PT2252309E - Composições nutricionais para a promoção do crescimento ósseo e manutenção da saúde óssea compreendendo extractos de, por exemplo, alecrim ou cominhos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES NUTRICIONAIS PARA A PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO ÓSSEO E MANUTENÇÃO DA SAÚDE ÓSSEA COMPREENDENDO EXTRACTOS DE, POR EXEMPLO, ALECRIM OU COMINHOS" A presente invenção refere-se, em geral, a novos compostos e a composições nutricionais que proporcionam benefícios para a saúde. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a composições benéficas que podem ser utilizadas, por exemplo, para melhorar a densidade e formação ósseas e/ou para induzir a expressão de proteína morfogénica óssea. As formas de realização da presente invenção referem-se a compostos de acordo com a reivindicação 1. A massa óssea evolui ao longo da vida e é regulada por mecanismos genéticos, mecânicos e hormonais. A aquisição mineral óssea ocorre durante a infância e o pico de massa óssea é alcançado em torno dos 20 anos de idade. Durante este período, a formação óssea excede a reabsorção óssea. No final da vida e, particularmente por volta da altura da menopausa, ou na população idosa, a massa e qualidade ósseas estão debilitadas, devido a uma rotação óssea mais elevada, com reabsorção óssea excessiva, conduzindo a uma perda gradual de massa, microarquitectura, estrutura e resistência ósseas. Para manter o osso, é importante restaurar o equilíbrio entre formação óssea e reabsorção óssea. Este processo de remodelação óssea é regulado ao nível celular ósseo, envolvendo uma estreita interacção entre células de formação óssea (osteoblastos) e células de reabsorção óssea (osteoclastos). 1

Os fitonutrientes, especialmente flavonóides, podem influenciar positivamente o processo de remodelação óssea. Os dados mais referidos são para as isoflavonas de soja que, em alguns estudos, se mostrou que previnem a perda óssea e melhoram a densidade mineral óssea (BMD) em mulheres pós-menopáusicas, a doses de 50 - 90 mg/dia. Contudo, nem todos os estudos com isoflavonas são positivos e ainda existe controvérsia sobre a sua eficácia. Além disso, existe alguma evidência epidemiológica para os benefícios do chá, visto que um estudo anterior mostrou que os consumidores de chá tinham uma BMD média mais elevada do que os não consumidores de chá, numa população idosa, contudo não foram efectuados estudos de intervenção para substanciar esta verificação.

Actualmente, existe um forte interesse na identificação de agentes que possam estimular a formação óssea. Mostrou-se que a distribuição de BMP-2 recombinante induz a formação óssea ou de cartilagem. Por exemplo, a proteína morfogénica óssea 2 (BMP-2) é um membro da família de ΤΟΡβ e é um regulador chave do crescimento ósseo durante o desenvolvimento embrionário e ainda do crescimento e reparação ósseos. As estatinas (fármacos eficazes para a diminuição do colesterol, através da inibição da enzima HMG-CoA redutase) melhoram a formação óssea, parcialmente mediada pela indução de BMP-2 (G. Mundy, et al., Science 286: 1946-1949 (1999); C.J. Edwards, et al., Lancet, 355: 2218-2219 (2000)). As estatinas também foram capazes de reduzir o risco de fractura da anca em mulheres menopáusicas (P.S. Wang, et al., JAMA 283:3211-3216 (2000)). A presente invenção refere-se, em geral, a composições para a manutenção da saúde óssea ou prevenção, alívio e/ou tratamento 2 de distúrbios ósseos. A presente invenção também proporciona 6 "- Feruloilnepitrina, 6 Cumaroilnepitrina e um composto com a seguinte fórmula

ácido desidroxirosmarínico, que pode ser utilizado nas composições da presente invenção. Em particular, a presente invenção refere-se a um composto para utilização de acordo com a reivindicação 1. 6 "- Feruloilnepitrina, 6 "-Cumaroilnepitrina, ácido desidroxirosmarínico, podem ser proporcionados na forma de um extracto de planta. 0 produto pode ser um medicamento, um produto alimentar, suplemento nutricional e/ou nutracêutico para humanos e/ou animais de estimação. De um modo preferido, o produto compreende o pelo menos um polifenol, numa quantidade de 0,001-100% em peso, do peso seco total da composição. O pelo menos um polifenol pode ser para administrar numa quantidade de 0,01 pg -100 mg, por kg de peso corporal, por dia. O produto pode ainda compreender uma fonte de proteína, uma fonte de gordura e/ou uma fonte de hidratos de carbono. A fonte de proteína pode proporcionar cerca de 1-55% da energia total do produto, a fonte de gordura pode proporcionar cerca de 5-55% da 3 energia total do produto e a fonte de hidratos de carbono pode proporcionar cerca de 40-80% da energia total do produto. O produto pode ser destinado a aplicação oral e/ou entérica.

