PT773789E - Composições farmacêuticas contendo moléculas de mhc extraidas para estimular o sistema imunitário - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO MOLÉCULAS DE MHC EXTRAÍDAS PARA ESTIMULAR O SISTEMA IMUNITÁRIO" Área da invenção A presente invenção relaciona-se com a utilização de xenoantigénios, os quais são úteis para estimular o sistema imunitário, em particular para a terapia do cancro, isto é, no fabrico de um medicamento para tratamento do cancro no Homem e nos mamíferos em geral. Mais especificamente, a utilização de antigénios do complexo major de histocompatibilidade (MHC) extraídos de tecidos animais e com o mesmo peso molecular (entre 10.000 e 50.000 daltons).

Antecedentes da técnica

No tratamento do cancro cancro, tendo em consideração os resultados obtidos até à data com fármacos sintéticos e terapias químicas e físicas, os investigadores têm procurado vias para desenvolver sistemas para estimular a resposta imunitária do organismo contra a proliferação de células cancerosas. Um factor chamado AF2 (alfa- fetoproteína), obtido a partir de extractos de embriões de carneiros e ovelhas, tem sido utilizado em terapia de apoio antitumoral como um analgésico e antiemético biológico (Schweiz. Rundsch. Med. Prax. 1990, 79(16): 498-502).

Também é conhecido um polipéptido antitumoral obtido de células humanas de tipo macrófago e com um peso molecular de 47.010 daltons.

No pedido de patente Italiano n° ΜΙ 93A001369 apresentado no nome do actual requerente, é descrito como os antigénios 2 de histocompatibilidade e a ubiquitina ou moléculas associadas administradas a indivíduos portadores de tumor estimulam uma resposta imunológica mediada por células e/ou humoral que pode produzir inibição do crescimento das células tumorais e uma regressão da doença neoplásica. Sabe-se que os antigénios do MHC (os quais estão presentes de modo ubíquo nas células) desempenham uma função de importância vital para a regulação do sistema imunitário tomando parte no mecanismo que permite que as células imunológicas diferenciem antigénios estranhos (não próprios) de antigénios do indivíduo (próprios). Os antigénios e, de uma maneira mais geral, as moléculas de histocompatibilidade são codificadas por um grupo de genes localizado numa região extensa de um único cromossoma.

Reconhece-se três classes principais de genes: classe I, a qual inclui genes que codificam antigénios e moléculas responsáveis pela rejeição e transplantes e pela destruição de células autólogas alteradas; classe li, a qual inclui genes que codificam as estruturas superficiais que interferem na cooperação entre os linfócitos B e T e macrófagos; e classe III, a qual inclui genes que codificam algumas fracções do "sistema complemento" e a síntese de uma proteína sérica (proteína Ss) .

Os antigénios do MHC de classe I são constituídos por duas cadeias polipeptídicas que não estão covalentemente ligadas. A cadeia maior, responsável pela alogenicidade, tem um peso molecular de cerca de 43.000 daltons. A cadeia menor, identificada com a microglobulina β-2, tem um peso molecular de cerca de 13.000, não é codificada pelo sistema MHC, e é sempre a mesma para cada molécula de classe I. As 3 duas cadeias polipeptídicas estão covalentemente associadas a uma cadeia que não muda de cerca de 33.000 daltons.

Os antigénios do MHC de classe li são caracterizados por duas cadeias de glicoproteina - uma com um peso molecular de 34.000 daltons (chamada alfa) e a outra com um peso molecular de 29.000 daltons (chamada beta).

