PT1937067E

PT1937067E - Utilização de um agente estimulante do sistema defensivo de plantas e processo para funcionamento desse agente

Info

Publication number: PT1937067E
Application number: PT06820241T
Authority: PT
Inventors: Stephan Dorey; Fabienne Baillieul; Christophe Clement; Anne-Lise Varnier; Malk Terganier
Original assignee: Univ Reims Champagne Ardenne U
Priority date: 2005-10-19
Filing date: 2006-10-19
Publication date: 2009-08-19
Also published as: EP1937067B1; FR2891992B1; EP1937067A2; WO2007045767A3; DE602006006857D1; WO2007045767A2; ES2327450T3; ATE431075T1; FR2891992A1

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DE UM AGENTE ESTIMULANTE DO SISTEMA DEFENSIVO DE PLANTAS E PROCESSO PARA FUNCIONAMENTO DESSE AGENTE A presente invenção diz respeito à utilização de um agente para estimular as reacções de defesa natural de plantas e processo para pôr em funcionamento esse agente.

Desde há alguns anos verificou-se que as plantas possuem mecanismos de protecção de duas ordens: em primeiro lugar meios de protecção pré-existentes tais como a presença de camadas externas rígidas como a cutícula que bloqueia a entrada de agentes contaminantes, que só podem, portanto, penetrar na planta por feridas ou poros naturais, ou tais como compostos anti-microbianos armazenados, especialmente, nos vacúolos e, em segundo lugar, reacções induzidas destinadas a proteger a planta. Estas reacções conduzem à produção de antibióticos vegetais, os fitoalexinas, de proteínas de defesa, os PR-proteínas, e de compostos destinados a reforçar as paredes das células vegetais. Além disso, as células infectadas são capazes de prevenir os seus vizinhos do perigo e ficarão aptas a reagir, imediatamente, a ataques ulteriores. Estas reacções podem ser provocadas por moléculas chamadas elicitores, emanadas da planta ou de microorganismos (patogénicos ou não). Os elicitores isolados, postos em contacto com uma planta, são capazes de estimular nesta as mesmas reacções de defesa que 2-10 as que desenvolve a planta quando ela é atacada por um agente patogénico.

Pelo termo estimular é preciso compreender também, "despo-letar", "promover" ou "aumentar". Acontece o mesmo para os substantivos correspondentes.

Se se puser uma planta em contacto com um elicitor capaz de activar as defesas naturais desta, antes que entre em contacto com o agente patogénico, esta planta ficará melhor protegida , isto é, imunizada contra a doença provocada por este agente.

Como se poderá ter compreendido, a utilização de elicitores apresenta um grande número de vantagens: em primeiro lugar, o de respeitar o ambiente visto que a utilização de pesticidas poderá ser reduzida ou mesmo abolida; e, em segundo lugar, a utilização de elicitores permite activar o sistema de defesa da planta, e por consequência, é eficaz contra um grande número de microrganismos patogénicos.

Entre as plantas susceptiveis de ser postas em contacto com agentes elicitores, citar-se-à, especialmente, a vinha, o tabaco e a arabeta. Esta última é particularmente interessante porque é uma planta modelo para os biólogos moleculares .

Além disso, um dos objectivos da presente invenção é utilizar um agente estimulante do sistema defensivo de uma planta a fim de lhe permitir lutar melhor contra microrga- 3-10 nismos patogénicos.

Este objectivo, assim como outros que aparecerão na continuação, são atingidos pela utilização de ramnolípidos RI e/ou R2 enquanto agente de estimulação das reacções de defesa naturais das plantas. A presente invenção diz respeito também a um processo para estimular reacções de defesa naturais das plantas, caracterizado pelo facto de se aplicar sobra as plantas a tratar uma composição aquosa comportando uma concentração de pelo menos 0,01% (v/v) ramnolípidos Rl e/ou R2.

De preferência aplica-se sobre as plantas a tratar uma composição aquosa comportando uma concentração de pelo menos 0,1% (v/) de ramnolípidos Rl e/ou R2.

Os ramnolípidos são glicolípidos compreendendo uma cadeia de ácidos gordos alojada com um (Rl) ou dois (R2) ramnoses, na parte carboximetilcelulose terminal da cadeia de ácidos gordos. Um ramnolípido Rl ou RLL é um éster de ácido deca- nóico e de 3-(6-deoxi-L- manopiranosil) oxi-, 1-(carboxime-tilo) octilo; um ramnolípido R2 ou RRLL é um éster de ácido decanóico e de 3-(6-deoxi-2-0-(6-deoxi-L-manopiranosil oxi-1-(carboximetilo) octilo.