De um modo preferido, o produto pode estar numa forma seleccionada do grupo consistindo num alimento nutricionalmente equilibrado, uma fórmula nutricionalmente completa, um suplemento dietético, um produto lácteo, uma bebida refrigerada ou de durabilidade longa, uma sopa, uma barra nutricional, alimento para animais de estimação, confeitaria, uma composição farmacêutica e suas combinações. 0 produto preparado pela utilização da presente invenção pode ser utilizado para tratar ou prevenir a osteoporose. A presente invenção proporciona um método de tratamento ou prevenção de osteoporose, o método compreendendo a administração, a um indivíduo tendo ou em risco de ter osteoporose, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo um ingrediente activo tendo uma quantidade eficaz de, pelo menos, um novo composto e/ou, pelo menos, um polifenol da presente invenção, tendo a capacidade de induzir a expressão de proteína morfogénica óssea no indivíduo.

Características e vantagens adicionais da presente invenção são aqui descritas e serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, das figuras e dos exemplos. 4

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 ilustra um protocolo de extracçao. A FIG. 2 ilustra um sumário do processo de extracção e primeiro fraccionamento. A FIG. 3A ilustra resultados de BMP-2 para extractos de alecrim e cominhos. A FIG. 3B ilustra resultados de fosfatase alcalina para extractos de alecrim e cominhos. A FIG. 3C ilustra a formação óssea em cultura de órgãos para extractos de alecrim e cominhos. A FIG. 4 ilustra um processo de extracção utilizando um extracto inicial de metanol/água e actividade de BMP-2 dos extractos (de 80 g de folhas secas (hexano = 6 g)). A FIG. 5 ilustra a formação óssea in vivo com extracto de alecrim. A FIG. 6A ilustra fenólicos verificados positivos no ensaio de BMP-2. A FIG. 6B ilustra um ensaio de fosfatase alcalina de fenólicos positivos para BMP-2. A FIG. 6C ilustra uma formação óssea de cultura de órgãos: exemplos com eupafolina e carnosol. 5 A FIG 7 proporciona detalhes dos efeitos do extracto de alecrim na actividade de osteoclastos humanos. A FIG 8 mostra a indução de ARNm de Osteopontina (OPN) em células de osteoblastos humanos (hPOBterc) por extracto de alecrim ou carnosol. A FIG. 9 mostra que o Carnosol induz a expressão da enzima NQ01 de fase II, um gene/proteína tipicamente regulado por Nrf-1.

Em plantas, verificou-se que vários isoprenóides (monoterpenos, sesquiterpenos, etc.) são moduladores de HMG-CoA redutase e prenilação de proteína, mecanismos provavelmente ligados à inibição da reabsorção óssea ou estimulação da formação óssea. Por conseguinte, determinados compostos de plantas podem ser potenciais inibidores da reabsorção óssea e/ou estimuladores da formação óssea.

Os extractos compreendendo os polifenóis da presente invenção foram preparados a partir de espécies de plantas comestíveis e/ou medicinais, tendo um potencial para estimular BMP-2 e a formação óssea. Como discutido em maior detalhe mais tarde, os extractos foram, em geral, preparados por um processo de 4 etapas (a) hexano, (b) metanol-água, (c) extractos de metanol-água hidrolisados com glicosidases e reextraídos com acetato de etilo e (d) remoção de polifenóis de grandes dimensões com uma coluna de PVPP. Os extractos de metanol-água e acetato de etilo foram utilizados para rastreio in vitro. Os extractos foram hidrolisados por a- e β-glicosidases, em vez de ácido, para garantir a libertação de agliconas de flavonóides (a forma biologicamente activa) a partir dos seus glicósidos. 6

Os seguintes bioensaios foram utilizados para análise de formação óssea

Ensaio de gene repórter de capacidade) Fosfatase alcalina em células Cultura de órgãos de calvária Injecção na calvária in vivo, BMP-2 (rastreio de alta de osteoblastos in vitro, formação óssea formação óssea.

Por exemplo, os extractos foram rastreados para formação óssea por um ensaio de gene repórter de alta capacidade para BMP-2, seguido de um ensaio de fosfatase alcalina e um modelo de cultura de órgãos e, finalmente, por injecção na calvária de murganhos in vivo. As subfracções de extractos positivos e/ou compostos puros foram ainda testadas para actividade. De modo a determinar os compostos activos, foi realizada a análise da composição química de um extracto activo.

Verificou-se, surpreendentemente, que, e. g., os compostos extraídos de plantas de alecrim poderiam ser utilizados como compostos activos para desenvolvimento, crescimento e/ou manutenção ósseos. Por exemplo, verificou-se que os seguintes compostos fenólicos têm um potencial anabólico: 6 Feruloilnepitrina, 6 "-Cumaroilnepitrina e/ou ácido desidroxirosmarínico. Os extractos de plantas de alecrim e os compostos puros foram testados num sistema de co-cultura de osteoblasto/osteoclasto. Mostrou-se que o extracto de alecrim, assim como, e. g., eupafolina, carnosol e escutelareína, têm uma actividade para regulação das citocinas chave controlando a remodelação óssea, i. e., OPG/RANKL. Além disso, verificou-se 7 que o carnosol estimula a expressão de osteopontina (OPN) em células de osteoblastos humanos, possivelmente por meio das vias de sinalização de AP-l/Nrf-2.

Foram identificados três novos polifenóis activos e, de acordo com o conhecimento da requerente, nunca foram descritos na literatura.