Os antigénios do MHC são geralmente isolados depois de as células terem sido destruídas por ultra-sons, tratamento com azoto liquido ou congelação/descongelação. Uma vez preparadas as membranas, as moléculas de histocompatibilidade são extraidas por meio de uma variedade de detergentes ou por proteólise. Também são utilizados sais de força iónica elevada para a extracção de antigénios do MHC a partir de células vitais, mas não de membranas celulares. A maior quantidade de antigénios de histocompatibilidade é persistentemente obtida com detergentes, tal como Nonidet P40 (ver para um exemplo, A. Dautigny et al, Biochimica et Blophysica Acta, 298:783-789, 1973). Neste caso pode separar-se as várias especificidades do MHC por electroforese com um gradiente de pH. A WO 9314126 descreve um antigénio da classe II do complexo major de histocompatibilidade para ser utilizado como uma vacina contra um vírus da imunodeficiência, em particular o HIV. A WO 9401130 descreve um antigénio da classe I do complexo major de histocompatibilidade para ser utilizado como uma vacina contra um vírus da imunodeficiência, em particular o HIV. 4 A EP 563 627 descreve um método para tratar cancro utilizando reacções imunológicas especificas para antigénios tumorais expressados na superfície das células tumorais. Em particular, administra-se um antigénio da classe 1 de histocompatibilidade não clássico como uma imunoterapia. A EP 569 678 descreve a utilização de células tumorais nas quais foram inseridos pelo menos dois genes que codificam proteínas MHC de haplotipos diferentes e em que pelo menos uma das referidas proteínas de MHC tem o mesmo haplotipo que um haplotipo do indivíduo a ser tratado. A EP 569 678 descreve a utilização de oligopéptidos provenientes da região hipervariável da cadeia beta de uma molécula da classe II do MHC para o tratamento de respostas imunológicas perniciosas, tais como autoimunidade e alergias.

Labeta et al., J. Immunol Methods. 1988; 112(1):133-8, descreve métodos de solubilização utilizando vários detergentes, em que a solubilização é seguida de imunoprecipitação e análise por SDS PAGE.

Dautigny et al.f Biochim Biophys Acta. 1973; 298(4):783-9, descreve um método de purificação de antigénios de hl-a a partir de plaquetas humanas. 0 método descrito consiste de um passo de solubilização utilizando NP-40 como detergente seguido de um passo de diálise.

Sumário da invenção 5

Determinou-se que a resposta imunológica de um organismo afectado por uma neoplasia melhora consideravelmente quando são administrados antigénios do MHC extraídos a partir de tecidos animais, soro ou células de várias espécies (xenoantigénios). Esse efeito é ainda mais pronunciado e duradouro se forem alternados xenoantigénios de várias origens.

Objectos da invenção 0 objecto da presente invenção é assim a utilização de xenoantigénios do MHC para estimular o sistema imunitário, em que as referidas moléculas de MHC são susceptíveis de serem extraídas de tecidos animais ou humanos, soro ou células.

Aqui, o termo moléculas de histocompatibilidade refere-se aos antigénios do MHC e a todas as moléculas que sejam codificadas de modo análogo aos antigénios de histocompatibilidade pelos correspondentes lócus genéticos do MHC, assim como às suas moléculas associadas obtidas por extracção, e refere-se também aos antigénios de glóbulos vermelhos.

Aqui, o termo moléculas de histocompatibilidade de origens diferentes refere-se a moléculas de MHC obtidas a partir de organismos ou espécies diferentes, ou provenientes de lotes distintos de tecidos, soros ou células.

Como indicado acima, as moléculas de histocompatibilidade úteis para a invenção são geralmente obteníveis por extracção a partir de tecidos animais, em conjunto com as suas moléculas associadas. Os antigénios e moléculas de 6 histocompatibilidade constituem a substância activa real, enquanto as suas moléculas associadas são extraídas conjuntamente com os antigénios e actuam provavelmente como veículos para as moléculas de histocompatibilidade.

Os antigénios e moléculas de histocompatibilidade utilizados na presente invenção foram preparados a partir de tecido hepático de mamífero, geralmente fígado de vitela ou cabra homogeneizado.

Descrição abreviada dos desenhos A invenção será agora adicionalmente descrita relativamente aos desenhos apensos, nos quais: - as figuras 1 até 7 são gráficos que mostram a diferente proliferação de células tumorais em ratazanas tratadas e não tratadas.

