PT1836489E - Processo de ensaio de substâncias em biomatrizes - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "PROCESSO DE ENSAIO DE SUBSTÂNCIAS EM BIOMATRIZES" A presente invenção refere-se a um processo de ensaio de substâncias em biomatrizes. As biomatrizes constituem equivalentes de tecidos, isto é células de tecidos em matrizes porosas à base de polímeros ou misturas de polímeros biologicamente compatíveis. Um outro objecto da presente invenção consiste assim na utilização dos equivalentes de tecidos para ensaio de substâncias. São igualmente descritos um processo para a preparação de matrizes porosas, bem como as matrizes obtidas segundo este processo, um processo especial de obtenção de células para inoculação das matrizes e para a preparação dos equivalentes de tecido. A engenharia de tecidos (tissue engineering) é um domínio interdisciplinar que conjugas a engenharia e a ciência dos materiais com a medicina. 0 objectivo consiste em reconstruir um tecido danificado ou melhorar o respectivo funcionamento. 0 princípio da engenharia dos tecidos humanos é obviamente simples: Em primeiro ligar são preparadas células, por exemplo são recolhidas algumas células de um organismo que são multiplicadas in vitro. As células multiplicadas podem depois ser incorporadas numa substância que constitui uma estrutura, originando um equivalente de tecido vivo, completo. 2

Revestem-se de especial significado para a funcionalidade do equivalente de tecido o tipo e constituição da substância estrutural empregue, doravante designada matriz. Independentemente do material utilizado, nomeadamente em regra polímeros biodegradáveis, a dimensão do poro, a porosidade e superfície, tal como a forma dos poros, a morfologia da parede do poro e a conectividade entre os poros desempenham igualmente um papel decisivo para a continuação do desenvolvimento das células incorporadas na substância estrutural e finalmente para a forma tridimensional do equivalente de tecido. As matrizes tridimensionais foram investigada, por exemplo no contexto de uma utilização para o transplante de células hepáticas (Kaufmann P. M. et al. (1999), Transplantation 68(2), p. 272-279).

São já conhecidos processos para a criação destas biomatrizes. Assim, foram já aplicadas técnicas da área têxtil, a fim de elaborar biomatrizes reticuladas, tipo manta, em fibra. Um outro processo habitual, no qual se incorporam primeiro cristais de sal no polímero biodegradável e em seguida se dissolvem os cristais novamente, permite controlar a dimensão dos poros através do tamanho das partículas de sal e a porosidade através da proporção de sal/polímero (WO 98/44027; Hou Q. et al. (2003), Biomaterials 24, p. 1937-47; Harris L. D. et al. (1998), J. Biomed. Mater. Res. 42, S.396-402). Numa adaptação do processo, os polímeros biodegradáveis dissolvidos num solvente são aplicados sobre um material porogénico mencionado que, depois, é eliminado por dissolução do material compósito, deixando poros com a forma do negativo do referido material porogénico (WO 3 01/87575 Α2). Tanto matrizes revestidas como matrizes à base de um hidrogel liofilizado são já conhecidas (ver, por exemplo WO 99/09149 AI e US2004/0063206 Al). 0 teste que determina se uma dada substância é tóxica para um corpo de animal, humano ou não-humano, constitui uma fase decisiva durante o desenvolvimento de um fármaco para a medicina humana ou veterinária. Fundamentalmente seria desejável identificar uma toxicidade potencial o mais cedo possível. Não é raro a retirada de substâncias activas do mercado porque provocaram uma falência hepática aguda, apresentando portanto uma toxicidade hepática desconhecida.

No passado, o exame toxicológico de substâncias activas farmacológicas, pesticidas, aditivos alimentares e outras substâncias ambientais eram efectuadas in vivo, em animais experimentais, ou em sistemas in vitro como bactérias (teste de mutagenicidade de Arnes) e culturas de células animais. Os sistemas de teste bacterianos e algumas das culturas de células animais não contemplam a actividade metabólica, em consequência produtos metabólicos tóxicos não são identificados com estes sistemas. Para resolver este problema utilizou-se no passado extractos enzimáticos específicos, por exemplo extracto de fígado de rato. A actividade metabólica simulada deste modo não é necessariamente equivalente à do ser humano ou de animais. Além disso pode acontecer que metabolitos altamente reactivos não atinjam as moléculas alvo, não sendo, assim, detectados.

