PT711148E

PT711148E - BIPHASIC MULTILAMELAR LIPIDIC VESICLE

Info

Publication number: PT711148E
Application number: PT94922214T
Authority: PT
Inventors: Marianna Foldvari
Original assignee: Pharmaderm Lab Ltd
Priority date: 1993-07-28
Filing date: 1994-07-28
Publication date: 2001-02-28
Also published as: EP0711148B1; ES2152324T3; GR3034777T3; DK0711148T3; DE69425750D1; CA2168260C; CA2168260A1; ATE195866T1; DE69425750T2; EP0711148A1; WO1995003787A1; AU7343894A

Abstract

A biphasic multilamellar lipid vesicle comprising a plurality of spaced apart lipid bilayers that include a liposome-forming component and optionally a biologically active agent entrapped within the lipid bilayers. The lipid vesicle also comprises peripheral aqueous solution compartments formed between the lipid bilayers and a central lipophilic core compartment substantially at the center of the multilamellar lipid vesicle.

Description

Descrição “Vesícula lipídica multilamelar bifásica”Description "Biphasic multilamellar lipid vesicle"

Os lipossomas são vesículas microscópicas constituídas por bicamadas fosfolipídicas simples ou concêntricas que encerram fases aquosas. Estas vesículas podem funcionar como veículos farmacêuticos, tanto para substâncias hidrofóbicas como hidrofílicas, incluindo diversas moléculas e péptidos de aplicação farmacêutica. Os lipossomas são preparados fundamentalmente a partir de fosfolípidos de diferentes grupos terminais e de diferentes comprimentos das cadeias e a partir de colesterol. Devido às semelhanças físico-químicas com as membranas celulares, os lipossomas constituem veículos biocompatíveis, biodegradáveis e não tóxicos para as moléculas de aplicação farmacêutica. Os lipossomas são substâncias excelentes para a administração sistémica e também para a administração tópica de fármacos. Há vários estudos em que foi comprovado que a encapsulação de lipossomas modifica vantajosamente a forma de degradação farmacocinética do fármaco após a aplicação tópica. A primeira prova experimental de que os lipossomas podem penetrar na pele e depositar-se dentro da derme foi conseguida recentemente, utilizando um novo marcador denso em electrões e constituído por partículas de pequenas dimensões (ferro coloidal) que pode ser encapsulado eficientemente em lipossomas de diversos tamanhos e composições e que pode ser facilmente identificado em células e tecidos por microscopia electrónica.Liposomes are microscopic vesicles consisting of simple or concentric phospholipid bilayers enclosing aqueous phases. These vesicles can function as pharmaceutical carriers for both hydrophobic and hydrophilic substances, including various molecules and peptides for pharmaceutical application. Liposomes are prepared fundamentally from phospholipids of different terminal groups and of different lengths of the chains and from cholesterol. Because of the physico-chemical similarities with cell membranes, liposomes constitute biocompatible, biodegradable and non-toxic vehicles for the pharmaceutical application molecules. Liposomes are excellent substances for systemic administration and also for topical administration of drugs. There have been several studies in which it has been proven that liposome encapsulation advantageously modifies the pharmacokinetic degradation form of the drug after topical application. The first experimental evidence that liposomes can penetrate the skin and deposit within the dermis has recently been achieved using a novel dense electron-labeled marker consisting of small particles (colloidal iron) that can be efficiently encapsulated in liposomes of various sizes and compositions and which can be easily identified in cells and tissues by electron microscopy.

No entanto, a tecnologia actual dos lipossomas tem diversos inconvenientes importantes que impediram até agora a sua utilização vulgarizada em aplicações déimicas e na administração sistémica. Por exemplo, as formulações lipossómicas apresentam problemas de consistência para as aplicações dérmicas que têm vindo a ser resolvidas quer por adição de agentes que fazem aumentar a viscosidade, tais como os derivados de celulose, à preparação final lipossómica, quer utilizando concentrações mais elevadas de fosfolípidos na preparação dos lipossomas.However, the current technology of liposomes has several important drawbacks which have hitherto prevented their widespread use in demineral applications and in systemic administration. For example, liposomal formulations present consistency problems for dermal applications which have been resolved either by the addition of viscosity enhancing agents, such as cellulose derivatives, to the final liposomal preparation, or by using higher concentrations of phospholipids in the preparation of the liposomes.

Ao adicionar à preparação lipossómica final agentes que fazem aumentar a viscosidade, dilui-se o produto, mas o que é mais importante, verificou-se que tais agentes fazem diminuir a libertação do fármaco encapsulado para fora dos lipossomas. Além do mais, os agentes que fazem aumentar a viscosidade têm um efeito nocivo sobre a integridade dos lipossomas. No que diz respeito aos fosfolípidos, estes são o ingrediente principal e também o mais dispendioso que entra na formação dos lipossomas. Posto isto, a sua utilização como agentes para aumentar a viscosidade não é prática sob o ponto de vista económico.By adding agents to the liposomal preparation which increase the viscosity, the product is diluted, but more important, it has been found that such agents decrease the release of the encapsulated drug out of the liposomes. Furthermore, viscosity-increasing agents have a deleterious effect on the integrity of the liposomes. As far as phospholipids are concerned, these are the main and also the most expensive ingredient that goes into liposome formation. Therefore, their use as agents for increasing viscosity is not practical from the economic point of view.

Outro problema associado à tecnologia actual dos lipossomas é o dos métodos conhecidos para os produzir. A utilização de métodos tais como o método da evaporação do solvente é muito difícil à escala industrial. Além do mais, o método da evaporação do solvente exige a utilização de solventes orgânicos tóxicos, tais como o clorofórmio, para a dissolução dos componentes que entram na formação dos lipossomas. Por último, ficam no produto final alguns resíduos desses solventes tóxicos. Além disso, nem todas as substâncias biologicamente activas são solúveis em tais solventes orgânicos. A impotência, ou a incapacidade parcial ou total do macho desempenhar o acto sexual ou de atingir o orgasmo, pode ser de natureza psicogénica e/ou orgânica. Inicialmente considerava-se que a etiologia psicogénica era responsável por 95% dos casos de impotência, mas é agora evidente que há factores orgânicos que estão quase sempre invariavelmente associados aos casos de impotência. Assim sendo, caracteriza-se melhor a impotência classifícando-a quer como de etiologia predominantemente orgânica quer como de etiologia predominantemente psicogénica. A impotência é uma doença socialmente inibitória. Compromete a autoestima do paciente e em alguns casos a sua aptidão para interactuar com outros. Os processos terapêuticos vulgares compreendem a psicoterapia, a microcirurgia (para restabelecer os circuitos vasculares comprometidos), a implantação de próteses de pénis e a farmacoterapia. Há inúmeros agentes que foram já utilizados na terapia da impotência. Foi já utilizada a manipulação hormonal, por exemplo, a terapia androgénica de substituição. No entanto, os pacientes com impotência de etiologia orgânica raramente são elegíveis para a manipulação hormonal. Assim, este modo de terapia deve ficar estritamente limitado aos casos em que estejam definidas deficiências endócrinas. Por outro lado, em cerca de 50% dos pacientes que padecem de uma endocrinopatia é possível verificar que é a impotência de etiologia psicogénica o factor predominante nas dificuldades erécteis. Assim sendo, na grande maioria dos homens impotentes, os factores vasculares e neurológicos são causas subjacentes. O tratamento mais vulgarmente utilizado para esses pacientes é a implantação de próteses do pénis. A natureza invasiva desta técnica, associada a provas cada vez maiores de insuficiências mecânicas, complicações cirúrgicas ou infecções, veio chamar mais uma vez a atenção para o desenvolvimento de agentes farmacológicos que tenham potencial para melhorar a libido e a qualidade das erecções. Foram já testados vários agentes, v.g. bromocriptina, trinitrato de glicerilo, zinco, oxitocina, ioimbina e nitroglicerina. Considera-se agora que a injecção intra-corpórea de agentes vasoactivos é o melhor tratamento para muitos pacientes com impotência de etiologia orgânica (Kattan et ai, 1991). A injecção de papaverina, que é um relaxante dos músculos lisos, ou a injecção de uma combinação de papaverina e de fentolamina (que é um bloqueador α-adrenérgico) directamente dentro do corpo cavernoso (qualquer das duas colunas erécteis do dorso do pénis) revelou ser uma terapia eficaz em casos de impotência. Recentemente descobriu-se que as injecções intracavemosas de prostaglandina Ei (alprostadil), que é uma substância química, que ocorre naturalmente, derivada do ácido di-homo-y-linolénico (20:3«6) também induzem a erecção. A injecção da prostaglandina Ei dá origem a uma vasodilatação que permite um aumento do influxo arterial e uma diminuição do efluxo venoso por oclusão das vénulas de drenagem, provavelmente através do relaxamento do músculo liso corporal. Devido ao seu poderoso efeito relaxante sobre o músculo liso vascular, utiliza-se a prostaglandina Ei para manter a desobstrução do canal arterial no recém-nascido. É esta a única situação presentemente aprovada pela instituição ‘FDA’ para a utilização da prostaglandina Ej. Sabe-se que o efeito da prostaglandina Ei sobre a disfunção eréctil depende da dose.Another problem associated with the current technology of liposomes is that of known methods for producing them. The use of methods such as the solvent evaporation method is very difficult on an industrial scale. Moreover, the solvent evaporation method requires the use of toxic organic solvents, such as chloroform, for the dissolution of the components that enter into the formation of the liposomes. Finally, some of these toxic solvents remain in the final product. In addition, not all biologically active substances are soluble in such organic solvents. Impotence, or partial or total inability of the male to perform the sexual act or to achieve orgasm, may be psychogenic and / or organic in nature. Psychogenic etiology was initially thought to be responsible for 95% of cases of impotence, but it is now clear that there are organic factors that are almost invariably associated with cases of impotence. Thus, impotence is better characterized by classifying it either as predominantly organic etiology or as a predominantly psychogenic etiology. Impotence is a socially inhibitory disease. It compromises the patient's self-esteem and in some cases his or her ability to interact with others. Common therapeutic processes include psychotherapy, microsurgery (to restore compromised vascular circuits), implantation of penile prostheses and pharmacotherapy. There are numerous agents that have already been used in impotence therapy. Hormone manipulation has already been used, for example, androgen replacement therapy. However, patients with impotence of organic etiology are rarely eligible for hormonal manipulation. Thus, this mode of therapy should be strictly limited to cases in which endocrine deficiencies are defined. On the other hand, in about 50% of patients suffering from endocrinopathy, it is possible to verify that impotence of psychogenic etiology is the predominant factor in erectile difficulties. Thus, in the vast majority of impotent men, vascular and neurological factors are underlying causes. The most commonly used treatment for these patients is the implantation of penile prostheses. The invasive nature of this technique, coupled with increasing evidence of mechanical failures, surgical complications or infections, has once again drawn attention to the development of pharmacological agents that have the potential to improve libido and the quality of erections. Various agents have already been tested, e.g. bromocriptine, glyceryl trinitrate, zinc, oxytocin, yohimbine and nitroglycerin. It is now considered that intra-corporeal injection of vasoactive agents is the best treatment for many patients with impotence of organic etiology (Kattan et al., 1991). Injection of papaverine, which is a smooth muscle relaxant, or the injection of a combination of papaverine and phentolamine (which is an α-adrenergic blocker) directly into the corpus cavernosum (either erectile columns of the dorsum of the penis) be an effective therapy in cases of impotence. Intracavemosal injections of prostaglandin E1 (alprostadil), which is a naturally occurring chemical derived from dihomo-y-linolenic acid (20: 3 '6) have also recently been found to also induce erection. Injection of prostaglandin E1 leads to vasodilation that allows an increase in arterial influx and a decrease in venous efflux by occlusion of drainage venules, probably through relaxation of body smooth muscle. Due to its powerful relaxing effect on vascular smooth muscle, prostaglandin E1 is used to maintain the unblocking of the ductus arteriosus in the newborn. This is the only situation currently approved by the FDA for the use of prostaglandin Ex. It is known that the effect of prostaglandin E1 on erectile dysfunction depends on the dose.

Demonstrou-se já que a prostaglandina Ei (PGEi), que é um poderoso relaxante da musculatura lisa vascular, é eficaz e segura no tratamento de impotência, devido ao facto de aumentar o influxo arterial através da vasodilatação e devido ao facto de diminuir o efluxo venoso por oclusão das vénulas de drenagem por relaxamento da musculatura lisa corporal. Contrariamente a outros fármacos anteriormente utilizados, tais como a papaverina ou a fentolamina, a PGEt não aparece tão frequentemente associada a efeitos secundários vulgares, v.g. priapismo, formação de placas no local de injecção e anomalias da função hepática, e por isso é clinicamente mais aceitável. A PGEi é normalmente autoinjectada no corpo cavernoso através da face lateral do tronco do pénis. Este tipo de administração está no entanto associado a um desconforto para o pénis, dores no local de injecção e à inconveniência da sua aplicação antes do acto sexual. A aplicação tópica da PGE| seria uma via ideal de administração, mas o fármaco (sem um sistema de aplicação) não consegue por si só atravessar a pele com uma 5 concentração adequada e de qualquer forma seria metabolizado dentro da pele muito rapidamente, antes de alcançar os tecidos subjacentes.It has been shown that prostaglandin E1 (PGE1), which is a powerful vascular smooth muscle relaxant, is effective and safe in the treatment of impotence, due to the increase of arterial influx through vasodilation and due to the decrease of efflux venous by occlusion of the drainage venules by relaxation of the body smooth muscle. Unlike other previously used drugs, such as papaverine or phentolamine, PGE1 does not appear as frequently associated with common side effects, e.g. priapism, plaque formation at the injection site, and liver function abnormalities, and is therefore clinically more acceptable. PGE 1 is normally self-injected into the corpus cavernosum through the lateral face of the trunk of the penis. This type of administration is however associated with discomfort to the penis, pain at the injection site and the inconvenience of its application before intercourse. Topical application of PGE | would be an ideal route of administration, but the drug (without an application system) can not by itself cross the skin at an appropriate concentration and would otherwise be metabolized within the skin very rapidly, before reaching the underlying tissues.

Presentemente estima-se que a condylomata acuminata seja responsável por 1,3 a 1,4 milhões de consultas médicas por ano só nos Estados Unidos da América do Norte, representando um aumento de 580% entre os anos de 1966 e 1983 (‘Center for Disease Control’, 1983). A ‘‘condylomata acuminata’ é provocada pelos vírus do papiloma humano (VPH) e é uma das doenças virais mais frequentemente diagnosticadas e que são transmitidas por via sexual. Foram já classificados mais de 50 tipos de VPH e estão permanentemente a ser identificados novos tipos. Comprovou-se que determinados subconjuntos de VPH (principalmente os tipos 16 e 18) estão associados a tumores malignos do tracto anogenital, do tracto respiratório e da pele. A terapia convencional para as verrugas genitais tem consistido na utilização de podofilina, crioterapia, ácido tricloroacético, cauterização eléctrica, ablação por laser e cirurgia convencional e tem incidido fundamentalmente sobre lesões visíveis. A existência de fenómenos de recorrência após a terapia, nos casos de infecções de VPH, é muito frequente, o que presumivelmente se fica a dever à erradicação incompleta do vírus uma vez que foi já demonstrada a presença de vírus residuais em tecidos com um aspecto normal.It is now estimated that condylomata acuminata accounts for 1.3 to 1.4 million medical consultations per year in the United States alone, representing an increase of 580 per cent between 1966 and 1983 ('Center for Disease Control, 1983). Condylomata acuminata is caused by human papillomavirus (HPV) and is one of the most commonly diagnosed and sexually transmitted viral diseases. More than 50 types of HPV have been classified and new types are being identified at all times. It has been shown that certain subsets of HPV (mainly types 16 and 18) are associated with malignant tumors of the anogenital tract, respiratory tract and skin. Conventional therapy for genital warts has consisted of the use of podophyllin, cryotherapy, trichloroacetic acid, electrical cauterization, laser ablation and conventional surgery and has focused mainly on visible lesions. Recurrence phenomena following therapy in cases of HPV infections are very common, presumably due to incomplete eradication of the virus since the presence of residual viruses in normal-looking tissues has already been demonstrated .

Os interferões (IFN) são activos contra os vírus do papiloma e curam células infectadas, eliminando o ADN virai extracromossómico. Demonstrou-se que a aplicação sistémica (injecção por via i.m.) de interferão α em pacientes com verrugas genitais tem um sucesso razoável, mas está associada a diversos efeitos secundários, tais como febre, mialgias, hemicranias, náuseas e fadiga. Admite-se que o tratamento com IFN intralesões constitua uma solução promissora no caso de lesões visíveis, mas não é conveniente para infecções latentes ou subclínicas. Inicialmente foram obtidos resultados bastante positivos com a aplicação tópica 6 do IFN leucocitário natural. Vesterinen et al. descreveram a remissão colposcópica em cinco de oito pacientes com condilomas planos vaginais, as quais foram tratadas com um poderoso creme de IFN de aplicação tópica. No entanto, apesar da melhoria do aspecto clínico, a citologia continuou a ser positiva em todos os casos e duas pacientes que participaram no estudo tiveram episódios recorrentes ao fim de 2 meses. O pedido de patente de invenção internacional PCT com o n° WO 92/06676 descreve uma técnica de “carga” a frio para encher com um material imiscível com água a cavidade central amorfa de vesículas lipídicas paucilamelares. O documento EPA n° 0 130 577 descreve um método para a formação de lipossomas em que se mistura os componentes da membrana lipossómica com um solvente não volátil e solúvel em água e em que depois se dispersa a mistura num meio aquoso. Não há nesse documento nenhuma menção à encapsulação de uma emulsão nos lipossomas. Os pedidos de patentes de invenção internacionais PCT com os n- WO 93/0094 e WO 91/01719 descrevem respectivamente a utilização da PGE2 para 0 tratamento de disfunções erécteis e a utilização do interferão α para 0 tratamento de verrugas genitais originadas pelo vírus do papiloma humano. Nenhuma dessas obras explica a utilização de uma vesícula lipídica multilamelar que contenha uma emulsão no seu compartimento nuclear central, enquanto veículo para a administração do agente activo sob o ponto de vista farmacêutico. O pedido de patente de invenção internacional PCT com o n° WO 90/12565 divulga um método para a preparação de formulações aquosas de fosfolípidos, na presença de agentes que aceleram 0 aumento de volume, e descreve também a utilização dos geles assim formados para a preparação de formulações lipossómicas por diluição com água. Tal documento não explica a encapsulação das emulsões nos lipossomas. 7Interferons (IFNs) are active against papilloma viruses and heal infected cells by eliminating extrachromosomal viral DNA. Systemic application (i.m. injection) of interferon α in patients with genital warts has been shown to be a reasonable success, but it is associated with a number of side effects, such as fever, myalgia, hemicrania, nausea, and fatigue. It is assumed that intralesional IFN treatment is a promising solution in the case of visible lesions, but is not suitable for latent or subclinical infections. Initially quite positive results were obtained with the topical application of natural leukocyte IFN. Vesterinen et al. described colposcopic remission in five of eight patients with flat vaginal condylomas, who were treated with a powerful topical application of IFN cream. However, despite the improvement in the clinical aspect, cytology remained positive in all cases and two patients who participated in the study had recurrent episodes after 2 months. International patent application PCT No. WO 92/06676 describes a cold "charging" technique for filling with a water immiscible material the amorphous central cavity of paucilamellar lipid vesicles. EPA No. 0 130 577 describes a method for the formation of liposomes in which the components of the liposomal membrane are mixed with a non-volatile, water-soluble solvent and wherein the mixture is then dispersed in an aqueous medium. There is no mention in this document of the encapsulation of an emulsion in the liposomes. PCT International Application Nos. WO 93/0094 and WO 91/01719 respectively describe the use of PGE 2 for the treatment of erectile dysfunctions and the use of interferon α for the treatment of genital warts caused by the papilloma virus human. None of these works explains the use of a multilamellar lipid vesicle containing an emulsion in its central nuclear compartment as a vehicle for administration of the pharmaceutically active agent. PCT International Application WO 90/12565 discloses a method for the preparation of aqueous phospholipid formulations in the presence of volume accelerating agents and also describes the use of the gels so formed for the preparation of liposomal formulations by dilution with water. Such a document does not explain the encapsulation of the emulsions in the liposomes. 7

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a uma vesícula lipídica multilamelar e em particular diz respeito a vesículas lipídicas multilamelares bifásicas. A vesícula lipídica bifásica é constituída por bicamadas lipídicas separadas entre si que contêm um componente formador dos lipossomas e facultativamente um agente biologicamente activo (para efeitos da presente memória descritiva, a expressão “agente ou composto biologicamente activo” designa qualquer agente que tenha um efeito farmacológico, farmacêutico ou cosmético) aprisionado dentro das bicamadas. A vesícula lipídica compreende também compartimentos de uma solução aquosa periférica, formados entre as bicamadas lipídicas, e um compartimento nuclear lipofilico central que fica praticamente no centro da vesícula lipídica multilamelar.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a multilamellar lipid vesicle and in particular relates to biphasic multilamellar lipid vesicles. The biphasic lipid vesicle consists of lipid bilayers separated from each other which contain a liposome forming component and optionally a biologically active agent (for the purpose of this specification the term "biologically active agent or compound" means any agent having a pharmacological effect , pharmaceutical or cosmetic) trapped within the bilayers. The lipid vesicle also comprises compartments of a peripheral aqueous solution, formed between the lipid bilayers, and a central lipophilic core compartment that is substantially at the center of the multilamellar lipid vesicle.

De preferência, as bicamadas lipídicas são obtidas a partir de um gel prolipossómico anidro que compreende um componente formador dos lipossomas misturado com um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável, diferente da água. O componente formador dos lipos--somas é normalmente escolhido entre o conjunto constituído por glicolípidos, fosfolípidos, ceramidas e suas misturas e facultativamente junta-se também uma substância gorda, tal como o colesterol, para aumentar a resistência das bicamadas lipídicas.Preferably, lipid bilayers are obtained from an anhydrous prolipossomic gel comprising a liposome forming component mixed with a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent other than water. The liposome forming component is usually selected from the group consisting of glycolipids, phospholipids, ceramides and mixtures thereof and optionally also a fatty substance, such as cholesterol, is added to increase the resistance of the lipid bilayers.

De forma facultativa, as bicamadas lipídicas ainda podem conter pelo menos um agente para intensificar a penetração cutânea ou percutânea, ficando esse agente aprisionado dentro das bicamadas lipídicas ou ficando absorvido sobre a sua superfície. Os agentes preferidos intensificadores da penetração podem ser aminoácidos gordos acilados, tais como mono-lauroíl-lisina. A incorporação de substâncias lipofílicas no compartimento nuclear central da vesícula lipídica multilamelar é realizada através de uma emulsão de uma substância lipofílica em 8 água, sob a forma de gotículas em cuja superfície há um agente que favorece a formação dos lipossomas, adaptado para estabilizar o componente formador dos lipossomas e para facilitar a formação de vesículas lipídicas em tomo das gotículas. O agente que facilita a formação de lipossomas é preferencialmente um agente tensioactivo ou um emulsionante catiónico primário, tal como linoleamidopropil PG-fosfato do cloreto de dimónio (PEFA), cocamidopropil PG--fosfato do cloreto de dimónio ou estearamido PG-fosfato do cloreto de dimónio.Optionally, the lipid bilayers may further contain at least one agent to enhance cutaneous or percutaneous penetration, which is trapped within the lipid bilayers or absorbed on its surface. Preferred penetration enhancing agents may be acylated fatty acids, such as mono-lauroyl lysine. The incorporation of lipophilic substances into the central nuclear compartment of the multilamellar lipid vesicle is carried out by means of an emulsion of a lipophilic substance in water in the form of droplets on the surface of which there is an agent which promotes the formation of liposomes adapted to stabilize the component forming the liposomes and to facilitate the formation of lipid vesicles around the droplets. The liposome-facilitating agent is preferably a primary cationic surfactant or emulsifier, such as dimonium chloride linoleamidopropyl PG-phosphate (PEFA), cocamidopropyl PG-dimonium chloride phosphate or stearamide PG-phosphate of dimmonium.

Assim, é possível encapsular nos lipossomas gotículas de ingredientes lipofílicos sólidos/ /semi-sólidos. Esta encapsulação compreende especificamente o revestimento das gotículas oleosas ou dos ingredientes lipofílicos sólidos/semi-sólidos com um agente tensioactivo, seguindo-se uma redução do tamanho das gotículas para dimensões sensivelmente abaixo de 0,5 μτη, utilizando para tal um homogeneizador de alta pressão. Este procedimento gera uma solução leitosa que pode ser utilizada em vez de uma fase aquosa na formação dos lipossomas. As gotículas recobertas são encapsuladas no compartimento nuclear central dos lipossomas e são depois envolvidas por várias bicamadas. Neste tipo de sistema, o produto final pode conter o fármaco relevante encapsulado em três compartimentos diferentes dentro do lipossoma: bicamadas lipídicas, compartimentos periféricos da solução aquosa e núcleo lipofílico central.Thus, it is possible to encapsulate in the liposomes droplets of solid / semi-solid lipophilic ingredients. This encapsulation specifically comprises coating the oil droplets or the solid / semi-solid lipophilic ingredients with a surfactant, followed by a droplet size reduction to dimensions substantially below 0.5 μτη using a high pressure homogenizer . This procedure generates a milky solution that can be used instead of an aqueous phase in the formation of the liposomes. The coated droplets are encapsulated in the central nuclear compartment of the liposomes and are then surrounded by various bilayers. In this type of system, the final product may contain the relevant drug encapsulated in three different compartments within the liposome: lipid bilayers, peripheral aqueous compartments and central lipophilic core.

