂμL) Incubated at 37Â ° C for 1 hour.

Assegurar as Extremidades Cegas 1. Adicionou-se à reacção de metilação:Ensure the Blind Ends 1. To the methylation reaction was added:

5.0 pL MgCl2 100 mM5.0 pL 100 mM MgCl2

8.0 pL mistura de dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP cada um 2,5 mM) 4.0 pL Klenow (5 u/pL) 2. Incubou-se a 12 °C, durante 30 minutos.8.0 æl dNTP mixture (dGTP, dATP, dTTP, dCTP each 2.5 mM) 4.0 æl Klenow (5 æl / æl) 2. Incubated at 12øC for 30 minutes.

Adicionou-se 450 pL de IX STE. 4. Extraiu-se uma vez no seio de fenol/clorofórmio. 5. Extraiu-se uma vez no seio de clorofórmio 6. Adicionou-se 1 mL de etanol arrefecido com gelo para precipitar e colocar em gelo durante 10 minutos. 7. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 3 0 minutos. 8. Lavou-se com 1 mL de etanol a 70 %. 9. Fez-se uma micro-centrífugação, a alta velocidade, durante 10 minutos e em atmosfera anidra. 40450 μl IX STE was added. 4. Extract once in phenol / chloroform. 5. Extracted once in chloroform 6. 1 ml of ice-cold ethanol was added to precipitate and placed on ice for 10 minutes. 7. Micro-centrifugation was done at high speed for 30 minutes. 8. Washed with 1 mL of 70% ethanol. 9. Micr centrifugation was performed at high speed for 10 minutes under anhydrous atmosphere. 40

Ligação do Ligando 1. Fez-se uma nova suspensão, cuidadosamente, de ADN em 7 pL em Tris-EDTA (TE). 2 .Binding of Ligand 1. Carefully resuspended 7 μl DNA in Tris-EDTA (TE). 2 .

Adicionou-se:To this was added:

14 pL 3, 0 pL 3.0 pL 3.0 pL14 pL 3.0 pL 3.0 pL 3.0 pL

ligantes de EcoRI fosforilado (200 ng/pL) 10X tampão de ligação rATP 10 mM ligase de ADN de T4 (4Wu/pL) 3. Incubou-se a 4 °C, durante a noite.phosphorylated EcoRI ligands (200 ng / well) 10X rATP binding buffer 10 mM T4 DNA ligase (4Wu / æl) 3. Incubated at 4 ° C overnight.

Corte de EcoRI 1. Reacção de ligação para matar por acção do calor a 68 °C, durante 10 minutos. 2. Adicionou-se: 237,9 pL H20EcoRI Cut 1. Bond reaction to kill by heat at 68 ° C for 10 minutes. 2. 237.9 pL H 2 O

30 pL 10X tampão de EcoRI 2,1 pL enzima de restrição de EcoRI (100 U/pL) 3. Incubou-se a 37 °C, durante 1,5 horas. 4. Adicionou-se 1,5 pL de EDTA 0,5 M. 5. Colocou-se em gelo.30 Âμl 10X EcoRI buffer 2.1 Âμl EcoRI restriction enzyme (100 U / ÂμL) 3. Incubated at 37Â ° C for 1.5 hours. 4. 1.5 Âμl of 0.5 M EDTA was added. 5. Place on ice.

Fraccionamento da Dimensão por Meio de um Gradiente de Sacarose (2,2 mL) 41 1. Aqueceu-se a amostra até 65 °C, durante 10 minutos. 2. Carregou-se, cuidadosamente, em 2,2 mL de um gradiente de sacarose. 3. Fez-se uma mini-ultracentrifugação, a 45 K, a 20 °C, durante 4 horas (sem paragem). 4. Recolheu-se as fracções na ponta da base do tubo do gradiente com uma agulha com uma dimensão de 20G e deixou-se que a sacarose fluísse através da agulha. Recolheram-se as primeiras 20 gotas num tubo Falcon 2059 e depois recolheu-se 10 fracções de uma gota (marcadas de 1-10). Cada gota tinha um volume de cerca de 60 pL. 5. Fez-se passar 5 pL de cada fracção num gel de agarose a 0,8 % para verificar a dimensão. 6. Juntaram-se as fracções 1-4 (-10-1,5 kb) e, num tubo separado, juntaram-se as fracções 5-7 (cerca de 5-0,5 kb) . 7. Adicionou-se 1 mL de etanol arrefecido com gelo para precipitar e colocou-se em gelo durante 10 minutos. 8. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 30 minutos. 9. Lavou-se com 1 mL de etanol a 70 %. 10. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 10 minutos e em atmosfera anidra. 42 11.Fractionation of the Dimension by a Sucrose Gradient (2.2 mL) 1. The sample was heated to 65 ° C for 10 minutes. 2. Charge carefully in 2.2 mL of a sucrose gradient. 3. A mini ultracentrifugation was performed at 45 K at 20øC for 4 hours (no stoppage). 4. The fractions were collected at the tip of the base of the gradient tube with a 20G size needle and the sucrose was allowed to flow through the needle. The first 20 drops were collected in a Falcon 2059 tube and then 10 fractions of one drop (marked 1-10) were collected. Each drop had a volume of about 60 pL. 5. 5æl of each fraction was passed on a 0.8% agarose gel to verify the size. 6. Fractions 1-4 (-10-1.5 kb) were pooled and fractions 5-7 (about 5-0.5 kb) were pooled in a separate tube. 7. Ice-cold ethanol (1 mL) was added to precipitate and ice-cooled over 10 minutes. 8. Micro-centrifugation was performed at high speed for 30 minutes. 9. Washed with 1 mL of 70% ethanol. 10. Micro-centrifugation was performed at high speed for 10 minutes under anhydrous atmosphere. 42 11.

Fez-se uma nova suspensão, de cada um, em 10 pL de tampão TE.Each suspension was resuspended in 10 μl of TE buffer.

Ligação de Ensaio aos Ramos de Lambda 1. Fez-se um ensaio em placa para se obter uma concentração aproximada. Espalhou-se 0,5 pL da amostra em agarose contendo brometo de etídio em conjunto com padrões (amostras de ADN de concentração conhecida). Visualizou-se à luz ultravioleta e estimou-se a concentração comparada com os padrões. Fracção 1-4 = >1,0 pg/pL.Test Ligation to Lambda Branches 1. A plaque assay was performed to obtain an approximate concentration. 0.5 æl of the sample was run on ethidium bromide containing agarose along with standards (DNA samples of known concentration). It was visualized in ultraviolet light and concentration was estimated compared to standards. Fraction 1-4 => 1.0 pg / Âμl.

Fracção 5-7 = 500 ng/pL. 2. Preparou-se as reacções de ligação que se seguem (reacções de 5 pL) e incubaram-se a 4 °C, durante a noite:Fraction 5-7 = 500 ng / μl. 2. The following binding reactions were prepared (5 μl reactions) and incubated at 4 ° C overnight:

Amostra H20 10X tampão de ligase rATP 10 mM Ramos de lambda ígtll, zap) Inserção de ADN Ligase de ADN de T4 (4 Wu/p) I Fracção 1-4 0,5 pL 0,5 pL 0,5 pL 1,0 pL 2,0 pL 0,5 pL Fracção 5-7 0, 5 pL 0,5 pL 0, 5 pL 1,0 μΐ 7,0 pL 0,5 pLSample H20 10X ligase buffer 10 mM rATP (lambda lines, zap) DNA insertion T4 DNA ligase (4 Wu / p) I Fraction 1-4 0.5 pL 0.5 pL 0.5 pL 1.0 pL 2.0 pL 0.5 pL Fraction 5-7 0.5 pL 0.5 pL 0.5 pL 1.0 μΐ 7.0 pL 0.5 pL

Embalagem e Placa de Ensaio 1. Fez-se a embalagem das reacções de ligação seguindo o protocolo do fabricante. Embalou-se 2,5 pL por cada extracto embalado (2 extractos por ligação). 43 2. Pararam-se as reacções de embalamento com 500 pL de tampão de SM e juntaram-se as embalagens provenientes da mesma ligação. 3. Fez-se a titulação de 1,0 pL de cada, no hospedeiro apropriado (OD60o = 1,0) [XLI-Blue MRF para ZAP e Y1088 para gtll]Packing and Test Plate 1. Binding reactions were packaged following the manufacturer's protocol. 2.5 Âμl per packaged extract (2 extracts per binding) was packed. 2. The packing reactions were stopped with 500 μl of SM buffer and the cartons from the same connection were pooled. 3. Titration of 1.0 Âμl of each in the appropriate host (OD60o = 1.0) [XLI-Blue MRF for ZAP and Y1088 for gtll]

Adicionou-se 200 pL do hospedeiro (em MgS04 mM) a tubos Falcon 2059200 Âμl of the host (in MgSO4 mM) was added to Falcon 2059 tubes