Descrição das formas de realização preferidas Exemplo I - Extracçao com ácidos (HCIO4 1 N)

Dispersa-se um homogenato de fígado de vitela (5 g) em 10 ml de água destilada, adiciona-se então gota a gota 10 ml de HC104 2 N ao longo de 20 min. sob agitação a 4°C. Prossegue-se a agitação durante 30 min. e centrifuga-se a mistura a 100.000 x g durante 20 min. a 4°C. Submete-se o sobrenadante a diálise contra água corrente e depois contra água destilada durante toda a noite. Concentra-se por um factor de 5 com Amicon PM 10, e adiciona-se um volume triplo de KC1 4 M em tampão de fosfato 0,05 M a pH 7,5. Agita-se a mistura a 4°C durante 24 h e centrifuga-se em seguida a 100.000 x g durante lha 4°C. Submete-se o sobrenadante a diálise contra soro fisiológico tamponado 7 com fosfato (PBS) e centrifuga-se de novo. Finalmente, concentra-se o extracto por ultrafiltração através de uma membrana com um limite de 10.000 daltons até uma concentração de proteína de 1 mg/ml.

Exemplo II - Extracção com detergentes (PBS + Nonidet P40)

Corta-se fígado de vitela (103 g obtido a partir de um animal recentemente abatido) em pedaços pequenos e homogeneíza-se numa misturadora Waring em 260 ml de PBS 0,14 M, pH 7,2, e 0,5% (v/v) de Nonidet P40. A homogeneização é realizada a 11.400 rpm durante 2 min. (alternando 30 s de tratamento com 30 s de descanso) . As determinações de proteína realizadas em várias fases do tratamento demonstraram que a lise celular estava concluída após 2 min. Agitou-se a amostra durante 45 min a 4°C e centrifugou-se em seguida durante 90 min. a 4°C num rotor Sorvall SS-34 a 20.500 rpm (50.000 x g) . Submeteu-se então o sobrenadante (cerca de 300 ml) a diálise a 4°C contra 4 L de PBS 0,14 M, pH 7,2, com três mudanças da fase de diálise (uma cada 8 h) . Na diálise utilizou-se membranas com um limite de 10 kDa. A amostra assim obtida, com um volume de 310 ml, foi submetida ao doseamento da proteína segundo o método de Lowry, utilizando albumina de soro bovino como a proteína de calibração. Obteve-se um título de 40,8 ± 2,2 mg de proteína/ml de solução. Diluiu-se uma alíquota (150 ml) da solução até 1200 ml através da adição de PBS 0,14 M a pH 7,2 e congelou-se em seguida. A parte restante da amostra foi congelada como tal. 8

Com os procedimentos dos exemplos I e II obteve-se antigénios do MHC e as suas moléculas associadas com um peso molecular elevado (desde 10.000 até 50.000). O extracto hepático assim obtido, designado por AIM-3, foi utilizado para testes in vitro e in vivo.

Para os testes in vivo utilizou-se duas vias de administração: subcutânea e local. A administração diária de 4 ml da preparação obtida de acordo com o exemplo II a indivíduos humanos deu geralmente resultados positivos em cerca de 4 semanas. A neutralização das proteínas do MHC por anticorpos contra as mesmas moléculas de MHC foi evitada mudando semanalmente a origem do extracto, isto é, utilizando extractos de lotes diferentes obtidos a partir de tecidos da mesma espécie ou de espécies diferentes.

Seja como for podem utilizar-se vias de administração diferentes, tais como a parentérica ou por aerossol. A composição farmacêutica conterá consequentemente veículos e substâncias inertes que são farmaceuticamente aceitáveis e escolhidos a partir dos conhecidos na técnica, em função da via e administração escolhida. A invenção é agora descrita em mais pormenor relativamente aos exemplos e Figuras 1-7 relevantes que se seguem.

Experiências in vitro

Exemplo A

Inoculou-se células Molt 4 com o extracto do exemplo I. As células inoculadas produziram factor de necrose tumoral 9 (TNF) no sobrenadante apenas 24 h após inoculação, com concentrações manifestamente superiores às encontradas em células não tratadas (1000 pg/ml por comparação com 300 pg/ml).