Estes são 6 Feruloilnepitrina, 6 Cumaroilnepitrina e um composto com a seguinte fórmula

ácido desidroxirosmarínico.

Numa forma de realização da presente invenção, os novos compostos e/ou polifenóis da presente invenção são obtidos de extractos de metanol/água da planta de alecrim (25% da matéria seca da folha inicial) , obtidos após uma etapa de desengorduramento com hexano, contêm as moléculas responsáveis pela actividade e poderiam ser utilizados num produto alimentar. A sua actividade in vitro foi observada no extracto inicial de metanol/água e como compostos puros. É observada uma elevada actividade num ensaio de BMP-2, após purificação/concentração através de extracção com acetato de etilo e/ou hidrólise com glucosidase e subsequente extracção com acetato de etilo. Visto que a actividade dos compostos puros é significativamente superior à actividade nos extractos iniciais de MeOH/água, prefere-se que os extractos de plantas utilizados de acordo com a presente invenção sejam enriquecidos nos polifenóis da presente invenção. Prefere-se que a concentração dos polifenóis da presente invenção no extracto de planta enriquecido seja, pelo menos, 2 vezes, de um modo preferido, 10 vezes, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 50 vezes, em comparação com o seu teor nos extractos de MeOH/água descritos acima. Comparativamente com a planta natural, o teor dos polifenóis da presente invenção no extracto enriquecido está, de um modo preferido, pelo menos, 10 vezes aumentado, de um modo preferido, pelo menos, 100 vezes aumentado, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 500 vezes aumentado.

Os novos compostos e polifenóis da presente invenção, ou plantas ou extractos de plantas compreendendo-os, em particular plantas ou extractos de plantas de alecrim, podem ser utilizados na preparação de uma composição alimentar. A composição pode estar na forma de um alimento ou alimento para animais de estimação nutricionalmente equilibrado, um suplemento dietético, uma gulodice ou uma composição farmacêutica.

Os novos compostos e polifenóis podem ser utilizados isoladamente ou em associação com outros compostos, plantas ou extractos de plantas, tais como chicória, chá, cacau, ou com uma ou mais outras moléculas bioactivas, tais como antioxidantes, ácidos gordos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de condroitina, por exemplo.

Numa forma de realização da presente invenção, é preparada uma composição alimentar ou uma fórmula nutricional para consumo 9 humano. Esta composição pode ser uma fórmula nutricional completa, um produto lácteo, uma bebida refrigerada ou de durabilidade longa, uma sopa, um suplemento dietético, um substituto de refeição, uma barra nutricional ou confeitaria.

Uma fórmula nutricional preparada pela utilização da presente invenção pode compreender uma fonte de proteína. As proteínas dietéticas são utilizadas, de um modo preferido, como uma fonte de proteína. As proteínas dietéticas podem ser qualquer proteína dietética adequada; por exemplo, proteínas animais (tais como proteínas lácteas, proteínas cárneas e proteínas de ovo); proteínas vegetais (tais como proteína de soja, proteína de trigo, proteína de arroz e proteína de ervilha); misturas de aminoácidos livres; ou suas combinações. Proteínas lácteas, tal como caseína, proteínas de trigo e proteínas de soja são particularmente preferidas. A composição também pode conter uma fonte de hidratos de carbono e uma fonte de gordura.

Se a fórmula nutricional incluir uma fonte de gordura, a fonte de gordura proporciona, de um modo preferido, cerca de 5% a cerca de 55% da energia da fórmula nutricional; por exemplo, cerca de 20% a cerca de 50% da energia. Os lípidos constituindo a fonte de gordura podem ser qualquer gordura ou misturas de gorduras adequadas. São particularmente adequadas as gorduras vegetais; por exemplo, óleo de soja, óleo de palma, óleo de coco, óleo de cártamo, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de colza, lecitinas e semelhantes. Se desejado, também podem ser adicionadas gorduras animais, tal como gorduras lácteas.

Uma fonte de hidratos de carbono pode ser adicionada à fórmula nutricional. Esta proporciona, de um modo preferido, 10 cerca de 40% a cerca de 80% da energia da composição nutricional. Podem ser utilizados quaisquer hidratos de carbono adequados, por exemplo, sacarose, lactose, glucose, frutose, sólidos de xarope de milho e maltodextrinas e suas misturas. Se desejado, também pode ser adicionada fibra dietética. Se utilizada, compreende, de um modo preferido, até cerca de 5% da energia da fórmula nutricional. A fibra dietética pode ser de qualquer origem adequada incluindo, por exemplo, soja, ervilha, aveia, pectina, goma de guar, goma arábica e frutooligossacáridos. Vitaminas e minerais adequados podem estar incluídos na fórmula nutricional, numa quantidade que cumpra as directrizes apropriadas.

Se desejado, um ou mais emulsionantes de classe alimentar podem estar incorporados dentro da fórmula nutricional; por exemplo, ésteres do ácido diacetiltartárico de mono- e di-glicéridos, lecitina e mono- e di-glicéridos. De modo semelhante, podem estar incluídos sais e estabilizantes adequados. Vitaminas e minerais também podem ser combinados com o extracto de planta. A composição nutricional é, de um modo preferido, administrável entericamente; por exemplo, na forma de um pó, comprimido, cápsula, um concentrado líquido, produto sólido ou uma bebida pronta para consumo. Se for desejado produzir uma fórmula nutricional em pó, a mistura homogeneizada é transferida para um aparelho de secagem adequado, tais como um secador por pulverização ou liofilizador, e convertida em pó.