As substâncias lipofílicas preferidas que podem ser incorporadas no núcleo central das vesículas lipídicas multilamelares da presente invenção são os óleos e os agentes lipofílicos intensificadores da consistência, sólidos ou semi-sólidos, em que é possível incorporar os compostos lipofílicos biologicamente activos.Preferred lipophilic substances which may be incorporated into the central nucleus of the multilamellar lipid vesicles of the present invention are solid or semi-solid consistency enhancing lipophilic oils and agents wherein the biologically active lipophilic compounds can be incorporated.

Também faz parte do âmbito da presente invenção uma composição lipossómica que compreende uma população de vesículas lipídicas multilamelares bifásicas, conforme descrito supra. 9 ryAlso within the scope of the present invention is a liposomal composition comprising a population of biphasic multilamellar lipid vesicles as described supra. 9 ry

Também é do âmbito da presente invenção proporcionar um processo para a preparação de vesículas lipídicas multilamelares bifásicas que possuem diversas bicamadas lipídicas. Tal processo compreende a formação de uma fase lipídica liquefeita que se obtém misturando um componente formador dos lipossomas e preferencialmente uma substância graxa que serve para aumentar a resistência das bicamadas lipídicas com um solvente hidrofílico farmaceu-ticamente aceitável diferente da água e facultativamente um composto biologicamente activo para se produzir um gel prolipossómico anidro sob a forma de uma fase lipídica liquefeita formadora de lipossomas estáveis. Depois acrescenta-se ao gel prolipossómico uma solução lipofilica que contenha facultativamente um composto biologicamente activo e efectua-se a recuperação das vesículas lipídicas multilamelares.It is also within the scope of the present invention to provide a process for the preparation of biphasic multilamellar lipid vesicles having various lipid bilayers. Such a process comprises forming a liquefied lipid phase which is obtained by mixing a liposome forming component and preferably a grease substance which serves to increase the resistance of the lipid bilayers with a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent other than water and optionally a biologically active compound to produce an anhydrous prolipossomic gel in the form of a liquefied lipid phase which forms stable liposomes. A lipophilic solution is then added to the prolipossomic gel optionally containing a biologically active compound and the multilamellar lipid vesicles are recovered.

De preferência, a solução lipofilica é uma emulsão aquosa de uma substância lipofilica, assumindo tal emulsão a forma de um conjunto de gotículas em cuja superfície há um agente que favorece a formação dos lipossomas e que está adaptado para estabilizar o componente formador dos lipossomas e para facilitar a formação das vesículas lipídicas em tomo das gotículas. Prepara-se esta solução dissolvendo em água o agente que favorece a formação dos lipossomas e acrescentando à água a substância lipofilica. A substância lipofilica compreende preferencialmente pelo menos um componente seleccionado entre o conjunto constituído por um óleo e um agente lipofílico intensificador da consistência, sólido ou semi-sólido. A presente invenção proporciona também uma vesícula lipídica multilamelar que irá ser utilizada particularmente em aplicações tópicas. A vesícula lipídica compreende um conjunto de bicamadas lipídicas afastadas entre si que contêm um componente formador dos lipossomas preferencialmente misturado com uma substância graxa que serve para aumentar a potência das bicamadas e facultativamente um agente biologicamente activo aprisionado 10 dentro dessas bicamadas. A vesícula lipídica também compreende compartimentos periféricos de solução aquosa formados entre as bicamadas lipídicas e um compartimento nuclear aquoso central que fica praticamente no centro da vesícula lipídica multilamelar. Os compartimentos periféricos contêm pelo menos vestígios de um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável que é diferente da água. As vesículas lipídicas multilamelares não contêm vestígios de solventes orgânicos, tais como o clorofórmio, que são normalmente utilizados em técnicas convencionais de formação de lipossomas para dissolver o componente formador dos lipossomas.Preferably, the lipophilic solution is an aqueous emulsion of a lipophilic substance, said emulsion assuming the form of a droplet set on the surface of which there is an agent which promotes liposome formation and which is adapted to stabilize the liposome forming component and to facilitate the formation of lipid vesicles around droplets. This solution is prepared by dissolving in water the agent which promotes the formation of the liposomes and adding to the water the lipophilic substance. The lipophilic substance preferably comprises at least one component selected from the group consisting of an oil and a lipophilic agent that enhances the consistency, solid or semi-solid. The present invention also provides a multilamellar lipid vesicle which will be used particularly in topical applications. The lipid vesicle comprises a set of spaced apart lipid bilayers which contain a liposome forming component preferably mixed with a grease substance which serves to increase the strength of the bilayers and optionally a biologically active agent trapped within these bilayers. The lipid vesicle also comprises peripheral aqueous solution compartments formed between the lipid bilayers and a central aqueous nuclear compartment that is substantially at the center of the multilamellar lipid vesicle. The peripheral compartments contain at least traces of a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent which is different from water. Multilamellar lipid vesicles do not contain traces of organic solvents, such as chloroform, which are commonly used in conventional liposome formation techniques to dissolve the liposome forming component.

De preferência, as bicamadas lipídicas são formadas a partir de um gel prolipossómico anidro que contém o componente formador dos lipossomas misturado com o ácido graxo e com um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável que é diferente da água. O componente formador dos lipossomas é seleccionado normalmente entre o conjunto constituído por glico-lípidos, ceramidas, fosfolípidos e suas misturas e a substância graxa é normalmente o colesterol.Preferably, lipid bilayers are formed from an anhydrous prolipossomic gel containing the liposome forming component mixed with the fatty acid and with a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent which is different from water. The liposome-forming component is usually selected from the group consisting of glycolipids, ceramides, phospholipids and mixtures thereof and the fatty substance is usually cholesterol.

De forma facultativa, as bicamadas lipídicas ainda podem conter pelo menos um agente intensificador da penetração cutânea ou percutânea aprisionado dentro das bicamadas lipídicas ou absorvido na sua superfície. Os agentes preferidos intensificadores da penetração compreendem os aminoácidos acilados graxos, tais como monolauroíl-lisina.Optionally, the lipid bilayers may further contain at least one penetration enhancing agent or percutaneously entrapped within the lipid bilayers or absorbed on its surface. Preferred penetration enhancing agents comprise fatty acylated amino acids, such as monolauroyl lysine.

Duas das diversas aplicações das vesículas lipídicas multilamelares da presente invenção estão relacionadas com a sua utilização para o tratamento de disfunções erécteis e infecções originadas pelos vírus do papiloma. Para o tratamento das disfunções erécteis incorpora-se nas bicamadas lipídicas uma prostaglandina, de preferência a PGEi. Para o tratamento das infecções provocadas pelos vírus do papiloma incorpora-se nas bicamadas lipídicas o interferão a.Two of the various applications of the multilamellar lipid vesicles of the present invention relate to their use for the treatment of erectile dysfunctions and infections caused by papilloma viruses. For the treatment of erectile dysfunctions a prostaglandin, preferably PGE 1, is incorporated into the lipid bilayers. For the treatment of infections caused by papilloma virus, the interferon a is incorporated into the lipid bilayers.

Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar uma composição lipossómica que compreende uma população de vesículas lipídicas multilamelares, conforme '· ,r 11 descrito supra. A distribuição dimensional da população de vesículas lipídicas multilamelares é bastante uniforme, variando de preferência entre 0,1 pm e 10 μιη, sendo ao mesmo tempo praticamente isenta de lipossomas agregados ou liquefeitos e isenta de vestígios dos solventes orgânicos vulgaimente utilizados para a dissolução dos componentes formadores dos lípidos.It is also within the scope of the present invention to provide a liposomal composition comprising a population of multilamellar lipid vesicles as described above. The dimensional distribution of the multilamellar lipid vesicle population is quite uniform, preferably ranging from 0.1 to 10 μιη, while being substantially free of aggregated or liquefied liposomes and free from traces of the organic solvents commonly used for the dissolution of the components lipid builders.

Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar um processo para a preparação de vesículas lipídicas multilamelares que possuam um conjunto de bicamadas lipídicas. O processo consiste em preparar uma fase lipídica liquefeita, misturando um componente formador dos lipossomas de preferência com uma substância graxa que sirva para aumentar a resistência das bicamadas lipídicas, com um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável, diferente da água, e facultativamente um composto biologicamente activo, para assim se produzir um gel prolipossómico anidro sob a forma de uma fase lipídica liquefeita formadora de lipossomas estáveis. Depois acrescenta-se ao gel prolipossómico uma solução aquosa que contenha facultativamente um composto biologicamente activo e a seguir efectua-se a recuperação das vesículas lipídicas multilamelares.It is also within the scope of the present invention to provide a process for the preparation of multilamellar lipid vesicles having a set of lipid bilayers. The process comprises preparing a liquefied lipid phase by mixing a liposome forming component preferably with a grease substance which serves to increase the resistance of the lipid bilayers with a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent other than water and optionally a biologically active compound, to thereby produce an anhydrous prolipossomic gel in the form of a liquefied lipid phase which forms stable liposomes. An aqueous solution optionally containing a biologically active compound is then added to the prolipossomic gel and then the multilamellar lipid vesicles are recovered.

Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar uma composição para a preparação de vesículas lipídicas multilamelares que possuam um conjunto de bicamadas lipídicas. A composição compreende um componente formador dos lipossomas, de preferência misturado com um ácido gordo que sirva para aumentar a resistência das bicamadas lipídicas, e um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável, diferente da água, para assim se produzir um gel prolipossómico anidro sob a forma de uma fase lipídica fundida formadora de lipossomas estáveis.It is also within the scope of the present invention to provide a composition for the preparation of multilamellar lipid vesicles having a set of lipid bilayers. The composition comprises a liposome forming component, preferably mixed with a fatty acid which serves to increase the resistance of the lipid bilayers, and a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent, other than water, to thereby produce an anhydrous prolipossomic gel in the form of a stable fused lipid-forming phase of liposomes.

Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar um método para o tratamento de disfunções erécteis. Este método consiste em administrar por via tópica a um 12 paciente que disso necessite uma quantidade eficaz de uma composição lipossómica que contenha uma população de vesículas lipídicas multilamelares. As vesículas lipídicas multi-lamelares compreendem um conjunto de bicamadas lipídicas separadas entre si que contêm um componente formador dos lipossomas, de preferência misturado com uma substância graxa que sirva para aumentar a resistência das bicamadas lipídicas e contêm PGEi aprisionada dentro dessas bicamadas lipídicas. As vesículas lipídicas multilamelares possuem também compartimentos periféricos de solução aquosa formados entre as bicamadas lipídicas e um compartimento nuclear central aquoso ou lipofílico que fica praticamente no centro de cada vesícula lipídica multilamelar. O compartimento periférico possui pelo menos vestígios de um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável, diferente da água. A distribuição dimensional da população de vesículas lipídicas multilamelares é praticamente uniforme, sendo essa população simultaneamente isenta de lipossomas agregados ou liquefeitos e isenta de vestígios de solventes orgânicos adequados para dissolver as bicamadas lipídicas, com a finalidade de se tratar as disfunções erécteis.It is also within the scope of the present invention to provide a method for the treatment of erectile dysfunctions. This method consists in administering topically to a patient in need thereof an effective amount of a liposomal composition containing a population of multilamellar lipid vesicles. The multi-lamellar lipid vesicles comprise a set of lipid bilayers separated from each other containing a liposome forming component, preferably mixed with a fatty substance which serves to increase the resistance of the lipid bilayers and contain PGE1 trapped within such lipid bilayers. The multilamellar lipid vesicles also have peripheral aqueous compartments formed between the lipid bilayers and an aqueous or lipophilic central core compartment that is substantially at the center of each multilamellar lipid vesicle. The peripheral compartment has at least traces of a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent, other than water. The dimensional distribution of the multilamellar lipid vesicle population is practically uniform, the population being simultaneously free of aggregated or liquefied liposomes and free of traces of organic solvents suitable to dissolve the lipid bilayers for the purpose of treating erectile dysfunctions.

Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar a utilização de uma composição lipossómica tópica para a aplicação de PGEi no tratamento de disfunções erécteis. A composição lipossómica compreende as vesículas lipídicas multilamelares ou as vesículas lipídicas multilamelares bifásicas descritas supra. Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar a utilização de vesículas lipídicas multilamelares ou de vesículas lipídicas multilamelares bifásicas descritas supra para a preparação de um medicamento de aplicação tópica que contenha PGEi para o tratamento de disfunções erécteis. A invenção também diz respeito a um método para o tratamento de infecções provocadas pelo vírus do papiloma. Tal método consiste em administrar por via tópica a um paciente que disso necessite uma quantidade /s 13 eficaz de uma composição lipossómica que contenha uma população de vesículas lipídicas multilamelares. As vesículas lipídicas multilamelares são constituídas por um conjunto de bicamadas lipídicas afastadas entre si que contêm um componente formador dos lipossomas, de preferência misturado com uma substância graxa que sirva para aumentar a resistência das bicamadas lipídicas, e o interferão α aprisionado dentro dessas bicamadas lipídicas. As vesículas lipídicas multilamelares compreendem compartimentos periféricos de solução aquosa formados entre as bicamadas lipídicas e um compartimento nuclear central aquoso ou lipofilico prati-camente no centro da vesícula lipídica multilamelar. Os compartimentos periféricos contêm pelo menos vestígios de um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável, diferente da água. A distribuição dimensional da população de vesículas lipídicas multilamelares é praticamente uniforme e simultaneamente está isenta de lipossomas agregados ou liquefeitos e isenta de vestígios de solventes orgânicos adequados para a dissolução das referidas bicamadas lipídicas.It is also within the scope of the present invention to provide the use of a topical liposomal composition for the application of PGE 1 in the treatment of erectile dysfunction. The liposomal composition comprises the multilamellar lipid vesicles or the biphasic multilamellar lipid vesicles described supra. It is also within the scope of the present invention to provide the use of multilamellar lipid vesicles or biphasic multilamellar lipid vesicles described above for the preparation of a topically applied medicament containing PGE 1 for the treatment of erectile dysfunctions. The invention also relates to a method for the treatment of infections caused by the papilloma virus. Such a method comprises administering topically to a patient in need thereof an effective amount of a liposomal composition containing a population of multilamellar lipid vesicles. The multilamellar lipid vesicles consist of a set of lipid bilayers separated from each other containing a liposome forming component, preferably mixed with a fatty substance which serves to increase the resistance of the lipid bilayers, and interferon α entrapped within these lipid bilayers. Multilamellar lipid vesicles comprise peripheral aqueous compartments formed between the lipid bilayers and an aqueous or lipophilic central core compartment practically at the center of the multilamellar lipid vesicle. The peripheral compartments contain at least traces of a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent, other than water. The dimensional distribution of the multilamellar lipid vesicle population is substantially uniform and simultaneously free of aggregated or liquefied liposomes and free of traces of organic solvents suitable for the dissolution of said lipid bilayers.

Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar a utilização de uma composição lipossómica de aplicação tópica para a administração de PGE! no tratamento de impotência. A composição lipossómica compreende uma população de vesículas lipídicas multilamelares ou de vesículas lipídicas multilamelares bifásicas.It is also within the scope of the present invention to provide the use of a topically-applied liposomal composition for the administration of PGE1; in the treatment of impotence. The liposomal composition comprises a population of multilamellar lipid vesicles or biphasic multilamellar lipid vesicles.

Também faz parte do âmbito da presente invenção proporcionar a utilização de vesículas lipídicas multilamelares ou de vesículas lipídicas multilamelares bifásicas para a preparação de um medicamento para o tratamento de infecções de vírus do papiloma.It is also within the scope of the present invention to provide the use of multilamellar lipid vesicles or biphasic multilamellar lipid vesicles for the preparation of a medicament for the treatment of papilloma virus infections.

As vesículas lipídicas multilamelares desenvolvidas no contexto da presente invenção revelaram possuir uma elevada eficiência de encapsulação de ingredientes activos hidrofilicos, lipofílicos e de tipo oleoso. A simplicidade do método para a preparação das vesículas permite a sua produção em grande escala. Graças ao método da presente invenção, é possível produzir 14 um produto acabado que não seja um intermediário lipossómico e incorporá-lo numa matriz à base de um creme ou de um gel para se obter o produto final. A expressão “agente biologicamente activo”, quando utilizada na presente memória descritiva, pretende designar os compostos que possuam uma actividade medicinal e também os compostos utilizados para a preparação de cosméticos.The multilamellar lipid vesicles developed in the context of the present invention have been shown to have a high encapsulation efficiency of hydrophilic, lipophilic and oily type active ingredients. The simplicity of the method for the preparation of the vesicles allows its production on a large scale. By the method of the present invention, it is possible to produce a finished product other than a liposomal intermediate and incorporate it into a matrix based on a cream or a gel to give the final product. The term "biologically active agent" as used herein is intended to denote compounds having a medicinal activity and also the compounds used for the preparation of cosmetics.

Uma vantagem notórias do método desenvolvido no contexto da presente invenção é o facto de não ser necessário recorrer à utilização de solventes orgânicos tóxicos, tais como o clorofórmio ou o metanol. Com efeito, uma das particularidades importantes da presente invenção é a utilização de componentes formadores dos lipossomas, tais como os fosfolípidos, e outros excipientes necessários, sob a forma de um sistema “liquefeito” que é preparado utilizando um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável, tal como o propileno-glicol. O propileno-glicol é utilizado como agente plastificante e como adjuvante para a preparação de um produto liquefeito uniforme. Assim, os lipossomas resultantes são isentos de quaisquer vestígios de solventes orgânicos.A notorious advantage of the method developed in the context of the present invention is that it is not necessary to resort to the use of toxic organic solvents, such as chloroform or methanol. Indeed, one of the important features of the present invention is the use of liposome forming components, such as phospholipids, and other necessary excipients, in the form of a "liquefied" system which is prepared using a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent such as or propylene glycol. The propylene glycol is used as a plasticizer and as an adjuvant for the preparation of a uniform liquefied product. Thus, the resulting liposomes are free from any traces of organic solvents.

Com a utilização do processo da presente invenção obtém-se uma composição lipossómica fisicamente mais estável. Em consequência, obtém-se uma distribuição dimensional dos lipossomas mais uniforme e simultaneamente reduz-se a um mínimo a agregação e a fusão dos lipossomas. Além do mais, a consistência da composição final de lipossomas também é bastante melhorada. Demonstrou-se ainda que a eficiência de encapsulação é superior ou pelo menos tão boa como aquela que se consegue com o método mais convencional de evaporação do solvente. Poder-se-ia admitir que a encapsulação é mais reproduzível e este facto é indicado por desvios padrão mais pequenos. 15Using the process of the present invention a physically more stable liposomal composition is obtained. As a consequence, a more uniform dimensional distribution of the liposomes is obtained and at the same time the aggregation and fusion of the liposomes is reduced to a minimum. Moreover, the consistency of the final composition of liposomes is also greatly improved. It has further been demonstrated that the encapsulation efficiency is higher or at least as good as that achieved with the more conventional solvent evaporation method. It could be assumed that encapsulation is more reproducible and this fact is indicated by smaller standard deviations. 15

Outras particularidades importantes da composição lipossómica da presente invenção são a possibilidade de encapsulação e co-encapsulação de uma grande variedade de ingredientes activos com diferentes propriedades físico-químicas. Por exemplo, é agora possível utilizar para a construção de lipossomas compostos lipídicos que não sejam solúveis em solventes orgânicos. Este tipo de produto não podia mesmo ser produzido com os métodos convencionais de evaporação do solvente, que implicam a dissolução dos ingredientes dos lipossomas numa mistura de clorofórmio e metanol.Other important features of the liposomal composition of the present invention are the possibility of encapsulation and co-encapsulation of a wide variety of active ingredients with different physicochemical properties. For example, it is now possible to use for the liposome construction lipid compounds which are not soluble in organic solvents. This type of product could not even be produced with conventional solvent evaporation methods, which involve dissolving the ingredients of the liposomes in a mixture of chloroform and methanol.

Além do mais, as vesículas lipídicas multilamelares desenvolvidas* utilizando o processo da presente invenção, podem ser utilizadas para fornecer gotículas de óleo onde estejam contidos fármacos lipofílicos solubilizados ou extractos vegetais oleosos. A presente invenção também permite a encapsulação de agentes lipofílicos sólidos/semi-sólidos, intensificadores da consistência, no compartimento nuclear central das vesículas lipídicas multilamelares. Isto confere uma maior viscosidade ao produto final e elimina a necessidade de se acrescentar à preparação lipossómica final agentes para aumentar a viscosidade.Furthermore, the multilamellar lipid vesicles developed using the process of the present invention can be used to provide oil droplets containing solubilized lipophilic drugs or oily plant extracts. The present invention also allows the encapsulation of solid / semi-solid, consistency enhancing lipophilic agents in the central nuclear compartment of the multilamellar lipid vesicles. This confers a higher viscosity to the final product and eliminates the need to add agents to increase the viscosity to the final liposomal preparation.

Acresce ainda dizer que a formulação de EFN lipossómicos contribuiu para o desenvolvimento de uma forma eficaz de interferão para administração tópica que proporciona a vantagem de permitir tratar infecções latentes de VPH e também verrugas genitais visíveis e ainda a vantagem de poder ser administrada aos pacientes em sua casa, sem necessidade de se recorrer a múltiplas injecções dolorosas locais ou por via i.m.. A presente invenção será ilustrada mais facilmente tomando como referência o texto subsequente. 16 ffIn addition, the liposomal EFN formulation has contributed to the development of an effective form of interferon for topical administration which provides the advantage of allowing the treatment of latent HPV infections and also visible genital warts and the advantage of being able to be administered to patients in their The present invention will be more readily illustrated with reference to the subsequent text. 16 ff

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura la é uma fotografia de lipossomas multilamelares preparados pelo método de evaporação do solvente. A figura lb é uma fotografia de lipossomas multilamelares preparados pelo inventor da presente invenção, utilizando o método do “gel prolipossómico plástico anidro” (‘produto liquefeito’). A figura 2 é uma vista esquemática em corte lateral de uma vesícula multilamelar (VML) com um núcleo aquoso central. A figura 3 é uma vista esquemática em corte lateral de uma VML com um núcleo lipofílico central onde está contida uma gotícula de óleo. A figura 4 é uma vista esquemática em corte lateral de uma VML com um núcleo lipofílico central que contém um agente semi-sólido intensificador da consistência.DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1a is a photograph of multilamellar liposomes prepared by the solvent evaporation method. Figure 1b is a photograph of multilamellar liposomes prepared by the inventor of the present invention using the "plastic anhydrous prolipossom gel" ("liquefied") method. Figure 2 is a schematic side cross-sectional view of a multilamellar vesicle (MLV) with a central aqueous core. Figure 3 is a schematic side cross-sectional view of an MLL with a central lipophilic core where an oil droplet is contained. Figure 4 is a schematic side cross-sectional view of an MLL with a central lipophilic core containing a semi-solid agent that enhances consistency.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a composições lipossómicas para utilização oral e tópica. As composições da presente invenção são particularmente convenientes para a administração de compostos biologicamente activos, tais como as prostaglandinas e as proteínas, pelas vias dérmica e transdérmica. As composições lipossómicas da presente invenção podem ser utilizadas para a administração tópica de compostos biologicamente activos em zonas da pele onde haja pêlos ou onde não haja pêlos. Também podem ser utilizadas nas membranas mucosas para administração nasal, bucal, ocular, óptica, vaginal e uretral. As composições lipossómicas ainda podem ser utilizadas para a administração localizada (intradermal e intramucosal) ou 17 sistémica (transdérmica ou transmucosal) e também para injecção subcutânea ou intracutânea para colocar debaixo da pele um implante de libertação lenta.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to liposomal compositions for oral and topical use. The compositions of the present invention are particularly suitable for the administration of biologically active compounds, such as prostaglandins and proteins, by the dermal and transdermal routes. The liposomal compositions of the present invention may be used for the topical administration of biologically active compounds in areas of the skin where there are hairs or where there are no hairs. They can also be used in mucous membranes for nasal, buccal, ocular, optic, vaginal and urethral administration. The liposomal compositions can still be used for localized (intradermal and intramucosal) or systemic (transdermal or transmucosal) administration and also for subcutaneous or intracutaneous injection to place under the skin a slow release implant.