Experiência in vivo

Utilizou-se ratazanas Fischer consanguíneas com 150-175 g de peso. Induziu-se tumores por inoculação na cavidade pleural de cerca de 250.000 células Yoshida AH-130. Uma tal dose permitiu observar o crescimento do tumor durante cerca de 18 dias antes da morte do animal.

Efectuou-se então o tratamento com a composição da invenção, como obtida no exemplo I, em doses de 0,025 mg/kg/dia na pleura, peritoneu ou por via subcutânea de acordo com os exemplos seguintes.

Exemplo B

Algumas das ratazanas inoculadas foram tratadas com a dose supramencionada do extracto do exemplo I (mas obtida a partir do fígado de cabra) na pleura (Δ), peritoneu (O) ou por via subcutânea (Δ) desde o 4o até ao 8o dia e depois desde o 12° até ao 16° dia a partir da inoculação da célula (Fig. 1). Os dados (média ± EPM de 7 experiências) mostraram que a partir do 8 o dia o número de células tumorais intrapleurais era significativamente inferior nas ratazanas tratadas do que nos controlos (·) tratados com uma solução fisiológica.

Exemplo C

Neste caso, o extracto do exemplo I foi administrado com tratamento diário do 4° até ao 15° dia. A Fig. 2 mostra a 10 redução no crescimento de células tumorais em ratazanas tratadas (O) relativamente aos controlos (·) .

Exemplo D

Preparou-se dois extractos segundo o exemplo I a partir de dois lotes diferentes de homogenato de figado de vitela. O primeiro lote foi administrado a ratazanas inoculadas a partir do 6o até ao 14° dia e o segundo lote foi administrado desde o dia 15 até ao dia 21. Os resultados mostraram que a tendência das células tumorais para proliferar diminuiu quando o extracto foi alterado (Fig. 3). Os controlos (curva superior) foram tratados com uma solução fisiológica como nos exemplos anteriores.

Exemplo E

Nesta experiência administrou-se um extracto obtido como no exemplo I a partir de figado de cabra desde o dia 5 até ao dia 10, e administrou-se o mesmo tipo de extracto mas obtido a partir de figado de vitela desde o dia 11 até ao dia 16. Os resultados mostraram uma redução acentuada no crescimento celular a partir do dia 8 em ratazanas tratadas (O) em relação aos controlos (·) e também em relação ao crescimento observado nas ratazanas tratadas dos exemplos anteriores (Fig. 4).

Exemplo F

Neste caso utilizou-se ratazanas NIH-RNU+ (Fig. 5) e ratazanas NIH-RNtr (isto é, sem o timo) (Fig. 6), e administrou-se o extracto do exemplo II. A Fig. 5 mostra o comportamento de ratazanas inteiras tratadas (curva A) e correspondentes aos controlos (curva B) . A Fig. 6 mostra que o tratamento com as moléculas MHC do extracto obtido de 11 acordo com a invenção não determinaram uma redução na proliferação de células tumorais até ao dia 8, uma vez que as ratazanas glabras não têm linfócitos T. A partir do dia 9 observou-se uma redução no crescimento de células neoplásicas nas ratazanas tratadas (curva C) provocada pela activação de linfócitos B específicos para o tumor e pela estimulação de outras células efectoras.