Noutra forma de realização, uma composição nutricional compreende um cereal à base de leite, juntamente com uma formulação prebiótica. De um modo preferido, o cereal à base de 11 leite é um cereal infantil que actua como um veiculo para a formulação prebiótica.

Noutra forma de realização, um produto alimentar pode ser enriquecido com, pelo menos, um composto, planta ou extracto de planta de acordo com a presente invenção. Por exemplo, um leite fermentado, um iogurte, um queijo fresco, um leite coagulado, artigo de confeitaria, uma bebida doce ou açucarada, uma barra de confeitaria, flocos ou barras de cereais para o pequeno-almoço, bebidas, leites em pó, produtos à base de soja, produtos fermentados não lácteos ou suplementos nutricionais para nutrição clinica. A quantidade dos novos compostos e/ou polifenóis da presente invenção e - se presentes - planta ou extracto de planta, na composição, pode variar de acordo com a sua fonte e sua utilização. Numa forma de realização preferida, uma quantidade de dose diária eficiente é de, pelo menos, cerca de 1 mg e, de um modo mais preferido, de 1 mg a 200 mg, da molécula activa, por dia.

Numa forma de realização alternativa, pode ser preparada uma composição farmacêutica contendo, pelo menos, um novo composto e/ou um polifenol da presente invenção, como descrito acima, numa quantidade suficiente para alcançar o efeito desejado num indivíduo. Esta composição pode ser um comprimido, um líquido, cápsulas, cápsulas macias, pastas ou pastilhas, gomas ou soluções ou emulsões bebíveis, um suplemento oral seco, um suplemento oral húmido. A composição farmacêutica pode ainda conter veículos e excipientes que sejam adequados para distribuição da respectiva molécula activa de natureza diferente para o tecido alvo. O tipo do veículo/excipiente e a sua 12 quantidade irá depender da natureza da substância e do modo de distribuição e/ou administração do fármaco contemplado. Será entendido que o especialista irá, com base no seu próprio conhecimento, seleccionar os componentes apropriados e forma galénica. 0 novo composto e/ou polifenol de acordo com a invenção pode ser utilizado na preparação de uma composição de alimento para animais de estimação. A referida composição pode ser administrada ao animal de estimação como um suplemento à sua dieta normal ou como um componente de um alimento para animais de estimação nutricionalmente completo e, de um modo mais preferido, num alimento para animais de estimação hipocalórico. Também pode ser uma composição farmacêutica para animais de estimação. 0 novo composto e/ou polifenol de acordo com a invenção pode ser utilizado isoladamente ou em associação com outras plantas, tais como chicória, chá, cacau ou com outras moléculas bioactivas, tais como antioxidantes, ácidos gordos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de condroitina, por exemplo.

De um modo preferido, uma composição de alimento para animais de estimação, preparada de acordo com a presente invenção, contém cerca de 0,01 a 100 mg dos compostos e/ou polifenóis por grama de alimento para animais de estimação seco. A composição de alimento para animais de estimação nutricionalmente completa de acordo com a invenção pode estar na forma de pó, seca, uma gulodice ou um produto alimentar para animais de estimação húmido, refrigerado ou de durabilidade longa. Pode ser refrigerada ou proporcionada como um produto de 13 durabilidade longa. Estes alimentos para animais de estimação podem ser produzidos por modos conhecidos na técnica. 0 alimento para animais de estimação também pode, opcionalmente, conter um prebiótico, um microrganismo probiótico ou outro agente activo, por exemplo um ácido gordo de cadeia longa. A guantidade de prebiótico no alimento para animais de estimação é, de um modo preferido, inferior a 10% em peso. Por exemplo, o prebiótico pode compreender cerca de 0,1% a cerca de 5%, em peso, do alimento para animais de estimação. Para alimentos para animais de estimação que utilizam chicória como a fonte do prebiótico, a chicória pode estar incluída até compreender cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, da mistura alimentar; de um modo mais preferido, cerca de 1% a cerca de 5% em peso.

Se for utilizado um microrganismo probiótico, o alimento para animais de estimação contém, de um modo preferido, cerca de 104 a cerca de IO10 células do microrganismo probiótico por grama do alimento para animais de estimação; de um modo mais preferido, cerca de 106 a cerca de 106 células do microrganismo probiótico por grama. O alimento para animais de estimação pode conter cerca de 0,5% a cerca de 20 % em peso, da mistura do microrganismo probiótico; de um modo preferido, cerca de 1% a cerca de 6% em peso; por exemplo, cerca de 3% a cerca de 6% em peso.

Se necessário, o alimento para animais de estimação pode ser suplementado com minerais e vitaminas, de modo a ser nutricionalmente completo. Além disso, diversos outros ingredientes, por exemplo, açúcar, sal, especiarias, temperos, agentes aromatizantes e semelhantes, também podem estar 14 incorporados dentro do alimento para animais de estimação como desejado.