Inoculou-se com 1 pL do fago embalado Incubou-se a 37 °C, durante 15 minutosInoculated with 1 Âμl of the packaged phage Incubated at 37Â ° C for 15 minutes

Adicionou-se cerca de 3 mL de agar do topo, a 48 °CAbout 3 ml of top agar was added at 48 ° C

[stock de 50 mL contendo 150 pL de IPTG (0,5 M) e 300 pL de X-GAL (350 mg/mL)]50 mL stock containing 150 μl of IPTG (0.5 M) and 300 μl of X-GAL (350 mg / ml)]

Colocou-se em placas de 10 mM e incubou-se a 37 °C, durante a noite. 4. Resultados da eficiência: gtll: 1,7 x 104 recombinantes com um background a 95 % ZAP II: 4,2 x 104 recombinantes com um background a 66 %It was placed in 10 mM plates and incubated at 37 ° C overnight. 4. Efficacy results: gtll: 1.7 x 104 recombinants with a background at 95% ZAP II: 4.2 x 104 recombinants with a background at 66%

Os contaminantes na amostra de ADN podem ter inibido as reacções enzimáticas, embora o gradiente de sacarose e as fracções orgânicas possam tê-los removido. Dado que a amostra 44 de ADN é preciosa, deve fazer-se ura esforço para "fixar" as extremidades para clonagem: ADN Tornado Novamente Cego 1. Juntaram-se todo o ADN que restou e que não estava ligado aos braços de lambda (fracções 1-7) e adicionou-se H20 até a um volume final de 12 pL. Depois adicionou-se : 143 pL H20 20 pL 10X tampão 2 (kit de síntese de ADNc daThe contaminants in the DNA sample may have inhibited the enzymatic reactions, although the sucrose gradient and the organic fractions may have removed them. Since the DNA sample 44 is precious, an effort must be made to " the ends for cloning: Again Blind Tornado DNA 1. All remaining DNA that was not bound to the lambda arms (fractions 1-7) was added and H 2 O was added to a final volume of 12 pL. Then: 143æl H₂O 20æl 10X buffer 2 (cDNA Synthesis Kit from

Stratagene) 23 pL dNTP para tornar cega a extremidade (kit de síntese de ADNc da Stratagene) 2,0 pL pfu (kit de síntese de ADNc daStratagene) 23 pL dNTP to make the end-blind (Stratagene cDNA synthesis kit) 2.0 pL pfu (cDNA

Stratagene) 2. Incubou-se a 72 °C, durante 30 minutos. 3. Extraiu-se uma vez no seio de fenol/clorofórmio. 4. Extraiu-se uma vez no seio de clorofórmio. 5. Adicionou-se 20 pL de NaOAc 3 M e 400 pL de etanol arrefecido com gelo até precipitar. 6. Colocou-se a -20 °C durante a noite. 7. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 30 minutos. 8. Lavou-se com 1 mL de etanol a 70 %. 45 9 .Stratagene) 2. Incubate at 72 ° C for 30 minutes. 3. Extract once in phenol / chloroform. 4. Extract once in chloroform. 5. 20 Âμl of 3 M NaOAc and 400 Âμl ice cold ethanol was added until precipitated. It was placed at -20 ° C overnight. 7. Micro-centrifugation was performed at high speed for 30 minutes. 8. Washed with 1 mL of 70% ethanol. 45 9.

Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 10 minutos e em atmosfera anidra. (NÃO se metilou o ADN dado que ele já estava metilado na primeira passagem do processo)Micro-centrifugation was performed at high speed for 10 minutes under anhydrous atmosphere. (DNA was not methylated since it was already methylated in the first pass of the process)

Ligação do Adaptador 1. Fez-se uma nova suspensão, cuidadosamente, de ADN em 8 pL de adaptadores de EcoRI (do kit de síntese de ADNc da Stratagene). 2. Adícionou-se: 1.0 pL 10X tampão de ligaçãoAdapter Binding 1. Carefully resuspend DNA in 8 μl of EcoRI adapters (from the Stratagene cDNA synthesis kit). 2. Added: 1.0 Âμl 10X binding buffer

1.0 pL rATP 10 mM 1.0 pL ligase de ADN de T4 (4 Wu/pL) 3. Incubou-se a 4 °C, durante 2 dias. (NÃO se fez o corte dado que desta vez se utilizaram adaptadores. Em vez disso é necessário fosforilar)1.0 æl 10 mM 1.0 μl TAT DNA ligase (4 æl / æl) 3 μM rATP. 3. Incubated at 4 ° C for 2 days. (The cut was NOT made since this time used adapters, instead it is necessary to phosphorylate)

Adaptadores fosforilados 1. Reacção de ligação para matar pelo calor a 7 0 °C, durante 30 minutos. 2. Adicionou-se: 46 1.0 pL 10Χ tampão de ligaçãoPhosphorylated Adapters 1. Binding reaction to heat kill at 70 ° C for 30 minutes. 2. Added: 1.0 Âμl 10 Âμl binding buffer

2.0 pL rATF 10 mM 6.0 yL H20 1.0 pL PNK (kit de síntese do ADNc da2.0 pL rATF 10 mM 6.0 yL H20 1.0 pL PNK (cDNA Synthesis Kit from

Stratagene) 3. Incubou-se a 37 °C, durante 30 minutos. 4. Adicionou-se 31 pL de H20 e 5 pL 10X STE. 5. Fraccionamento da dimensão numa coluna de rotação S-500 da Sephacryl (conjunto das fracções 1-3). 6. Extraiu-se uma vez no seio de fenol/clorofórmio. 7. Extraiu-se uma vez no seio de clorofórmio. 8. Adicionou-se etanol arrefecido com gelo para precipitar. 9. Colocou-se em gelo, durante 10 minutos. 10. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 30 minutos. 11. Lavou-se com 1 mL de etanol a 70 %. 12. Fez-se uma micro-centrifugação, a alta velocidade, durante 10 minutos e em atmosfera anidra. 13. Fez-se uma nova suspensão no seio de 10,5 pL em tampão de TE. 47 Não se coloca em placa os compostos do ensaio. Em vez disso, liga-se directamente aos ramos, tal como anteriormente, excepto na utilização de 2,5 pL de ADN e sem água.Stratagene) 3. Incubated at 37 ° C for 30 minutes. 4. 31æl of H2 0 and 5æl 10X STE were added. 5. Fractionation of the size on a Sephacryl S-500 spin column (set of fractions 1-3). 6. Extraction once in phenol / chloroform. 7. Extract once in chloroform. 8. Ice-cold ethanol was added to precipitate. 9. It was placed on ice for 10 minutes. 10. Micro-centrifugation was performed at high speed for 30 minutes. 11. Washed with 1 mL of 70% ethanol. 12. Micro-centrifugation was performed at high speed for 10 minutes under anhydrous atmosphere. 13. A further suspension was made in 10.5 μl in TE buffer. The test compounds are not put on a plate. Instead, it binds directly to the branches, as before, except using 2.5 æl of DNA and without water.

Embalagem e titulação tal como antes.Packing and titration as before.

Resultados da eficiência: gtll: 2,5 x 106 recombinantes com um background a 2,5 % ΖΑΡ II: 9,6 x 105 recombinantes com um background a 0 %Efficacy results: gtll: 2.5 x 106 recombinants with a background at 2.5% ΖΑΡ II: 9.6 x 105 recombinants with a background at 0%

Amplificação das Bibliotecas (5,0 x 105 recombinantes de cada biblioteca) 1. Adicionou-se 3,0 mL de células hospedeiras (OD6eo = 1,0) a dois tubos cónicos de 50 mL. 2. Inoculou-se com 2,5 x 105 pfu por cada tubo cónico. 3. Fez-se a incubação a 37 °C, durante 20 minutos. 4. Adicionou-se agar do topo a cada um dos tubos até a um volume final de 45 mL. 5. Colocou-se o tubo em placa em 5 placas de 150 mm. 6. Incubou-se a 37 °C, durante 6-8 horas ou até as placas terem uma dimensão semelhante a um gancho da cabeça. 48 7. Recobre-se com 8-10 mL de tampão SM e colocou-se a 4 °C, durante a noite (com um arrefecimento suave, se possível).Amplification of the Libraries (5.0 x 105 recombinants from each library) 1. 3.0 mL host cells (OD6eo = 1.0) were added to two 50 mL conical tubes. 2. Inoculated with 2.5 x 10 5 pfu per conical tube. 3. Incubation was performed at 37 ° C for 20 minutes. 4. Top agar was added to each of the tubes to a final volume of 45 mL. 5. The tube was plated on 5 150 mm plates. 6. Incubated at 37 ° C for 6-8 hours or until the plates are similar in size to a head hook. 7. Collect with 8-10 mL of SM buffer and place at 4 ° C overnight (with gentle cooling, if possible).