Cada aspecto da presente invenção será descrito minuciosamente e seguido por exemplos concretos de aplicações para o tratamento de disfunções erécteis e infecções com o vírus do papiloma. Na primeira secção deste trabalho é discutida a preparação de vesículas lipídicas multilamelares com um núcleo central aquoso. Seguir-se-lhe-á uma segunda secção onde se descreve a preparação de vesículas lipídicas multilamelares bifásicas que possuem um núcleo lipofílico central. A. Preparação de vesículas multilamelares com um compartimento nuclear central aquoso Γ Formação de um gel prolipossómico plástico anidro O gel prolipossómico anidro é um intermediário importante na formação das vesículas multilamelares da presente invenção. Prepara-se este gel recorrendo a uma técnica de mistura que é utilizada frequentemente na tecnologia das emulsões.Each aspect of the present invention will be described in detail and followed by concrete examples of applications for the treatment of erectile dysfunctions and infections with the papilloma virus. In the first section of this work the preparation of multilamellar lipid vesicles with an aqueous central nucleus is discussed. A second section will be followed which describes the preparation of biphasic multilamellar lipid vesicles having a central lipophilic core. A. Preparation of Multilamellar Vesicles with an Aqueous Central Nuclear Compartment Γ Formation of anhydrous plastic prolipossomic gel Anhydrous prolipossomic gel is an important intermediate in the formation of the multilamellar vesicles of the present invention. This gel is prepared using a blending technique which is often used in emulsion technology.

Liquefaz-se o componente formador dos lipossomas e outros excipientes necessários conjuntamente com um solvente hidrofílico farmaceuticamente aceitável, tal como o propileno--glicol, que normalmente poderia fazer parte da fase aquosa da formulação. Além disso, é possível utilizar os extractos a seguir indicados (ou outros idênticos) em vez do propileno--glicol para fazer a mistura com o componente formador dos lipossomas para se obter um gel prolipossómico anidro: alfazema, salva, rosmaninho, camomila-romana (macela), cenoura, mirra, malmequer, sabugueiro, arnica, eucalipto, hamamel, unha-do-diabo, raínha-dos-prados, salgueiro, bétula, baga de roseira brava, camomila-alemã (matricária), castanha-da-índia, cipreste, incenso, benjoim, tomilho, gingko biloba e mil-em-rama (milefólio). 18 A expressão “componente formador dos lipossomas”, quando utilizada na presente invenção, serve para designar qualquer substância que seja utilizada como componente principal para a preparação das bicamadas lipídicas.The liposome forming component and other necessary excipients are liquefied together with a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent, such as propylene glycol, which could normally be part of the aqueous phase of the formulation. In addition, the following (or the like) extracts may be used in place of the propylene glycol to make the mixture with the liposome forming component to give an anhydrous prolipossomic gel: lavender, salve, rosemary, camomile-roman (mackerel), carrot, myrrh, marigold, elderberry, arnica, eucalyptus, hamamel, devil's nail, meadow queen, willow, birch, berry rose bush, india, cypress, incense, benzoin, thyme, gingko biloba and thousand-in-rama (milfoil). The term "liposome forming component", when used in the present invention, is meant to denote any substance that is used as the main component for the preparation of the lipid bilayers.

Os componentes típicos formadores de lipossomas são seleccionados entre glicolípidos, lecitinas, fosfolípidos, ceramidas ou suas misturas, sendo qualquer deles utilizado como ingrediente primário na formação de uma bicamada lipídica. No entanto, para fazer os lipossomas é possível utilizar outros compostos naturais e sintéticos que possuam a necessária característica anfipática. A escolha dos materiais adequados compete aos especialistas nesta matéria. Como exemplos refere-se as substâncias seleccionadas entres fosfatidil-etanolamina, lisolecitina, lisofosfatidil-etanolamina, fosfatidil-serina, fosfatidil-inositol, esfmgomielina, cardiolipina, ácido fosfatídico e os cerebrósidos, lípidos voláteis e fitanóis.Typical liposome forming components are selected from glycolipids, lecithins, phospholipids, ceramides or mixtures thereof, any of which are used as the primary ingredient in the formation of a lipid bilayer. However, to make the liposomes it is possible to use other natural and synthetic compounds which have the requisite amphipathic feature. The choice of the appropriate materials is the responsibility of those skilled in the art. Examples include the substances selected from phosphatidyl ethanolamine, lysolecithin, lysophosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl serine, phosphatidyl inositol, sphingomyelin, cardiolipin, phosphatidic acid and cerebrosides, volatile lipids and phytanols.

As formulações lipossómicas da presente invenção contêm preferencialmente fosfolípidos saturados e/ou insaturados e mais preferencialmente contêm fosfatidil-colina, lisofosfatidil--colina, fosfatidil-serina, fosfatidil-etanolamina, glicolípidos e ceramidas. De preferência, combina-se os fosfolípidos com um agente para aumentar a penetração, tal como monolauril--lisina ou salicilato de metilo, para se obter fundamentalmente um potencial de administração transdérmica.The liposomal formulations of the present invention preferably contain saturated and / or unsaturated phospholipids and most preferably contain phosphatidylcholine, lysophosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidyl ethanolamine, glycolipids and ceramides. Preferably, the phospholipids are combined with a penetration enhancing agent, such as monolauryl lysine or methyl salicylate, to provide essentially a transdermal delivery potential.

No que diz respeito às expressões “substância graxa” ou “substância gorda”, pretende--se com elas designar qualquer substância que seja utilizada como agente secundário para a formação das bicamadas lipídicas. Este agente secundário serve para aumentar a resistência das bicamadas lipídicas formadas a partir dos componentes adequados formadores de lipossomas. Como exemplos de substâncias graxas úteis refere-se os esteróides, tais como colesterol, corprostanol, colestanol e colestano, e os ácidos gordos saturados de cadeia longa. 19 tais como o ácido esteárico, os quais servem para aumentar a estabilidade e melhorar o aspecto do produto. O agente biologicamente activo que pode ficar aprisionado dentro dos compartimentos periféricos de solução aquosa ou dentro das bicamadas lipídicas pode ser seleccionado, mas sem que isso constitua qualquer limitação, entre ácidos nucleicos, polinucleótidos, compostos antibacterianos, compostos antivirais, compostos antifungicos, compostos antiparasíticos, compostos tumoricidas, proteínas, toxinas, enzimas, hormonas, neurotransmissores, glico-proteínas, imunoglobulinas, imunomoduladores, corantes, marcadores radioactivos, compostos radiopacos, compostos fluorescentes, polissacáridos, moléculas de ligação aos receptores celulares, anti-inflamatórios, agentes anti-glaucoma, compostos midriáticos, anestésicos locais, análogos nucleosídicos, etc.. O solvente hidrofílico é utilizado como um agente plastificante do componente formador dos lipossomas e como um adjuvante para a preparação de um produto liquefeito uniforme. O solvente hidrofílico é preferencialmente de tipo não tóxico. Como exemplos de solventes hidrofílicos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os seleccionados entre propileno-ghcol, ghcerol, polietileno-glicol com um peso molecular compreendido entre 300 e 8000 e etanol. O produto liquefeito resultante pode ser descrito como um gel prolipossómico plástico anidro. Este gel prolipossómico plástico anidro contém todos os ingredientes da fase lipídica e pode ser preparado antecipadamente e guardado em grandes quantidades. Este gel é um material semi-sólido com uma consistência homogénea. 2° Formação das vesículas lipídicas multilamelaresWith respect to the terms "fatty substance" or "fatty substance", it is intended to designate any substance which is used as a secondary agent for the formation of lipid bilayers. This secondary agent serves to increase the resistance of the lipid bilayers formed from the appropriate liposome forming components. Examples of useful fatty substances include steroids, such as cholesterol, corprostanol, cholestanol and cholestane, and long chain saturated fatty acids. Such as stearic acid, which serve to increase stability and improve the appearance of the product. The biologically active agent that may be trapped within the aqueous solution peripheral compartments or within the lipid bilayers may be selected, but not limited to, nucleic acids, polynucleotides, antibacterial compounds, antiviral compounds, antifungal compounds, antiparasitic compounds, tumoricidal compounds, proteins, toxins, enzymes, hormones, neurotransmitters, glycoproteins, immunoglobulins, immunomodulators, dyes, radioactive labels, radiopaque compounds, fluorescent compounds, polysaccharides, cell receptor binding molecules, antiinflammatory agents, anti-glaucoma agents, mydriatic compounds, local anesthetics, nucleoside analogues, etc. The hydrophilic solvent is used as a plasticizing agent of the liposome forming component and as an adjuvant for the preparation of a uniform liquefied product. The hydrophilic solvent is preferably non-toxic in nature. Examples of hydrophilic solvents include, but are not limited to, those selected from propylene glycol, ghcerol, polyethylene glycol having a molecular weight of from 300 to 8000 and ethanol. The resulting liquefied product may be described as an anhydrous plastic prolipossomic gel. This anhydrous plastic prolipossic gel contains all the ingredients of the lipid phase and can be prepared in advance and stored in large quantities. This gel is a semi-solid material with a homogeneous consistency. 2 ° Formation of multilamellar lipid vesicles

Uma vez formado o gel prolipossómico plástico anidro, prepara-se então separadamente os ingredientes hidrofílicos que vão fazer parte da composição lipossómica, por exemplo, os 20 agentes intensificadores da penetração, os agentes conservantes e outros que tais, sob a forma de uma solução aquosa que se junta ao produto liquefeito da fase lipídica previamente aquecido até à temperatura de fusão adequada que pode estar compreendida entre 40°C e 80°C, misturando-se vigorosamente por meio de qualquer técnica conhecida que permita obter o tamanho desejado para o produto. Como exemplos de técnicas de mistura refere-se a agitação centrífuga vigorosa e a agitação por meio de uma misturadora de pás. Nesta fase também é possível incorporar agentes biologicamente activos no estado sólido que irão ficar aprisionados dentro das bicamadas lipídicas.Once the anhydrous plastic prolipossomic gel is formed, the hydrophilic ingredients which form part of the liposomal composition, for example penetration enhancing agents, preservatives and the like, are then separately prepared as an aqueous solution which is added to the liquefied product of the pre-heated lipid phase to the appropriate melting temperature which may be in the range of 40 ° C to 80 ° C, by vigorously mixing by any known technique which allows the desired size to be obtained for the product. Examples of mixing techniques include vigorous centrifugal agitation and stirring by means of a blade blender. At this stage it is also possible to incorporate biologically active agents in the solid state which will become entrapped within the lipid bilayers.

Este procedimento é adequado para a preparação de quantidades diversas de produto lipossómico para administração tópica. No caso de se recorrer à mistura vigorosa centrífuga como meio de agitação, é possível preparar até cera de 20 g de produto. No caso de se utilizar uma misturadora de pás de tipo laboratorial, é possível preparar até cerca de 2000 g de produto. Este procedimento de formulação também pode ser adaptado para o fabrico em grande escala. Assim sendo, a técnica de mistura com uma misturadora de pás pode ser transposta directamente para quantidades maiores, aumentando de forma geométrica o tamanho do vaso de mistura e o diâmetro da misturadora de pás. No entanto, à medida que for aumentando o tamanho do vaso de mistura, a adaptação preferível seria a utilização de uma combinação de misturadoras, isto é, uma misturadora de alta velocidade com uma misturadora de pás e um mecanismo de agitação que varra a superfície. A fase aquosa é bombeada do tanque A para o tanque B que contém o gel prolipossómico plástico anidro à temperatura pretendida e é ai misturada. Este procedimento serve perfeitamente para se produzir em grande escala qualquer produto lipossómico para aplicação tópica. 21 É possível preparar as composições lipossómicas com as vesículas lipídicas multi-Iamelares da presente invenção utilizando aditivos farmacêuticos adequados. Por exemplo, eventualemente poderia ser necessário juntar à preparação final de lipossomas agentes para aumentar a sua viscosidade. A adição de outros compostos farmaceuticamente aceitáveis é uma questão da competência de um especialista na matéria. 3° Características do produto final constituído pelas vesículas lipídicas multilamelares A figura 2 ilustra uma representação esquemática de uma vesícula lipídica multilamelar preparada em conformidade com o processo anteriormente descrito. A vesícula lipídica multilamelar, genericamente identificada pelo número de referência 2, é feita de um conjunto de bicamadas 4, 6 e 8 lipídicas separadas entre si, que definem um conjunto de compartimentos 3 e 5 periféricos de solução aquosa. A bicamada lipídica mais pequena 7 define no seu centro um compartimento nuclear aquoso central 9.This procedure is suitable for the preparation of various amounts of liposomal product for topical administration. If the vigorous centrifugal mixture is used as the stirring medium, it is possible to prepare 20 g of the product. In the case where a laboratory-type blender is used, up to about 2000 g of product can be prepared. This formulation procedure can also be adapted for large scale manufacture. Thus, the blending technique with a blade blender can be transposed directly into larger amounts, geometrically increasing the size of the blending vessel and the diameter of the blade blender. However, as the size of the mixing vessel increases, the preferred adaptation would be the use of a combination of mixers, i.e. a high speed mixer with a blade mixer and a surface sweeping stirring mechanism. The aqueous phase is pumped from tank A to tank B containing the anhydrous plastic prolipossomic gel at the desired temperature and is therein admixed. This procedure perfectly serves to produce on a large scale any liposomal product for topical application. The liposomal compositions can be prepared with the multi-lipid vesicles of the present invention using suitable pharmaceutical additives. For example, it may be necessary to add agents to the final preparation of liposomes to increase their viscosity. The addition of other pharmaceutically acceptable compounds is a matter of skill to one skilled in the art. 3. Characteristics of the final product consisting of multilamellar lipid vesicles Figure 2 shows a schematic representation of a multilamellar lipid vesicle prepared according to the process previously described. The multilamellar lipid vesicle, generally identified by reference numeral 2, is made from a set of separate lipid bilayers 4, 6 and 8 which define a set of peripheral compartments 3 and 5 of aqueous solution. The smaller lipid bilayer 7 defines at its center a central aqueous nuclear compartment 9.

Para se demonstrar a diferença de propriedades observadas na população de lipossomas produzidos em conformidade com o método da presente invenção foram efectuados testes comparativos entre duas composições lipossómicas preparadas a partir dos mesmos ingredientes, mas em que se recorreu quer ao método de evaporação do solvente quer ao método do gel prolipossómico plástico anidro da presente invenção. A figura la corresponde a uma fotografia da população de lipossomas preparados pelo método de evaporação do solvente e a figura lb corresponde a uma fotografia da população de lipossomas preparados por meio do método do gel prolipossómico plástico anidro. Conforme se conclui observando e comparando as figuras la e lb, a população de lipossomas obtidos por meio do método do gel prolipossómico plástico anidro tem uma distribuição dimensional dos lipossomas que é bastante mais uniforme do 22 que a da população de lipossomas obtidos através do método de evaporação do solvente. Além disso, formam-se quantidades mínimas de lipossomas agregados ou liquefeitos quando se utiliza o método do gel prolipossómico plástico anidro, ao passo que é possível observar agregados de grandes dimensões na população de lipossomas que se obtém ao praticar o método da evaporação do solvente. O quadro 1 indica de forma resumida as propriedades físicas das formulações de lipossomas a que correspondem as figuras la e lb. QUADRO 1In order to demonstrate the difference in properties observed in the population of liposomes produced in accordance with the method of the present invention, comparative tests were performed between two liposomal compositions prepared from the same ingredients, but using either the solvent evaporation method or the Anhydrous plastic prolipossomic gel method of the present invention. Figure 1a corresponds to a photograph of the population of liposomes prepared by the solvent evaporation method and Figure 1b corresponds to a photograph of the population of liposomes prepared by the anhydrous plastic prolipossom method. As shown by observing and comparing Figures 1a and 1b, the population of liposomes obtained by the anhydrous plastic prolipossomic gel method has a dimensional distribution of the liposomes which is much more uniform than that of the population of liposomes obtained by the method of evaporation of the solvent. In addition, minimal amounts of aggregated or liquefied liposomes are formed when using the anhydrous plastic prolipossomic gel method, whereas it is possible to observe large aggregates in the population of liposomes which is obtained by practicing the solvent evaporation method. Table 1 summarizes the physical properties of the liposome formulations corresponding to Figures 1a and 1b. TABLE 1

Comparação de duas formulações idênticas preparadas por: a) método da evaporação do solvente (Formulação n° 1) b) método do “gel prolipossómico plástico anidro” (‘produto liquefeito’) (Formulação nu2)Comparison of two identical formulations prepared by: a) solvent evaporation method (Formulation No. 1) b) anhydrous plastic prolipossomic gel (liquefied product) method (Formulation No. 2)

Formulação n° Propriedades Distribuição dimensional dos organolépticas lipossomas/mícroscopia 1 (figura la) Creme branco homogéneo VML, 1-30μιη, agregação, fusão 2 (figura lb) Creme branco homogéneo VML, 1-10 pm, distribuição uniforme de lipossomas, sem fusão nem agregaçãoFormulation n ° Properties Dimensional distribution of organoleptic liposomes / microscopy 1 (figure 1) Homogeneous white cream VML, 1-30μιη, aggregation, fusion 2 (Figure 1b) Homogeneous white cream VML, 1-10 pm, uniform distribution of liposomes without fusion nor aggregation

Demonstrou-se também que a eficiência da encapsulação de proteínas em lipossomas é superior ou pelo menos tão boa como a eficiência de encapsulação quando se utiliza o método da evaporação do solvente, sem o inconveniente dos vestígios de solventes tóxicos, tais como o clorofórmio, que são observados com o método da evaporação do solvente. Além de tudo isso, é importante referir que parece que a encapsulação é mais reproduzível quando se utiliza o método do gel prolipossómico plástico anidro, que dá origem a um desvio padrão 23 muito menor, do que quando se utiliza o método da evaporação do solvente. Os resultados estão agrupados de forma resumida no quadro 2. QUADRO 2It has also been shown that the efficiency of protein encapsulation in liposomes is greater or at least as good as the encapsulation efficiency when using the solvent evaporation method without the drawback of traces of toxic solvents such as chloroform which are observed with the solvent evaporation method. In addition to all of this, it is important to note that encapsulation appears to be more reproducible when using the anhydrous plastic prolipossomic gel method, which gives a much lower standard deviation 23, than when using the solvent evaporation method. The results are summarized in Table 2. TABLE 2

Eficiência da encapsulação do interferão α nos lipossomasEfficiency of interferon α encapsulation in liposomes

Formulação n° Eficiência de encapsulação ± d.p. (n = 5) 1 59,1 ± 10,4 2 55,9 ± 1,5 B. Preparação de vesículas lipídicas multilamelares bifásicas com um compartimento nuclear lipofílico central Γ Formação do gel prolipossómico plástico anidro O procedimento utilizado para se fazer o gel prolipossómico plástico anidro é o mesmo procedimento anteriormente descrito. Conforme se disse antes, este gel contém todos os ingredientes da fase lipídica utilizados para se fazer as bicamadas lipídicas da vesícula lipídica multilamelar. Tal gel pode ser preparado antecipadamente e guardado em grandes quantidades. 2° Formação do compartimento nuclear lipofílico central O compartimento nuclear lipofílico central é feito a partir de uma emulsão de uma substância lipofílica em água, sob a forma de uma gotícula em cuja superfície existe um agente que favorece a formação dos lipossomas, adaptado para estabilizar o componente formador dos lipossomas e para facilitar a formação das vesículas lipídicas em tomo da gotícula. 24 A expressão “substância lipofílica”, tal como aqui utilizada, serve para designar óleos ou agentes lipofílicos intensifícadores da consistência, sólidos/semi-sólidos, que podem ser encapsulados nos lipossomas. Como exemplos de óleos que foram utilizados com êxito para efeitos de encapsulação nos lipossomas refere-se os seleccionados entre: azeite, óleo de nozes de macadamia, óleo de farelo de arroz, óleo de sementes de abóbora-menina, óleo de miolo de damasco, óleo de avelã, óleo de sementes de bagas de roseira brava, óleo de borragem, óleo da planta do chá, óleo de roçou, óleo de camélia, óleo de amêndoas doces, óleo de açafroa, óleo de erva-de-são-joão, lipodermol, óleo de pistachos, óleo de chia, óleo de sementes de quivi, óleo de lesquerella, óleo de tiare, óleo de graínhas, óleo de amendoim, óleo de babaçu, óleo de abacate, esqualeno, óleo de ónagra, óleo de groselha-negra, tetracaprilato/caprato de pentaeritritol, tetraisostearato de pentaeritritol, octanoato de estearilo e óleo de canola, óleo de jojobá, óleo de amendoim, óleo de sementes de algodão, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de nozes, óleo de abacate, bálsamo-do-peru, óleo de cravo-da-índia e eugenol. Também foram incorporados com êxito nos lipossomas extractos de plantas à base de óleos, por exemplo, seleccionados ente consolda, camomila-alemã (matricária), noz de cola, malmequer, bétula, ‘gingko biloga’, hamamel, salgueiro, guaraná, arnica, castanha-da-índia, eucalipto, rainha--dos-prados, rosmaninho, phyt 'Iod, café, mate, chá e hera. No que diz respeito aos ingredientes sólidos/semi-sólidos intensifícadores da consistência lipofílica refere-se que podem ser seleccionados entre ceras, álcoois graxos, ésteres de ácidos graxos, estearato de glicerilo, petrolato ou suas combinações. Como exemplos específicos de agentes preferidos intensifi-cadores da consistência refere-se os seleccionados entre cem de abelhas, tribeénato de glicerilo, estearato de glicerilo, heptanoato de estearilo, palmitato de estearilo, álcool cetílico, álcool estearílico, miristato de miristilo, erucato de beénilo e palmitato de cetilo. 25 A expressão “agente que favorece a formação dos lipossomas”, tal como aqui utilizada, serve para designar compostos que podem ser utilizados para estabilizar o componente formador dos lipossomas e para facilitar a formação de vesículas lipídicas em tomo das gotículas. A escolha óbvia é a dos agentes tensioactivos. O agente tensioactivo utilizado para recobrir as gotículas oleosas ou os ingredientes lipofílicos sólidos/semi-sólidos intensificadores da consistência é importante para que haja êxito na encapsulação de um núcleo lipofílico dentro de vesículas lipídicas multilamelares. Foram já estudados e identificados cerca de 30 tipos diferentes de agentes tensioactivos e há uma família de agentes tensioactivos que permite obter os resultados mais aceitáveis. Este tipo de agente tensioactivo é um emulsionante catiónieo primário. O agente tensioactivo mais preferido é o produto linol-amidopropil PG-fosfato do cloreto de dimónio. Considera-se esta substância como sendo um complexo fosfolipídico sintético. Este agente tensioactivo é comercializado por “Mona Industries Inc., Patterson, New Jersey” com a marca comercial ‘PHOSPHOLIPID EFA’, aqui designado abreviadamente por PEFA. Outros dois membros desta família, também da “Mona Industries”, são as substâncias estereamidopropil PG-fosfato do cloreto de dimónio com a marca comercial ‘PHOSPHOLIPID SV’ e a substância cocamidopropil PG-fosfato do cloreto de dimónio com a marca comercial ‘PHOSPHOLIPID PTC’, sendo qualquer delas aceitável mas sendo preferível a substância PEFA. Também é possível utilizar agentes tensioactivos não tónicos ou anfotéricos, tais como os agentes emulsionantes obtidos por via natural: glicéridos de amêndoas PEG-60, dietanolamina com óleo de abacate, óleo de jojobá etoxilado (ácido de jojobá com PEG-40 e álcool de jojobá com PEG-40); derivados de polioxietileno: mono-oleato de polioxietileno (20)-sorbitano, monoestearato de polioxietileno (20)-sorbitano; derivados de lanolina: policol 20 (‘laneth 20’), policol 40 (‘laneth 40’); ésteres de fosfatos neutros: fosfato do éter PPG- 26 -cetílico, fosfato de DEA oleth-3. Também é possível utilizar agentes tensioactivos aniónicos, tais como os acilgutamatos: glutamato de TEAQ-cocoílo, glutamato sódico de lauroílo, glutamato sódico de sebo hidrogenado e glutamato sódico de cocoílo.Formulation # Encapsulation efficiency ± d.p. (n = 5) 1 59.1 ± 10.4 2 55.9 ± 1.5 B. Preparation of biphasic multilamellar lipid vesicles with a central lipophilic nuclear compartment Γ Formation of the anhydrous plastic prolipossomic gel The procedure used to make the gel anhydrous plastic is the same procedure as previously described. As stated above, this gel contains all of the lipid phase ingredients used to make the lipid bilayers of the multilamellar lipid vesicle. Such gel can be prepared in advance and stored in large quantities. 2. Formation of the central lipophilic nuclear compartment The central lipophilic nuclear compartment is made from an emulsion of a lipophilic substance in water, in the form of a droplet on the surface of which there is an agent which promotes the formation of liposomes, adapted to stabilize the forming component of the liposomes and to facilitate formation of the lipid vesicles around the droplet. The term "lipophilic substance" as used herein is meant to consist of solid or semi-solid, consistency enhancing lipophilic oils or agents which may be encapsulated in the liposomes. As examples of oils which have been successfully used for encapsulation purposes in the liposomes are those selected from: olive oil, macadamia nut oil, rice bran oil, pumpkin seed oil, apricot kernel oil, almond oil, hazelnut oil, rosewater berries seed oil, borage oil, tea plant oil, scrub oil, camellia oil, sweet almond oil, safflower oil, St. John's wort oil, lipodermol oil, pistachio oil, chia oil, kiwi seed oil, lesquerella oil, tiare oil, pomegranate oil, peanut oil, babassu oil, avocado oil, squalene, onion oil, pentaerythritol tetraisostearate, stearyl octanoate and canola oil, jojoba oil, peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, corn oil, walnut oil, avocado oil, pentaerythritol tetracaprylate / turkey balsam and of clove and eugenol. Oil-based plant extracts have also been successfully incorporated into the liposomes, for example, selected from among the consomme, chamomile, kola nut, marigold, birch, gingko biloga, hamamel, willow, guarana, arnica, eucalyptus, queen of the meadows, rosemary, phyt 'Iod, coffee, mate, tea and ivy. As regards the lipophilic consistency-enhancing solid / semi-solid ingredients it is mentioned that they may be selected from waxes, fatty alcohols, fatty acid esters, glyceryl stearate, petrolatum or combinations thereof. Specific examples of preferred strength enhancing agents include those selected from beeswax, glyceryl tribeenate, glyceryl stearate, stearyl heptanoate, stearyl palmitate, cetyl alcohol, stearyl alcohol, myristyl myristate, behenyl erucate and cetyl palmitate. The term "liposome-forming agent" as used herein is meant to denote compounds which may be used to stabilize the liposome-forming component and to facilitate formation of lipid vesicles around the droplets. The obvious choice is surfactants. The surfactant used to coat oil droplets or solid / semi-solid lipophilic ingredients enhancing consistency is important for successful encapsulation of a lipophilic core within multilamellar lipid vesicles. Approximately 30 different types of surfactants have been studied and identified and there is a family of surfactants which allows the most acceptable results to be obtained. This type of surfactant is a primary cationic emulsifier. The most preferred surfactant is the lignol-amidopropyl PG-phosphate product of dimonium chloride. This substance is considered to be a synthetic phospholipid complex. This surfactant is available from Mona Industries Inc., Patterson, New Jersey under the trademark 'PHOSPHOLIPID EFA', hereinafter abbreviated as PEFA. Another two members of this family, also from Mona Industries, are the stereamidopropyl PG-phosphate derivatives of dimonium chloride under the trademark 'PHOSPHOLIPID SV' and the substance cocamidopropyl PG-phosphate of dimonium chloride under the trademark 'PHOSPHOLIPID PTC any of which is acceptable but PEFA is preferred. It is also possible to use non-tonics or amphoteric surfactants, such as naturally occurring emulsifying agents: PEG-60 almond glycerides, diethanolamine with avocado oil, ethoxylated jojoba oil (jojoba acid with PEG-40 and jojoba alcohol with PEG-40); polyoxyethylene (polyoxyethylene) (20) sorbitan monooleate, polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate; lanolin derivatives: polyol 20 ('laneth 20'), polyol 40 ('laneth 40'); neutral phosphate esters: PPG-26-ethyl ether phosphate, DEA oleth-3 phosphate. It is also possible to use anionic surfactants, such as the acylgutamates: TEAQ-cocoyl glutamate, sodium lauroyl glutamate, sodium hydrogenated tallow glutamate and sodium cocoyl glutamate.