Do mesmo modo, não têm faltado experiências de cultura de células humanas diferenciadas com actividades metabólicas específicas in vitro para estabelecer um 4 sistema de ensaio com uma determinada proximidade ao metabolismo humano. Uma vez que as células diferenciadas só podem ser cultivadas em determinadas circunstâncias, entre outros aspectos porque os tratamentos mecânicos e/ou enzimáticos obrigatoriamente executados para fragmentação das células implicam uma perda e/ou danificação do contacto célula com célula, seriam necessárias outras medidas para estabelecer uma cultura celular correspondente. Assim, tentou-se por exemplo imortalizar células hepáticas o que pode, porém, conduzir a artefactos. Por outro lado, os tecidos em cultura morrem normalmente num espaço de tempo muito curto, uma vez que não é normalmente proporcionada uma troca de nutrientes e produtos metabólicos suficiente.

Deste modo, os sistemas in vitro conhecidos estão associados à desvantagem de não poderem representar um organismo humano ou animal. Assim, os resultados obtidos com estes sistemas ainda menos aptos a serem transferidos do que os resultados de experiências em animais. 0 risco de uma administração das substâncias de ensaio ou da absorção em especial por seres humanos não pode ser determinado ou só pode ser insuficientemente determinado. 0 objectivo em que se baseia a presente invenção, disponibilização de um equivalente de tecido funcional, com os quais se possa realizar os ensaios mencionados com substâncias de modo satisfatório, é atingido pela invenção através de determinadas biomatrizes que podem ser obtidas mediante um processo especial e que são adequadas à formação de um equivalente de tecido correspondente. 5 0 objecto da presente invenção consiste assim no processo definido nas reivindicações. Trata-se de um processo in vitro.

As substâncias de ensaio são substâncias que entrem ou possam entrar em contacto com seres humanos ou animais não-humanos, em especial animais domésticos ou animais de trabalho, especialmente portanto aquelas que sejam ou possam ser absorvidas por seres humanos ou animais não-humanos. Assim, contam-se entre estas substâncias em especial substâncias activas do dominio da farmácia e protecção de plantas, aditivos alimentares bem como várias substâncias ambientais com as quais os seres humanos ou animais não-humanos possam entrar em contacto. 0 processo de acordo com a presente invenção destina-se principalmente à investigação das interacçoes de uma substância de ensaio com 0 equivalente de tecido. A interacção significa neste contexto tanto uma acçao da substância no equivalente de tecido como uma acção do equivalente de tecido na substância.

Assim, é possível determinar com o processo de acordo com a presente invenção especialmente se o equivalente de tecido sofreu alterações sob o efeito da substância. Uma determinação deste género inclui em regra a investigação de pelo menos um estado (parâmetros) no equivalente de tecido ou numa parte deste abrangendo pelo menos 1 célula. Os parâmetros úteis são fundamentalmente os valores observados ou medidos descritivos de um determinado estado do equivalente de tecido. Entre estes contam-se, por exemplo parâmetros citológicos como a morfologia celular, actividade celular e velocidade de mitose, parâmetros 6 bioquímicos, como determinadas actividades metabólicas, por exemplo a indução de determinadas enzimas e a formação de determinados produtos metabólicos e parâmetros biomoleculares, como a existência de certos ácidos nucleicos e proteínas.

As modificações da morfologia celular podem ser examinadas visualmente, por exemplo ao microscópio. Especialmente é possível determinar o tamanho das células. A vitalidade de células do equivalente de tecido pode ser determinada de modo conhecido, por exemplo com ajuda de métodos de coloração conhecidos. A utilização do azul de tripano, vermelho neutro ou outros substratos cromogénicos como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (teste de viabilidade celular) é conhecida desde há muito dos especialistas. Além disso, pode-se citar a determinação electrónica como por meio de

Processo com exclusão de corrente eléctrica (Tecnologia CASY®).

Certas actividades enzimáticas, por exemplo as enzimas que participam nas biotransformações da fase I e/ou da fase II, podem ser determinadas quimicamente de modo habitual, por exemplo utilizando-se substratos cuja conversão conduz a um produto detectável e quantificável. Os ácidos nucleicos e proteínas, por exemplo enzimas, podem ser determinados pelos correntes métodos analíticos de biologia molecular.