Fago da Colheita 1. Recuperou-se a suspensão de fagos vertendo o tampão SM de cada placa num tubo cónico de 50 mL. 2. Adicionou-se 3 mL de clorofórmio, agitou-se vigorosamente e incubou-se à temperatura ambiente, durante 15 minutos. 3. Centrifugou-se a 2 K rpm, durante 10 minutos e eliminou-se os fragmentos das células. 4. Verteu-se o sobrenadante num frasco esterilizado e adicionou-se 50 pL de clorofórmio. 5. Armazenou-se a 4 °C. Título da biblioteca Amplificada 1. Fizeram-se diluições em série:Harvest Phage 1. The phage suspension was recovered by pouring the SM buffer from each plate into a 50 mL conical tube. 2. 3 ml of chloroform was added, stirred vigorously and incubated at room temperature for 15 minutes. 3. Centrifuged at 2 K rpm for 10 minutes and the cell fragments were discarded. 4. The supernatant was poured into a sterilized flask and 50 æl of chloroform was added. 5. Stored at 4 ° C. Amplified library title 1. Serial dilutions were made:

10'5= 1 pL de fago amplificado em 1 mL de tampão SM 10~s= 1 pL da diluição 10~3 em 1 mL de tampão de SM 2. Adicionou-se 200 pL de hospedeiro (no seio de MgS04 10 mM) aos dois tubos. 49 3. Inoculou-se um com 10 pL de uma diluição 1CT6 (IO'5) . 4. Inoculou-se o outro com 1 pL de uma diluição ΙΟ'6 (IO"6). 5. Incubou-se a 37 °C, durante 15 minutos. 6. Adicionou-se cerca de 3 mL de agar do topo, a 48 °C.10 Âμl = 1 Âμl of amplified phage in 1 ml SM 10 Âμ s buffer = 1 Âμl of the 10 Âμl dilution in 1 ml SM 2 buffer. 200 Âμl host (in 10 mM MgSO4) to the two tubes. 3. One was inoculated with 10 æl of a 1CT 6 dilution (10 5). 4. The other was inoculated with 1 æl of a ΙΟ 6 dilution (10 6). 5. Incubate at 37 ° C for 15 minutes. 6. About 3 ml of top agar was added at 48 ° C.

[stock 50 mL contendo 150 pL de IPTG (0,5 M) e 375 pL de X-GAL (350 mg/mL)] 7. Colocou-se em placas de 100 mm e fez-se a incubação a 37 °C, durante a noite. 8. Resultados:50 mL stock containing 150 μl of IPTG (0.5 M) and 375 μl of X-GAL (350 mg / ml)] 7. Placed in 100 mm plates and incubated at 37 ° C, during the night. 8. Results:

gtll: 1,7 x lO^/mLgtll: 1.7 x 10 4 / mL

ΖΑΡ II: 2,0 X 1010/mLΖΑΡ II: 2.0 X 1010 / mL

Excizou-se a biblioteca de ΖΑΡ II para criar a biblioteca pBluescript.The ΖΑΡ II library was raised to create the pBluescript library.

Exemplo 3Example 3

Preparação de uma biblioteca de ADN Procariótico Não Posta emPreparation of a Prokaryotic DNA library

Cultura A figura 1 mostra uma visão geral dos processos utilizados para construir uma biblioteca ambiental a partir de uma amostra de uma mistura de picoplâncton. O objectivo foi construir uma biblioteca de ADN com inserções grandes e estáveis, representando o ADN genõmico do picoplâncton.Culture Figure 1 shows an overview of the processes used to construct an environmental library from a sample of a picoplankton blend. The aim was to construct a DNA library with large and stable inserts, representing the genomic DNA of picoplankton.

Recolha das células e preparação do ADN. Prepararam-se almofadas de agarose contendo células de picoplâncton 50 concentradas a partir de amostras recolhidas num cruzeiro oceanográfico de Newport, Oregon até Honolulu, Havai. Recolheu-se água do mar (30 litros) em garrafas de Niskin, rastreou-se através de Nitex 10 pm e concentrou-se por filtração em fibras ocas (Amicon DC10) através de filtros de poli-sulfona de corte com 30.000 PM. Recolheram-se as células de bacterioplâncton concentrado num filtro Durapore de 47 mm, 0,22 pm e fez-se uma nova suspensão em 1 mL de 2X tampão de STE (NaCl 1 M, EDTA 0,1 M, Tris 10 mM, a pH 8,0) até a uma densidade final de, aproximadamente, 1 X 1010 células por mL. Misturou-se a suspensão das células com um volume de agarose LMP da Seaplaque fundida a 1 % (FMC), arrefecida para 40 °C e depois fez-se deslizar imediatamente para uma seringa de 1 mL. Selou-se a seringa com um parafilme e colocou-se em gelo durante 10 minutos. A almofada de agarose contendo as células foi extrudida em 10 mL de tampão de lise (Tris 10 mM, a pH 8,0, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 M, sarcosil a 1 %, dexoxicolato de sódio a 0,2 %, 1 mg/mL de lisozima) e incubou-se a 37 °C, durante 1 hora. Transferiu-se então a almofada de agarose para 4 0 mis de tampão de ESP (Sarkosyl a 1 %, 1 mg/mL de proteinase-K, no seio de EDTA a 0,5 M) e incubou-se a 55 °C, durante 16 horas. Decantou-se a solução e substituiu-se com tampão de ESP fresco e incubou-se a 55 °C, durante mais 1 hora. Colocaram-se então as almofadas de agarose em EDTA 50 mM e armazenou-se a 4 °C, a bordo, durante a duração do cruzeiro oceanográfico.Collection of cells and preparation of DNA. Agarose pads containing concentrated picoplankton cells were prepared from samples collected on an oceanographic cruise from Newport, Oregon to Honolulu, Hawaii. Sea water (30 liters) was collected in Niskin bottles, screened through Nitex 10 μm and concentrated by hollow fiber filtration (Amicon DC10) through 30,000 μm cutoff polysulfone filters. The cells of concentrated bacterioplankton were collected on a 47 mm Durapore filter, 0.22 Âμm and resuspended in 1 ml of 2X STE buffer (1 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris, pH 8.0) to a final density of approximately 1 X 10 10 cells per ml. The cell suspension was mixed with a volume of 1% Seaplaque LMP agarose (FMC), cooled to 40øC and then slid immediately into a 1 ml syringe. The syringe was sealed with a parafilm and placed on ice for 10 minutes. The agarose pad containing the cells was extruded into 10 ml of lysis buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 M EDTA, 1% sarcosyl, 0.2% sodium deoxycholate, , 1 mg / ml lysozyme) and incubated at 37 ° C for 1 hour. The agarose pad was then transferred to 40 ml of ESP buffer (1% Sarkosyl, 1 mg / ml proteinase-K in 0.5 M EDTA) and incubated at 55 ° C, for 16 hours. The solution was decanted and replaced with fresh ESP buffer and incubated at 55 ° C for an additional 1 hour. The agarose pads were then placed in 50 mM EDTA and stored at 4øC on board for the duration of the oceanographic cruise.