Ao fazer a preparação da emulsão da substância lipofílica em água, incorpora-se todos os ingredientes hidrofílicos na fase aquosa da emulsão. Dissolve-se o agente tensioactivo em água e junta-se todos os outros ingredientes de natureza hidrofílica. Uma vez preparada a fase aquosa da emulsão, acrescenta-se à água o óleo e/ou os ingredientes lipofílicos sólidos/semi-sólidos numa homogeneizadora durante um período variável entre 5 e 30 minutos para se obter gotículas com um tamanho relativamente pequeno. O tamanho preferido para as gotículas varia entre 0,1 pm e 1 pm. O produto liquefeito da fase lipídica é então aquecido e junta-se-lhe a emulsão da substância lipofílica em água e depois mexe-se vigorosamente quer por mistura centrífuga a alta velocidade quer utilizando uma misturadora de pás, consoante o tamanho do produto. O procedimento de formulação descrito supra pode ser adaptado facilmente ao fabrico em grande escala. O método da misturadora de pás pode ser transposto directamente para uma produção em maior escala, aumentando geometricamente o tamanho do vaso e o diâmetro da misturadora de pás. No entanto, à medida que for aumentando o tamanho do vaso, a forma preferida de resolver este problema consiste numa combinação de misturadoras tais como uma misturadora de alta velocidade com uma misturadora de pás e um mecanismo de agitação de varrimento superficial. Numa operação em grande escala, bombeia-se a emulsão da substância lipofílica em água de um primeiro depósito para um segundo depósito onde está contido o gel prolipossómico plástico anidro à temperatura necessária e mistura-se bem. Os tipos de compostos que podem ser encapsulados nas VML bifásicas são, sem que isso 27 constitua qualquer limitação, seleccionados entre prostaglandinas, agentes anestésicos locais, proteínas e péptidos, agentes antivirais, vitaminas, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-fúngicos, corticosteróides, extractos de plantas e aminoácidos. Como exemplos específicos refere-se as substâncias seleccionadas entre PGE), tetracaína, lidocaína, etidocaína, interferão a, interferão γ, adenina^-D-arabinofúranósido (Ara-A), 5-metoximetil-2’-desoxiuridina (MMUdR), vitamina A, vitamina C, vitamina E, provitamina B5, azuleno, alantoína, a--bisabolol e L-camitina. 3° Características das vesículas lipídicas multilamelares bifásicas que possuem um núcleo lipofilico centralIn preparing the emulsion of the lipophilic substance in water, all hydrophilic ingredients are incorporated into the aqueous phase of the emulsion. The surfactant is dissolved in water and all other ingredients of hydrophilic nature are added together. Once the aqueous phase of the emulsion is prepared, the oil and / or solid / semi-solid lipophilic ingredients are added to the water in a homogenizer for a period varying from 5 to 30 minutes to obtain droplets of a relatively small size. The preferred droplet size ranges from 0.1 Âμm to 1 Âμm. The liquefied product of the lipid phase is then heated and the emulsion of the lipophilic substance is added in water and then stirred vigorously either by centrifugal mixing at high speed or using a blade mixer, depending on the size of the product. The formulation procedure described above can easily be adapted to large-scale manufacture. The blender mixer method can be transposed directly into a larger scale production, geometrically increasing the size of the vessel and the diameter of the blender mixer. However, as vessel size increases, the preferred way of solving this problem is a combination of mixers such as a high speed mixer with a blade mixer and a surface scanning agitator. In a large-scale operation, the emulsion of the lipophilic substance is pumped in water from a first reservoir to a second reservoir where the anhydrous plastic prolipossomic gel is contained at the required temperature and mixed well. The types of compounds that can be encapsulated in the biphasic MLVs are, without limitation, selected from prostaglandins, local anesthetics, proteins and peptides, antiviral agents, vitamins, anti-inflammatory agents, antifungal agents, corticosteroids, plant extracts and amino acids. Specific examples include substances selected from PGE), tetracaine, lidocaine, etidocaine, interferon Î ±, interferon γ, adenine Î²-D-arabinofuranoside (Ara-A), 5-methoxymethyl-2'-deoxyuridine (MMUdR), vitamin A, vitamin C, vitamin E, provitamin B5, azulene, allantoin, a-bisabolol and L-camitine. 3 ° Characteristics of biphasic multilamellar lipid vesicles having a central lipophilic nucleus

Com este tipo de vesículas lipídicas multilamelares é possível a encapsulação e a co--encapsulação de ingredientes activos com diferentes propriedades físico-químicas, quer sejam hidrofílicos quer sejam lipofílicos. As figuras 3 e 4 ilustram de forma esquemática as estruturas das vesículas lipídicas multilamelares que possuem um compartimento nuclear lipofilico central. Conforme se pode observar na figura 3, a vesícula multilamelar, genericamente identificada pelo número 10 de referência, é constituída por um conjunto de bicamadas lipossómicas 12, 14 e 16 afastadas entre si para definirem um conjunto de compartimentos periféricos 13 e 15 de solução aquosa. A bicamada lipídica que define o círculo menor 18 forma um espaço interior 19 que constitui 0 compartimento nuclear central. No caso de se utilizar uma gotícula de óleo, o agente tensioactivo actua no sentido de recobrir a superfície da gotícula e de a estabilizar para efeitos de encapsulação por uma bicamada lipídica. A seguir à primeira encapsulação, as camadas restantes, uma vez encapsuladas, irão constituir os compartimentos periféricos da solução aquosa. Assim sendo, é importante que o tamanho das gotículas seja 28 bastante pequeno para que possam ser incorporadas no núcleo central da vesícula lipídica multilamelar.With this type of multilamellar lipid vesicles it is possible to encapsulate and co-encapsulate active ingredients with different physicochemical properties, whether hydrophilic or lipophilic. Figures 3 and 4 schematically illustrate the structures of multilamellar lipid vesicles having a central lipophilic nuclear compartment. As can be seen in Figure 3, the multilamellar vesicle, generally identified by reference numeral 10, is comprised of a set of liposomal bilayers 12, 14 and 16 spaced apart to define a set of peripheral compartments 13 and 15 of aqueous solution. The lipid bilayer defining the smaller circle 18 forms an inner space 19 constituting the central nuclear compartment. In case an oil droplet is used, the surfactant acts to cover the surface of the droplet and to stabilize it for the purposes of encapsulation by a lipid bilayer. Following the first encapsulation, the remaining layers, once encapsulated, will constitute the peripheral compartments of the aqueous solution. Thus, it is important that the droplet size is rather small so that they can be incorporated into the central nucleus of the multilamellar lipid vesicle.

De igual modo, no caso de se utilizar um intensifícador de consistência lipofílico sólido/semi-sólido, forma-se um compartimento nuclear lipofílico central, conforme ilustrado na figura 4. Nesta figura, a vesícula multilamelar, genericamente identificada pelo número 20 de referência, compreende um conjunto de bicamadas lipossómicas 22, 24 e 26 entre as quais são formados os compartimentos periféricos 21 e 23 da solução aquosa. A bicamada lipídica 28, a que corresponde a circunferência menor, forma o compartimento nuclear lipofílico central 30. O compartimento nuclear lipofílico central 30 contém intensificadores de consistência sólidos ou semi-sólidos que ficam aprisionados dentro da vesícula lipídica multilamelar, tal como anteriormente descrito, ou seja, mediante a utilização de um agente tensioactivo conveniente.Likewise, in the case where a solid / semi-solid lipophilic consistency intensifier is used, a central lipophilic core compartment is formed, as shown in Figure 4. In this figure, the multilamellar vesicle, generally identified by the reference numeral 20, comprises a set of liposomal bilayers 22, 24 and 26 between which the peripheral compartments 21 and 23 of the aqueous solution are formed. The lipid bilayer 28, which corresponds to the smaller circumference, forms the central lipophilic nuclear compartment 30. The central lipophilic nuclear compartment 30 contains solid or semi-solid consistency enhancers which become entrapped within the multilamellar lipid vesicle as previously described, or either by the use of a suitable surfactant.

Com a vesícula lipídica multilamelar da presente invenção as gotículas de óleo, contendo compostos lipofílicos solubilizados e biologicamente activos ou extractos oleosos de plantas, podem ser administradas através da encapsulação de lipossomas. Além do mais, a possibilidade de encapsulação de multicompartimentos permite que a libertação do fármaco possa decorrer durante um intervalo de tempo prolongado. Por outro lado, a encapsulação de intensificadores de consistência lipofílicos sólido/semi-sólidos dentro do compartimento nuclear lipofílico central confere uma maior viscosidade à composição lipossómica final. Neste caso, é possível evitar a adição de agentes para aumentar a viscosidade à preparação lipossómica final.With the multilamellar lipid vesicle of the present invention the oil droplets containing solubilized and biologically active lipophilic compounds or oily plant extracts can be administered through the encapsulation of liposomes. Moreover, the possibility of multi-compartment encapsulation allows the release of the drug to take place over an extended period of time. On the other hand, the encapsulation of solid / semi-solid lipophilic consistency enhancers within the central lipophilic core confers a higher viscosity to the final liposomal composition. In this case, it is possible to avoid adding agents to increase the viscosity to the final liposomal preparation.

Acima de tudo, a preparação de vesículas lipídicas multilamelares com um compartimento nuclear lipofílico central proporciona uma composição lipossómica uniforme e fisicamente estável. A composição tem uma viscosidade que é adequada para administração tópica e pode ser facilmente produzida em grande escala. 29Above all, the preparation of multilamellar lipid vesicles with a central lipophilic nuclear compartment provides a uniform and physically stable liposomal composition. The composition has a viscosity which is suitable for topical administration and can be easily produced on a large scale. 29

DESCRIÇÃO DOS CASOS PREFERIDOS A. Encapsulaçào de prostaglandinas e análogos de prostaglandinas em vesículas Iipídicas multilamelaresDESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS A. Encapsulation of prostaglandins and prostaglandin analogs in multilamellar lipid vesicles

As prostaglandinas e os análogos de prostaglandinas encapsulados em lipossomas podem ser benéficos em inúmeros domínios terapêuticos. O quadro subsequente agrupa, de forma resumida, a utilidade das prostaglandinas encapsuladas em lipossomas. A vantagem da administração destas prostaglandinas encapsuladas em lipossomas é o facto de ser uma administração mais eficiente, localizada e dirigida para os tecidos visados, isto é, a pele, as membranas mucosas e os tecidos envolventes. O sistema lipossómico pode ser concebido de forma a constituir um implante de libertação lenta no local visado por dentro da pele ou da membrana mucosa ou para localizar o fármaco num olho por bioadesão e para permitir uma libertação lenta ou para favorecer o fluxo transdérmico do fármaco encapsulado.Prostaglandins and prostaglandin analogs encapsulated in liposomes may be beneficial in a number of therapeutic domains. The following table briefly summarizes the usefulness of prostaglandins encapsulated in liposomes. The advantage of administering these prostaglandins encapsulated in liposomes is that it is a more efficient, localized and targeted delivery to the target tissues, i.e. the skin, mucous membranes and surrounding tissues. The liposomal system may be designed so as to constitute a slow release implant at the target site within the skin or mucosal membrane or to locate the drug in an eye by bioadhesion and to allow slow release or to promote the transdermal flux of the encapsulated drug .

Prostagl andina Efeito e utilização PGE1 Vasodilatação: doenças vasculares periféricas, úlceras isquémicas dos membros inferiores, cicatrização de ferimentos, doenças diversas da pele, tais como psoríase e dermatite atópica PGE2 lesão cervical ou indução do parto por administração local dentro do canal cervical ou por via intravaginal; vasodilatação: doenças vasculares periféricas PGA e série J agentes anticancerosos e antivirais FCP (o mesmo que PGF) e derivados hipotensão ocular: glaucoma 30Prostagl andine Effect and use PGE1 Vasodilation: peripheral vascular diseases, ischemic ulceration of the lower limbs, wound healing, various skin diseases such as psoriasis and atopic dermatitis PGE2 cervical injury or induction of labor by local administration within the cervical canal or via intravaginal; vasodilation: peripheral vascular diseases PGA and J series anticancer and antiviral agents FCP (the same as PGF) and ocular hypotension derivatives: glaucoma 30

Al. Encapsulação da PGEi em vesículas lipídicas multilamelares para a preparação da composição Upossómica utilizada no tratamento de disfunções erécteisAl. Encapsulation of PGE 1 in multilamellar lipid vesicles for the preparation of the Upossom composition used in the treatment of erectile dysfunction

Para superar os problemas associados à administração de PGEi por injecção desenvolveu-se uma nova forma de dosagem que pode ser aplicada por via tópica. Incorpora--se a PGEi dentro de lipossomas, utilizando para tal o método da presente invenção. Isto vai facilitar a sua penetração através da pele de um pénis e fornece uma concentração de fármaco clinicamente útil ao interior do corpo cavernoso. A encapsulação Upossómica aumenta a Ubertação da PGE! encapsulada através da pele do pénis e simultaneamente protege o fármaco no interior da pele contra o metabolismo prematuro, antes de chegar ao local pretendido. Tais propriedades fazem com que os Upossomas constituam um sistema adequado para a administração de PGEi no tratamento da impotência. A PGEi é um fármaco solúvel nos lípidos. Assim sendo, este fármaco pode ser encapsulado em bicamadas Upídicas e/ou no núcleo lipofUico central dos Upossomas. A eficiência da encapsulação da PGEi dentro dos Upossomas é manipulada fazendo variar a composição Upídica, o quociente entre lípidos/fármaco, o pH e a concentração de outros excipientes. Para a concepção de uma preparação óptima de PGEi Upossómica para administração dérmica ou transdérmica são utilizados agentes intensificadores de penetração/agentes de Ubertação específicos compatíveis com os Upossomas. 1° Encapsulação da PGE^ em vesículas Upídicas multilamelares com um compartimento nuclear aquoso centralTo overcome the problems associated with administration of PGE1 by injection a novel dosage form has been developed which can be applied topically. PGE1 is incorporated into liposomes using the method of the present invention. This will facilitate its penetration through the skin of a penis and provides a concentration of clinically useful drug within the cavernous body. Upossic encapsulation increases PBE Ubertation! encapsulated through the skin of the penis and simultaneously protects the drug inside the skin against premature metabolism before reaching the intended site. Such properties make the Upossomas a suitable system for the administration of PGE1 in the treatment of impotence. PGE 1 is a lipid-soluble drug. Thus, this drug can be encapsulated in Upidic bilayers and / or the central lipophilic nucleus of the Upossomas. The efficiency of encapsulation of PGE1 within the Upossomes is manipulated by varying the Atyred composition, lipid / drug ratio, pH and concentration of other excipients. For the design of an optimal preparation of Psoi Upossom for dermal or transdermal administration specific Penetration Enhancement Agents / Uberting Agents compatible with the Upossomes are used. 1 ° Encapsulation of PGE 2 in multilamellar uplifted vesicles with a central aqueous nuclear compartment

Efectuou-se a preparação de Upossomas multilamelares conforme a seguir se descreve. Pesou-se para dentro de um frasco de vidro ou de uma proveta os ingredientes lipídicos e o 31 ; :?/ solvente hidrofílico propileno-glicol e liquefez-se a mistura a uma temperatura entre 65°C e 75°C por aquecimento intermitente em banho-maria. Preparou-se os ingredientes hidrofílicos separadamente sob a forma de uma solução aquosa. A fase lipídica liquefeita e a solução em fase aquosa foram guardadas respectivamente às temperaturas de -20°C e 4°C, até virem a ser necessárias. Guardou-se o fármaco PGEt sob a forma de uma solução etanólica a -20°C.Multilamellar Upossomas were prepared as described below. The lipid ingredients were weighed into a glass vial or a beaker; : hydrophilic solvent propylene glycol and the mixture was liquefied at 65-75 ° C by intermittent warming in a water bath. The hydrophilic ingredients were separately prepared as an aqueous solution. The liquefied lipid phase and the aqueous phase solution were respectively stored at -20Â ° C and 4Â ° C until needed. The drug PGEt was stored as an ethanolic solution at -20 ° C.

Antes de se fazer a formulação lipossómica evaporou-se o solvente etanol sob uma atmosfera de azoto, juntou-se a fase lipídica liquefeita ao fármaco PGEi no estado sólido e misturou-se tudo homogeneamente por aquecimento intermitente e agitação vigorosa. A fase lipídica liquefeita que continha o fármaco PGEi e a fase aquosa foram então aquecidas a 55°C e juntou-se a fase aquosa à fase lipídica liquefeita e misturou-se vigorosamente por um processo de mistura em centrífuga ou com uma agitadora de pás, dependendo isso do tamanho do produto.Before the liposomal formulation was made, the solvent was evaporated ethanol under a nitrogen atmosphere, the liquid phase liquefied to the drug PGE1 was added in the solid state and all mixed homogeneously by intermittent heating and vigorous stirring. The liquefied lipid phase containing the drug PGE1 and the aqueous phase were then heated to 55Â ° C and the aqueous phase was added to the liquefied lipid phase and vigorously mixed by centrifugal mixing or with a paddle stirrer, depending on the size of the product.

No quadro 3 indica-se a composição e a eficiência de encapsulação das formulações seleccionados de PGEi em lipossomas, estudadas para administração transdérmica (formulações η- 1, 2. 5 e 6-0,1%) e para administração dérmica (formulações n~ 3 e 4). As formulações lipossómicas para a administração transdérmica de PGE] contêm fosfolípidos saturados e/ou insaturados, em especial seleccionados entre fosfatidil-colina, lisofosfatidil-colina, fosfatidil--serina, fosfatidil-etanolamina e glicolípidos. Os lipossomas também contêm colesterol, ácidos graxos de cadeia longa saturados (v.g. o ácido esteárico) para melhorar a estabilidade física e o aspecto do produto. Os fosfolípidos são combinados com um agente para aumentar a penetração, por exemplo, monoIauroD-lisina e/ou salicilato de metilo, para se conseguir obter predominantemente um potencial de administração transdérmica.Table 3 shows the composition and the encapsulation efficiency of the selected formulations of PGE 1 in liposomes, studied for transdermal administration (formulations η -1, 2.5 and 6-0.1%) and for dermal administration (formulations no. 3 and 4). Liposomal formulations for the transdermal administration of PGE1 contain saturated and / or unsaturated phospholipids, especially selected from phosphatidylcholine, lysophosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidyl ethanolamine and glycolipids. Liposomes also contain cholesterol, saturated long chain fatty acids (e.g., stearic acid) to improve the physical stability and appearance of the product. The phospholipids are combined with a penetration enhancing agent, for example mono-D-lysine and / or methyl salicylate, to achieve predominantly a potential for transdermal administration.