Noutra forma de realização, podem ser preparados auxiliares dietéticos, de modo a melhorar a qualidade do alimento para animais de estimação. Como auxiliares dietéticos, podem estar encapsulados ou podem ser proporcionados na forma de pó e embalados em conjunto ou separadamente com uma refeição principal, seja húmida ou seca. A titulo exemplificativo, um pó contendo extractos de acordo com a invenção, pode ser embalado em saquetas numa forma de pó ou num gel ou lipido ou outro veiculo adequado. Estas unidades separadamente embaladas podem ser proporcionadas juntamente com uma refeição principal ou em embalagens multiunidade, para utilização com uma refeição principal ou gulodice, de acordo com instruções de utilizador.

Administrando a um humano ou animal, a composição alimentar ou de alimento para animais de estimação, como descrita acima, resulta numa redução do risco de desenvolvimento de osteoporose.

Fica claro para os especialistas na técnica que podem combinar livremente todas as características como aqui divulgadas, sem sair do âmbito da invenção como divulgada.

Vantagens e características adicionais da presente invenção serão evidentes a partir dos exemplos e figuras.

EXEMPLOS A título exemplificativo e nao de limitação, os seguintes exemplos são ilustrativos ou comparativos de diversas formas de 15 realização da presente invenção e ilustram, ainda, a testagem experimental conduzida de acordo com as formas de realização da presente invenção. EXEMPLO 1 (Fonte) de extractos de especiarias ricos em polifenóis : Alguns polifenóis são encontrados em extractos de alecrim ou cominhos TABELA 1: Fonte de extractos de especiarias ricos em polifenóis NOME GÉNEROS ESPÉCIES ÓRGÃO Alecrim Rosmarinus officinalis folhas Cominhos Carum carvi sementes Tomilho Thymus vulgaris folhas Hortelã-verde Mentha spicata folhas

Processo de Extracção de Planta

Fazendo referência à FIG. 1, o processo de extracção incluiu, em geral, as seguintes etapas: • Hexano, desengorduramento (extractos não rastreados) • Me0H/H20 (la) • Me0H/H20, hidrolisado com a, β-glicosidases, extraído com acetato de etilo (lb) 16 remover • la purificado em coluna de PVPP, para polifenóis de elevado peso molecular (2a) • lb purificado em coluna de PVPP, para remover polifenóis de elevado peso molecular (2b)

Os extractos 2a e 2b proporcionaram resultados semelhantes aos extractos la e lb. 0 processo de extracção incluiu tratamento de glicosidase (em vez de hidrólise ácida), para garantir a conversão de glicósidos flavonóides em agliconas.

Subfraccionamento - Quatro subfracções foram preparadas por fraccionamento em carga de sílica gel, com eluição por solventes de polaridade variável: acetato de etilo, depois, acetato de etilo/metanol (95/5), seguido de acetato de etilo/metanol (50/50) e, finalmente, metanol (FIG. 2).

Etapas de Rastreio e Bioensaios O rastreio para a formação óssea foi efectuado em vários estádios: (i) Ensaio de gene repórter de alta capacidade de BMP-2 de extractos de Me0H/H20 não hidrolisados (la) e correspondente extracto hidrolisado de glicosidase em acetato de etilo (lb). Os extractos foram testados duas vezes, a concentrações de 1 a 100 pg/mL, diluídos em meio de cultura de stocks de extractos de plantas, preparados como 50 mg/mL em DMSO. 17 (ii) Os extractos positivos no rastreio de BMP-2 foram preparados de novo e rastreados, mais uma vez, com dose-resposta, para confirmar os "acertos". (iii) Testagem de BMP-2 de subfraccionamento de positivos/acertos e compostos candidatos puros (iv) Os compostos que se mostraram positivos no ensaio de BMP-2 foram, ainda, testados para diferenciação de osteoblastos, utilizando o ensaio de fosfatase alcalina e num modelo organotipico de formação óssea, utilizando uma cultura de ossos da calvária e histomorfometria, para demonstração da formação óssea, como descrito por Traianedes et al., (1998). (v) Injecção final in vivo de compostos de "acerto" dentro dos ossos da calvária de murganho e monitorização de área e espessura ósseas. Os extractos foram avaliados num ensaio de calvária murinos neonatais de 4 dias in vitro. Os ossos foram incubados com os extractos durante todos os 4 dias. (vi) Actividade de reabsorção monitorizada pela medição da quantidade de colagénio tipo I libertado nos meios, como osso digerido de osteoclastos.

Resultados: Rastreio de Extracto de Planta em Cultura de Gene Repórter de BMP-2 & Órgão

Os extractos das espécies Rosmarinus officinalis, Carum carvi, Thymus vulgaris, Mentha spicata foram positivos em 2 séries de rastreio de BMP-2.