Assim, é possível comprovar enzimaticamente ou por biologia molecular em especial a indução de uma série de citocromos P450 (por exemplo 1A1, 1A2, 2A1, 3A4, 3A5, 2B6, 2C8, 2C9, 2C11, 2C19, 2D6, 2E1). 7

Em consequência deste aspecto, o processo de acordo com a presente invenção está especialmente orientado para ensaios com substâncias para determinar se a substância de ensaio tem efeitos tóxicos nas células do equivalente de tecido (citotoxicidade). Neste sentido, dos parâmetros anteriormente mencionados são preferidos os que reproduzem um efeito citotóxico,

Normalmente é possível identificar uma modificação do equivalente de tecido nas células do equivalente de tecido. Em certos casos é também possível determinar uma modificação do equivalente de tecido indirectamente, através de uma alteração do meio de cultura, por exemplo quando o equivalente de tecido forma um produto metabólico sob o efeito da substância do ensaio e o liberta para o meio de cultura envolvente.

Por outro lado, é também possível determinar com o processo de acordo com a presente invenção se a substância em ensaio sofreu alterações sob o efeito do equivalente de tecido. Entre estas alterações contam-se em especial uma alteração da estrutura química da substância em ensaio e a formação de aductos da substância em ensaio com outras substâncias libertadas do equivalente de tecido. A alteração da substância em ensaio derivada do efeito do equivalente de tecido será presentemente designada por biotransformação e os produtos resultantes, originários da substância em ensaio são designados metabolitos. Entre estas biotransformações contam-se em especial as biotransformações de fase I, como hidroxilações e biotransf ormações de fase II, tal como uma glucuronidação, sulfatação, metilação, acetilação, conjugação de aminoácidos e conjugação de glutationa. As 8 biotransformações de fase I destinam-se normalmente a aumentar a polaridade da substância em ensaio e/ou introduzir grupos quimicamente reactivos nesta, na qual depois se dá as transformações de fase II.

Em consequência deste aspecto, o processo de acordo com a presente invenção está especialmente orientado para ensaios de substâncias para determinar se a substância de ensaio é metabolizada pelas células do equivalente de tecido (biotransformação).

Os produtos que entram nestas biotransformações, portanto em especial as substâncias que se pretende analisar como educto, bem como os respectivos metabolitos, podem ser normalmente determinados com os métodos de análise vulgares, em que o meio de cultura e/ou as células do equivalente de tecido podem ser sujeitos à detecção. Neste contexto, podem-se citar em especial técnicas cromatográficas como a HPLC, processos espectrométricos, como a espectrometria de massa, bem como processos imunológicos, com os quais os metabolitos são detectados com ajuda de anticorpos adequados.

Para a realização do processo de acordo com a presente invenção, o equivalente de tecido é mantido normalmente em meio aquoso, adicionando-se nutriente e removendo-se produtos do metabolismo, proporcionando-se a permuta gasosa necessária. Além disso, o meio contém normalmente os nutrientes necessários. Neste contexto remete-se para os meios incluindo na cultura de células humanas. Para equivalentes de tecido hepáticos, que podem ser empregues preferencialmente no processo de acordo com a presente invenção, verificou-se ser adequado por exemplo meio de 9

Williams E vulgar (suplementado com 10% de soro fetal de bovino). Além disso são adequados soros humanos ou fracções destes.

Para proporcionar uma entrada suficiente de nutrientes ou uma permuta gasosa suficiente desloca-se normalmente o meio. Os dispositivos adequados, nos quais se cultiva o equivalente de tecido de acordo com a presente invenção, são conhecidos dos especialistas desde há muito tempo e encontram-se especialmente no domínio dos biorreactores. A ou as substâncias em ensaio são adicionadas ao meio, que normalmente contém já o equivalente de tecido, num dado momento. Adequadamente, caso se pretenda analisar diferentes concentrações, iniciando-se com a menor concentração. Várias substâncias em ensaio podem ser adicionadas ao meio misturadas com outras substâncias ou isoladas. A determinação de se a acção da substância ou das substâncias provocou uma alteração do equivalente de tecido e/ou da(s) substância (s) inclui normalmente pelo menos duas determinações de um estado (parâmetro), nomeadamente uma determinação antes do efeito e uma determinação depois do efeito. Se a comparação dos resultados obtidos com as duas determinações revelar um desvio, então existe uma alteração. Em especial, é possível executar mais de duas determinações do mesmo estado e/ou determinações de vários estados. Neste contexto procura-se incluir vários equivalentes de tecido semelhantes no mesmo meio, de forma que por cada determinação se possa recolher um equivalente de tecido sem afectar os equivalentes de tecido restantes. 10