As formulações lipossómicas para a administração dérmica de PGEi podem conter fosfolípidos saturados e/ou insaturados, em especial seleccionados entre fosfatidil-colina. lisofosfatidil-colina, fosfatidil-serina, fosfatidil-etanolamina, glicolípidos e ceramidas. Os lipossomas também podem conter colesterol. Para se conseguir obter predominantemente uma administração dérmica, junta-se agentes de libertação cutânea, tais como os ácidos graxos insaturados (ácido oleico) ou ácidos graxos de cadeia curta (ácido láurico). QUADRO 3Liposomal formulations for the dermal administration of PGE1 may contain saturated and / or unsaturated phospholipids, especially selected from phosphatidylcholine. lysophosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidyl ethanolamine, glycolipids and ceramides. Liposomes may also contain cholesterol. To achieve predominantly dermal administration, cutaneous release agents, such as unsaturated fatty acids (oleic acid) or short chain fatty acids (lauric acid), are added. TABLE 3

Formulações de PGE] lipossómicas FORMULAÇÃO N° 1 ‘Phospholípon 90H’ 15% Colesterol 2% Palmitato de ascorbilo 0,05% 4 Phospholípon 80’ 1% Prostaglandina Ei 0,05% Propileno-glicol 7% Fase F aquosa q.s. Eficiência da encapsulação: 16% FORMULAÇÃO N° 2 ‘Phospholípon 90H’ 15% Colesterol 1,5% Palmitato de ascorbilo 0,05% Propileno-glicol 1% Monolauroíl-lisina 1% Glicerol 5% Ácido esteárico 0,5% ‘Centrolex P’ 0,3% Prostaglandina Ei 0,05% Fase 16 aquosa q.s.Formulations of liposomal PGE] FORMULATION No. 1 'Phospholipine 90H' 15% Cholesterol 2% Ascorbyl palmitate 0.05% Phospholip 80 '1% Prostaglandin E1 0.05% Propylene Glycol 7% Aqueous Phase F q.s. Efficacy of the encapsulation: 16% Formulation No. 2 Phospholipine 90H 15% Cholesterol 1.5% Ascorbyl palmitate 0.05% Propylene glycol 1% Monolauroyl lysine 1% Glycerol 5% Stearic acid 0.5% Centrolex P 0.3% Prostaglandin E1 0.05% Phase 16 aqueous qs

Eficiência da encapsulação: 81% 33 FORMULAÇÃO N° 3 ‘Phospholipon 90H’ 15% Colesterol 1,5% Palmitato de ascorbilo 0,05% Propileno-glicol 7% Monolauroíl-lisina 1% Glicerol 5% Acido láurico 0,5% ‘Centrolex P’ 0,3% Prostaglandina Et 0,05% Fase 16 aquosa q.s. Eficiência da encapsulação: 76% FORMULAÇÃO N° 4 ‘Phospholipon 90ΡΓ 15% Colesterol 1,5% Palmitato de ascorbilo 0.05% Propileno-glicol 7% Monolauroíl-lisina 1% Glicerol 5% Ácido oleico 1% ‘Centrolex P’ 0,3% Prostaglandina E! 0,05% Fase 16 aquosa q.s. Eficiência da encapsulação: 67% FORMULAÇÃO N° 5 ‘Phospholipon 90ΕΓ 15% Colesterol 1,5% Palmitato de ascorbilo 0,05%Encapsulation Efficiency: 81% Formulation No. 3 'Phospholipon 90H' 15% Cholesterol 1.5% Ascorbyl Palmitate 0.05% Propylene Glycol 7% Monolauroyl Lysine 1% Glycerol 5% Lauric Acid 0.5% Centrolex P '0.3% Prostaglandin Et 0.05% Phase 16 aqueous qs Encapsulation Efficiency: 76% Formulation No. 4 Phospholipon 90 15% Cholesterol 1.5% Ascorbyl palmitate 0.05% Propylene Glycol 7% Monolauroyl lysine 1% Glycerol 5% Oleic acid 1% Centrolex P 0.3% Prostaglandin E! 0.05% Aqueous phase 16 q.s. Efficiency of encapsulation: 67% FORMULATION No. 5 'Phospholipon 90EU 15% Cholesterol 1.5% Ascorbyl palmitate 0.05%

Propileno-glicol 7% Monolauroíl-lisina 1% Glicerol 5% Acido esteárico 0,5% ‘Centrolex P’ 0,3% Salicilato de metilo 2% Prostaglandina E| 0,05% Fase 16 aquosa q.s. Eficiência da encapsulação: 33% FORMULAÇÃO N° 6 - 0,1% ‘Phospholipon 90H’ 15% Colesterol 1,5% Palmitato de ascorbilo 0,05% Propileno-glicol 7% Monolauroíl-lisina 1% Glicerol 5% Ácido esteárico 0,5% ‘Centrolex P’ 0,3% Salicilato de metilo 2% Prostaglandina Et 0,1% Fase 16 aquosa q.s. FORMULAÇÃO N° 7 ‘Phospholipon 90H' 15% Colesterol 1,5% Palmitato de ascorbilo 0,05% Propileno-glicol 7,0% Monolauroíl-lisina 1,0% Glicerol 5,0% 35 Ácido esteárico 0,5% ‘Centrolex P’ 0,3% Prostaglandina Ei 0,05% Tioglicolato de cálcio 1,0% Fase 16 aquosa q.s. até 100% FORMULAÇÃO CONVENCIONAL (NÃO LIPOSSÓMICA)Propylene glycol 7% Monolauroyl lysine 1% Glycerol 5% Stearic acid 0.5% 'Centrolex P' 0.3% Methyl salicylate 2% Prostaglandin E | 0.05% Aqueous phase 16 q.s. Efficacy of the encapsulation: 33% Formulation No. 6 - 0.1% Phospholipon 90H 15% Cholesterol 1.5% Ascorbyl palmitate 0.05% Propylene glycol 7% Monolauroyl lysine 1% Glycerol 5% Stearic acid 0, 5% Centrolex P 0.3% Methyl salicylate 2% Prostaglandin Et 0.1% Phase 16 aqueous qs Formulation No. 7 Phospholipon 90H 15% Cholesterol 1.5% Ascorbyl Palmitate 0.05% Propylene Glycol 7.0% Monolauroyl Lysine 1.0% Glycerol 5.0% 35 Stearic Acid 0.5% Centrolex P '0.3% Prostaglandin Ei 0.05% Calcium thioglycolate 1.0% Phase 16 aqueous qs up to 100% CONVENTIONAL FORMULATION (NON-LIPOSOMIC)

Prostaglandina Ei 0,05% Base dérmica q.s. FASE F AQUOSA FASE 16 AQUOSA NaCl 0,9% NaCl 0,9% Etanol 10% Metil-parabeno 0,1% dd, H20 q.s. Propil-parabeno 0,02% pH 5,5 Trietanolamina 0,5% dd, H20 q.s. pH 8,3 2. Ensaio in vitro sobre a absorção percutânea de PGE^Prostaglandin Ei 0.05% Dermal base q.s. PHASE F AQUOSA PHASE 16 AQUOSA NaCl 0.9% NaCl 0.9% Ethanol 10% Methyl paraben 0.1% dd, H20 q.s. Propyl paraben 0.02% pH 5.5 Triethanolamine 0.5% dd, H20 q.s. pH 8.3 2. In vitro assay on the percutaneous absorption of PGE2 +

Investigou-se a velocidade de difusão da PGEi a partir de preparações lipossómicas, através da espessura total do prepúcio de adultos, obtido por cirurgia de circuncisão, utilizando no processo células de difusão “Teflon® Flow-Thru” (Crown Glass Co. Inc. Somerville, N.J.) que possuem uma superfície de difusão de 0,32 cm‘. As células de difusão são concebidas de tal modo que seja possível bombear continuamente fluido através delas para se manter as condições de imersão. Utilizou-se como fluido de perfusão uma solução de tampão fosfato (Na2HP04 7,5 mM, NaCl 141,2 mM) isotónica com os fluidos corporais e com um valor de pH igual a 7,2.The diffusion rate of PGE1 from liposomal preparations was determined through the total thickness of the adult foreskin obtained by circumcision surgery using Teflon® Flow-Thru diffusion cells (Crown Glass Co. Inc. Somerville, NJ) having a diffusion surface of 0.32 cm2. The diffusion cells are designed such that it is possible to continuously pump fluid through them to maintain immersion conditions. A solution of phosphate buffer (7.5 mM Na 2 HPO 4, 141.2 mM NaCl) was used as the infusion fluid with the body fluids and with a pH value of 7.2.

Efectuou-se a montagem das células de difusão num calefactor de células de difusão de modelo ‘PosiBloc ’ (Crown Glass Co. Inc. Somerville, N.J.) que se manteve a 32°C por meio de água quente circulante. O caudal foi de 3 mL por hora. Cada experiência teve a duração de 24 horas e foi realizada de forma contínua. No início de cada experiência aplicou-se em cada célula uma preparação lipossómica (20 mg) que continha 10 pg de PGE( e o agente de rastreio 3H-prostaglandma Ei. Considera-se que esta quantidade é grosso modo equivalente à dose por unidade de superfície da preparação (1,5 g) que foi aplicada sobre o tronco do pénis nas experiências clínicas. Para cada experiência foram realizadas pelo menos três réplicas. Determinou-se a quantidade de PGEi em cada fracção por contagem de cintilação em meio líquido.The diffusion cells were mounted on a PosiBloc diffusion cell heater (Crown Glass Co. Inc. Somerville, N.J.) which was maintained at 32 ° C by means of circulating hot water. The flow rate was 3 mL per hour. Each experiment lasted 24 hours and was carried out continuously. At the beginning of each experiment a liposomal preparation (20 mg) containing 10 μg PGE (and the 3H-prostaglandin E1 tracer) was applied to each cell. This amount is considered to be roughly equivalent to the dose per unit of The amount of PGE 1 in each fraction was determined by liquid scintillation counting. The amount of PGE1 in each fraction was determined by liquid scintillation counting.

Efectuou-se o cálculo dos parâmetros de penetração da pele a partir da parte estacionária das curvas cumulativas de fluxo, conforme adiante se descreve.The parameters of skin penetration were calculated from the stationary part of the cumulative flow curves, as described below.

a) Coeficiente de Permeabilidade, P=J/AC em que J é a inclinação em regime estacionário e AC é a concentração da PGEi na câmara dadora,(a) Coefficient of Permeability, P = J / AC where J is steady-state slope and AC is the concentration of PGE1 in the donor chamber,

b) Coeficiente de Difusão, D=h2/6L em que h é a espessura média da amostra de prepúcio, que foi de 1 mm, e L é o tempo de demora em segundos.(b) Diffusion Coefficient, D = h2 / 6L where h is the mean thickness of the foreskin sample, which was 1 mm, and L is the delay time in seconds.

Para o tratamento da impotência é necessário administrar 5 a 40 pg de PGEi (a quantidade equivalente administrada durante a injecção intracavemosa) por via transdérmica. Esta quantidade tem de ser administrada num curto intervalo de tempo (idealmente em menos de 1 hora) para ser útil em termos práticos. Os resultados obtidos comprovam que a PGEt pode ser administrada por via transdérmica em formulações lipossómicas adequadas. 37 O quadro 4 agrupa resultados da administração percutânea de PGEi in vitro através do prepúcio de seres humanos. As formulações n~ 1,2,5 e 6-0,1% ilustram o método de formulação para o desenvolvimento de um produto transdérmico. QUADRO 4For the treatment of impotence it is necessary to administer 5 to 40 pg of PGE 1 (the equivalent amount administered during the intracavemosal injection) transdermally. This amount has to be administered in a short time (ideally in less than 1 hour) to be useful in practical terms. The results obtained prove that PGE1 can be administered transdermally in suitable liposomal formulations. Table 4 groups results of percutaneous PGE1 administration in vitro through the foreskin of humans. Formulations No. 1,2,5 and 6-0,1% illustrate the method of formulation for the development of a transdermal product. TABLE 4

Administração percutânea de PGE] a partir de formulações lipossómicas em 24 horasPercutaneous administration of PGE] from liposomal formulations in 24 hours

Formulação n° pg/cm2 ± D.P. % do total aplicado ± D.P. 1 0,96 ±0,87 2,14 ± 1,95 (n=3) 2 1,39 ±1,56 3,87 ± 4,34 (n=8) 5 3,51 ±2,80 9,93 ± 7,93 (n=6) 6-0,1% 6,73 ±3,97 8,74 ±5,15 (n=6) j 0,06 ± 0,04 0,17 ±0,12 (n=3) 4 0,34 ± 0,55 0,89 ± 1,43 (n=3) Não lipossómica 0,38 ±0,61 1,03 ± 1,64 (n=3) A concentração inicial de fármaco utilizada nestas formulações foi de 0,05%. A concentração eficaz de fármaco nestas formulações pode variar entre 0,01% e 5%. Conforme ilustrado nas formulações n° 5 e 6 - 0,1%, o aumento da concentração do fármaco para 0,1% duplicou a quantidade de PGE] administrada por via transdérmica.Formulation No. pg / cm 2 ± SD% of total applied ± SD 1 0.96 ± 0.87 2.14 ± 1.95 (n = 3) 2 1.39 ± 1.56 3.87 ± 4.34 ( n = 8) 5 3.51 ± 2.80 9.93 ± 7.93 (n = 6) 6-0.1% 6.73 ± 3.97 8.74 ± 5.15 (n = 6) 0.06 ± 0.04 0.17 ± 0.12 (n = 3) 4 0.34 ± 0.55 0.89 ± 1.43 (n = 3) Non-liposomal 0.38 ± 0.61 1, 03 ± 1.64 (n = 3) The initial drug concentration used in these formulations was 0.05%. The effective concentration of drug in these formulations may range from 0.01% to 5%. As shown in formulations 5 and 6 - 0.1%, the increase in drug concentration to 0.1% doubled the amount of PGE 2 administered transdermally.

No quadro 5 estão indicados os parâmetros de absorção percutânea. Os valores de fluxo obtidos para os produtos estão bem correlacionados com a sua eficácia in vivo avaliada por ultrassonografia por efeito Doppler. Os valores de fluxo mais elevados correspondem a uma potência mais elevada nos pacientes. As formulações n- 3 e 4 revelam possuir um fraco potencial de administração transdérmica. 38 QUADRO 5Table 5 shows the percutaneous absorption parameters. The flux values obtained for the products are well correlated with their in vivo efficacy assessed by Doppler ultrasonography. Higher flow values correspond to higher potency in patients. The formulations n-3 and 4 are shown to have a weak potential for transdermal administration. 38 TABLE 5

Parâmetros de penetração na pele irt vitro FORMULAÇÃO N° TEMPO DE DEMORA (h) FLUXO ESTACIONÁRIO (J)2 [pg/cm2/h] COEFICIENTE DE DIFUSÃO (D) [cm2/szx 10^ COEFICIENTE DE PERMEABILIDADE (P) [αη/h x I04] 1 8,5 0,059 5,50 U8 2 7,9 0,083 5,86 1,66 5 7,7 0,191 6,01 3,82 6-0,1% 9,5 0,427 4,87 4,27 -> :> 10,6 0,004 4,37 0,02 4 12,8 0,029 3,62 0,58 Não lipossómica 15,1 0,042 3,07 0,84 O quadro 6 indica a intensidade da administração de PGEi com diversas formulações. As formulações n- 3 e 4 são exemplos de formulações para se conseguir predominantemente uma administração cutânea. QUADRO 6In vitro skin penetration parameters (n) DEPTH TIME (h) STAGE FLOW (J) 2 [pg / cm2 / h] DIFFUSION COEFFICIENT (D) [cm2 / szx 10 ^ PERMEABILITY COEFFICIENT (P) hx I04] 1 8.5 0.059 5.50 U8 2 7.9 0.083 5.86 1.66 5 7.7 0.191 6.01 3.82 6-0.1% 9.5 0.427 4.87 4.27 - > : > 10.6 0.004 4.37 0.02 4 12.8 0.029 3.62 0.58 Non-liposome 15.1 0.042 3.07 0.84 Table 6 indicates the intensity of administration of PGE1 with various formulations. Formulations Nos. 3 and 4 are examples of formulations to achieve predominantly dermal administration. TABLE 6

Administração cutânea de PG£} a partir de formulações lipossómicasCutaneous administration of PGI from liposomal formulations

Formulação Pele intacta Estrato córneo Epiderme + derme viáveis n° pg/cm2 %* pg/cm2 %* pg/cm2 %* 10 (n=3) 7,11+2.63 15,98±3,87 0,85+0,84 1,84+1,63 6,99+3,39 14,80±4,07 18 A (n=8) 4,15+2,79 11,97+7,99 0,23+0,15 0,74+0,48 3,83+2,72 11,16+8,57 29 (n=6) 4.96±2.15 14,18±6,32 0,32±0,20 0,93+0,66 4,27±3,21 12,11±8,88 29-01 (n=6) 20.2517,44 26,16+8,30 0,54±0,23 0,71±0,28 15,54±8,56 20,46+8,21 21 (n=3) 1,71±0,83 4,85±1,73 0,17±0,08 0,50+0,27 0,89+0,78 0,251±2,13 27 (n=3) 5,82±4,21 14,89±10,18 0,14+0,06 0,37+0,15 4.70±4,43 11,80+10,33 * % do total ap içado 39 O potencial de administração transdérmica comparativamente com o potencial de administração dérmica destas formulações é reflectido pelo quociente T/D (quadro 7) calculado a partir da quantidade média (pg) de fármaco absorvido por via transdérmica e a quantidade média (pg) de PGEi administrado por via cutânea (valor para toda a pele). QUADRO 7Formulation Intact skin Stratum corneum Epidermis + viable dermis No. pg / cm2% * pg / cm2% * pg / cm2% * 10 (n = 3) 7.11 + 2.63 15.98 ± 3.87 0.85 + 84 1.84 + 1.63 6.99 + 3.39 14.80 ± 4.07 18 A (n = 8) 4.15 + 2.79 11.97 + 7.99 0.23 + 0.15 0.74 + 0.48 3.83 + 2.72 11.16 + 8.57 29 (n = 6) 4.96 ± 2.15 14.18 ± 6.32 0.32 ± 0.20 0.93 + 0, 66 4,27 ± 3,21 12,11 ± 8,88 29-01 (n = 6) 20,2517,44 26,16 + 8,30 0,54 ± 0,23 0,71 ± 0,28 15,54 ± 8.56 20.46 + 8.21 21 (n = 3) 1.71 ± 0.83 4.85 ± 1.73 0.17 ± 0.08 0.50 + 0.27 0.89 + 0 , 78 0.251 ± 2.13 27 (n = 3) 5.82 ± 4.21 14.89 ± 10.18 0.14 ± 0.06 0.37 ± 0.15 4.70 ± 4.43 11.80+ The potential for transdermal administration compared to the dermal delivery potential of these formulations is reflected by the T / D quotient (table 7) calculated from the mean (pg) amount of drug absorbed transdermally and the mean (pg) amount of PGE 1 administered by the skin (value for the whole skin). TABLE 7

Quocientes entre administração transdérmica e dérmica para os produtos de PGEi lipossómicosQuotas between transdermal and dermal administration for liposomal PGE1 products

Formulação n° Quocientes de administração transdérmica/dérmica 1 0,135 2 0,335 5 0,708 6-0,1% 0,332 0,035 4 0,060 3. Estabilidade física dos produtos lipossómicosFormulation # Transdermal / dermal administration quotients 1 0.135 2 0.335 5 0.708 6-0.1% 0.332 0.035 4 0.060 3. Physical stability of liposomal products

Avaliou-se a estabilidade física das formulações lipossómicas por estimativa visual e microscópica imediatamente após a preparação e a intervalos semanais a seguir à armazenagem à temperatura ambiente ou a 4°C.The physical stability of the liposomal formulations was assessed by visual and microscopic estimation immediately after preparation and at weekly intervals following storage at room temperature or at 4 ° C.

As formulações lipossómicas eram fisicamente estáveis mesmo após um período prolongado de armazenagem à temperatura ambiente e a 4°C. As formulações mantiveram-se totalmente homogéneas sem nenhuns sinais macroscópicos de separação de fases. Ao microscópio óptico foram observados inúmeros lipossomas multilamelares de tamanhos variáveis e na sua maior parte de forma esférica. Não houve nenhum aumento dos produtos de fusão ou de agregação (indicadores de instabilidade dos lipossomas) durante a armazenagem. 40 4. Estabilidade da PGEi em formulações lipossómicasLiposomal formulations were physically stable even after a prolonged storage period at room temperature and at 4 ° C. The formulations remained completely homogeneous without any macroscopic phase separation signals. A number of multilamellar liposomes of varying sizes and mostly spherical in shape were observed in the optical microscope. There was no increase in the melting or aggregation products (indicators of liposome instability) during storage. 4. Stability of PGE1 in liposomal formulations

Analisou-se a estabilidade da PGEi por cromatografia de camada fina (CCF) e por métodos radiométricos.The stability of PGE1 was analyzed by thin layer chromatography (TLC) and by radiometric methods.

4.1. Ensaio por CCF4.1. Test by TLC

Avaliou-se a degradação da PGEi por meio de uma análise por CCF efectuada sobre as fracções das células de difusão e das formulações de PGEi lipossómicas (após armazenagem a 4°C durante 2 semanas). Juntou-se e liofilizou-se as fracções aquosas provenientes das experiências com as células de difusão. Extraiu-se a PGEi com metanol, filtrou-se através de um filtro ‘Millipore’ e concentrou-se antes da análise cromatográfica. A formulação de PGE) lipossómica foi diluída quer com metanol quer com dioxano antes da análise cromatográfica. Como fase móvel utilizou-se uma mistura de benzeno.dioxano.ácido acético (20:20:1 v/v), tendo sido utilizado como reagente corante etanol absoluto:4-metoxi-benzaldeido:ácido sulfúiico concentrado (20:20:2 v/v). A seguir à experiência cromatográfica deixou-se a placa secar, aspergiu-se com o reagente corante, deixou-se secar outra vez durante 15 minutos pelo menos e aqueceu-se na mufla a 85°C durante 10 minutos para que tivesse lugar uma revelação completa da cor. As manchas de PGEi apareceram com o aspecto de manchas castanho-escuras idênticas às de uma amostra padrão de PGEi cromatografada simultaneamente. 4.2. Ensaio radiométricoDegradation of PGE1 was assessed by TLC analysis on the diffusion cell fractions and liposomal PGE1 formulations (after storage at 4 ° C for 2 weeks). The aqueous fractions from the diffusion cell experiments were pooled and lyophilized. The PGE1 was extracted with methanol, filtered through a Millipore filter and concentrated prior to chromatographic analysis. The liposomal PGE formulation was diluted with either methanol or dioxane prior to chromatographic analysis. As the mobile phase a mixture of benzene.dioxane.acetic acid (20: 20: 1 v / v) was used, and absolute ethanol: 4-methoxy-benzaldehyde: concentrated sulfuric acid (20: 20: 2) v / v). Following the chromatographic experiment the plate was dried, sprinkled with the coloring reagent, allowed to dry again for at least 15 minutes, and heated in the oven at 85 ° C for 10 minutes for a development to take place full color. PGE1 spots appeared as dark brown spots identical to those of a standard chromatographed PGE1 sample at the same time. 4.2. Radiometric test

Realizou-se um estudo semiquantitativo dos cromatogramas de camada fina por contagem de cintilação em meio líquido das manchas de PGEi e do resto de cada cromatograma e exprimiu-se a concentração de PGEt em termos de uma percentagem do número total de unidades de contagem obtidas no cromatograma. 41A semiquantitative study of the thin layer chromatograms was performed by liquid scintillation counting of the PGE1 spots and the remainder of each chromatogram and the concentration of PGEt expressed as a percentage of the total number of counting units obtained in the chromatogram. 41

Identificou-se de forma positiva a PGEt nos cromatogramas de camada fina realizados com a formulação lipossómica de PGEi após a armazenagem durante 2 semanas em frigorífico. Com base num exame visual sobre a intensidade da revelação da cor e da largura de banda, é possível concluir que houve pouca degradação da PGEi ou mesmo nenhuma. 5. Eficiência de encapsulação e estudos de fiigas A encapsulação lipossómica da PGEi tem por finalidade aumentar a sua estabilidade e por isso, quanto maior for a eficiência da encapsulação tanto mais estável irá ficar o fármaco na formulação.PGE1 was positively identified in the thin layer chromatograms performed with the liposomal formulation of PGE1 after storage for 2 weeks in the refrigerator. Based on a visual examination of the intensity of color and bandwidth disclosure, it can be concluded that there was little degradation of PGE 1 or none at all. 5. Encapsulation Efficiency and Fixation Studies Liposomal encapsulation of PGE 1 is intended to increase its stability and therefore, the greater the efficiency of the encapsulation the more stable the drug will remain in the formulation.

Determinou-se a eficiência da encapsulação da PGEi em lipossoinas por contagem de cintilação em meio líquido. Para tal, foram diluídas aliquotas do creme lipossómico com a fase aquosa e centrifiigadas a 200 000 x g durante 60 minutos. Separou-se o sobrenadante do agregado (lipossomas) e efectuou-se a sua pesagem. As quantidades calculadas do sobrenadante e do agregado foram dissolvidas na mistura de cintilação e efectuada a correspondente contagem. A concentração da PGEi em cada fracção foi obtida a partir da actividade total (dpm) em cada fracção.The efficiency of PGE1 encapsulation in liposomes was determined by liquid scintillation counting. To this end, aliquots of the liposomal cream were diluted with the aqueous phase and centrifuged at 200,000 x g for 60 minutes. The supernatant was separated from the pellet (liposomes) and weighed. The calculated amounts of the supernatant and the aggregate were dissolved in the scintillation mixture and counted accordingly. The concentration of PGE1 in each fraction was obtained from the total activity (dpm) in each fraction.

Eficiência de encapsulação=Concentração da PGEi no agregado/(Concentração no agregado e no sobrenadante)Efficiency of encapsulation = Concentration of PGE1 in the aggregate / (Concentration in the aggregate and in the supernatant)

Os estudos de eficiência de encapsulação foram repetidos semanalmente a intervalos de 2 semanas para se determinar a existência de fugas de fármaco encapsulado para fora das formulações lipossómicas guardadas quer em frigorífico quer à temperatura ambiente. 6. Avaliações clínicasEncapsulation efficiency studies were repeated weekly at 2 week intervals to determine the existence of leakages of encapsulated drug out of the liposomal formulations stored either in the refrigerator or at room temperature. 6. Clinical evaluations

Os protocolos praticados para os estudos com seres humanos foram aceites pelo Comité de Ética sobre Experiências com Seres Humanos na Universidade de Saskatchewan.Protocols for human studies were accepted by the Ethics Committee on Human Experiments at the University of Saskatchewan.