Foi, ainda, confirmado que estes extractos ou subfracções activos estimulam a formação óssea no modelo de cultura de órgãos da calvária: 18 TABELA 2: Sumário de extractos de especiarias positivos no rastreio de BMP-2 e confirmados em cultura de órgãos

Nome Latino Nome Inglês Parte Extracto Extractos positivos de BMP-2 Cultura de órgãos Rosmarinus Folhas Me0H/H20 2004, 2127 2004 officinalis acetato de 2005, 2089 2005 alecrim et ilo Carum carvi Sementes acetato de 2074 2074 cominhos et ilo Thymus vulgaris Folhas acetato de 2067 2067 (tomilho) etilo Mentha spicata Folhas acetato de 2072 2072 Hortelã-verde etilo

Conclusões do Rastreio de Extracto de Planta

Os acertos de BMP-2 confirmados no ensaio de formação óssea de cultura de órgãos foram, por exemplo, os extractos de folhas de alecrim, folhas de tomilho, folhas de hortelã-verde, sementes de cominhos. 19

Exemplo de Acertos de Alecrim & Cominhos para Actividade de BMP-2, Confirmados no Ensaio de Fosfatase Alcalina e Cultura de Órgãos

As FIG. 3A-C ilustram resultados do ensaio da formaçao óssea para extractos de alecrim e cominhos.

Efeito do Processo de Extracçao na Actividade de BMP-2

Após uma primeira extracção de alecrim com metanol/água em folhas anteriormente desengorduradas (ext. 2127), a indução da expressão génica de BMP-2 foi 1,5X, a 10 pg/mL (FIG. 4). Uma extracção especifica deste extracto com acetato de etilo (2188), conduziu a um aumento na expressão de BMP-2 (indução de 8X). Tal sugere que o processo de extracção com EtOAc resultou na concentração dos compostos activos a partir do extracto de MeOH/água original. Após hidrólise com glicosidases, o extracto de acetato de etilo resultante (2189) também é activo, mostrando que foram extraídas moléculas activas adicionais. O extracto 2189 é ainda ligeiramente mais activo do que o não hidrolisado.

Estes resultados mostram, inequivocamente, uma actividade em ambos os extractos (não hidrolisado: 2188 e hidrolisado: 2189), sugerindo a existência de moléculas activas sob duas formas: livre e/ou ligada (glicosilada) no extracto original.

Formaçao Óssea em Calvária Após Injecção In Vivo

Rosmarinus officinalis (extracto de alecrim) mostra actividade de formação óssea em 3 ensaios in vitro de formação 20 cultura de óssea independentes (BMP-2, fosfatase alcalina, órgãos de osso), assim como no ensaio in vivo de calvária (ver a FIG. 5). 0 extracto de alecrim (aqui, as folhas foram extraídas, em primeiro lugar, com água e o extracto aquoso foi hidrolisado, depois, extraido com acetato de etilo) é injectado na calvária craniana de murinos, seguido de análise de formação óssea ex vi vo -f-

Rastreio de Compostos Puros

Os fenólicos foram testados às concentrações de 1 - 10 μΜ.

Os fenólicos activos no ensaio de BMP-2 são listados na Tabela 4. As FIG. 6A-C mostram determinados fenólicos positivos nos ensaios de formação óssea. TABELA 4: Fenólicos activos nos ensaios de BMP-2, ALP e cultura de órgãos: (Comparativo)

Flavonóide Indução de Indução de Formação óssea em BMP-2 actividade ALP cultura de órgãos Eupafolina 3-8X 2X, 4X Sim 2,5 - 10 μΜ 5, 10 μΜ Carnosol 4,5 - 7X 2X Sim 2,5 - 10 μΜ 2,5 - 10 μΜ Escutelareina 3-4X 2X Sim 5, 10 μΜ 10 μΜ 21 (continuação)

Flavonóide Indução de Indução de Formação óssea em BMP-2 actividade ALP cultura de órgãos Campferol 2,5X 2-4X Sim 1-10 μΜ 2,5-10 μΜ Acacetina 5,5X 2X Ligeira 5-10 μΜ 5-10 μΜ Genkwanina 4X 1,5X Ligeira 5 μΜ 10 μΜ

Análise de Extractos de Alecrim Activos para BMP-2 0 extracto para análise foi escolhido seguindo resultados anteriores, mostrando que a actividade de formação óssea estava concentrada em extractos de acetato de etilo, preparados a partir de um extracto de metanol/água, com (2189) ou sem hidrólise enzimática (2188), (ver a FIG. 4). 0 extracto de acetato de etilo 2188 foi seleccionado para um estudo fitoquimico dos seus constituintes principais, incluindo a identificação e a purificação dos compostos por HPLC/ELSD/UV/MS. Uma avaliação fitoquímica aprofundada foi, depois, completada no extracto de Alecrim, activo no ensaio de BMP-2. Os resultados preliminares conduziram ao isolamento dos compostos activos identificados acima.