De seguida passa-se a descrever os equivalentes de tecido propriamente ditos bem como as matrizes que constituem as respectivas bases e a preparação destes. 0 grau de porosidade é igual ao valor numérico em % para a proporção do volume de poro no volume total da matriz.

Designa-se por poros os espaços ocos existentes na matriz de acordo com a presente invenção com uma forma quadrangular no presente caso de uma perspectiva bidimensional, em especial octogonal ou uma forma angular numa perspectiva tridimensional. De preferência, a forma caracteriza-se ainda por extensões, de modo que a forma dos espaços ocos se assemelha à forma de enurónios. 0 tamanho de um poro pode ser indicado com ajuda de um diâmetro, isto é a média do diâmetro mais comprido e do diâmetro mais curto dos poros identificados a 2 dimensões. A matriz de acordo com a presente invenção apresenta poros com diferentes tamanhos, estando os tamanhos distribuídos por uma área específica (distribuição do tamanho dos poros tal como definido nas reivindicações). De acordo com a presente invenção é significativo que uma matriz apresente uma distribuição da dimensão dos poros ampla, mais ampla que o intervalo que se estende desde poros com um tamanho cerca de 150 μιτι e poros com um tamanho cerca de 300 μπι. Além disso, uma matriz de acordo com a presente invenção apresenta poros com um tamanho de 130 μιη ou inferiores Além disso, uma matriz de acordo com a presente invenção apresenta poros com um tamanho de 370 pm ou inferiores. Estes valores podem ser combinados facultativamente em áreas mínimas, nas quais se estende a 11 distribuição do tamanho de poros, sendo de destacar especialmente até 370 pm. Em especial, cada distribuição do tamanho do poro apresenta um máximo de frequência foram do intervalo 150 a 300 pm, isto é um máximo de frequência encontra-se acima de um tamanho de poro de 300 pm e um outro máximo de frequência abaixo de um tamanho de poro de 150 pm.

Uma matriz de acordo com a presente invenção típica apresenta a seguinte distribuição de poros. Cerca de 0,5% a 6%, de preferência cerca de 1% a 5%, mais preferencialmente cerca de 2% a 4% e especialmente 3% de poros com um diâmetro médio entre 70 e 100 pm; cerca de 2% a 8%, de preferência cerca de 3% a 7%, mais preferencialmente cerca de 4% a 6% e especialmente 5% de poros com um diâmetro médio entre 101 e 115 pm; cerca de 2% a 8%, de preferência cerca de 3% a 7%, mais preferencialmente cerca de 4% a 6% e especialmente 5% de poros com um diâmetro médio entre 116 e 130 pm; cerca de 1% a 7%, de preferência cerca 2% a 6%, mais preferencialmente cerca de 3% a 5% e especialmente 4% de poros com um diâmetro médio até 300 pm; cerca de 11% a 23%, de preferência cerca 13% a 21%, mais preferencialmente cerca de 15% a 19% e especialmente 17% de poros com um diâmetro médio entre 301 e 330 pm; cerca de 4% a 10%, de preferência cerca 5% a 9%, mais preferencialmente cerca de 6% a 8% e especialmente 7% poros com um diâmetro médio entre 331 a 360 pm; cerca de 5% a 17%, de preferência cerca de 7% a 15%, mais preferencialmente cerca de 9% a 13% e especialmente cerca de 11% poros com um diâmetro médio entre 361 a 390 pm; cerca de 7% a 19%, de preferência cerca de 9% a 17%, mais preferencialmente cerca de 11% a 15% e especialmente cerca 12 de 13% poros com um diâmetro médio entre 391 a 420 pm; cerca de 3% a 9%, de preferência cerca de 4% a 8%, mais preferencialmente cerca de 5% a 7% e especialmente cerca de 6% Poros com um diâmetro médio entre 421 a 450 pm; cerca de 12% a 24%, de preferência cerca de 14% a 22%, mais preferencialmente cerca de 16% a 20% e especialmente cerca de 18% poros com um diâmetro médio entre 451 a 480 pm; und cerca de 5% a 17%, de preferência cerca de 7% a 15%, mais preferencialmente cerca de 9% a 13% e especialmente cerca de 11% poros com um diâmetro médio entre 481 a 510 pm.