Trata-se de moléculas muito estáveis que são utilizadas enquanto agentes molhantes, emulsionantes, adjuvantes para herbicidas e pesticidas. Elas são também utilizadas para desintoxicar os solos, em particular no quadro da despo- 4-10 luição em hidrocarbonetos e metais pesados. Além disso, os ramnolípidos RI e R2 não são tóxicos para o homem: são, aliás, utilizados como aditivos para certos produtos alimentares. Utiliza-se em particular biosurfactantes tais como os da família dos ramnolípidos, enquanto biofungicidas para lutar contra os cogumelos com zoospórios.

Os ramnolípidos são isolados a partir da bactéria

Pseudomonas aeruginosa. A obtenção dos ramnolípidos e as utilizações enumeradas acima são em particular descritas nos documentos seguintes: Langmuir (2001) 17, 1367-1371; Pest Manag. Sei. (2000)56, 1029-1035; Appl. Microbiol.

Biotechnol. (2000) 54, 625-633 WO 97/25866A, Biotechn. e

Bioengin. (2003), 81(3), 316-322, Colloids and Surfaces (2004), 39, 1-7, Plant Disease (1997), 81(1), 4-12. Os ramnolípidos RI e R2 são, em particular, comercializados sob a forma de soluções tais como a solução JBR215 pela sociedade Jeneil biosurfactant co., 11c (400 N. Dekora Woods Blvd. Saukville, VJI 53080) . 0 limite superior da concentração em ramnolípidos RI e/ou R2 das composições postas em funcionamento, de acordo com a invenção, não é apresentado como crítica: mas, na prática, uma concentração superior a 0,1% (v/v) não traz nenhum benefício suplementar.

No quadro da presente invenção, examinou-se a estimulação das reacções de defesa naturais, obtida no caso da vinha e 5-10 da arabeta, procedendo ao tratamento destas plantas por soluções de ramnolipidos RI e/ou R2 de acordo com os exemplos a seguir descritos. A composição em ramnolipidos Rl e/ou R2 utilizada é a comercializada sob a denominação JBR215, pela sociedade americana Jeneil Biosurfactant Co., LLC: este produto é uma solução aquosa, com uma concentração de 15% (v/v) em ramnolipidos Rl e R2.

Exemplo 1

Trata-se de vitroplantas de Vitis Vinifera ( vinha, cepa Chardonnay), por infiltração de duas composições aquosas De ramnolipidos Rl e/ou R2, uma contendo 0,01% (v/v) e a outra contendo 0,1% (v/v); a composição testemunha é de água pura.

Este tratamento é realizado por infiltração destas composições no parênquima das vitroplantas, quer seja com a ajuda de uma seringa, quer seja com uma câmpanula no vazio. Recolhe-se as folhas 24 horas após a aplicação do tratamento . A indução das respostas de defesa, na ocorrência, a expressão dos genes de defesa tais como os genes chit4-c, glucanase, pgip, pr27, pal e lox, é medida por PCR quantitativo, em tempo real sobre os ADNc correspondente aos ARNm extraídos das folhas retiradas 24 horas antes. 0 método de extracção, assim como a análise por PCR, em tempo real, são descritos no Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 e Mol. 6-10

Plant Microb. Interact. (2003) 16, 1118-1128. Estes resul tados estão reagrupados nas fig 1 a 6.

Parece que uma solução de ramnolípidos RI e/ou R2 com uma concentração de 0,01% (v/v) na água aplicada às vitro- plantas da vinha de acordo com o presente exemplo, induz de 5 vezes a expressão dos genes de defesa chitinases (chit-4C) como representado na fig 1, de mais de 4 vezes o gene de glucanase (figura 2), de mais de 3 vezes o gene pgip (figura 3), mais de 2 vezes o gene de pr27 ( figura 4), de mais de 3 vezes o gene pal (figura 5) e mais de 2 vezes o gene lox (figura 6).

Além disso, uma solução de ramnolípidos Rl e/ou R2 com uma concentração de 0,1% (v/v) na água aplicada às vitroplantas da vinha, por infiltração, induz de mais de 6 vezes a expressão dos genes de defesa chit-4c como representado na figura 1, de mais de 8 vezes o gene glucanase (figura 2),de mais de 4 vezes o gene pgip (figura 3), de mais de 3 vezes o gene pr27, de mais de 4 vezes o gene pal (figura 5), de mais de 8 vezes o gene lox (figura 6).

Exemplo 2

Trata-se de vitroplantas de Vitis Vinifera (vinha, cepa Chardonnay), por imersão por 30 segundos, numa solução aquosa de ramnolípidos Rle/ou R2 contendo 0,1% (v/v); a composição testemunha é de água pura. Este tratamento por imersão equivale a uma pulverização e interessa à vitro- 7- 10 planta no seu conjunto, raízes e folhas. A indução das respostas de defesa, na ocorrência, a expressão dos genes de defesa tais como os genes chit4-c, glucanase, pgip e pr27 é medida por PCR quantitativo em tempo real sobre os ADN correspondentes aos ARNm extraídos das folhas retiradas previamente 24 horas antes. O método de extracção assim como a análise por PCR, em tempo real, são descritas no Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 e Mol. Plant Microb. Interact (2003) 16, 1118-1128. Estes resultados estão reagrupados nas fig 7 a 10.