Fez-se a diãlise durante a noite, a 4 °C, de uma fatia da almofada de agarose (72 pL) preparada a partir de uma amostra recolhida na costa do Oregon versus 1 mL de tampão A (NaCl 100 mM, Bis Tris propano-HCl 10 mM, 100 pg/mL de ASB acetilada; pH 7,0 @ 25 °C) num tubo de micro-centrifugação de 2 mL. Substituiu-se a solução com 250 pL de tampão A fresco contendo MgCl2 10 mM e DTT 1 mM e fez-se a incubação numa 51 durante 1 hora, plataforma arrefecida, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Mudou-se então a solução para 250 pL do mesmo tampão contendo 4 U de Sau3Al (NEB), equilibrou-se até 37 °C num banho de água e depois incubou-se numa plataforma de arrefecimento numa incubadora a 37 °C, durante 45 minutos. Transferiu-se a almofada para um tubo de micro-centrifugação de 1,5 mL e fez-se a incubação a 68 °C, durante 30 minutos, para inactivar a proteína, por exemplo, a enzima e para fundir a agarose. A agarose foi digerida e o ADN desfosforilado utilizando gelase e HK-fosfatase (Epicentre), respectivamente, de acordo com as recomendações do fabricante. Eliminou-se a proteína por meio de uma extracção cuidadosa no seio de fenol/clorofórmio e o ADN precipitou no seio de etanol, foi aglomerado e depois lavado com etanol a 70 %. Este ADN parcialmente digerido foi então novamente suspenso em H20 esterilizada até a uma concentração de 2,5 ng/pL, para a ligação ao vector de pFOSl. A amplificação por RCP resulta de várias das almofadas de agarose (dados não mostrados) , indicou a presença de quantidades significativas de ADN arquial. Experiências de hibridação quantitativas utilizando ARN extraído de uma amostra, recolhida a 200 metros de profundidade, na costa do Oregon, indicou que a arqueia plânctónica (compreendida neste conjunto era de, aproximadamente, 4,7 % do total da biomassa picoplanctónica (esta amostra corresponde a "PACI"-200 m no quadro 1 de DeLong et al., high abundance of Archaea in Antarctic marine picoplâncton, Nature, 371:695-698, 1994). Os resultados da amplificação por RCP do ADNr de arquial-biased realizados em lisados de almofadas de agarose, confirmaram a presença de quantidades relativamente grandes do ADN arquial nesta amostra. As almofadas de agarose preparadas desta amostra de picoplâncton foram escolhidas para a preparação subsequente de bibliotecas de fosmidos. 52A slice of the agarose pad (72 μL) prepared from a sample collected off the coast of Oregon was tested overnight at 4 ° C versus 1 mL of buffer A (100 mM NaCl, Bis Tris propane 10 mM HCl, 100 μg / mL acetylated ASB, pH 7.0 @ 25 ° C) in a 2 mL micro-centrifuge tube. The solution was replaced with 250æl of fresh buffer A containing 10mM MgCl 2 and 1mM DTT and incubated in a cooled platform for 1 hour for 1 hour at room temperature. The solution was then moved to 250 μl of the same buffer containing 4 U of Sau 3 Al (NEB), equilibrated to 37 ° C in a water bath and then incubated on a cooling platform in an incubator at 37 ° C for 45 h minutes. The pad was transferred to a 1.5 ml micro-centrifuge tube and incubated at 68øC for 30 minutes to inactivate the protein, for example the enzyme and to melt the agarose. The agarose was digested and the DNA dephosphorylated using gelase and HK-phosphatase (Epicenter), respectively, according to the manufacturer's recommendations. The protein was removed by careful extraction in phenol / chloroform and the DNA precipitated in ethanol, agglomerated and then washed with 70% ethanol. This partially digested DNA was then resuspended in sterile H20 to a concentration of 2.5 ng / well, for binding to the pFOS1 vector. PCR amplification results from several of the agarose pads (data not shown), indicating the presence of significant amounts of archial DNA. Quantitative hybridization experiments using RNA extracted from a sample, collected at 200 meters depth, off the coast of Oregon, indicated that the planktonic arcs (comprised in this set was approximately 4.7% of the total picoplankton biomass (this sample corresponds a " PACI " -200 m in table 1 of DeLong et al., high abundance of Archaea in Antarctic marine picoplankton, Nature, 371: 695-698, 1994). in agarose pad lysates confirmed the presence of relatively large amounts of the archial DNA in this sample. The prepared agarose pads from this picoplankton sample were chosen for the subsequent preparation of the facim libraries.

Cada almofada de 1 mL de agarose deste sítio continha, aproximadamente, 7,5 x 105 células, portanto estavam presentes, aproximadamente, 5,4 x 105 células na fatia de 72 pL utilizada na preparação do ADN parcialmente digerido.Each 1 ml agarose pad from this site contained approximately 7.5 x 105 cells, so approximately 5.4 x 10 5 cells were present in the 72 pL slice used in the preparation of the partially digested DNA.

Preparam-se ramos de vectores a partir de pFOSl tal como descrito (Kim et ai. , Stable propagation of casmid sized human DNA inserts in an F factor based vector, Nucl. Acids Res., 20:10832-10835, 1992). Em resumo, o plasmido foi completamente digerido com AstII, desfosforilado com fosfatase HK e depois digerido com BamHI, para gerar dois ramos, cada um deles contendo um sítio de COS na orientação apropriada para a clonagem e a embalagem do ADN ligado entre 35-45 kbp, Este ADN de picoplâncton parcialmente digerido, ligou-se durante a noite aos ramos de pFOSl numa mistura reaccional de ligação de 15 pL contendo 25 mg de cada um dos vectores e inserções e 1 U de ligase de ADN de T4 (Boehringer-Mannheim). O ADN ligado nos quatro microlitros desta mistura reaccional, foi embalado in vitro utilizando o sistema de embalagem Gigapack XL (Stratagene), as partículas do fõsmido foram transfectadas numa estirpe DH10B de E. coli (BRL) e as células foram dispersas em placas I>BCmi5. Recolheram-se os clones de fõsmido resultantes em pratos de microtubos de 96 microlitros contendo LBcmis complementado com glicerol a 7 %. Os fosmidos recombinantes, contendo cada um 4 0 kb de inserções de ADN do picoplâncton, originaram uma biblioteca de 3.552 clones de fõsmido, contendo, aproximadamente, 1,4 x lo8 pares de bases do ADN clonado. Todos os clones examinados continham inserções variando de 38 até 42 kbp. Esta biblioteca foi armazenada congelada a -80 °C, para análise posterior.Branches of vectors are prepared from pFOS1 as described (Kim et al., Stable propagation of casemid human DNA inserts in an F factor based vector, Nucl Acids Res., 20: 10832-10835, 1992). Briefly, the plasmid was completely digested with AstII, dephosphorylated with HK phosphatase and then digested with BamHI, to generate two arms, each containing a COS site in the appropriate orientation for cloning and packaging the bound DNA between 35-45 kbp This partially digested picoplankton DNA was ligated overnight to the pFOS1 branches in a 15 pL binding reaction mixture containing 25 mg of each of the vectors and inserts and 1 U of T4 DNA ligase (Boehringer-Mannheim ). The DNA attached in the four microliters of this reaction mixture was packed in vitro using the Gigapack XL packaging system (Stratagene), the particles of the fungus were transfected into a E. coli strain DH10B (BRL) and the cells were dispersed in I > BCmi5. The resulting fmmid clones were collected in 96 microliter microtubes plates containing LBcmis supplemented with 7% glycerol. Recombinant fosmoids, each containing 40 kb of picoplankton DNA insertions, yielded a library of 3,552 phosmid clones, containing approximately 1.4 x 8 base pairs of the cloned DNA. All clones examined contained inserts ranging from 38 to 42 kbp. This library was stored frozen at -80 ° C for further analysis.

Exemplo 4 53Example 4 53

Ensaio da Actividade Enzimática A seguir dá-se um exemplo representativo de um processo para o rastreio de uma biblioteca de expressão, preparada de acordo com o exemplo 2. Em seguida, dão-se as características químicas das fileiras:Enzyme Activity Assay The following is a representative example of a process for the screening of an expression library prepared according to example 2. The chemical characteristics of the rows are given below:

Fileira 1: hidrolaseRow 1: hydrolase

Fileira 2: amida, éster e acetalRow 2: amide, ester and acetal

Fileira 3: As divisões e subdivisões baseiam-se nas diferenças entre os substratos individuais, que estão ligados de forma covalente à funcionalidade da fileira 2, que sofre a reacção; assim como, a especificidade do substrato.Row 3: The divisions and subdivisions are based on the differences between the individual substrates, which are covalently linked to the functionality of row 2, which undergoes the reaction; as well as the specificity of the substrate.

Fileira 4: Os dois produtos enantioméricos possíveis que a enzima pode produzir a partir de um substrato.Row 4: The two possible enantiomeric products that the enzyme can produce from a substrate.

Embora o exemplo que se segue seja especificamente dirigido às fileiras mencionadas antes, os processos gerais para análise das várias características químicas são geralmente aplicáveis a substratos diferentes daqueles que foram especificamente referidos neste exemplo.Although the following example is specifically directed to the aforementioned rows, the general methods for analyzing the various chemical characteristics are generally applicable to substrates other than those specifically mentioned in this example.

Rastreio de hidrolase na fileira 1; amida na fileira 2Hydrolase screening in row 1; amide in row 2