Apesar de não ser aqui dada uma explicação completa do mecanismo de acção da substância activa da presente invenção, julga-se que se baseie na presença de antigénios e moléculas do MHC, as quais são extremamente imunogénicas. A eficácia de tais moléculas é o resultado da activação, por proteínas do MHC, de linfócitos anérgicos do indivíduo portador do tumor. As células tumorais fogem normalmente ao ataque dos linfócitos T uma vez que os últimos, apesar de terem reconhecido os antigénios tumorais, não recebem um segundo sinal porque as células tumorais são desprovidas de moléculas adequadas para co-estimulação. As moléculas codificadas por um MHC estranho ligam-se aos receptores do linfócito T por um mecanismo análogo ao que ocorre na rejeição de transplantes e põem em movimento uma série de acontecimentos bioquímicos que levam à destruição das células tumorais. Nas ratazanas desprovidas de linfócitos T, nas quais são inoculadas células tumorais, as proteínas do MHC completam a estimulação dos linfócitos B, os quais -apesar de terem reconhecido o antigénio tumoral permaneceriam inactivos na ausência dos linfócitos T auxiliares. Os resultados das experiências seguintes confirmam esta hipótese.

Exemplo G 12

Tratou-se algumas das ratazanas inoculadas com a dose supramencionada do extracto do exemplo II. Uma vez que não se observou qualquer crescimento apreciável de células tumorais, o teste foi repetido de acordo com o exemplo seguinte.

Exemplo H

Tratou-se algumas das ratazanas inoculadas com a dose anteriormente mencionada a partir do 5 o em vez do 4o dia, administrando apenas um tipo de extracto. Os controlos foram tratados com soro fisiológico. Os resultados são mostrados na Fig. 7.

Também foi investigada a possível acção do extracto do exemplo II contra agentes virais, em particular o HIV. Realizou-se a experiência in vitro seguinte.

Exemplo III

Avaliou-se o efeito da substância, adicionada contemporaneamente a culturas de células T linfoblásticas ou 4, 8 e 24 h antes da infecção com HIV, na replicação virai. Adicionou-se uma alíquota (100 ng) da substância às suspensões celulares (cerca de 800.000 células/ml de suspensão virai) de células MOLT 4 e CEM. Infectou-se as suspensões celulares simultaneamente e após 4, 8 e 24 h de pré-incubação a 37°C em 5% de C02 da substância sob avaliação com 100 μΐ de suspensão virai contendo 1 x 104 TICD5o/ml de HIV. A avaliação do efeito inibidor foi efectuada comparando os níveis de replicação do HIV, medidos por determinação do antigénio virai P24 ou da actividade da transcriptase 13 inversa no sobrenadante de células pré-tratadas relativamente a células de controlo infectadas ao mesmo tempo apenas com a suspensão virai. Efectuou-se a determinação da replicação virai aos 3, 6, 9, 12 e 15 dias a partir da infecção virai. Os nossos resultados mostraram que a adição contemporânea de 100 ng da substância e das partículas virais às suspensões celulares não determinaram qualquer inibição da replicação virai. Observou-se uma redução na replicação virai apenas após pré-tratamento das células com a substância AIM durante 4 e 8 h antes da infecção com HIV. Este efeito inibidor foi mais evidente nas primeiras fases de replicação do HIV, aos 3 e 6 dias a partir da infecção, com valores de inibição de 60-70%. O efeito inibidor diminuiu quando a replicação virai foi avaliada aos 9 dias a partir da infecção e atingiu valores de 30-20% aos 12-15 dias a partir da infecção. Contrariamente, não se observou qualquer efeito inibidor quando as culturas celulares foram pré-tratadas 24 h antes da adição do vírus.

Lisboa, 12 de Abril de 2007

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de xenoantigénios do Complexo Major de Histocompatibilidade (MHC) no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que os referidos xenoantigénios de MHC são extraídos a partir de tecidos animais, soro ou células.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que os referidos xenoantigénios de MHC têm um peso molecular entre 10.000 e 50.000 daltons.

4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3 em que são alternadamente administrados xenoantigénios de MHC de espécies diferentes.

5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4 em que os referidos xenoantigénios de MHC podem ser obtidos como um extracto de tecidos animais, células ou soros através da utilização de detergentes e têm um peso molecular superior a 10.000 daltons.

6. Utilização de acordo com a reivindicação 5 em que os xenoantigénios de MHC são susceptíveis de serem extraídos a partir de fígado de cabra, vitela ou porco, ou de glóbulos vermelhos de bovino. Lisboa,12 de Abril de 2007