Assim, uma solução ramnolípida RI e/ou R2 com uma concentração de 0,1% (v/v), na água, aplicada a vitroplantas de vinha de acordo com o presente exemplo, induz de 2,5 a expressão dos genes de defesa chitinases (chit-4c) como representado na fig 7 e de 5 vezes o gene glucanase (figura 8), à volta de 1,6 vezes o gene pgip (figura 9) e de mais de 6 vezes o gene pr27 (figura 10).

Exemplo 3

Trata-se por infiltração, em potes, das plantas inteiras de Arabidopsis thaliana (arabeta), por composições aquosas comportando 0,1% (v/v) de ramnolípidos Rl e/ou R2.

Este tratamento é realizado por infiltração destas composições no parênquima das plantas, quer seja com a ajuda de de uma seringa, quer seja em câmpanula no vazio.Recolhe-se as folhas 3 horas, 6 horas e 24 horas após a aplicação do 8- 10 tratamento. A indução das respostas de defesa, na ocorrência da expressão dos genes de defesa, tais como os genes prl e pdfl.2 é medida por PCR quantitativo, em tempo real, sobre os ADNc correspondentes aos ARNm extraídos das folhas retiradas, previamente, nos diferentes tempos mencionados acima. 0 método de extracção assim como a análise por PCR em tempo real, são descritos no Eur. J. Plant Bio. (2002) 108, 111-120 e Mol. Plant Microb.Interact. (2003) 16, 1118-1128. Estes resultados estão reagrupados nas figuras 11 e 12.

Como indicado nestas figuras, uma solução de ramnolípidos RI e/ou R2 com uma concentração de 0,1% (v/v) na água aplicada por infiltração nas folhas de Arabidopsis thaliana, induz de 60 vezes a expressão dos genes de defesa prl (fig 11) e de mais de 20 vezes o gene de defesa pdfl.2 ( figura 12) , desde 3 horas após o tratamento.

Os resultados dos exemplos 1 a 3 mostram que os ramnolípidos Rl e/ou R2 têm a capacidade de estimular os mecanismos de defesa ( actividade induzida,) nas plantas, tais como a vinha (Vitis Vinifera) e a arabeta (Arabidopsis thaliana).

Exemplo 4 Têm, igualmente, sido efectuados testes de protecção na vinha, especialmente contra os cogumelos Botrytis cinerea. 9-10

As vitroplantas de vinha foram tratadas por imersão, conforme descrito abaixo, no exemplo 1 com duas composições aquosas de ramnolípidos RI e/ou R2, uma contendo 0,01% (v/v) e a outra contendo 0,1% (v/v). 5 dias após este tratamento, as folhas foram destacadas e de seguida colocadas com as faces inferiores virada para cima, numa caixa de massa contendo um disco de papel Wattman humidificado com a água. Em seguida, foram inoculadas com uma pastilha de micélio de Botrytis cinerea emanada de uma cultura de 3 dias sobre o meio V8. As caixas são incubadas a 26° Ce os resultados da infecção são visualizados 96 horas após a inoculação com o cogumelo. Constatou-se,assim, que a infecção parou desde as primeiras horas seguintes à inoculação. A 96 horas após a infecção, nenhum micélio é visível nas amostras tratadas com as composições aquosas de ramnolípidos Rl e/ou R2 a 0,01 e 0,1, quando o micélio colonizou completamente as folhas, uma vez que não teve tratamento com os ramnolípidos Rl e/ou R2.

Resultados complementares obtidos, no crescimento do micélio na caixa no meio V8 mostram que, além disso, os ramnolípidos Rl e/ou R2 inibem o crescimento fúngico desde 0,01% e, preferencialmente, a 0,1% com mais de 70% de inibição de crescimento radial.

Estes resultados mostram que os ramnolípidos Rl e/ou R2 10 - 10 protegem, portanto, eficazmente a vinha contra Botrytis Cinerea.

Estes exemplos tendem a provar às pessoas da profissão que tais composições de ramnolípidos Rl e/ou R2 são eficazes sobre as plantas agronomicamente úteis e as plantas-modelo.

Lisboa, 13 de Agosto de 2009

Claims

REIVINDICAÇÕES 1 - Utilização de ramnolípidos RI e/ou R2 enquanto agente de estimulação das reacções de defesa naturais das plantas.
2 - Processo para estimular reacções de defesa naturais das plantas, caracterizado pelo facto de se aplicar sobre as plantas a tratar uma composição aquosa comportando uma concentração de pelo menos 0,01% (v/v) de ramnolípidos RI e/ou R2.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se aplicar sobre as plantas a tratar uma composição aquosa comportando uma concentração de pelo menos 0,1% (v/v) de ramnolípidos RI e/ou R2. Lisboa, 13 de Agosto de 2009