Utilizaram-se as 11 placas da biblioteca fonte utilizada para inocular de uma forma múltipla uma única placa (a "placa condensada"), contendo em cada microtubo 200 pL de LB Amp./Met., glicerol. Realizou-se esta etapa utilizando a ferramenta de replicação de elevada densidade (FRED) da Beckman Biomek com uma lixívia a 1 %, água, isopropanol, ciclo de esterilização com ar seco entre cada inoculação. Cada microtubo da placa condensada continha assim 11 clones diferentes de pBluescript de cada uma das 11 placas da 54 biblioteca fonte. A placa condensada cresceu durante 2 horas, a 37 ° C e depois foi utilizada para inocular duas placas filhas de microtitulação da Dynatech com 96 microtubos brancos, contendo em cada microtubo 250 pL de LB Amp./Met., glicerol. As placas originais condensadas, foram incubadas a 37 ° C, durante 18 horas e depois armazenadas a -80 °C. As duas placas filhas condensadas, foram incubadas a 37 °c, também durante 18 horas. As placas filhas condensadas foram então aquecidas a 7 0 “C, durante 4 5 minutos para matar as células e inactivar as enzimas da E. coli hospedeira. Diluiu-se uma solução concentrada de 5 mg/mL de morfourea-fenilalanil-7-amino-4-trifluorometil-coumarina (MuPheAFC, o "substrato") no seio de DMSO, foi diluída para 600 μΜ com tampão de Hepes 50 mM, a pH 7,5, contendo 0,6 mg/mL do detergente maltósido de dodecilo.The 11 plates from the source library were used to multiple inoculate a single plate (the " condensed plate "), containing in each microtube 200 μL LB Amp./Met., Glycerol. This step was performed using the Beckman Biomek High Density Replication Tool (FRED) with a 1% bleach, water, isopropanol, dry air sterilization cycle between each inoculation. Each microtube of the condensed plate thus contained 11 different clones of pBluescript from each of the 11 plates of the source library. The condensed plate was grown for 2 hours at 37 ° C and then used to inoculate two Dynatech microtiter daughter plates with 96 white microtubes, each containing 250 μl of LB Amp./Met., Glycerol. The original condensed plates were incubated at 37øC for 18 hours and then stored at -80øC. The two condensed daughter plates were incubated at 37øC, also for 18 hours. The condensed daughter plates were then heated at 70 ° C for 45 minutes to kill the cells and inactivate the host E. coli enzymes. A 5 mg / mL concentrated solution of morphourea-phenylalanyl-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin (MuPheAFC, the " substrate ") in a DMSO was diluted to 600 μl with 50 mM Hepes buffer , at pH 7.5, containing 0.6 mg / mL of the dodecyl maltose detergent.

MuPheAFCMuPheAFC

Adicionou-se 50 pL da solução de MuPheAFC 600 pM a cada um dos microtubos das placas brancas condensadas com um ciclo mistura de 50 pL utilizando Biomek, para se obter uma concentração final do substrato de -100 pM. Os valores da fluorescência foram registados (excitação = 400 nm, emissão = 505 nm) no fluorómetro de leitura de placa, imediatamente após a adição do substrato (t = 0) . Incubou-se a placa a 7 0 °C, durante 100 minutos, depois deixou-se arrefecer para a temperatura ambiente durante mais 15 minutos. Os valores da fluorescência foram novamente registados (t = 100). Os 55 valores a t = 0, foram subtraídos dos valores a t = 100, para se determinar se estava presente um clone activo.50 μl of the 600 μM MuPheAFC solution was added to each of the microtubes of the white plates condensed with a 50 μl mixture cycle using Biomek to give a final substrate concentration of -100 μM. Fluorescence values were recorded (excitation = 400 nm, emission = 505 nm) in the plate reading fluorometer, immediately after addition of the substrate (t = 0). The plate was incubated at 70 ° C for 100 minutes, then allowed to cool to room temperature for an additional 15 minutes. Fluorescence values were again recorded (t = 100). The 55 values at t = 0 were subtracted from the values at t = 100, to determine whether an active clone was present.

Estes dados indicaram que 1 dos 11 clones no tubo G8 estava a hidrolisar o substrato. Para determinar o clone individual que comportava a actividade, descongelaram-se as 11 placas da biblioteca fonte e utilizaram-se clones individuais simplesmente para inocular uma nova placa contendo LB Amp./Met., glicerol. Tal como antes, a placa foi incubada a 37 °C, para se fazer crescer as células, aqueceu-se a 70 °C para inactivar as enzimas hospedeiras e adicionou-se 50 pL de MuPheAFC 600 μΜ utilizando a Biomek.These data indicated that 1 of the 11 clones in the G8 tube was hydrolyzing the substrate. To determine the individual clone carrying the activity, the 11 plates from the source library were thawed and individual clones were used simply to inoculate a new plate containing LB Amp./Met., Glycerol. As before, the plate was incubated at 37øC to grow cells, heated to 70øC to inactivate the host enzymes, and 50æl of 600μ MuPheAFC was added using Biomek.

Adicionalmente, ensaiaram-se mais três substratos. O heptanoato de metilo e umbeliferona, o derivado de CBZ-arginina e rodamina e a caseína conjugada com fluoresceína (~3,2 mole de fluoresceína por mole de caseína).In addition, three further substrates were tested. Methyl heptanoate and umbelliferone, the derivative of CBZ-arginine and rhodamine and casein conjugated to fluorescein (~ 3.2 mole of fluorescein per mole casein).

(CBZ-arginina)2, rodamina 110 heptanoato de metilo e umbeliferona(CBZ-arginine) 2, rhodamine 110 methyl heptanoate and umbelliferone

Adicionaram-se a umbeliferona e a rodamina como soluções concentradas 600 μΜ a 50 pL de tampão de Hepes. Também se adicionou a caseína conjugada com a fluoresceína a 50 pL de uma solução concentrada de 20 e 200 mg/mL. Depois da adição dos substratos os valores de fluorescência a t = 0 foram registados, a placa foi incubada a 70 °C e registaram-se os valores a t = 100 minutos, tal como anteriormente. 56Umbelliferone and rhodamine were added as concentrated solutions 600 μg to 50 μl Hepes buffer. Fluorescein-conjugated casein was also added to 50 μl of a concentrated solution of 20 and 200 mg / ml. After addition of the substrates the fluorescence values at t = 0 were recorded, the plate was incubated at 70 ° C and the values recorded at t = 100 minutes, as above. 56

Os dados indicaram que o clone activo estava na placa 2. O derivado de arginina e rodamina também estava alterado por esta actividade, mas o substrato de lípase, o heptanoato de metilo e umbeliferona e a proteína, a caseína conjugada com fluoresceína, não funcionaram como substratos.The data indicated that the active clone was on plate 2. The arginine and rhodamine derivative was also altered by this activity, but the lipase substrate, methyl heptanoate and umbelliferone and the protein, fluorescein-conjugated casein, did not function as substrates.

Com base nos dados anteriores, a classificação da fileira 1 é "hidrolase" e a classificação da fileira 2 é ligação de amina. Não há uma reactividade cruzada com a classificação do éster da fileira 2.Based on the above data, the rank of row 1 is " hydrolase " and the rank of row 2 is amine bonding. There is no cross-reactivity with the ester classification of row 2.

Tal como se mostrou na figura 2, um clone recombinante da biblioteca que tinha sido caracterizado na fileira 1 como hidrolase e na fileira 2 como amida, pode então ser ensaiado na fileira 3 para várias especificidades. Na figura 2, as várias classes da fileira 3 são seguidas de um código (que identifica os substratos do quadro 1) que são utilizados na identificação dessas especificidades da fileira 3.As shown in Figure 2, a recombinant clone from the library which had been characterized in row 1 as hydrolase and in row 2 as amide may then be assayed in row 3 for various specificities. In Figure 2, the various classes of row 3 are followed by a code (identifying the substrates of table 1) which are used in identifying those specificities of row 3.

Tal como se mostra nas figuras 3 e 4, um clone recombinante da biblioteca que tenha sido caracterizado na fileira 1 como hidrolase e na fileira 2 como éster, pode então ser ensaiado na fileira 3 para várias especificidades. Nas figuras 3 e 4, as várias classes da fileira 2 são seguidas de um código (que identifica os substratos dos quadros 2 e 2) , que são utilizados na identificação dessas especificidades da fileira 3. Nas figuras 3 e 4, o símbolo R2 representa a porção de álcool do éster e o símbolo Ri representa uma porção de ácido do éster.As shown in Figures 3 and 4, a recombinant clone of the library which has been characterized in row 1 as hydrolase and in row 2 as ester, can then be assayed in row 3 for various specificities. In Figures 3 and 4, the various classes of row 2 are followed by a code (identifying the substrates in Tables 2 and 2), which are used in identifying those specificities of row 3. In Figures 3 and 4, R2 represents the alcohol portion of the ester and R1 represents an acid portion of the ester.

Tal como se mostra na figura 5, um clone recombinante da biblioteca, que tinha sido caracterizado na fileira 1 como hidrolase e na fileira 2 como acetal, pode então ser ensaiado na fileira 3 para várias especificidades. Na figura 5, as 57 várias classes da fileira 3 são seguidas por um código (que identifica os substratos do quadro 4), que são utilizados na identificação dessas especificidades da fileira 3.As shown in Figure 5, a recombinant clone from the library, which had been characterized in row 1 as hydrolase and in row 2 as acetal, can then be assayed in row 3 for various specificities. In figure 5, the various classes of row 3 are followed by a code (which identifies the substrates of table 4), which are used in identifying those specificities of row 3.