Aos pacientes incluídos nestes estudos havia sido diagnosticada impotência de origem essencialmente orgânica. Este grupo de pacientes é o mais difícil de tratar e normalmente são necessárias doses mais elevadas de PGEi. A base lógica para a utilização deste grupo “difícil” é a de fazer diminuir a possibilidade de se obter respostas ao placebo. 6,1. Estudo interdepartamental duplamente cegoPatients included in these studies had been diagnosed as impotence of essentially organic origin. This group of patients is the most difficult to treat and higher doses of PGE1 are usually required. The rationale for using this "difficult" group is to decrease the possibility of getting responses to placebo. 6.1. Double-blind interdepartmental study

Depois de obtido o necessário consentimento dos interessados, foram envolvidos neste estudo 6 pacientes aos quais havia sido diagnosticada impotência de etiologia predominantemente orgânica, para os quais se comprovou que respondiam à injecção de PGE( intracavemosa. O protocolo utilizado para se testar uma formulação de PGEj lipossómica, utilizando como contraprova placebo lipossómico, foi de tipo interdepartamental, aleatório e duplamente cego. Aplicou-se 1,5 g de cada creme ao tronco do pénis a intervalos semanais. Antes disto, aplicou-se uma pequena quantidade numa parte do braço, sem pêlos, para testar a existência eventual de reacções adversas. Nos casos em que não ocorreu nenhuma ao fim de 60 minutos, os pacientes foram então seleccionados para prosseguirem com o teste um pouco mais tarde no mesmo dia. Removeu-se o creme ao fim de 1 hora e antes do acto sexual, no caso de ter sido conseguida uma erecção. Pediu-se ao paciente que registasse o momento do início, a sua duração e a qualidade da resposta e também qualquer efeito secundário, nas folhas fornecidas de assento de registos. O estudo indicou que 5 de 6 pacientes responderam à preparação testada segundo graus variáveis (classificação das respostas > 1, quadro 8). Houve três pacientes que responderam com classificações elevadas (classificação das respostas > 2). A resposta ao placebo foi pra-ticamente nula. 43 QUADRO 8After obtaining the necessary consent of the interested parties, 6 patients who had been diagnosed as having impotence of predominantly organic etiology were identified in this study, for which they were found to respond to the injection of PGE (intracavemosa.) The protocol used to test a formulation of PGE liposomal and placebo-treated liposomes were randomized, double-blind, and interdepartmental, with 1.5 g of each cream applied to the penis at weekly intervals, before which a small amount was applied to one part of the arm, without hair, to test for possible adverse reactions.In cases where none occurred within 60 minutes, the patients were then selected to proceed with the test a little later on the same day. 1 hour prior to intercourse, if an erection had been achieved. The patient was asked to record the time of onset. its duration and the quality of the response and also any side effect on the sheets of record-keeping provided. The study indicated that 5 of 6 patients responded to the preparation tested in varying degrees (classification of responses > 1, table 8). There were three patients who responded with high scores (classification of responses > 2). The placebo response was virtually non-existent. 43 TABLE 8

Estudo clínico piloto utilizando a formulação n° 6 (0,1%) em pacientes com impotência orgânicaA pilot clinical study using formulation # 6 (0.1%) in patients with organic impotence

Classificação das respostas Paciente n° PGEj lipossómica Placebo 1 0 2 "» 0 'Λ O 2 0 4 1 0 5 1 1 6 0 0Classification of responses Patient # Liposome PGEj Placebo 1 0 2 " »0 'Λ O 2 0 4 1 0 5 1 1 6 0 0

Classificação das respostas 0 Não foi observado nenhum efeito. 1 Efeito ligeiro, isto é, um aumento ligeiro do pénis. Ausência de erecção. 2 Erecção conseguida mas não suficiente para o acto sexual. 3 Obtida uma boa erecção. O acto sexual foi tentado mas não foi satisfatório. 4 Obtida uma boa erecção. Acto sexual satisfatório. 6.2. Estudo ultrassonográfico por efeito DopplerResponse Classification 0 No effect observed. 1 Slight effect, ie a slight increase in the penis. Absence of erection. 2 Erection achieved but not sufficient for intercourse. 3 Got a good erection. The sexual act was attempted but was not satisfactory. 4 Got a good erection. Satisfactory sexual act. 6.2. Ultrasonographic study by Doppler effect

Recorreu-se à ultrassonografia por efeito Doppler para se avaliar o grau de dilatação arterial e para se medir o fluxo de sangue arterial no pénis a seguir à aplicação de PGE[ lipossómica por via transdérmica. Foram testadas as preparações lipossómicas de PGEj e uma contraprova de placebo. As preparações testadas foram administradas a intervalos não inferiores a 2 semanas. Após o exame sonográfico inicial para se determinar o fluxo de sangue no pénis flácido, aplicou-se a preparação testada no tronco e na glande do pénis e a seguir aplicou-se em tomo deste um envoltório oclusivo. Verificou-se o fluxo de sangue no pénis a intervalos de 15 minutos durante 1 hora. O estudo ultrassonográfico por efeito Doppler, realizado com pacientes com impotência predominantemente orgânica, revelou um aumento do fluxo de sangue no pénis após a aplicação tópica de PGEi lipossómica (quadro 9). A formulação lipossómica n° 5 revelou a eficácia mais elevada, com um máximo de fluxo de 32 cm/s no paciente n° 4. A formulação lipossómica n° 5 de contraprova (sem PEGt) também induziu um aumento do fluxo de sangue no pénis. A preparação lipossómica n° 5 é equivalente à n° 2 mais um agente intensificador da penetração que é o salicilato de metilo. E provável que este agente intensificador da penetração possa por si só aumentar ligeiramente o fluxo de sangue no pénis e que tenha um efeito sinérgico com a PGE) lipossómica. Os dados de absorção percutânea in vitro estavam bem correlacionados com os resultados obtidos por efeito Doppler. A preparação lipossómica de PGE] n° 5 utilizada in vitro deu origem ao mais elevado fluxo percutâneo, seguindo-se ordenadamente a preparação n° 2 e por fim a formulação lipossómica de PGE] n° 7. QUADRO 9Doppler ultrasonography was used to evaluate the degree of arterial dilatation and to measure the arterial blood flow in the penis following the application of transdermal liposomal PGE. Liposomal preparations of PGE 2 and a placebo control were tested. The tested preparations were administered at intervals of not less than 2 weeks. After the initial sonographic examination to determine the blood flow in the flaccid penis, the preparation tested was applied to the trunk and glans of the penis, and then an occlusive wrap was applied around it. The blood flow in the penis was checked at 15 minute intervals for 1 hour. The Doppler ultrasound study of patients with predominantly organic impotence revealed an increase in blood flow to the penis after topical application of liposomal PGE1 (Table 9). Liposomal formulation No. 5 revealed the highest efficacy, with a maximum flow of 32 cm / s in patient # 4. The control liposomal formulation # 5 (without PEGt) also induced an increase in blood flow in the penis . Liposomal preparation No. 5 is equivalent to No. 2 plus a penetration enhancing agent which is methyl salicylate. It is likely that this penetration enhancing agent alone may slightly increase the blood flow in the penis and have a synergistic effect with the liposomal PGE). In vitro percutaneous absorption data were well correlated with the results obtained by Doppler effect. The liposomal preparation of PGE] # 5 used in vitro gave rise to the highest percutaneous flow, followed closely by preparation No. 2 and finally the liposomal formulation of PGE] No. 7. TABLE 9

Velocidade máxima do fluxo sistémico (cm/s): artéria cavernosa profundaMaximum systemic flow velocity (cm / s): deep cavernous artery

Paciente n° Teste n" Formulação n° Referencial 0-15 min 16-30 min 31-45 min 46-60 min 1/1 18A-PGE, 0 0 5 10 8 1/2 18 A-Placebo 0 0 0 0 0 2/1 18A-PGE, 0 0 0 15 14 2/2 29-PGEi 0 10 17 20 22 3/1 29-PGE, 0 0 8 13 9 3/2 28-PGE, 0 0 0 0 0 4/1 29-PGE, 10 18 17 32 16 4/2 29-SCM 0 12 10 10 18 5/1 28-PGE, 0 0 0 0 0 5/2 29-PGE, 0 0 0 6 6 0 Ausência de fluxo detectável ultrassonograficamente SCM Salicilato de metilo 45Patient n ° Test n " Formulation No. Reference 0-15 min 16-30 min 31-45 min 46-60 min 1/1 18A-PGE, 0 0 5 10 8 1/2 18 A-Placebo 0 0 0 0 0 2/1 18A-PGE , 0 0 0 15 14 2/2 29-PGE 1 0 10 17 20 22 3/1 29-PGE, 0 0 8 13 9 3/2 28-PGE, 0 0 0 0 0 4/1 29-PGE, 10 18 17 32 16 4/2 29-SCM 0 12 10 10 18 5/1 28-PGE, 0 0 0 0 0 5/2 29-PGE, 0 0 0 6 6 0 Absence of ultrasound-detectable flow SCM Methyl salicylate 45

Outras utilizações possíveis para a preparação de PGE( lipossómica aplicada por via tópica são a preparação de formulações transdérmicas para o tratamento da impotência e também a preparação de formulações dérmicas para o tratamento de diversas doenças da pele, tais como pele atópica, psoríase, doenças vasculares periféricas, cicatrização de ferimentos e lesões isquémicas.Other possible uses for the preparation of PGE (topically applied liposome are the preparation of transdermal formulations for the treatment of impotence and also the preparation of dermal formulations for the treatment of various skin diseases such as atopic skin, psoriasis, vascular diseases injuries, and ischemic injuries.

B. INTERFERÃO g ENCAPSULADO EM LIPOSSOMAS PARA APLICAÇÃO TÓPICA PARA O TRATAMENTO DE INFECCÕES GENITAIS DO VÍRUS DO PAPILOMA MétodosB. INTERFERION g ENCAPSULATED IN LIPOSOMES FOR TOPICAL APPLICATION FOR THE TREATMENT OF GENITAL INFECTIONS OF THE PAPILOMA VIRUS Methods

Preparação lipossómica O método utilizado em A. foi também utilizado para incorporar o IFNa que está incluído na fase aquosa que é utilizada para hidratar o gel prolipossómico, mediante uma operação de mistura a uma temperatura não superior a 40°C.Liposomal preparation The method used in A. was also used to incorporate the IFNa which is included in the aqueous phase which is used to hydrate the prolipossomic gel by a blending operation at a temperature not higher than 40 ° C.

Hibridação in situIn situ hybridization

Para a determinação da presença de ADN de VPH (tipos 6 e 11, tipos 16 e 18 e tipos 31, 33 e 35) em secções de tecidos retirados de pacientes, embebidas em parafina, utilizou-se o estojo ‘ViraType™’ (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) de hibridação in situ de tecidos afectados com o vírus do papiloma humano.In order to determine the presence of HPV DNA (types 6 and 11, types 16 and 18 and types 31, 33 and 35) in sections of tissue removed from paraffin-embedded patients, the ViraType ™ kit (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) in situ hybridization of tissues affected with human papilloma virus.

ImunocontrastaçãoImmunosuppression

Efectuou-se a imunocontrastação de secções de biópsias obtidas antes e após o tratamento com o IFNa lipossómico, para se pesquisar a presença de IFN absorvido, utilizando para tal o anticorpo monoclonal de murganho anti-EFN humano (Boehringer Manheim 46Immunostaining of biopsy sections obtained before and after treatment with liposomal IFNα was performed to screen the presence of absorbed IFN using human monoclonal anti-EFN mouse antibody (Boehringer Manheim 46

Biochemical) e o anticorpo secundário marcado com fosfatase alcalina sob a forma de AS/AP do estojo universal ‘Mouse Immunostaining Kit’ (BIO/CAN Scientific Inc., Mississauga, Ont.).Biochemical) and the alkaline phosphatase labeled secondary antibody AS / AP from the Mouse Immunostaining Kit (BIO / CAN Scientific Inc., Mississauga, Ont.).

Estudo clínico A primeira paciente foi uma mulher com 30 anos de idade com um historial de 3 anos de VPH genital recorrente com envolvimento cervical (CIN I). Ao ser feito um exame antes de se ter instituído a terapia tópica com o IFNa (F n° 2) havia grandes placas confluentes e pápulas separadas verrugosas e filiformes típicas de condylomata acuminata no lábio maior, no lábio menor e na parte superior das coxas. A histopatologja revelou a existência de condiloma com ligeira atipia intraepitelial. O ‘VTRA-PAP’ revelou positividade ao VPH 6/11. A hibridação in situ revelou positividade ao VPH 6/11, reactividade ténue aos VPH 31, 33 e 35 e negatividade ao VPH 16/18. O protocolo de tratamento foi o seguinte: intrão A encapsulado em lipossomas, à razão de 3 x 106 Ul/semana, durante 12 semanas, e depois à razão de 10 x 106 Ul/semana durante 6 semanas; 1 g duas vezes por dia extemamente e 1 g uma vez por dia intravaginalmente. O segundo paciente foi um homem de 23 anos de idade com um historial de 2 anos de VPH genital. O exame efectuado permitiu concluir que tinha diversas pápulas planas de cor-de-came espalhadas sobre o tronco, o prepúcio e a glande do pénis. Quase todas as lesões adquiriram a cor branca característica induzida pelo ácido acético depois de molhadas com esta substância durante 5 minutos. A histopatologia revelou acantose, coilócitos e inflamação. O ‘VIRA-PAP’ revelou positividade ao VPH 6/11 e negatividade aos VPH 16/18, 31, 33 e 35. A hibridação in situ revelou negatividade aos 6/11; 16/18; 31, 33 e 35. O protocolo de tratamento consistiu na administração de intrão A encapsulado em lipossomas à razão de 3 x 10b Ul/semana, durante 8 semanas, 1 g duas vezes por dia extemamente. Efectuou-se a avaliação em ambos os casos observando o tamanho e o número das lesões, a histopatologia e a hibridação in si tu.Clinical study The first patient was a 30-year-old woman with a 3-year history of recurrent genital HPV with cervical involvement (CIN I). When an examination was performed prior to the introduction of topical therapy with IFNα (F n ° 2) there were large confluent plaques and separate warty and filiform papules typical of condylomata acuminata on the labia majora, on the lower lip and on the upper thighs. Histopathology revealed the existence of condyloma with slight intraepithelial atypia. 'VTRA-PAP' revealed HPV 6/11 positivity. In situ hybridization revealed HPV 6/11 positivity, tenuous reactivity to HPV 31, 33 and 35 and HPV 16/18 negativity. The treatment protocol was as follows: intron A encapsulated in liposomes at the rate of 3 x 106 IU / week for 12 weeks, and then at 10 x 106 IU / week for 6 weeks; 1 g twice daily and 1 g once daily intravaginally. The second patient was a 23-year-old man with a 2-year history of genital HPV. The examination revealed that he had several flat camomile papules scattered over the trunk, foreskin, and glans of the penis. Almost all of the lesions acquired the characteristic white color induced by acetic acid after being wetted with this substance for 5 minutes. Histopathology revealed acanthosis, coilocytes, and inflammation. 'VIRA-PAP' revealed HPV 6/11 positivity and HPV 16/18, 31, 33 and 35 negativity. In situ hybridization revealed negativity at 6/11; 16/18; 31, 33 and 35. The treatment protocol consisted of administration of intron A encapsulated in liposomes at the rate of 3 x 10 6 IU / week for 8 weeks, 1 g twice daily. The evaluation was performed in both cases by observing the size and number of lesions, histopathology and in situ hybridization.

ResultadosResults

Penetração cutânea de 125I-BFN125I-BFN cutaneous penetration

Investigou-se a absorção de IFN, contido em diversas formulações lipossómicas, na pele da mama da mulher, in vitro, utilizando como marcador IFN iodado. O intervalo estudado de variação da concentração do IFN foi de 20-80 UM/g. A dose habitual aplicada foi de 0,1 g de preparação/0,32 cm2 de superfície da pele na célula de difusão, o que corresponde a cerca de 6-38 UM de IFN por cm2 de superfície da pele, consoante a concentração testada. Nas experiências utilizou-se pele de mama de mulher, retirada por mamoplastia.The absorption of IFN, contained in various liposomal formulations, into the skin of the woman's breast was investigated in vitro using iodinated IFN marker. The range of variation of IFN concentration studied was 20-80 UM / g. The usual dose applied was 0.1 g of preparation / 0.32 cm 2 of skin surface in the diffusion cell, which corresponds to about 6-38 μg of IFN per cm 2 of skin surface, depending on the concentration tested. In the experiments, women's breast skin removed by mammoplasty was used.

Nos quadros 10A e 10B estão indicados os valores de penetração cutânea do IFN a partir de diversas formulações lipossómicas que contêm a preparação a 20 UM/g.The cutaneous penetration values of IFN are shown in Tables 10A and 10B from various liposomal formulations containing the preparation at 20 UM / g.

QUADRO 10ATABLE 10A

Absorção cutânea de 125I-IFN a partir de formulações lipossómicas em regime estacionário em 48 horas. Apresenta-se o valor total de IFN na pele intacta (todas as camadas de pele conjuntamente) 20x106 UI de IFN/g de produto 6xl06 UI de IFN/cm2 0716-92 ,25I-IFN 48 hCutaneous absorption of 125 I-IFN from liposomal formulations at steady state in 48 hours. The total value of IFN in the intact skin (all layers of skin together) is 20x10 6 IU IFN / g of product 6x106 IU IFN / cm 2 0716-92, 25 I-IFN 48 h

Concentração de fármaco no produto: Dose/unidade de superfície da pele: Pele utilizada:Concentration of drug in product: Dose / unit of skin surface: Skin used:

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Duração da experiência:Duration of the experiment:

Os valores representam a média ± D.P. (n=4). 48Values represent the mean ± S.D. (n = 4). 48

48 FORMULAÇÕES 1FN na pele intacta ng/cm2 UI/cm2 % do total aplicado Fn°2 491,75 1 136,39 110380130615 2,0010,5 5 F n° 3 1004,84 ±269,18 225553160424 3,4710,93 Fn° 5 783,67152,49 1759041 11783 2,7010,18 Fn° 9 971,291157,52 218022135358 3,3210,54 Fn° 10 822,58 1202,53 183022145120 3,5610,88 Fn° 11 768,11 1 151,44 172409133992 3,1610,62 Solução 344,41 1 105,52 77306123684 1,2310,38 QUADRO 10B48 FORMULATIONS 1FN in intact skin ng / cm2 IU / cm2% of total applied Fn ° 2 491.75 1 136.39 110380130615 2,0010.5 5 F n ° 3 1004.84 ± 269.18 225553160424 3.4710.93 Fn ° 5 783.67152,49 1759041 11783 2,7010.18 Fn ° 9 971,291157,52 218022135358 3,3210.54 Fn ° 10 822.58 1202.53 183022145120 3.5610.88 Fn ° 768.11 1 151.44 172409133992 3.1610.62 Solution 344.41 1 105.52 77306123684 1.2310.38 TABLE 10B

Absorção cutânea de 125I-IFN a partir de formulações lipossómicas em regime estacionário em 48 horas. Indica-se a quantidade de DFN no estrato córneo e nas camadas mais profundas da pele (epiderme e derme viáveis) 20x106 UI de IFN/g de produto 6x106 UI de IFN/cm2 0716-92 125I-IFN 48 hCutaneous absorption of 125 I-IFN from liposomal formulations at steady state in 48 hours. The amount of DFN in the stratum corneum and in the deeper layers of the skin (viable epidermis and dermis) is indicated 20x106 IU of IFN / g of product 6x106 IU of IFN / cm2 0716-92 125 I-IFN 48 h

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Duração da experiência:Duration of the experiment:

Os valores representam a média ± D.P. (n=4).Values represent the mean ± S.D. (n = 4).

Formulações IFN no estrato cómco IFN na epiderme + derme viáveis ng/cm2 Ul/cm2 % do total aplicado ng/cm2 UI/cm2 % do total uplicado Fn°2 239,63+136,39 53787128833 0,9510,51 213,90+33,04 4801317415 0,8710,13 Fn° 3 331,15+111,04 74346124929 1,1410.38 690,86+326,07 155076+73191 2,38+1,12 Fn°5 375,571183,82 84308141263 13910,63 426,951211,60 95833147495 1,47+0,73 Fn°9 554,07118827 124343+42250 1,94+0,66 528,651202,55 118665145467 1,8510,71 Fn° 10 426,17119234 95750143260 1,85+0,83 41826+78,44 93180117475 1,8110,34 Fn° 11 48536+228,59 108955+51324 1,99+0,94 322,52+72,93 72393+16369 1,3210,30 Solução 155,06165,61 34815+14730 0,56+023 178,1412340 39985+5257 0,6410,08 49 • * 2IFN formulations in the IFN layer in the epidermis + viable dermis ng / cm2 IU / cm2% of the total applied ng / cm2 IU / cm2% of the total amount Fn ° 239.63 + 136.39 53787128833 0.9510.51 213.90 +33.04 4801317415 0.8710.13 Fn ° 331.15 + 111.04 74346124929 1,1410.38 690.86 + 326.07 155076 + 73191 2.38 + 1.12 Fn ° 5 375.571183.82 84308141263 13910.63 426.951211,60 95833147495 1.47 + 0.73 Fn ° 9 554.07118827 124343 + 42250 1.94 + 0.66 528.651202.55 118665145467 1,8510.71 Fn ° 10 426.17119234 95750143260 1.85 + 0.83 41826 + 78.44 93180117475 1.8110.34 Fn ° 11 48536 + 228.59 108955 + 51324 1.99 + 0.94 322.52 + 72.93 72393 + 16369 1.3210, 30 Solution 155.06165.61 34815 + 14730 0.56 + 023 178.11412340 39985 + 5257 0.6410.08 49 * * 2

Com o regime de dosagem utilizado neste estudo, a dose aplicada foi de cerca de 6 UM/cm. A absorção de IFN a partir das diversas formulações lipossómicas foi razoavelmente idêntica, entre 2,00 e 3,56% do total aplicado quando analisada a pele intacta não arrancada (quadro 10A). Isto corresponde a cerca de 110 000-218 000 UI de IFN/cm2 de pele. A análise à pele arrancada (quadro 10B) permitiu observar grandes diferenças na taxa de absorção nas camadas mais profundas, isto é, na epiderme e na derme viáveis. A quantidade de IFN fornecido pelas formulações n- 3, 5, 9, 10 e 11 ficou compreendida no intervalo entre 72 000 e 155 000 UI/ /cm2. A solução de IFN de contraprova, com a mesma concentração e para a mesma dose, forneceu aproximadamente 77 000 UI de IFN/cm2 ao interior da pele ‘intacta’ (1,23%±0,38% do total aplicado) e 40 000 Ul/cm2 às camadas mais profundas da pele (0,64%±0,8% do total). Foram obtidos resultados idênticos quando foram utilizadas soluções mais concentradas. A um aumento da dose corresponde um aumento da quantidade de IFN absorvido. Foram preparadas e testadas formulações seleccionadas com 40 UM/g. Neste caso, a dose aplicada foi de cerca de 12 UM/cm2. As formulações F n- 5-40, 10-40 e 11-40 tinham a mesma composição lipídica indicada antes, com a excepção de se ter aumentado a concentração inicial do fáimaco. A quantidade de IFN absorvido pela pele chegou a cerca de 0,5 UM/cm2. O quadro 11 indica que entre estas três preparações a F n° 10-40 forneceu a quantidade mais elevada de IFN, da ordem de 600 000 Ul/cm2 Depois de se ter arrancado a pele, o nível de IFN na pele tratada com a formulação n° 1040 ainda estava próxima de 0,5 UM/cm2. As formulações F n° 5-40 e F n° 11-40 forneceram quantidades ligeiramente menores de IFN às camadas mais profundas da pele. 50 QUADRO 11With the dosage regimen used in this study, the applied dose was about 6 UM / cm. The absorption of IFN from the various liposomal formulations was fairly similar, between 2.00 and 3.56% of the total applied when analyzed for intact untapped skin (Table 10A). This corresponds to about 110,000-218,000 IU of IFN / cm 2 of skin. The peeled skin analysis (Table 10B) showed large differences in the absorption rate in the deeper layers, ie in the viable epidermis and dermis. The amount of IFN provided by the formulations Nos. 3, 5, 9, 10 and 11 ranged from 72,000 to 155,000 IU / cm2. The control IFN solution, at the same concentration and at the same dose, delivered approximately 77,000 IU IFN / cm 2 into intact skin (1.23% ± 0.38% of total applied) and 40,000 IU Ul / cm2 to the deepest layers of the skin (0.64% ± 0.8% of the total). Similar results were obtained when more concentrated solutions were used. At an increase in dose corresponds an increase in the amount of IFN absorbed. Selected formulations with 40 UM / g were prepared and tested. In this case, the applied dose was about 12 UM / cm 2. The formulations F n- 5-40, 10-40 and 11-40 had the same lipid composition as indicated above, except that the initial concentration of the drug was increased. The amount of IFN absorbed by the skin reached about 0.5 um / cm 2. Table 11 indicates that among these three preparations F No. 10-40 provided the highest amount of IFN, in the order of 600,000 IU / cm2. After the skin was peeled off, the IFN level in the skin treated with the formulation No. 1040 was still close to 0.5 um / cm 2. Formulations F No. 5-40 and F No. 11-40 provided slightly lower amounts of IFN to the deeper layers of the skin. 50 TABLE 11

Absorção cutânea de I25IN-IFN a partir de formulações Iipossómicas que contêm IFN à razão de 40 UM/g em regime estacionário em 48 horas. São apresentados os valores de IFN na pele integral (todas as camadas de pele conjuntamente) e no estrato córneo e nas camadas mais profundas da pele 40x106 UI de IFN/g de produto 12xl06 UI de IFN/cm2 0716-92 125i-ifn 48 hCutaneous absorption of I25IN-IFN from liposomal formulations containing IFN at the rate of 40 UM / g in steady state in 48 hours. IFN values are shown in the whole skin (all skin layers together) and in the stratum corneum and in the deeper layers of the skin 40x106 IU IFN / g of product 12x106 IU IFN / cm 2 0716-92 125i-ifn 48 h

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Duração da experiência:Duration of the experiment:

Os valores representam a média ± D.P. (n=4). FORMULAÇÕES IFN na pele intacta ng/cm2 UI/cm2 % do total aplicado F n° 5-40 1560,63 ± 157,68 350309 ±35395 3,37 ±0,34 F n° 10-40 2627,28 ± 705,42 589284 ±158221 4,69 ± 1,26 Fn° 11-40 1830,23 ±625,73 409837 ±140118 3,40 ±1,16Values represent the mean ± S.D. (n = 4). IFN FORMULATIONS in intact skin ng / cm2 IU / cm2% of total applied F No. 5-40 1560.63 ± 157.68 350309 ± 35395 3.37 ± 0.34 F No. 10-40 2627.28 ± 705, 42 589284 ± 158221 4.69 ± 1.26 Fn ° 11-40 1830.23 ± 625.73 409837 ± 140118 3.40 ± 1.16

Formidsições IFN no estrato córneo IFN na epiderme + derme viáveis ng/cm2 UI/cm2 % do total aplicado ng/cm2 UI/cm2 % do total aplicado Fn°540 808,10+29625 181459166523 1,7410,64 734,121174,67 164785139207 1,5810,37 Fn° 10-40 460,021282,00 103176163250 0,8210,50 2141,611959,46 480350+215202 3,8211,71 Fn° 11-40 952,061352,05 213244178851 1,7710,65 930,59+676,30 2083851151441 1,721125Formulations IFN in the stratum corneum IFN in the epidermis + viable dermis ng / cm2 IU / cm2% of the total applied ng / cm2 IU / cm2% of the applied total Fn ° 540 808.10 + 29625 181459166523 1,7410,64 734,121174,67 164785139207 1.5810,37 Fn ° 10-40 460,021282,00 103176163250 0,8210,50 2141,611959,46 480350 + 215202 3,8211,71 Fn ° 11-40 952,061352,0 213244178851 1,7710, 65 930.59 + 676.30 2083851151441 1.721125

Com as formulações F n° 5 e F n° 2 aumentou-se ainda mais a concentração do IFN para 80 UM/g para se determinar se seria necessário administrar mais fármaco. O quadro 12 permite concluir que a formulação n° 10-80 fomeceu à pele cerca de 0,9 UM/cm2 A epiderme e a 51., derme viáveis continham cerca de 0,7 UM/cm2. É digno de nota o facto de a formulação F n° 10 ter fornecido em geral uma proporção maior de IFN às camadas mais profundas da pele. Este efeito é mais pronunciado para as concentrações de 40 UM/g e de 80 UM/g de produto (quadros 11 e 12).With Formulations F No. 5 and F No. 2 the IFN concentration was further increased to 80 UM / g to determine whether further drug would be required. Table 12 shows that formulation No. 10-80 gave the skin about 0.9 um / cm2. The epidermis and the dermisable dermis contained about 0.7 um / cm 2. It is noteworthy that formulation F No. 10 has generally provided a greater proportion of IFN to the deeper layers of the skin. This effect is most pronounced at the concentrations of 40 UM / g and 80 UM / g of product (Tables 11 and 12).