Normalmente é produzida uma distribuição da dimensão do poro com mais do que um máximo, o que corresponde a uma frequência de poros a mais do que um intervalo de tamanho. Este facto é de especial significado para as caracteristicas das matrizes de acordo com a presente invenção. O volume de espaço oco e, consequentemente a porosidade são determinados de forma conhecida por porosimetria.

Os tamanhos de poros e portanto também a distribuição do tamanho dos poros podem ser determinados por exemplo por microscopia electrónica de varrimento. Neste caso são preparadas secções finas da matriz em análise e são cobertas de ouro. As imagens recolhidas por microscopia electrónica de varrimento são avaliadas, medindo-se vários poros de uma superfície definida, isto é para cada poro determina-se o diâmetro mais longo e o diâmetro mais curto, obtendo-se a soma dos dois valores e dividindo-se esta por 2. O conceito "matriz" refere-se a um suporte tridimensional adequado para uma colonização com células. 13

Neste sentido, a matriz serve de estrutura (modelo) tridimensional para colonização de células ou tecidos. A colonização é efectuada de preferência in vitro. 0 polímero pode ser, em princípio, qualquer polímero utilizado no domínio técnico. Entre estes contam-se em especial polímeros biocompatíveis que permitem uma colonização de células vivas sobre o polímero. Podem ser empregues polímeros essencialmente não biodegradáveis ou pelo menos biodegradáveis na sua maior parte. A expressão "biodegradável" refere-se a um material capaz de ser convertido em produtos metabolizáveis por seres vivos (ou líquidos corporais derivados de seres vivos ou culturas de células). Entre os polímeros biodegradáveis contam-se por exemplo os polímeros bioabsorvíveis e/ou bioerodíveis. Bioerodível designa a capacidade de ser solúvel ou ser suspenso em líquidos biológicos.

Bioabsorvível designa a capacidade de ser incorporada nas células, tecidos ou fluidos de um ser vivo.

Entre os polímeros biodegradáveis adequados de acordo com a presente invenção contam-se em princípio vários polímeros utilizáveis no domínio técnico, contando-se a par dos polímeros estabelecidos no domínio da engenharia dos tecidos, por exemplo ainda polímeros que têm encontrado aplicação em dispositivos de libertação de uma substância activa, como emplastros e implantes com substância activa.

Entre os polímeros naturais adequados contam-se, por exemplo, polipeptídeos como albumina, fibrinogénio, colagénio e gelatina, bem como polissacáridos como quitina, quitosano, alginato e agarose. Em determinadas circunstâncias, estes polímeros naturais podem ainda ser 14 modificados, por exemplo ser reticuladas proteínas como o colagénio.

Entre os polímeros sintéticos adequados contam-se, por exemplo, determinados polianidridos, em especial poli(ácido sebácico-ácido hexadecanodióico), poli(s-caprolactona), poli(ortoéster), e principalmente poli(cx-hidroxiéster) como poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico) e poli(ácido glicólico-ácido láctico). Assim, as matrizes e implantes de acordo com a presente invenção baseiam-se de preferência em polímeros biodegradáveis que contêm unidades repetitivas da fórmula I: H 0

R em que R1 representa hidrogénio ou metilo. No que respeita às unidades de ácido láctico é preferida a forma L (o enantiómero S-) . 0 polímero especialmente preferido é o poli(ácido glicólico-ácido láctico) com uma proporção de ácido glicólico para ácido láctico de 99:1 a 1:99, de preferência 10:90 a 90:10, por exemplo 15:85% em mol.

Podem ser igualmente adequadas misturas de dois ou mais polímeros.

Em conjunto com o tipo de polímero, o respectivo peso molecular determina também as características da matriz resultante. Em geral, a porosidade da matriz diminui com o aumento do peso molecular do polímero utilizado. Em especial é este o caso quando o material forma espuma durante a preparação da matriz, quer dizer é aplicada sob 15 pressão com um gás como CO2, que se dissolve primeiro no polímero e forma poros com a diminuição da pressão.