As enzimas podem ser classificadas na fileira 4 quanto à quiralidade dos produtos produzidos pela enzima. Por exemplo, os amino-ésteres quirálicos podem ser determinados utilizando pelo menos os seguintes substratos:The enzymes can be classified in row 4 as to the chirality of the products produced by the enzyme. For example, chiral amino esters can be determined using at least the following substrates:

u r q NHa* HzCC' N-< Hl H NHj R «CHj CH2-OH CH 2-002'## STR3 ## CH 2 CH 2 -OH CH 2 002 '

Para cada substrato que é alterado em relação ao valor de enantio-selectividade, determina-se E de acordo com a equação seguinte:For each substrate that is altered relative to the enantioselectivity value, E is determined according to the following equation:

In [ (1-c (l+eep) ] E = ----------------In [(1-c (1 + eep)] E = ----------------

In [ (1-c (l-eep) ] na qual eep = ao excesso enantiomérico (ee) do produto hidrolisado e c = à percentagem de conversão da reacção. Ver Wong e Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, 1994, Elsevier, Tarrytown, NY, págs. 9-12.In [e-1] of the hydrolyzed product and the percent conversion of the reaction, see Wong and Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, 1994, Elsevier, Tarrytown , NY, pp. 9-12.

Determina-se o excesso enantiomérico quer por cromatografia líquida de alta resolução (CLER) quirálica ou por electroforese capilar (EC) quirálica. Os ensaios realizam-se como se segue: adiciona-se 200 yL do tampão apropriado a cada microtubo de uma placa microtituladora branca com 96 miorotubos. seguido de 50 yL de solução de 58 enzima parcialmente ou completamente purificada; 50 pL do substrato é adicionado e controla-se o aumento da fluorescência em função do tempo até que 50 % do substrato tenha sido consumido ou que a reacção pare, aquilo que acontecer primeiro.The enantiomeric excess is determined either by chiral high performance liquid chromatography (HPLC) or by chiral capillary electrophoresis (EC). The assays are performed as follows: 200 Âμl of the appropriate buffer is added to each microtube of a white microtiter plate with 96 micromotubes. followed by 50 ul of partially or fully purified enzyme solution; 50 μl of the substrate is added and the fluorescence enhancement is monitored over time until 50% of the substrate has been consumed or the reaction stops whichever occurs first.

Determinou-se a enantio-selectividade para uma das esterases identificadas como se segue. Para a reacção formar (trans-esterificação) ou quebra (hidrólise) de acetato a-metilo e benzilo, obteve-se a enantio-selectividade da enzima determinando: eec (o excesso enantiomérico (ee) do substrato que não reagiu) , eep (o ee do produto hidrolisado) e c (a percentagem de conversão da reacção). 0 excesso enantiomérico foi determinado por cromatografia gasosa de elevada resolução quirálica (CG). As condições da cromatografia foram as seguintes:The enantioselectivity was determined for one of the esterases identified as follows. For the reaction to form (trans-esterification) or cleavage (hydrolysis) of α-methyl acetate and benzyl, enantioselectivity of the enzyme was obtained by determining: eec (the enantiomeric excess (ee) of the unreacted substrate), eep the ee of the hydrolyzed product) and c (the conversion rate of the reaction). The enantiomeric excess was determined by chiral high chroma (CG) chromatography. The conditions of the chromatography were as follows:

Preparação da Amostra: Filtraram-se as amostras através de um filtro de PTFE com um diâmetro de 13 mm e poros de 0,2 pm.Sample preparation: Samples were filtered through a PTFE filter having a diameter of 13 mm and pores of 0.2 μm.

Coluna: Supelco β-DEX 120, 0,25 mm ID, 30 m, 0,25 pm df.Column: Supelco β-DEX 120, 0.25 mm ID, 30 m, 0.25 pm df.

Forno: 90 °C durante 1 minuto, depois 90 °C até 150 °C a 5 “C/minuto. Hélio: 1 mL/minuto durante 2 minutos, depois 1 mL/minuto até 3 mL/minuto a 0,2 mL/minuto.Oven: 90øC for 1 minute, then 90øC to 150øC at 5øC / min. Helium: 1 mL / minute for 2 minutes, then 1 mL / min to 3 mL / minute at 0.2 mL / minute.

Detector: FID, 300 °C.Detector: FID, 300 ° C.

Injecção: 1 pL (substrato 1 mM em dissolvente de reacção), separado (1:75), 200 °C. 59 A reacção de trans-esterificação foi realizada de acordo com um processo descrito em Organic solvent tolerance. Water immiscible solvents. Ver a seguir. A trans-esterificação com a enzima ESL-001-01 originou os seguintes resultados:Injection: 1 Âμl (1 mM substrate in reaction solvent), separated (1:75), 200Â ° C. The trans-esterification reaction was carried out according to a procedure described in Organic solvent tolerance. Water immiscible solvents. See below. Trans-esterification with the enzyme ESL-001-01 gave the following results:

Dissolvente % de ees % de eep % de c n-heptano 10,9 44,3 19,8 tolueno 3,2 100 3,1 A reacção de hidrólise realizou-se como se segue: adicionou-se 50 pL de uma solução 10 mM de acetato α-metilo e benzilo, no seio de DMSO aquoso a 10 % (v/v) , a 200 pL de tampão de fosfato 100 mM, a pH 6,9. A esta solução adicionou-se 250 pL da enzima ESL-001-01 (2 mg/mL em tampão de fosfato 100 mM, a pH 6,9) e aqueceu-se a mistura reaccional a 70 °C, durante 15 minutos. Tratou-se a mistura reaccional de acordo com o seguinte processo: eliminou-se 250 pL da mistura reaccional da hidrólise e adicionou-se a um tubo de Eppendorf de 1 mL. Adicionou-se 250 pL de acetato de etilo e agitou-se vigorosamente durante 30 segundos. Deixou-se as fases separarem-se durante 15 minutos. Retirou-se com uma pipeta 200 pL da fase orgânica de topo e filtrou-se através de um filtro de PTFE com um diâmetro de 4 mm e com poros de 0,2 pm. Analisou-se por CG quirálica tal como anteriormente. A hídrolase com enzima ESL-001-01 originou os seguintes resultados: % de ees % de eep % de c 100 0,7 99,7 60Solvent% ee% eep% cn-heptane 10.9 44.3 19.8 toluene 3.2 100 3.1 The hydrolysis reaction was carried out as follows: 50æl of a solution 10 mM α-methyl acetate and benzyl in 10% (v / v) aqueous DMSO were added to 200 μl of 100 mM phosphate buffer, pH 6.9. To this solution was added 250 μl of the enzyme ESL-001-01 (2 mg / ml in 100 mM phosphate buffer, pH 6.9) and the reaction mixture was heated at 70 ° C for 15 minutes. The reaction mixture was treated according to the following procedure: 250 μl of the hydrolysis reaction mixture was removed and added to a 1 ml Eppendorf tube. 250 μl of ethyl acetate was added and stirred vigorously for 30 seconds. The layers were allowed to separate for 15 minutes. 200 Âμl of the top organic phase was pipetted out and filtered through a PTFE filter with a diameter of 4 mm and with pores of 0.2 Âμm. Chiral GC was analyzed as above. Hydrolysis with ESL-001-01 enzyme gave the following results:% ee% eep% c 100 0.7 99.7 60

Exemplo 5Example 5

Ensaio das Características Físicas de -um Clone RecombinanteAssay of the Physical Characteristics of a Recombinant Clone

Este exemplo descreve processos para o ensaio de certas características físicas de um clone recombinante de uma biblioteca. pH ÓptimoThis example describes processes for assaying certain physical characteristics of a recombinant clone from a library. pH optimum

Adicionou-se a cada um dos microtubos de uma placa microtituladora de 96 microtubos, 200 pL de 4-meti1-umbeliferil-2,2-dimetil-4-pentenoato e diluiu-se em série desde 1 a 12. Adicionou-se a cada linha da placa 50 pL de 5X de tampão a pH apropriado, de modo a que se pudesse ensaiar a taxa de reacção com 8 pH's diferentes numa única placa. Adicionou-se a cada microtubo 20 pL da enzima ESL-001-01 (diluição de 1:3.000 em 1 mg/mL de uma solução concentrada), para iniciar a reacção. O aumento na absorvência a 37 0 nm a 70 °C foi controlado, de modo a determinar a taxa de reacção; a taxa versus a concentração de substrato adaptou-se à equação de Michaelis-Menten para determinar Vmax para cada pH. A enzima ESL-001-01 deu os resultados indicados na figura 6.To each of the microtubes of a microtiter plate of 96 microtubes was placed 200 Âμl of 4-methyl-umbelliferyl-2,2-dimethyl-4-pentenoate and serially diluted from 1 to 12. plate line 50æl of 5X buffer at the appropriate pH so that the reaction rate could be assayed with 8 different pH's on a single plate. 20 μl of the enzyme ESL-001-01 (1: 3000 dilution in 1 mg / ml of a concentrated solution) was added to each well to initiate the reaction. The increase in absorbance at 370 nm at 70 ° C was monitored in order to determine the reaction rate; the rate versus substrate concentration was adapted to the Michaelis-Menten equation to determine Vmax for each pH. The enzyme ESL-001-01 gave the results shown in figure 6.