Nove moléculas puras foram identificadas e preparadas, de modo a efectuar a avaliação da sua actividade biológica na saúde óssea. Considera-se que três delas são novos compostos. Estes compostos são listados na Tabela 6. 22 TABELA 6: 3 novos compostos isolados do extracto de alecrim 2188 NOME QUANTIDADE (mg) PUREZA (%) Ácido desidroxirosmarinico 8, 7 38 6 "- Feruloilnepitrina 19, 9 99, 9 6 Cumaroilnepitrina 13 94

Extracto de alecrim e sua actividade de reabsorção antióssea A osteoporose é uma doença crónica, caracterizada por uma lenta perda óssea. 0 osso não é um tecido morto. Pelo contrário, é constantemente remodelado, com tecido ósseo antigo sendo substituído por um novo. Esta remodelação é controlada por osteoblastos, as células responsáveis pela formação óssea e por osteoclastos, as células responsáveis pela reabsorção óssea. Habitualmente, existe uma estreita ligação entre a formação óssea e a reabsorção óssea, de modo que não ocorre uma perda óssea liquida. Na osteoporose, esta ligação não é perfeita, visto que a perda óssea é mais proeminente que a formação óssea. Para tratar a osteoporose, pode visar-se o aumento da formação óssea, com diminuição da perda óssea ou ambas. Neste exemplo, mostra-se que os extractos de alecrim podem diminuir a perda óssea.

Os osteoclastos, diferenciados de Células Mononucleares de Sangue Periférico Humano (PBMC), foram cultivados em cortes de ossos bovinos. A sua actividade de reabsorção foi monitorizada pela medição da quantidade de colagénio tipo I libertado nos meios, à medida que digeriam o osso. 23 0 colagénio tipo I é a principal molécula orgânica do osso. À medida que o osso é digerido, a fase mineral do osso é dissolvida, expondo as fibras de colagénio à actividade proteolitica de metaloproteinases de matriz. Uma vez digeridas, as fibras de colagénio ficam solúveis e são libertadas nos meios de cultura, onde a sua presença pode ser quantificada por ensaios de ELISA - ensaio de CTX-I. A Figura 7 proporciona detalhes dos efeitos do extracto de alecrim na actividade de osteoclastos humanos, como se segue: 0 extracto 1 de alecrim (extracto P31, comercialmente disponível a partir de Robertet), a uma concentração de 10 pg/mL, diminuiu a quantidade de colagénio tipo I libertado de cortes de osso, em comparação com meios de cultura isoladamente (controlo (CTL)) (Figura 8A).

Indução de ARNm de osteopontina (OPN):

Cultura celular - Osteoblastos de HPOBTerc foram semeados em placas revestidas com colagénio e cultivados em meio MEM Eagle com Modificação a, suplementado com soro bovino fetal a 10%, 1% de L-glutamina e penicilina/estreptomicina, β-glicerolfosfato a 1 mM e ácido ascórbico a 50 pg/mL, numa atmosfera humidificada de CO2 a 5% e ar a 95%, a 37 °C. Quando foram adicionados carnosol e inibidores, uma quantidade equivalente de Me2SO foi utilizada como um controlo de veículo.

Análise de níveis de ARNm por PCR em tempo real - O ARN celular total foi extraído utilizando o kit NucleoSpin ARN II (Macherey-Nagel, Suíça). Quantidades iguais (1 pg) de ARN dos diferentes tratamentos foram transcritas de modo reverso utilizando o kit First Strand cDNA Synthesis para RT-PCR (Roche, Mannheim, Alemanha). Para cada amostra, 2 pL de tampão de reacção lOx, 4 pL de MgCl2 a 25 mM, 2 pL de mistura de nucleótidos, 2 pL de iniciadores aleatórios, 1 pL de inibidor de RNAse e 0,4 pL de transcritase reversa de AMV do kit foram adicionados à amostra. A transcritase reversa foi realizada nas seguintes condições de ciclização térmica (25 °C durante 10 min, 42 °C durante 60 min e 75 °C durante 5 min), utilizando o PTC-100TM Concept, Suíça). PCR Quantitativo em Tempo Real - O PCR quantitativo foi realizado em 25 pL em triplicados. Este consistiu em 12,5 pL de Taqman 2x Universal PCR Master Mix, 1,25 pL de iniciadores e sondas Assay-on-Demand (Applied Biosystems, EUA) e 6,25 pL de água isenta de ARNse. A amplificação foi conduzida numa máquina ABI 7000 (Applied Biosystems), com o seguinte perfil térmico: 50 °C durante 2 min, 10 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 1 min. Os níveis de expressão génica foram normalizados para níveis de expressão de β-actina. A FIG. 8 mostra que o extracto de Alecrim ou carnosol induz expressão de OPN de modo dependente de dose, por determinação de PCR em tempo real de níveis de ARNm de OPN. As células HPOBterc foram mantidas durante 48 h, em extracto de alecrim ou carnosol, às doses indicadas.

Indução de NQOl

Preparação de extractos citoplasmáticos - Células HPOBterc foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com 25 fosfatos fria e recolhidas com tampão de lise (Triton X-100 a 1%, Tris/HCL a 20 mM, pH 8, Nacl a 137 mM, Glicerol a 10%, EDTA a 2 mM, pH 8 e inibidores de proteinase adicionados de fresco: fenilmetilssulfonilfluoreto a 1 mM, Aprotinina a 0,15 U/mL, Leupéptido a 10 pg/mL e Pepstatina a 10 pg/mL). As amostras foram centrifugadas a 13000 rpm, 4 °C, durante 5 min e o sobrenadante transferido para um tubo novo. A concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína da

BioRad. Aproximadamente 50 pg de cada amostra foram misturados com um volume adequado de tampão de amostra, desnaturados durante 5 min, a 95 °C, juntamente com 5 pL de padrão de proteína, arrefecidos sobre gelo e carregados num gel pronto a 10% e submetidos a análise de imunotransferência, utilizando anticorpos anti-NQOl.