Além disso a cristalinidade do polímero utilizado actua nas características da matriz resultante. Neste caso a porosidade da matriz resultante aumenta em geral com a diminuição da cristalinidade, pelo que se prefere um polímero amorfo em especial para matrizes com elevada porosidade. Mesmo este aspecto desempenha um papel especialmente quando o material forma espuma durante a preparação da matriz.

As matrizes porosas à base de um polímero biocompatível podem ainda ser caracterizadas por uma superfície da matriz com um revestimento com pelo menos uma proteína de matriz extracelular.

As proteínas de matriz extracelulares são conhecidas em geral. São preferidas de acordo com a presente invenção o colagénio, em especial colagénio de tipo I e IV, laminina e fibronectina. Estas proteínas podem ser preparadas de modo conhecido sob forma purificada ou também podem ser adquiridas no comércio. De acordo com uma forma de realização, os revestimentos de matrizes de acordo com a presente invenção contêm fibronectina como proteína de matriz extracelular. De acordo com uma outra forma de realização, os revestimentos das matrizes de acordo com a presente invenção contêm como proteína de matriz extracelular uma mistura de colagénio do tipo I, laminina e colagénio do tipo IV, sendo preferido neste caso que a mistura contenha as proteínas em partes em peso aproximadamente iguais. 16

De acordo com a presente invenção são especialmente preferidas as matrizes revestidas do modo anteriormente descrito e preenchem pelo menos um dos seguintes critérios adicionais: - Os poros das matrizes apresentam os tamanhos de poros ou distribuição de poros anteriormente indicados, - o grau de porosidade é de 93 a 98%, - os poros apresentam a forma anteriormente indicada, - o polímero biocompatível é um dos polímeros naturais ou sintéticos anteriormente indicados, em especial poli(ácido glicólico-ácido láctico) com uma fracção de ácido láctico de cerca de 85% em mole e uma fracção de ácido glicólico de cerca de 15% em mole.

As matrizes revestidas deste modo são obtidas, por exemplo, mergulhando a matriz por revestir numa solução contendo a proteína ou mistura de proteínas para o revestimento e depois se seca a matriz molhada com a solução. Normalmente, conforme as dimensões do corpo matricial a revestir a solução reveste principalmente as áreas externas do corpo matricial enquanto comparativamente pouca solução penetra no interior do corpo matricial. Como consequência é possível que não resulte um revestimento uniforme da totalidade da superfície da matriz, diminuindo a espessura do revestimento do exterior para o interior.

Em alternativa ou além de um revestimento é possível aplicar substâncias biologicamente activas no polímero ou 17 mesmo acoplá-las. Entre estas contam-se por exemplo substâncias activas sintéticas (moléculas inorgânicas ou orgânicas), proteínas, polissacáridos e outros açúcares, lípidos e ácidos nucleicos, que afectam por exemplo o crescimento e a migração celular, a mitose, a diferenciação celular e/ou o crescimento de tecidos, ou que possuem efeitos terapêuticos, profilácticos ou diagnósticos. Podem-se citar, por exemplo substâncias vasoactivas, neuroactivas, hormonas, factores de crescimento, citoquinas, esteróides, anticoagulantes, substâncias activas inibidoras da inflamação, substâncias activas imunomoduladoras, substâncias activas citotóxicas, antibióticos e antivirais.

Um processo para a preparação de uma matriz porosa à base de um polímero ou mistura de polímeros biocompatíveis é caracterizado por se compactar uma mistura de partículas de polímero e partículas de cloreto de sódio com uma granulometria definida e depois se dissolver o cloreto de sódio.