Estimativa da actividade antiviral na pele tratada com IFNa lipossómico. QUADRO 12Estimation of antiviral activity in skin treated with liposomal IFNα. TABLE 12

Absorção cutânea de 12I-1FN a partir de formulações lipossómicas que contêm IFN à razão de 80 UM/g em regime estacionário em 48 horas. São apresentados os valores de IFN na pele intacta (todas as camadas de pele conjuntamente) e no estrato córneo e nas camadas mais profundas da pele 80x106 UI de IFN/g de produto 28x106 UI de IFN/cm2 0716-92 125I-IFN 48 hCutaneous absorption of 12I-1FN from liposomal formulations containing IFN at the rate of 80 UM / g steady state in 48 hours. IFN values on intact skin (all layers of skin together) and stratum corneum and deeper layers of skin are presented 80x106 IU IFN / g product 28x106 IU IFN / cm 2 0716-92 125 I-IFN 48 h

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Duração da experiência:Duration of the experiment:

Os valores representam a média ± D.P. (n=4). FORMULAÇÕES IFN na peie intacta ng/cm2 UI/cm2 % do total aplicado F n° 5-80 3452,49 ±929,00 773106 ±208028 2,75 ±0,74 Fn° 10-80 3867,71 ± 1375,89 866084 ±308099 3,21 ± 1,41 IFN ao estrato comeu IFN na epiderme+derme viáveis Fontubpjes ng/cm2 UI/cm2 %do total aplicado ng/cm2 UI/cm2 % do total aplicado F tf 5-80 1976,43±157520 442587*352728 1,57*125 1216,18*370,58 272335*82983 0,97*029 Fn° 10-80 728,19*610,93 163058*136800 0,60*0,50 308023*1196,41 689746*267210 2,55*0,99 52 A medição da penetração cutânea pela radioactividade é uma forma eficiente de se comparar diversas formulações diferentes e de se calcular os níveis aproximados de proteínas na pele. No entanto, este método não serve para averiguar se a proteína absorvida está intacta e activa.Values represent the mean ± S.D. (n = 4). FORMULATIONS IFN in intact material ng / cm2 IU / cm2% of total applied F No. 5-80 3452.49 ± 929.00 773106 ± 208028 2.75 ± 0.74 Fn ° 10-80 3867.71 ± 1375.89 866084 ± 308099 3.21 ± 1.41 IFN to the stratum IFN in the epidermis + viable dermis Fontubpjes ng / cm2 IU / cm2% of the applied total ng / cm2 IU / cm2% of the total applied F tf 5-80 1976,43 ± 157520 442587 * 352728 1.57 * 125 1216.18 * 370.58 272335 * 82983 0.97 * 029 Fn ° 10-80 728.19 * 610.93 163058 * 136800 0.60 * 0.50 308023 * 1196, 41 689746 * 267210 2.55 * 0.99 The measurement of skin penetration by radioactivity is an efficient way of comparing various different formulations and of calculating the approximate levels of proteins in the skin. However, this method does not serve to ascertain whether the absorbed protein is intact and active.

Para se conseguir saber melhor se o marcador radioactivo representa a proteína activa, foram realizadas experiências antivirais com amostras de pele tratadas com EFN lipossómico (20 UM/g). Estas experiências antivirais indicaram que havia actividade antiviral na pele com cada formulação lipossómica experimentada (quadro 13). Os valores obtidos nas experiências antivirais foram cerca de 10 vezes inferiores à quantidade de EFN detectável na pele pelo método radioactivo para todas as formulações, excepto para a F n° 10. No caso da F n° 10 a actividade antiviral correspondeu bem aos resultados obtidos nas experiências radioactivas (comparar o quadro 10A e o quadro 13). QUADRO 13To further determine whether the radioactive label represents the active protein, antiviral experiments were performed on skin samples treated with liposomal EFN (20 μM / g). These antiviral experiments indicated that there was antiviral activity on the skin with each liposomal formulation tested (Table 13). Values obtained in the antiviral experiments were about 10-fold lower than the amount of detectable EFN in the skin by the radioactive method for all formulations, except for F No. 10. In the case of F No. 10 antiviral activity corresponded well to the results obtained radioactive experiments (compare Table 10A and Table 13). TABLE 13

Avaliação da actividade antiviral na pele tratada com IFNa lipossómico in vitro N° da formulação — ..... * — IFN total na pele da mama em 48 horas (EJl/cm ) F n° 2 17 200 Fn° 3 26 600 Fn° 5 21 900 F n° 10 219 000 F n° 9 17 200 Fn° 11 17 200 Solução de EFN 12 000 53Evaluation of antiviral activity in the skin treated with liposomal IFNα in vitro Formulation No. - * - Total IFN on the skin of the breast in 48 hours (EJl / cm) F No. 2 17 200 Fn ° 3 26 600 Fn 5 21 900 F No 10 219 000 F No 9 17 200 Fn ° 11 17 200 EFN solution 12 000 53

Administração de IFNa a tecido verrugoso genital removido cirurgicamenteIFNa administration to surgically removed genital warts

Foram utilizados tecidos de condiloma excisados que foram tratados com uma dose fraca de IFN liposssómico (F n° 10-80) para se obter informação preliminar sobre o regime de administração do fármaco. A dificuldade existente nas experiências in vitro com tecidos verrugosos é a localização das quantidades adequadas de produto sobre a superfície das lesões.Excised condyloma tissues were treated with a low dose of liposomal IFN (F # 10-80) to provide preliminary information on the regimen of drug administration. The difficulty in in vitro experiments with warty tissues is the location of adequate amounts of product on the surface of the lesions.

Foram necessários os dois regimes de dosagem (0.5 UM/lesão e 2 UM/lesão, aproxi-madamente) para que tivesse lugar a formação de uma camada de produto suficientemente espessa sobre a superfície do tecido e para que já não fosse recebida mais nenhuma quantidade adicional (acabaria por cair). Os resultados destas experiências estão indicados no quadro 14.The two dosing regimens (0.5 UM / lesion and 2 UM / lesion, approx.) Were required to form a sufficiently thick layer of product on the surface of the tissue and no more quantity would be received (would eventually fall). The results of these experiments are shown in Table 14.

Efectuou-se o tratamento de 7 amostras de lesões de condiloma excisadas (com o diâmetro médio de 5 mm), utilizando no tratamento uma média de 0,5 UM por dose de F n° 10-80. A quantidade de IFN administrada às lesões foi de 34 000 ± 18 100 UI (6,5% da quantidade total aplicada). Depois de se ter determinado a radioactividade nas lesões ‘integrais’ (isto é, a seguir à lavagem completa e contrastação das verrugas), efectuou-se a remoção das camadas exteriores por arrancamento de tiras e determinou-se a radioactividade existente nas camadas mais profundas. A quantidade média de IFN na camada mais profunda foi de 29 000 ± 15 300 UI (5,5% da quantidade total aplicada).Seven samples of excised condyloma lesions (with the mean diameter of 5 mm) were treated, using in the treatment an average of 0.5 μM per dose of F No. 10-80. The amount of IFN administered to the lesions was 34,000 ± 18,100 IU (6.5% of the total amount applied). After radioactivity was determined in the 'whole' lesions (i.e. following complete lavage and counterstaining of the warts), the outer layers were removed by stripping and the radioactivity in the deeper layers . The mean amount of IFN in the deepest layer was 29,000 ± 15,300 IU (5.5% of the total amount applied).

Foram utilizadas três lesões de condiloma para as experiências com o tratamento de dose mais elevada (2 UM/lesão). A quantidade total de IFN administrada foi de 323 500 ± 235 100 UI (14,8% do total) e a actividade que ficou depois do arranque das tiras das verrugas foi de 286 500 ± 208 900 UI (9,5% do total).Three condyloma lesions were used for the experiments with the higher dose treatment (2 UM / lesion). The total amount of IFN administered was 323 500 ± 235 100 IU (14.8% of the total) and the activity after the warts strip was started was 286 500 ± 208 900 IU (9.5% of the total) .

Estas experiências comprovam o potencial desta formulação para fornecer quantidades suficientes de fármaco. No entanto, melhorando o ajustamento experimental, seria possível conseguir uma melhor estimativa do regime de administração aos tecidos das verrugas. Algumas das dificuldades destas experiências são a disponibilidade de tecidos de tamanhos semelhantes, a aplicação do creme lipossómico às lesões, o período preliminar de preparação e a análise dos tecidos.These experiments prove the potential of this formulation to provide sufficient amounts of drug. However, by improving the experimental fit, it would be possible to obtain a better estimate of the delivery regimen to warts tissues. Some of the difficulties of these experiments are the availability of similarly sized tissues, the application of the liposomal cream to the lesions, the preliminary period of preparation and tissue analysis.

Tratamento de pacientes com IFNa encapsulado em lipossomas (F n° 2)Treatment of patients with liposome-encapsulated IFNα (F n ° 2)

Ao fim de algumas semanas de sujeição da mulher ao regime terapêutico observou-se um amaciamento e um adelgaçamento do condiloma e também um desanuviamento da hiper-pigmentação. Foram ainda resolvidas três lesões removidas por anestesia local da zona superior da coxa direita à 10a semana de terapia, no final de um período de 12 semanas de tratamento com interferões lipossómicos, tendo essa zona continuado a não revelar nenhum sinal de recorrência 7 semanas após a remoção. Uma colposcopia efectuada um mês depois de se ter interrompido a terapia com interferões lipossómicos não revelou nenhuma evidência de existência de VPH ao nível do colo do útero. No caso do paciente masculino, houve várias lesões da região distai do prepúcio e da glande que ficaram resolvidas ao fim de duas semanas de tratamento com interferões lipossómicos duas vezes por dia. Continuou a haver lesões múltiplas ao fim de 8 semanas de terapia, quando o paciente mudou de residência e não foi possível acompanhá-lo. As lesões que ficaram resolvidas nas primeiras duas semanas continuaram a não existir durante o período de observação.At the end of a few weeks of subjection of the woman to the therapeutic regimen, there was a softening and thinning of the condyloma and also a clearing of hyper pigmentation. Three lesions removed by local anesthesia from the upper right thigh area were resolved at the 10th week of therapy at the end of a 12-week period of treatment with liposomal interferons, and this zone continued to show no sign of recurrence 7 weeks after removal. A colposcopy performed one month after stopping therapy with liposomal interferons revealed no evidence of HPV at the level of the cervix. In the case of the male patient, several lesions of the distal region of the foreskin and glans were resolved after two weeks of treatment with liposomal interferons twice daily. Multiple lesions continued after 8 weeks of therapy, when the patient changed residence and could not be followed. Lesions that were resolved in the first two weeks continued to be absent during the observation period.

As secções obtidas por biópsia no pré-tratamento não se apresentaram muito diferentes das secções obtidas pós-tratamento, revelando ambas ancatose e papilomatose, sendo no entanto 55 as mudanças coilocíticas menos evidentes nas secções obtidas pós-tratamento. A hibridação efectuada in situ com secções de tecidos obtidas por biópsia ao fim de 18 semanas pós--tratamento da mulher revelou apenas a existência de uma coloração focal relativamente fraca nos casos dos WH 6 e 11 em células superficiais raras, por contraposição ao pré-tratamento, quando o teste revelou inúmeros focos de núcleos positivamente contrastantes dentro das camadas superficiais do epitélio. Estes últimos resultados podem indicar eventualmente a eliminação do WH dos tecidos verrugosos.The sections obtained by pre-treatment biopsy did not appear very different from the sections obtained after treatment, revealing both anatosis and papillomatosis, but 55 the least evident coilocytic changes in the sections obtained after treatment. In situ hybridization with tissue sections obtained by biopsy at the end of 18 weeks posttreatment of the female revealed only the existence of a relatively weak focal staining in WH6 and 11 cases in rare superficial cells, as opposed to the pre- treatment, when the test revealed innumerable foci of positively contrasting nuclei within the superficial layers of the epithelium. These latter results may indicate the elimination of WH from verrucous tissues.

Concluímos que os lipossomas constituem um sistema adequado de administração do IFNa e uma forma de dosagem aceitável sob o ponto de vista dermatológico. Os nossos estudos clínicos preliminares indicam a eficácia do IFNa encapsulado em lipossomas para administração tópica no tratamento de infecções genitais com os WH. B. Encapsulação de sólidos lipofilicos ou de ingredientes activos líquidos ou de intensificadores da consistência dentro do compartimento nuclear central de vesículas lipídicas multilamelares 1. Procedimento de formulaçãoWe conclude that liposomes constitute a suitable delivery system for IFNÎ ± and a dermatologically acceptable dosage form. Our preliminary clinical studies indicate the efficacy of liposome-encapsulated IFNa for topical administration in the treatment of WH genital infections. B. Encapsulation of lipophilic solids or liquid active ingredients or consistency enhancers within the central nuclear compartment of multilamellar lipid vesicles 1. Formulation procedure

Os lipossomas multilamelares foram preparados conforme a seguir se descreve. Pesou-se para dentro de um frasco de vidro ou de uma proveta os ingredientes lipídicos e o solvente hidrofílico propileno-glicol e liquefez-se tudo a 65°C-75°C por aquecimento intermitente em banho-maria. Os ingredientes hidrofílicos e as gotículas de óleo ou os ingredientes lipofilicos sólidos/semi-sólidos foram preparados separadamente sob a forma de uma emulsão óleo-em-água (o/a). Este produto intermédio recebeu a designação de ‘Sistema A’. O Sistema A contém um agente tensioactivo adequado, que é o ingrediente fundamental 56 para recobrir a superfície das goticulas lipofilicas e para as estabilizar para encapsulação dentro dos lipossomas. Prepara-se o Sistema A dissolvendo o agente tensioactivo em água destilada e juntando o óleo e/ou os ingredientes lipofílicos sólidos^semi-sólidos a uma temperatura entre 60°C e 80°C numa homogeneizadora a trabalhar a 20-80 psig durante um período de 5 a 30 minutos para se obter goticulas de tamanho pequeno (< cerca de 0,5 pm). Aquece-se a 55°C a fase lipídica liquefeita (a qual pode conter ou não PGEi) e junta-se o Sistema A à fase lipídica liquefeita e mexe-se vigorosamente por acção centrífuga ou numa misturadora de pás, dependendo isso do tamanho do produto. Utilizando este procedimento, foram preparadas as formulações a seguir indicadas. 1. Prostaglandina lipossómica para administração tópica % (p/p)Multilamellar liposomes were prepared as described below. The lipid ingredients and the hydrophilic propylene glycol solvent were weighed into a glass vial or a beaker and the whole was liquefied at 65-75 ° C by intermittent warming in a water bath. The hydrophilic ingredients and the oil droplets or the solid / semi-solid lipophilic ingredients were prepared separately as an oil-in-water (o / w) emulsion. This intermediate product has been designated 'System A'. System A contains a suitable surfactant which is the key ingredient 56 for coating the surface of the lipophilic droplets and for stabilizing them for encapsulation within the liposomes. System A is prepared by dissolving the surfactant in distilled water and combining the oil and / or the solid semi-solid lipophilic ingredients at a temperature between 60 ° C and 80 ° C in a homogenizer operating at 20-80 psig for a period of 5 to 30 minutes to give droplets of small size (< about 0.5 μm). The liquefied lipid phase (which may or may not contain PGE1) is heated to 55øC and System A is added to the liquefied lipid phase and stirred vigorously by centrifugal action or in a blender mixer, depending on the size of the product. Using this procedure, the following formulations were prepared. 1. Liposomal Prostaglandin for topical administration% (w / w)

Fase A: fase lipídica ‘Phospholipon 90H’ Colesterol Palmitato de ascorbilo Monolauroíl-li sina Ácido esteárico ‘Centrolex P’ Salicilato de metilo Prostaglandina E| Propileno-glicol 15,0 1,5 0,051,0 0,5 0,32,0 0,05 7.0Phase A: Phospholipon 90H Cholesterol Ascorbyl Palmitate Monolaurolysine Stearic Acid 'Centrolex P' Methyl Salicylate Prostaglandin E | Propylene glycol 15.0 1.5 0.051.0 0.5 0.32.0 0.05 7.0

Fase B: fase aquosa q.s. até 100Stage B: aqueous phase q.s. up to 100

Cloreto de sódio Trietanolamina GlicerolSodium chloride Triethanolamine Glycerol

Metil-parabeno Propil-parabeno Água destilada 0,9 0,5 5,00,1 0,02 98,48 57 2. Produto lipossómico para administração tópica com gotículas de óleo encapsuladasMethyl paraben Propyl paraben Distilled water 0.9 0.5 5.00.1 0.02 98.48 57 2. Liposomal product for topical administration with encapsulated oil droplets

Fase A: fase lipídica %(p/p) ‘Phospholipon 90H’ 5,0 Colesterol 2,0 Ácido esteárico 1,0Phase A: lipid phase% (w / w) 'Phospholipon 90H' 5.0 Cholesterol 2.0 Stearic acid 1.0

Sistema A: q.s. até 100 4,0 0,15 0,05System A: q.s. to 100 4.0 0.15 0.05

Parte 1: água destilada PEFAPart 1: PEFA distilled water

Metil-parabeno Propil-parabeno Parte 2: azeite 3. Produto lipossómico para administração tópica com um agente intensificador da consistência encapsulado % (p/p)Methyl paraben Propyl paraben Part 2: Olive oil 3. Liposomal product for topical administration with an encapsulated consistency enhancer% (w / w)

Fase A: fase lipídica ‘Phospholipon 90H’ 5,0Phase A: Phospholipon 90H 'lipid phase 5.0

Colesterol 2,0 Ácido esteárico 1,0Cholesterol 2.0 Stearic acid 1.0

Sistema A:System A:

Parte 1: água destilada q.s. até 100 PEFA 4,0Part 1: Distilled water q.s. up to 100 PEFA 4.0

Metil-parabeno 0,15Methyl paraben 0.15

Propil-parabeno 0,05Propyl paraben 0.05

Parte 2: estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6Part 2: Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6

Cera de abelhas sintética 0,28 58 4. Produto lioossómico Dara administração tópica com sotículas de óleo e agente intensificador da consistência encapsulados Fase A: fase lipídica % (p/p) ‘Phospholipon 90H’ 5,0 Colesterol 2,0 Ácido esteárico 1,0 Sistema A: Parte 1: água destilada q.s. até 100 PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 Parte 2: azeite 10,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 5. Produto lipossómico para administração tópica com extracto de plantas oleoso e agente intensificador da consistência encapsulados Fase A: fase lipídica % (p/p) ‘Phospholipon 90FF 5,0 Colesterol 2,0 Ácido esteárico 1,0 Sistema A: Parte 1: água destilada q.s. até 100 PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 59 Parte 2: camomila-alemã Extracto oleoso 5,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetQico 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 6. Produto lipossómico para administração tópica com um ingrediente activo cosmético solúvel em óleo e agente intensificador da consistência encapsuladosSynthetic beeswax 0.28 58 4. Phospholipon 90H 5.0 Phospholipon 90H 5.0 Cholesterol 2.0 Stearic acid 1 Phospholipon 90H 5.0 Phospholipon 90H 5.0 Phospholipon 90H 5.0 Phospholipon 90H 5.0 Phospholipon 90H 5.0 , System A: Part 1: Distilled water qs up to 100 PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 Part 2: olive oil 10.0 Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0.28 5. Liposomal product for topical administration with oily plant extract and encapsulated consistency enhancing agent Phase A: lipid phase% (w / w) Phospholipon 90FF 5.0 Cholesterol 2.0 Stearic acid 1.0 System A: Part 1: distilled water qs up to 100 PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 59 Part 2: German camomile Oily extract 5.0 Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0.28 6. Liposomal product for topical administration with an encapsulated oil soluble cosmetic active ingredient and consistency enhancer

Fase A: fase lipídica % (p/p) ‘Phospholipon 90H’ 5,0 Colesterol 2,0 Ácido esteárico 1,0 Sistema A: Parte 1: água destilada q.s. até 100 PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 Parte 2: vitamina E 10,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 7. Produto lipossómico para administração tópica com um fármaco lioofílico encapsulado em multicompartimentos e com eotículas de óleo e com um agente intensificador da consistência encapsulados 60 % (p/p) Fase A: fase lipídica ‘Phospholipon 90H’ 5,0 Colesterol 2,0 Ácido esteárico 1,0 Prostaglandina Ei 0,05 Sistema A: Parte 1: água destilada q.s. até 100 PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 Parte 2: azeite 10,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetíbco 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 Prostaglandina Ei 0,05 8 Produto liDOSsómico para administração tónica com um fármaco lipofilico encapsulado em multicompartimentos e com aotículas de óleo e com um agente intensificador da consistência encapsulados % (p/p) Fase A: fase lipídica ‘Phospholipon 90H’ 5,0 Colesterol 2,0 Ácido esteárico 1,0 Tetracaína 1,0 Sistema A: Parte 1: água destilada q.s. até 100 PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 61 azeite 10,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 Tetracaína 1,0 9. Produto lipossómico para administração tópica com um fármaco proteínico encapsulado e gotículas de óleo e com um agente intensificador da consistência encapsuladosPhase A: lipid phase% (w / w) Phospholipon 90H 5.0 Cholesterol 2.0 Stearic acid 1.0 System A: Part 1: distilled water q.s. up to 100 PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 Part 2: Vitamin E 10.0 Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0.28 7. Liposomal product for administration topical with a multi-compartment encapsulated lyophilic drug and with oil epoxies and a 60% (w / w) encapsulated consistency enhancer Phase A: Phospholipon 90H 'lipid phase 5.0 Cholesterol 2.0 Stearic acid 1.0 Prostaglandin Ei 0.05 System A: Part 1: distilled water qs up to 100 PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 Part 2: olive oil 10.0 Glyceryl stearate 1.0 Ketone alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0.28 Prostaglandin Ei 0.05 8 Product (p / p) Phase A: Phospholipon 90H 'lipid phase 5.0 Cholesterol 2.0 Stearic acid 1, 2, 3, 4, 0 Tetracaine 1.0 System A: Part 1: distilled water qs up to 100 PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 61 olive oil 10.0 Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0.28 Tetracaine 1.0 9. Liposomal product for topical administration with an encapsulated proteinaceous drug and oil droplets and with an encapsulated consistency enhancer