Imunotransferência - 50 pg de lisado celular de proteína foram resolvidos por SDS-PAGE. Após electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. As membranas sondadas para OPN e NQOl foram bloqueadas e sondadas em leite a 5% em solução salina tamponada com Tris/Tween (Tris base a 20 mM, pH 7,6, 137 mM, Tween 20 a 0,1%). As transferências foram visualizadas por revelação de quimioluminescência, sistema de detecção de transferência de Western (Amersham Biosciences).

Anticorpos - Os anticorpos específicos para NQOl (sc-16464) foram adquiridos a Santa Cruz Biotechnologies Inc (Santa Cruz, CA). O anticorpo de β-actina (A-5441) foi adquirido à Sigma. Os anticorpos secundários foram adquiridos à Sigma. 26 A FIG. 9 mostra que o Carnosol induz a expressão da enzima NQ01 de fase II, um gene/proteína tipicamente regulado por Nrf-1.

Testagem de tolerância: Um teste de tolerância foi realizado em ratos Sprague-Dawley macho jovens. Os ratos foram alimentados oralmente "por sonda esofágica", durante 5 dias, com administração diária de 1 g (extracto 2127, MeOH/água) por kg de peso corporal de animal. Não foi observado comportamento, mortalidade ou sinais anormais de toxicidade durante o tratamento ou o subsequente período de observação de 10 dias. Sob estas condições, o rosmarinus officinalis foi, por conseguinte, considerado como seguro.

Conclusões

Verificou-se que vários extractos de especiarias, ricos em polifenóis, eram positivos no ensaio de rastreio de BMP-2, incluindo Rosmarinus officinalis, Thymus vulgar is (tomilho), Carum carvi (cominhos) e Mentha spicata (hortelã-verde). Os extractos activos do ensaio de BMP-2 foram confirmados nos ensaios funcionais de fosfatase alcalina e cultura de órgãos para formação óssea in vitro. Vários compostos polifenólicos foram identificados como responsáveis pelos efeitos observados.

Rosmarinus officinalis (extracto de alecrim) e Carum carvi (cominhos) foram os extractos mais promissores, mostrando actividade de formação óssea em 3 ensaios in vitro de formação óssea independentes (BMP-2, fosfatase alcalina, cultura de órgãos de osso), assim como no ensaio in vivo na calvária. Por 27 exemplo, os extractos de alecrim estimularam a formaçao óssea após injecção na calvária murinos in vivo.

Os dados apresentados também mostram que os compostos polifenólicos identificados de extracto de alecrim são capazes de aumentar a formação óssea mas também diminuírem a reabsorção óssea. Não é comum encontrar um único composto/extracto exibindo ambas as propriedades. Isto faz destes compostos candidatos altamente interessantes para a prevenção da osteoporose ou abrandamento da sua progressão em humanos ou animais de estimação.

Lisboa, 23 de Novembro de 2012 28

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto seleccionado do grupo consistindo em, 6 Feruloilnepitrina, 6 Cumaroilnepitrina e um composto com a seguinte fórmula

   ácido desidroxirosmarinico, para utilização na indução da expressão de proteína morfogénica óssea no tratamento ou prevenção da osteoporose.
2. 2. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é proporcionado como um medicamento para humanos e/ou animais de estimação.
3. 3. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é proporcionado como produto alimentar, suplemento nutricional e/ou nutracêutico para humanos e/ou animais de estimação.
4. 4. Composto para utilização de acordo com uma das reivindicações 1-3, para utilização na modulação da razão de formação óssea e/ou reabsorção óssea. 1
5. 5. Composto para utilização de acordo com uma das reivindicações 1-4, para utilização na inibição da reabsorção óssea.
6. 6. Composto para utilização de acordo com uma das reivindicações 1-5, para utilização no auxílio da regeneração óssea durante a cura de fracturas, aumento da formação óssea e densidade mineral óssea durante o crescimento e optimização do pico de massa óssea ou na diminuição da perda óssea, em particular perda óssea associada à idade, em humanos ou animais de estimação.
7. 7. Composto para utilização de acordo com uma das reivindicações 1-6, para utilização no melhoramento da densidade óssea.
8. 8. Composto para utilização de acordo com uma das reivindicações 1-7, para ser administrado na quantidade de 0,01 pg - 100 mg, por kg de peso corporal, por dia.
9. 9. Composto para utilização de acordo com uma das reivindicações 1-8, destinado para aplicação oral e/ou entérica.
10. 10. Composto para utilização de acordo com uma das reivindicações 1-9, para ser administrado na forma de um produto seleccionado do grupo consistindo num alimento nutricionalmente equilibrado, uma fórmula nutricionalmente completa, um produto lácteo, uma bebida refrigerada ou de durabilidade longa, uma sopa, uma barra nutricional, 2 uma alimento para animais de estimaçao, confeitaria composição farmacêutica e suas combinações. Lisboa, 23 de Novembro de 2012 3