Temperatura Óptima A um cuvete de 1 mL com um termostato, adicionou-se 930 pL de tampão de Hepes 50 mM, a pH 7,5. Depois do equilíbrio 61 da temperatura, adicionou-se 50 pL da enzima ESL-001-01 (diluição de 1:8.000 em 1 mg/mL de uma solução concentrada em tampão de Hepes) e 20 pL de 4-metil-umbeliferil-heptanoato 5 mM, contendo 30 mg/mL de maltósido de dodecilo. A taxa de aumento na absorvência de 370 nm foi medida a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, e 90 °C. A enzima ESL-001-01 deu os resultados indicados na figura 7.Optimal Temperature To a 1 mL cuvette with a thermostat was added 930 μl of 50 mM Hepes buffer, pH 7.5. After equilibration of the temperature, 50 μl of the enzyme ESL-001-01 (1: 8000 dilution in 1 mg / ml of a concentrated solution in Hepes buffer) and 20 μl of 4-methyl-umbelliferyl heptanoate 5 mM, containing 30 mg / mL dodecyl maltoside. The rate of increase in absorbance of 370 nm was measured at 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, and 90øC. The enzyme ESL-001-01 gave the results shown in figure 7.

Estabilidade da TemperaturaTemperature Stability

Fez-se a incubação a 70, 80 e 90 °C de amostras de 1 mL da enzima ESL-001-01 (diluição de 1:4.000 em 1 mg/mL de uma solução concentrada em tampão de Hepes). Em momentos seleccionados, retiraram-se aliquotas de 25 pL e fez-se a sua análise, tal como antes, numa placa microtituladora de 96 microtubos com 200 pL de palmitato de 4-metilumbeliferilo 100 pM e 0,6 mg/mL de maltósido de dodecilo. Estes dados foram utilizados para determinar o semi-período de vida para a inactivação da enzima. A enzima ESL-001-01 originou os seguintes resultados: Temperatura Semi-período de vida 90 23 minutos 80 32 minutos 70 110 horasThe enzyme ESL-001-01 (1: 4000 dilution in 1 mg / ml of a concentrated solution in Hepes buffer) was incubated at 70, 80 and 90øC. At selected times, 25 æl aliquots were removed and analyzed, as before, in a 96-well microtiter plate with 200 æl of 100 æM 4-methylumbelliferyl palmitate and 0.6 mg / mL of dodecyl. These data were used to determine the half-life for inactivation of the enzyme. The enzyme ESL-001-01 gave the following results: Temperature Half-life 90 23 minutes 80 32 minutes 70 110 hours

Tolerância do Dissolvente Orgânico 62Tolerance of Organic Solvent 62

Dissolventes miscíveis em água (dimetilssulfóxido (DMSO) e tetra-hidrofurano (THF))Water miscible solvents (dimethylsulfoxide (DMSO) and tetrahydrofuran (THF))

Adicionou-se 30 pL de 4-metil-umbeliferil-butirato 1 mM, no seio de dissolvente orgânico, aos microtubos de uma placa microtituladora de 96 microtubos. Adicionou-se 250 pL de tampão e mistura de dissolvente orgânico (ver quadro a seguir) aos microtubos da placa, seguida de 30 pL de uma enzima ESL-001-01 (diluição de 1:50.000 em 1 mg/mL de uma solução concentrada em tampão de MOPS 50 mM, a pH 6,9) e fez-se a incubação a 70 °C. Controlou-se o aumento da fluorescência (EX = 360 nm, EM = 440 nm) em função do tempo para determinar as actividades relativas. pL de Dissolvente % Final Orgânico pL de Tampão Dissolvente 240 0 90 195 45 75 150 90 60 120 120 50 90 150 40 60 180 30 30 210 20 0 240 10 de1 Âμl of 4-methyl-1Î²-umbelliferyl butyrate, in organic solvent, was added to the microtubes of a 96 microtube microtiter plate. 250 μl of buffer and organic solvent mixture (see table below) were added to the microtubes of the plate, followed by 30 μl of an enzyme ESL-001-01 (dilution 1: 50,000 in 1 mg / ml of a concentrated solution in 50 mM MOPS buffer, pH 6.9) and incubated at 70 ° C. The increase in fluorescence (EX = 360 nm, MS = 440 nm) was monitored as a function of time to determine the relative activities. pL of Solvent Final Final% pL of Solvent Buffer 240 0 90 195 45 75 150 90 60 120 120 50 90 150 40 60 180 30 30 210 20 0 240 10

Orgânico indicados na A enzima ESL-001-01 originou os resultados figura 8.The enzyme ESL-001-01 yielded the results figure 8.

Dissolventes imiscíveis em água (n-heptano, tolueno) 63Water immiscible solvents (n-heptane, toluene) 63

Adicionou-se 1 mL do dissolvente a um frasco contendo 1 mg de enzima ESL-001-01 liofilizada e uma barra de agitação. Adicionou-se ao frasco 10 pL de álcool de 1-fenetilo 100 mM e 10 pL de acetato de vinilo 100 mM e agitou-se com a vareta num bloco de aquecimento a 70 °C, durante 24 horas. Filtrou-se a amostra através de um filtro de PTFE com um diâmetro de 4 mm e poros de 0,2 pm e analisou-se por CG quirãlica, tal como anteriormente. Ver a secção anterior para os dados.1 ml of the solvent was added to a flask containing 1 mg of lyophilized enzyme ESL-001-01 and a stir bar. 10 Âμl of 100 mM 1-phenethyl alcohol and 10 Âμl of 100 mM vinyl acetate was added to the flask and stirred with the stick in a heating block at 70Â ° C for 24 hours. The sample was filtered through a PTFE filter having a diameter of 4 mm and pores of 0.2 μm and analyzed by chiral GC, as before. See previous section for data.

Actividade EspecíficaSpecific Activity

Determinou-se a actividade específica utilizando heptanoato de 4-metilo e umbeliferilo 100 pM, a 90 °C, em tampão de MOPS, a pH 6,9. A actividade específica obtida para a enzima ESL-001-01 foi de 1.662 pmole/minuto por mg.The specific activity was determined using 4-methyl heptanoate and 100 pM umbelliferil at 90 ° C in MOPS buffer at pH 6.9. The specific activity obtained for the enzyme ESL-001-01 was 1662 pmole / min per mg.

Exemplo 6Example 6

Ensaio para a Especificidade do Substrato de um CloneAssay for the Specificity of a Clone Substrate

RecombinanteRecombinant

Este exemplo descreve processos para o ensaio da especificidade do substrato de um clone recombinante de uma biblioteca.This example describes processes for assaying the substrate specificity of a recombinant clone from a library.

Características do SubstratoSubstrate Characteristics

Preparou-se soluções de 1 e 1/4 milimolares contendo 1 mg/ mL de maltósido de dodecilo, no seio de tampão de MOPS 50 mM, a pH 6,9, de cada um dos substratos que se seguem: acetato de 4-metilo e umbeliferilo (A) propanoato de 4-metilo e umbeliferilo (B) 64 butirato de 4-metilo e umbeliferilo (C) heptanoato de 4-metilo e umbeliferilo (D) butirato de α-metilo e de 4-metilo e umbeliferilo (E) β-metilcrotonoato de 4-metilo e umbeliferilo (F) 2,2-dimetil-4-pentenoato de 4-metilo e umbeliferilo (G) monoéster do ácido adípico e de 4-metilo e umbeliferilo (H) dicarboxilato de 1,4-ciclo-hexano e de 4-metilo e umbeliferilo (I) benzoato de 4-metilo e umbeliferilo (M) cinamato de p-trimetilo, amónio e de 4-metilo e umbeliferilo (N) 4-guanidinobenzoato de 4-metilo e umbeliferilo (O) acetato de α-metilo, fenilo e de 4-metilo e umbeliferilo (P) acetato de α-metoxi, fenilo e 4-metilo e umbeliferilo (Q) pamlitato de 4-metilo e umbeliferilo (S) estearato de 4-metilo e umbeliferilo (T) oleato de 4-metilo e umbeliferilo (U) elaidato de 4-metilo e umbeliferilo (W).1 and 1/4 millimolar solutions containing 1 mg / ml dodecyl maltoside were prepared in 50 mM MOPS buffer, pH 6.9, of each of the following substrates: 4-methyl acetate (A) 4-methyl propanoate and 4-methyl umbelliferyl (B) 64 butyrate and 4-methyl umbelliferyl (C) heptanoate and umbelliferyl (D) butyrate and E ) 4-methyl β-methylcrotonoate and 4-methyl umbelliferyl (F) 4-methyl 2,2-dimethyl-4-pentenoate and 4-methyl adipic acid (G) monoester and 1,4-umbelliferyl (H) dicarboxylate 4-methyl umbelliferyl (I) 4-methyl benzoate and 4-methyl umbelliferyl (M) cinnamate, and 4-methyl umbelliferyl (N) 4-guanidinobenzoate and umbelliferyl (O) α-methyl, phenyl and 4-methyl acetate and α-methoxy, phenyl and 4-methyl umbelliferyl acetate and 4-methyl umbelliferyl (Q) palladium and 4- methyl and umbelliferyl (T) oleate of 4-methyl and umbelliferyl (U) 4-methyl elaidate and umbelliferyl (W).