Fase A: fase lipídica % (p/p) ‘Phospholipon 90H’ 5,0 Colesterol 2,0 Monolauroíl-lisina 2,0 Sistema A: Parte 1: tampão fosfato q.s. até 100 PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 Interferão α 20 UM Parte 2: azeite 10,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 10. Produto lipossómico para administração tópica com uma combinação de fármacos antivirais na presença ou na ausência de agente intensificador da consistência encapsulados 62 62 Fase A: fase lipídica % (p/p) ‘Phospholipon 90H’ 10,0 ‘Phospholipon 90’ 0,5 Colesterol 1,0 Ácido esteárico 1,0 Propileno-glicol 7,0 ‘Ara-A’ 1,0 ‘MMUdR’ 1,0 Fase B: fase F aquosa q.s. até 100 OU: Fase B: Sistema A: q.s. até 100 Parte 1: água destilada q.s. até 100 PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 Parte 2: óleo de canola 10,0 11. Produto lipossómico para administração tópica com ingredientes activos cosméticos solúveis em óleo (vitaminas) e um agente intensificador da consistência encapsulados % (p/p) 5.0 2.0 1,0 0,5Phase A: lipid phase% (w / w) 'Phospholipon 90H' 5.0 Cholesterol 2.0 Monolauroyl lysine 2.0 System A: Part 1: phosphate buffer q.s. up to 100 PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 Interferon α 20 UM Part 2: olive oil 10.0 Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0.28 10. Product liposomal administration for topical administration with a combination of antiviral drugs in the presence or absence of encapsulated consistency enhancer 62 62 Phase A: lipid phase% (w / w) 'Phospholipon 90H' 10.0 'Phospholipon 90' 0.5 Cholesterol 1 , 0 Stearic acid 1.0 Propylene glycol 7.0 Ara-A '1.0' MMUdR '1.0 Phase B: aqueous phase F qs up to 100 OU: Phase B: System A: q.s. up to 100 Part 1: distilled water q.s. up to 100 PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 Part 2: canola oil 10.0 11. Liposomal product for topical administration with oil-soluble cosmetic active ingredients (vitamins) and a consistency-enhancing agent encapsulated% (w / w) 5.0 2.0 1.0 0.5

Fase A: fase lipídica ‘Phospholipon 90H’ Colesterol Acido esteárico Palmitato de ascorbilo 63Phase A: lipid phase 'Phospholipon 90H' Cholesterol Stearic acid Ascorbyl palmitate 63

Sistema A: Parte l: água destilada q.s. até PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 Parte 2: vitamina E 10,0 Vitamina A 2,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 12. Produto lipossómico para administração tópica com óleo e com um ingrediente activo cosmético solúvel em óleo e um agente intensificador da consistência encapsulados % (p/p) Fase A: fase lipídica ‘Phospholipon 90H’ Λ0 Colesterol 2,0 Sistema A: Parte 1: água destilada q.s. até PEFA 4,0 Metil-parabeno 0,15 Propil-parabeno 0,05 Parte 2: azulenol 0,1 Óleo de bagas de roseira brava 5,0 Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6 Cera de abelhas sintética 0,28 64 13. Produto lipossómico para administração tópica com óleo e com um ingrediente activo cosmético solúvel em óleo e um agente intensifícador da consistência encapsulados %(p/p)System A: Part 1: distilled water q.s. to PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 Part 2: Vitamin E 10.0 Vitamin A 2.0 Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0.28 12. Liposomal product for topical administration with oil and with an oil soluble cosmetic active ingredient and an encapsulated consistency enhancer (% w / w) Phase A: Phospholipon 90H 'lipid phase Λ0 Cholesterol 2.0 System A: Part 1: water distilled qs to PEFA 4.0 Methyl paraben 0.15 Propyl paraben 0.05 Part 2: azulenol 0.1 Rosehip berries oil 5.0 Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6 Synthetic beeswax 0, A liposomal product for topical administration with oil and with an oil-soluble cosmetic active ingredient and an encapsulated consistency enhancement agent (w / w)

Colesterol 2,0Cholesterol 2.0

Sistema A:System A:

Metil-parabeno 0,15Methyl paraben 0.15

Propil-parabeno 0,05Propyl paraben 0.05

Parte 2: a-bisabolol 10,0 Óleo de ‘rocou ami’ 3,0Part 2: a-bisabolol 10.0 Roque ami oil 3.0

Estearato de glicerilo 1,0 Álcool cetílico 0,6Glyceryl stearate 1.0 Cetyl alcohol 0.6

Cera de abelhas sintética 0,28 14. Produto lipossómico para administração tópica com um fármaco proteínico e um agente intensifícador da consistência encapsulados % (p/p)Synthetic beeswax 0.28 14. Liposomal product for topical administration with a proteinaceous drug and encapsulated strength agent (% w / w)

Colesterol 2,0Cholesterol 2.0

Monolauroíl-lisina 2,0Monolauroyl lysine 2.0

Sistema A:System A:

Parte 1: tampão fosfato q.s. até 100 PEFA 4,0Part 1: phosphate buffer q.s. up to 100 PEFA 4.0

Metil-parabeno 0,15 65Methyl paraben 0.15 65

65 0,05 2 UM 1,0 0,665 0.05 2 UM 1.0 0.6

Propil-parabeno Interferão γPropyl-paraben Interferon γ

Parte 2: estearato de glicerilo Álcool cetílicoPart 2: Glyceryl Stearate Cetyl Alcohol

Quando se utiliza compostos com grupos hidrofílicos acídicos (sulfato, fosfato, etc.), as VLPS (o mesmo que SPLV) irão ser aniónicas; com grupos alcalinos, tais como os grupos amino, serão obtidos lipossomas catiónicos; com grupos polietilenoxi ou glicol irão ser obtidos lipossomas neutros. O tamanho das VLPS varia bastante. O intervalo de variação vai desde cerca de 100 nm até cerca de 10 000 nm (10 μτη) e normalmente estará entre cerca de 100 nm e cerca de 1500 nm.When using compounds with acidic hydrophilic groups (sulfate, phosphate, etc.), the VLPS (the same as SPLV) will be anionic; with alkali groups, such as amino groups, cationic liposomes will be obtained; With neutral polyethyleneoxy or glycol groups, neutral liposomes will be obtained. The size of the VLPS varies greatly. The range ranges from about 100 nm to about 10 000 nm (10 μτη) and will usually be between about 100 nm and about 1500 nm.

Virtualmente é possível aprisionar qualquer composto bioactivo dentro de uma VLPS (o termo ‘aprisionar’ significa que o aprisionamento foi feito dentro do compartimento aquoso ou dentro da bicamada membranar). 66 QUADRO 14It is virtually possible to entrap any bioactive compound within a VLPS (the term 'entrap' means that entrapment was done within the aqueous compartment or within the membrane bilayer). TABLE 14

Tratamento de tecidos de condiloma excisados, efectuado com IFNa lipossómico para administração tópica em dose fraca (F n° l(t-80) durante 24 horasTreatment of excised condyloma tissues, performed with liposomal IFNα for weak dose topical administration (F No. 1 (t-80) for 24 hours

REGIME DE DOSAGEM IDOSAGE SCHEME I

Lesão condilomalosa Tamanho 0 (mm) Massa Superfície (cm2) IFN aplicado (UI) IFN na lesão total (UI) IFN nas camadas mais profandas (UI) 1 5 0.0794 0.78 560000 29800 25 700 2 4 0,0509 0,50 496000 31500 29200 3 7 0,0542 1,54 864000 18 100 13 100 4 4.5 0.0788 0,64 432000 70700 57800 5 5 0,0807 0,78 424000 31000 25 300 6 7 0,0621 1,54 240000 17400 13 900 7 6 0,0766 1,13 672 000 42 100 37700 Média 5,5 0,0689 0,95 527 000 34400±18 100 (6,5% do total aplicado) 29 000±15 300 (5,5% do total aplicado)Condylomaous lesion Size 0 (mm) Mass Surface (cm2) IFN applied (IU) IFN in the total lesion (IU) IFN in the most profusion layers (IU) 1 5 0.0794 0.78 560000 29800 25 700 2 4 0.0509 0.50 496000 31500 29200 3 7 0.0542 1.54 864000 18 100 13 100 4 4.5 0.0788 0.64 432000 70700 57800 5 5 0.0807 0.78 424000 31000 25 300 6 7 0.0621 1.54 240000 17400 13 900 7 6 0 , 0766 1.13 672 000 42 100 37700 Average 5.5 0.0689 0.95 527 000 34400 ± 18 100 (6.5% of the total applied) 29 000 ± 15 300 (5.5% of the total applied)

REGIME DE DOSAGEM IIDOSAGE SCHEME II

Lesão condilomatosa Tamanho 0 (mm) Massa Superfície (cm2) IFN aplicado (UI) IFN na lesão total (UI) IFN nas camadas mais profitndas (UI) 8 6 0,0925 1,13 . 1,34.\106 65 300 56700 9 8 0,1235 2,01 2,82.x 106 525 100 464 700 10 12 0,1845 4,52 2,42.\106 380 200 338 200 Média 8,7 0,1335 2,55 2,19xl06 323 500+235 100 (14,8% do total aplicado) 286500+208 900 (9,5% do total aplicado) 67 QUADRO 15Condylomatous lesion Size 0 (mm) Mass Surface (cm2) IFN applied (IU) IFN in the total lesion (IU) IFN in the most profitable layers (IU) 8 6 0.0925 1.13. 1.34. \ 106 65 300 56700 9 8 0.1235 2.01 2.82.x 106 525 100 464 700 10 12 0.1845 4.52 2.42 0.880 380 200 338 200 Mean 8.7 0 , 1335 2.55 2.19x106 323 500 + 235 100 (14.8% of the total applied) 286500 + 208 900 (9.5% of the total applied) 67 TABLE 15

Formulação de produtos de IFN lipossómicos para administração tópica FORMULAÇÕES MÉTODO DE FABRICO EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO* N° Fase lipídica mg/g de produto Fase aquosa μί/g de produto 1 ‘Phospholipcn 90H’ 70 Colesterol 18 Ácido esteárico 18 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20 x 106 UI) H20 q.s. liquefàcção (o mesmo que fusão) 55,9% ± 1,5% 2 ‘Phospholipcn 90H’ 70 Colesterol 18 Ácido esteárico 18 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20 x 106 UI) H20 q.s. evaporação do solvente 57,8% 3 ‘Phospholipcn 90H’ 100 Colesterol 18 Ácido deico 6 Ácido esteárico 6 Ácido erúcico 6 Palmitato de ascorbilo 0,5 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20 x 106 UI) H20 q.s. liquefàcção 57,3% 4 ‘Phospholipcn 90’ 200 Palmitato de ascorbilo 1 5,24 da finte de IFN H2Oq.s. liquefàcção 5 ‘Phospholipcn 90H’ 100 Colesterol 20 Áddo esteárico 10 Extracto de cérebro de bovino de tipo VID 5 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20xl06UI) H20 q.s. liquefàcção 59,2% 6 ‘Phospholipcn 90H’ 50 ‘Phospholipcn 90’ 50 Colesterol 20 Extracto de cérebro de bovino de tipo ΙΠ 10 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20xl06UI) H2Oq.s. liquefàcção 69,8% ±2,3 7 ‘Phospholipcn 90H’ 50 ‘Phospholipcn 90’ 50 Colesterol 20 Estearilamina 10 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20 x 106 UI) STP (o mesmo que PBS) qs. liquefàcção 65,9% 8 ‘Phospholipcn 90H’ 50 ‘Phospholipcn 90’ 50 COMPOSTO A 20 Colesterol 20 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20 x 106 Ul) STP q.s. liquefàcção 79,0% 9 ‘Phospholipon 90H’ 50 ‘Phospholipcn 90’ 50 COMPOSTO A 10 Colesterol 20 Propileno-glicol 70 10,48 da finte de IFN (20 x 106UI) STP q.s. liquefàcção 77,8%±1,3% 68 QUADRO 15 fcont.) FORMULAÇÕES MÉTODO DE FABRICO EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO* N° Fase lipídica mg/g de produto Fase aquosa μΐ/g de produto 10 ‘Phospholipcn 90H’ 100 COMPOSTO B 20 Colesterol 20 Piopileno-glicol 70 10,48 da fonte de IFN (20 x 106 Ul) STPq.s. liquefàcção 47,0% ± 1,3% 11 ‘Phospholipon 90H’ 100 COMPOSTO A 10 COMPOSTO B 10 Colesterol 20 Propileno-glicol 70 10,48 da fonte de IFN (20 x 106 UI) STP q.s. liquefàcção 75,2% 12 ‘Phospholipon 90H’ 50 ‘Phospholipcn 90’ 50 COMPOSTO B 10 Colesterol 20 Propileno-glicol 70 10,48 da fonte de IFN (20 x 106U1) STP q.s. liquefàcção 45,7% 13 ‘Phospholipon 90’ 100 COMPOSTO A 20 Colesterol 20 Propileno-glicol 70 10,48 da fonte de IFN (20 x 106 UI) STP q.s. liquefàcção 73,1% 14 ‘Phospholipon 90H’ 100 ‘Centrolex P’ 10 Colesterol 20 Propileno-glicol 70 10,48 da fonte de IFN (20 x 106 UI) STPq.s. liquefàcção 54,8% * As medições da eficiência de encapsulação são a média de 2 a 5 experiências independentes COMPOSTO A - dipalmitoíl-lisina COMPOSTO B = monolauroíl-lisina 69 QUADRO 16Formulation of liposomal IFN products for topical administration FORMULATIONS MANUFACTURING METHOD ENCAPSULATION EFFICIENCY * No. Lipid phase mg / g product Aqueous phase μg / g of product 1 'Phospholipine 90H' 70 Cholesterol 18 Stearic acid 18 Propylene glycol 70 10, 48 of the IFN finte (20 x 106 IU) H20 qs (same as melting) 55.9% ± 1.5% 2 'Phospholipine 90H' 70 Cholesterol 18 Stearic acid 18 Propylene glycol 70 10.48 of the IFN finte (20 x 106 IU) H20 q.s. evaporation of solvent 57.8% 3 'Phospholipine 90H' 100 Cholesterol 18 Deic acid 6 Stearic acid 6 Erucic acid 6 Ascorbyl palmitate 0.5 Propylene glycol 70 10.48 of IFN finte (20 x 106 IU) H20 q.s. liquefaction 57.3% 4 'Phospholipine 90' 200 Ascorbyl palmitate 1 5.24 of the IFN H2Oq.s finite. 5 'Phospholipine 90H' 100 Cholesterol 20 Stearic Acid 10 VID 5 bovine brain extract Propylene glycol 70 10.48 IFN finte (20x106 UI) H20 q.s. Phospholipine 90H 50 Phospholipine 90 50 Cholesterol 20 Bovine Brain Extract ΙΠ 10 Propylene Glycol 70 10.48 Fetal IFN (20x106 IU) H2 Oq.s. (20 x 10 6 IU) STP (the same as PBS) qs. The compound of claim 1, which is the same as that of PBS. Phospholipine 90H 50 Phospholipine 90 50 COMPOSITION A 20 Cholesterol 20 Propylene Glycol 70 10.48 of the IFN-finite (20 x 106 IU) STP q.s. Phospholipon 90H 50 Phospholipine 90 50 COMPOSITION A 10 Cholesterol 20 Propylene Glycol 70 10.48 of the IFN finte (20 x 106 IU) STP q.s. TABLE 15 FORMULATIONS MANUFACTURING METHOD ENCAPSULATION EFFICIENCY * No. Lipid phase mg / g of product Aqueous phase μΐ / g of product 10 'Phospholipcn 90H' 100 COMPOUND B 20 Cholesterol 20 Piopylene glycol 70 10.48 of the IFN source (20 x 106 IU) STPq.s. liquefaction 47.0% ± 1.3% 11 'Phospholipon 90H' 100 COMPOUND 10 COMPOSITE B 10 Cholesterol 20 Propylene glycol 70 10.48 of the IFN source (20 x 106 IU) STP q.s. Phospholipon 90H 50 COMPOSITE B 10 Cholesterol 20 Propylene glycol 70 10.48 of the IFN source (20 x 106U1) STP q.s. Phospholipon 90 '100 COMPOSITION A 20 Cholesterol 20 Propylene glycol 70 10.48 of the IFN source (20 x 106 IU) STP q.s. (%) Phospholipon 90H '100' Centrolex P '10 Cholesterol 20 Propylene glycol 70 10.48 of the IFN source (20 x 106 IU) STPq.s. 54.8% * Encapsulation efficiency measurements are the mean of 2 to 5 independent experiments COMPOUND A - dipalmitoyl-lysine COMPOUND B = monolauroyl lysine 69 TABLE 16

Propriedades dos lipossomas que contêm IFNaProperties of the IFNa-containing liposomes

Formulação n° Propriedades organoléptícas Estabilidade* Distribuição do tamanho dos lipossomas/ /microscopia 1 creme branco homogéneo (7) VML, 1-30μιη, agregação, fusão 2 creme branco homogéneo (7) VML, l-ΙΟμτη, distribuição uniforme dos lipossomas, sem fusão nem agregação 3 loção branca homogénea (7) VML, 1-1 Opm, distribuição uniforme dos lipossomas, sem fusão nem agregação 4 líquido amarelo não atractivo não se formaram lipossomas 5 creme macio branco homogéneo (5) VML, 1-15pm, distribuição uniforme dos lipossomas, fusão ligeira, ausência de agregação 6 loção homogénea de cor-de-vinho amarelada (5) VML, 1-5μτη, distribuição uniforme dos lipossomas, fusão ligeira, ausência de agregação 7 creme homogéneo de cor branca amarelada (5) VML, Ι-15μτη, sinais de separação de fases, sem agregação nem fusão 8 creme branco homogéneo (8) VML, l-5pm, distribuição uniforme dos lipossomas, sem fusão nem agregação 9 creme branco viscoso e homogéneo (8) VML, 1-5μτη, distribuição uniforme dos lipossomas, sem fusão nem agregação 10 liquido branco não homogéneo (D VML, 1-20μτη, agregação, estão presentes partículas amorfas 11 creme macio branco homogéneo (6) VML, 1-1 Opm, sinais de separação de fases, fusão ligeira, ausência de agregação, estão presentes algumas partículas amorfas 12 líquido branco e homogéneo (6) VML, 1-5μητ, sinais de separação de fases, fusão ligeira, ausência de agregação, estão presentes partículas amorfas 13 loção branca não homogénea (6) Lipossomas? ou emulsão?, estão presentes partículas amorfas e fragmentos membranares 14 loção branco homogénea (5) VML, l-20pm, agregação, fusão, sinais de separação de fases * Avaliou-se a estabilidade dos lipossomas ao fim de 1 mês, de acordo com a escala de classificação seguinte. Classificação da estabilidade visual para produtos do sistema disperso (S.A. Hanna, 1989) 9 Ausência de separação visual, completamente homogéneo 8 Ausência de separação visual, virtualmente homogéneo 7 Separação muito indistinta, ausência de uma camada nítida no fundo ou em cima 6 Separação indistinta, ausência de uma camada nítida no fundo ou em cima 5 Separação distinta, ausência de uma camada nítida no fundo ou em cima 4 Camada homogénea em cima ou no fundo, camada nítida no fundo ou em cima 3 Separação distinta, camada nítida no fundo ou em cima, sem coalescência 2 Separação distinta com coalescência ligeira 1 Separação distinta com coalescência ligeira 0 Separação total e coalescência totalFormulation No. Organoleptic properties Stability * Distribution of liposome size / microscopy 1 homogeneous white cream (7) VML, 1-30μιη, aggregation, melting 2 homogeneous white cream (7) VML, l-ΙΟμτη, uniform distribution of liposomes without (7) VML, 1-1 Opm, uniform distribution of liposomes, no fusion or aggregation 4 Yellow liquid not attractive No liposomes formed 5 Soft white cream homogeneous (5) VML, 1-15pm, distribution (5) VML, 1-5μτη, uniform distribution of liposomes, slight melting, absence of aggregation 7 homogeneous cream of yellow-white color (5) VML, 1-5μτη, uniform distribution of liposomes, VML, Ι-15μτη, phase separation signals, no aggregation or fusion 8 homogeneous white cream (8) VML, 1-5pm, uniform distribution of liposomes, no fusion or aggregation 9 cre (VML, 1-20μτη, aggregation, amorphous particles are present 11 homogeneous white soft cream (6), with a homogeneous white viscous (8) VML, 1-5μτη, uniform distribution of liposomes without melting or aggregation 10 non-homogeneous white liquid VML, 1-1 Opm, phase separation signals, light melting, absence of aggregation, some amorphous particles 12 are white and homogeneous (6) VML, 1-5μητ, phase separation signals, slight melting, absence of aggregation, amorphous particles are present 13 non-homogeneous white lotion (6) Liposomes? or emulsion?, amorphous particles and membrane fragments are present 14 homogeneous white lotion (5) VML, 1-20pm, aggregation, melting, phase separation signals. The stability of the liposomes was evaluated at 1 month, according to the next classification scale. Classification of visual stability for products of the dispersed system (SA Hanna, 1989) 9 Absence of visual separation, completely homogeneous 8 Absence of visual separation, virtually homogeneous 7 Separation very indistinct, absence of a clear layer on the bottom or top 6 Separation, absence of a clear layer on the bottom or top 5 Separate separation, no clear layer on the bottom or top 4 Smooth layer on top or bottom, clear layer on the bottom or top 3 Separate separation, coalescence 2 Separate separation with slight coalescence 1 Separate separation with slight coalescence 0 Total separation and total coalescence

Lisboa, 15 de Novembro 2000 ?4Lisbon, 15th November 2000? 4

Claims

A liposomal composition for topical administration of an agent having a pharmaceutical, pharmacological or cosmetic effect, comprising: a suspension of multilamellar liposomes which can be obtained by: (i) preparing an oil-in-water type emulsion, said oil-in-water emulsion stabilized by means of a surfactant, and (ii) blending said oil-in-water emulsion with vesicle-forming lipids, said liposomes being (i) a membrane (ii) a central nuclear compartment containing said oil-in-water type emulsion and (iii) a captive agent having a pharmaceutical, pharmacological or cosmetic effect.

A composition according to claim 1, wherein said oil-in-water emulsion also comprises a lipophilic compound selected from the group consisting of fatty alcohols, waxes, fatty alcohol esters, fatty acid esters, esters glycerides, refined petrolatum and mixtures thereof.

The composition of any one of claims 1 or 2, wherein said oil-in-water emulsion is stabilized by means of a cationic surfactant.

The composition according to claim 3, wherein said cationic surfactant is selected from the group consisting of dimethyl chloride linoleamidopropyl PG-phosphate 2, dimonium chloride cocamidopropyl PG-phosphate and stearazopropyl PG-phosphate of the dimonium chloride.

A composition according to any one of the preceding claims, wherein said lipid bilayer type outer membrane also comprises a lipid selected from steroids, saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, fatty amines and proteins and acylated fatty peptides.

A composition according to any one of the preceding claims, wherein said liposome suspension also contains a penetration enhancing agent.

The composition of claim 6, wherein said penetration enhancing agent is methyl salicylate or an acylated fatty acid.

The composition of claim 7, wherein said penetration enhancing agent is monolauroyl lysine.

A composition according to any one of the preceding claims, wherein said trapped agent is selected from prostaglandins, local anesthetics, proteins, peptides, antiviral agents, vitamins, anti-inflammatory agents, antifungal agents, corticosteroids, extracts of plants, amino acids and nucleoside analogs.

A composition according to any one of claims 1 to 8, wherein said entrapped agent is selected from prostaglandin E1, tetracaine, lidocaine, etidocaine, interferon α, interferon γ, adenine-PD-arabinoyluranoside (Ara-A), 5- methoxy-

methyl-2'-deoxyuridine (MMUdR), vitamin A, vitamin C, vitamin E, provitamin B5, azulene, allantoin, α-bisabolol and L-camitine.

A composition according to any one of the preceding claims, wherein said preparation consists of mixing a lipophilic substance in an aqueous medium in the presence of said surfactant to form said oil-in-water emulsion and wherein said emulsion admixture comprises the step of adding said oil-in-water emulsion to the vesicle-forming lipids solubilized in a pharmaceutically acceptable hydrophilic solvent other than water.

Use of prostaglandin E (as the trapped agent for the preparation of a liposomal composition according to any one of claims 1 to 11, for use in the treatment of impotence.

Use of interferon α as the trapped agent for the preparation of a liposomal composition according to any one of claims 1 to 11, for use in the treatment of a human papilloma virus infection.

A process for the preparation of a liposome composition according to any one of claims 1 to 11, which comprises preparing an oil-in-water emulsion, said oil-in-water type emulsion stabilized by means of a surfactant, and in mixing said oil-in-water emulsion with the vesicle-forming lipids.