Adicionaram-se 200 pL de cada uma das soluções anteriores aos microtubos de uma placa microtituladora de 96 microtubos, seguidos de 50 pL de enzima ESL-001-01 (diluição de 1:2.000 em 1 mg/mL de uma solução concentrada em tampão de MOPS) e fez-se a incubação a 70 °C, durante 20 minutos.200æl of each of the above solutions were added to the microtubes of a 96-well microtiter plate, followed by 50æl of enzyme ESL-001-01 (dilution of 1: 2000 in 1 mg / ml of a concentrated solution in MOPS) and incubated at 70 ° C for 20 minutes.

Mediu-se a fluorescência (EX' = 360 nm, EM = 440 nm) e a fluorescência devida à hidrólise não enzimática foi subtraída. O quadro 5 mostra a fluorescência relativa de cada um dos substratos anteriores. São possíveis numerosas modificações e variações da presente invenção alguns dos ensinamentos anteriores; por isso, dentro do âmbito das reivindicações, a presente invenção pode ser praticada de forma diferente daquela que foi particularmente descrita. 65The fluorescence (EX '= 360 nm, MS = 440 nm) was measured and fluorescence due to non-enzymatic hydrolysis was subtracted. Table 5 shows the relative fluorescence of each of the above substrates. Numerous modifications and variations of the present invention are possible from some of the foregoing teachings; therefore, within the scope of the claims, the present invention may be practiced in a manner different from that which has been particularly described. 65

Quadro 1 A2Table 1 A2

Caseína conjugada com fluoresceína (32 mole de fluoresceína/mole de caseínaCasein conjugated with fluorescein (32 mole of fluorescein / soft casein

CBZ-Ala-AMCCBZ-Ala-AMC

t-BOC-Ala-Ala-Asp-AMCt-BOC-Ala-Ala-Asp-AMC

succinil-Ala-Gli-Leu-AMCsuccinyl-Ala-Gly-Leu-AMC

CBZ-Arg-AMCCBZ-Arg-AMC

CBZ-Met-AMCCBZ-Met-AMC

morfourea-Fen-AMC t-BOC = t-butoxi-carbonilo, CBZ = carbonil-benziloxi, AMC = 7-amino-4-metil-coumarina AA3 'γ' nh, NHj NH, AB3 AC3 th/ w Άmorphourea-Fen-AMC t-BOC = t-butoxycarbonyl, CBZ = carbonyl benzyloxy, AMC = 7-amino-4-methyl-coumarin AA3 'γ' nh, NH3 NH3, AB3 AC3 th / w Ά

HfyoHfyo

Vo AD3Vo AD3

Caseína conjugada com fluoresceínaCasein conjugated with fluorescein

t-BOC-Ala-Ala-Asp-AFCt-BOC-Ala-Ala-Asp-AFC

CBZ-Ala-Ala-Lis-AFCCBZ-Ala-Ala-Lys-AFC

succinil-Ala-Ala-Fen-AFCsuccinyl-Ala-Ala-Fen-AFC

succinil-Ala-Gli-Leu-AFC AFC = 7-amino-4-trifluorometil-coumarina AI3 AH3succinyl-Ala-Gly-Leu-AFC AFC = 7-amino-4-trifluoromethyl-coumarin AI3 AH3

Caseína conjugada com fluoresceína succinil-Ala-Ala-Fen-AFCCasein conjugated with fluorescein succinyl-Ala-Ala-Fen-AFC

CBZ-Fen-AFC CBZ-Trp-AFCCBZ-Fen-AFC CBZ-Trp-AFC

AF3 t-BOC-Ala-Ala-Asp-AFC CBZ-Asp-AFC AI 3AF3 t-BOC-Ala-Ala-Asp-AFC CBZ-Asp-AFC-AI 3

succinil-Ala-Gli-Leu-AFC CBZ-Ala-AFC CBZ-Ser-AFC AG 3succinyl-Ala-Gly-Leu-AFC CBZ-Ala-AFC CBZ-Ser-AFC AG 3

CBZ-Ala-Ala-Lis-AFCCBZ-Ala-Ala-Lys-AFC

CBZ-Arg-AFC 66CBZ-Arg-AFC 66

Quadro 2Table 2

6767

E LH3E LH3

todos de L2all of L2

Quadro 3 °XCXi 3jTable 3 XCXi 3j

LJ3LJ3

LK3LK3

LM3LM3

LL3LL3

LN3 LO 3 ΡΙνΗ,Ο-Ο^ r/ O-CHj-Ph JCCVCHjPh COrCH^LN 3 LO 3 ΡΙνΗ, Ο Ο / / / / / / / / / / / ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ ΡΙ

O 68O 68

Quadro 4Table 4

4-metil-umbeliferona4-methyl-umbelliferone

Em que o símbolo R = G2 β-D-galactose β-D-glicose β-D-glicurónido GB3 β-D-celotriósido β-Β-celobiopiranósido GC3 β-D-galactose a-D-galactose GD3 β-D-glicose a-D-glicose GE3 B-D-glicurónido GI3 B-D-N,N-diacetilquitobiose GJ3 β-D-fucose α-L-fucose B-L-fucose GK3 β-D-mannose c-D-mannoseIn that the symbol R = G2 β-D-galactose β-D-glucose β-D-glucuronide GB3 β-D-celotrioside β-β-cellobiopyranoside GC3 β-D-galactose aD-galactose GD3 β- glycogen GE3 BD-glucuronide GI3 BDN, N-diacetylchi- ciosis GJ3 β-D-fucose α-L-fucose BL-fucose GK3 β-D-mannose cD-mannose

Substratos não umbeliferílicos GA3 amilose [ligações al,4 de poliglicano], amilopectina [ligações al,6 de ramificações de poliglicano] GF3 xilano [poli-1,4-D-xilano] GG3 amilopectina, pululano GH3 sacarose, fructofuranósido 69Non-umbiliferous substrates GA3 amylose [polyglycan al, 4], amylopectin [6-link polyglycol branches] GF3 xylan [poly-1,4-D-xylan] GG3 amylopectin, pullulan GH3 sucrose, fructofuranoside 69

Quadro 5 COMPOSTO FLUORESCÊNCIA RELATIVA A 60,6 B 73,6 C 100,0 D 84,2 E 29,1 F 5,4 G 7,1 H 0,9 I 0,0 M 9,4 N 0,5 0 0,5 P 4,0 Q 11,3 S 0,6 T 0,1 U 0,3 W 0,2Table 5 FLUORESCENCE COMPOUND RELATIVE TO 60.6 B 73.6 C 100.0 D 84.2 E 29.1 F 5.4 G 7.1 H 0.9 I 0.0 M 9.4 N 0.5 0 0.5 P 4.0 Q 11.3 S 0.6 T 0.1 U 0.3 W 0.2

Lisboa, 20 de Dezembro de 2006 70Lisbon, 20 December 2006 70

Claims

A method for obtaining a library of recombinant enzymes derived from different microorganisms comprising: screening for recombinant proteins produced by a plurality of expression clones derived from different microorganisms, said screening being performed for determining which clones produce recombinant enzymes and to determining a plurality of different characteristics of the enzymes for the recombinant enzymes; and classification of the recombinant enzymes by means of said enzyme characteristics, thereby obtaining said recombinant enzyme library.

A process according to claim 1, wherein said screening includes screening of said recombinant enzymes for a chemical feature and screening for recombinant enzymes having said chemical characteristic, relative to a second characteristic chemistry.

A method according to claim 1, wherein said screening includes screening of said recombinant enzymes for one or more of the oxyruthases, transferases, hydrolases, lyases, isometases and ligases. 1

A method according to claim 2 or 3, wherein said screening further includes re-screening of said recombinant enzymes, in relation to one or more specified chemical functionalities.

A method according to claim 1 or 4, wherein said screening comprises screening said recombinant enzymes for one or more physical properties.

A process according to any one of claims 15, further comprising the step of identifying the clones producing the recombinant enzymes.

A method according to claim 6, further comprising the sequencing step of the identified clones, to identify the DNA sequence encoding the enzyme.

Process according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the micro-organisms are non-crop micro-organisms.

Process according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the micro-organisms are obtained from a sample of the environment.

A process according to claim 9, characterized in that the microorganisms are extremophilic. 2

A process according to claim 10, characterized in that the extremophiles are thermophilic, hyperthermophilic, psychophylic and psychrotrophic.

Process according to any one of Claims 9 to 11, characterized in that the environmental sample is obtained from Arctic and Antarctic ice, water, permanently frozen subsoil, volcanoes, soil or plants in tropical areas. Lisbon, December 20, 2006 3