As partículas de polímero com uma granulometria entre cerca de 20 e 950 pm, vantajosamente entre cerca de 20 e 760 pm e especialmente entre cerca de 108 e 250 pm e partículas de cloreto de sódio com uma granulometria entre 90 e 670 pm, vantajosamente entre cerca de 110 e 520 pm e especialmente entre cerca de 250 e 425 pm revelaram-se adequadas para o ajuste da dimensão de poro ou distribuição de poros desejada. Além disso, uma proporção em peso de partículas de polímero para partículas de cloreto de sódio entre 1:100 e 1:10, vantajosamente entre 1:50 e 1:15 e especialmente entre cerca de 1:20 e 1:18 revelou-se adequada para o ajuste da porosidade desejada. 18

Constatou-se ainda ser adequada a utilização de sal e polímero com uma distribuição da granulometria específica. No que se refere ao cloreto de sódio utilizado para a preparação da matriz é vantajosa uma proporção de sal com uma granulometria entre 250 pm e 320 pm perfazendo cerca de 15% a 50%, vantajosamente cerca de 18% a 42% e preferencialmente cerca de 22% a 28%; a fracção de sal com uma granulometria entre 330 pm e 380 pm perfazendo cerca de 20% a 65%, vantajosamente cerca de 30% a 52% e preferencialmente cerca de 42% a 46%; e uma fracção de sal com uma granulometria entre 390 pm e 425 pm perfazendo cerca de 15% a 62%, vantajosamente cerca de 25% a 42% e preferencialmente cerca de 29% a 33%, referindo-se a fracção ao peso total em sal utilizado para a preparação. Fracções com granulometria superiores e/ou inferiores ao indicado não ficam excluídas.

Numa forma de realização especial constatou-se ser vantajoso, quando a fracção de partículas de cloreto de sódio com uma granulometria de 108 pm a 140 pm perfaz 1 a 15% em peso, de preferência 4 a 12% em peso e especialmente 7 a 9% em peso, a fracção de sal com uma granulometria de 145 pm a 180 pm perfaz 1 a 11% em peso, de preferência 3 a 9% em peso e especialmente 5 a 7% em peso, a fracção de sal com uma granulometria de 185 pm a 220 pm perfaz 3 a 21% em peso, de preferência 7 a 17% em peso e especialmente 10 a 14% em peso, a fracção de sal com uma granulometria de 225 pm a 250 pm perfaz 1 a 11% em peso, de preferência 3 a 9% em peso e especialmente 5 a 7% em peso, a fracção de sal com uma granulometria de 250 pm a 320 pm perfaz 15 a 50% em peso, de preferência 18 a 42% em peso e especialmente 22 a 28% em peso, a fracção de sal com uma granulometria entre 19 330 μιη e 380 μιη perfaz 15 a 50% em peso, de preferência 18 a 42 e especialmente 22 a 28% em peso e a fracção de sal com uma granulometria de 390 pm a 425 pm perfaz 5 a 29% em peso, de preferência 10 a 24% em peso e especialmente 15 a 19% em peso.

No que se refere ao polímero utilizado para a preparação da matriz é vantajosa uma proporção de polímero com uma granulometria entre 108 pm e 140 pm perfazendo cerca de 5% a 50%, vantajosamente cerca de 10% a 30% e preferencialmente cerca de 14% a 18%; a percentagem de polímero com uma granulometria entre 145 pm e 180 pm perfazendo cerca de 10% a 55%, vantajosamente cerca de 15% a 40% e preferencialmente cerca de 20% a 24%; uma percentagem de polímero com uma granulometria entre 185 pm e 220 pm perfazendo cerca de 18% a 88%, vantajosamente cerca de 32% a 76% e preferencialmente cerca de 43% a 49%; e a fracção de polímero com uma granulometria entre 225 pm a 250 pm perfazendo cerca de 5% a 45%, vantajosamente cerca de 10% a 28% e preferencialmente cerca de 14% a 18%, referindo-se a percentagem ao peso total em polímero utilizado para a preparação.

Para se obter partículas de sal ou de polímero com a distribuição de granulometria desejada é normalmente adequado fragmentar primeiro os artigos comerciais. Esta operação pode ser realizada em dispositivos habituais, por exemplo em batedores ou moinhos. Determinante para a distribuição da granulometria desejada é a tamisagem subsequente com ajuda de crivos analíticos vulgares. A compactação é efectuada de preferência mediante a aplicação de pressão. Com este objectivo pode-se comprimir 20 a mistura de polímero / cloreto de sódio numa prensa hidráulica vulgar, com uma pressão de estampagem entre cerca de 780 psi e 1450 psi, vantajosamente entre cerca de 840 psi e 1230 psi e especialmente entre cerca de 900 psi e 1100 psi. Constatou-se ser vantajosa uma pressão entre cerca de 10 s e 360 s, vantajosamente cerca de 40 s e 180 s e em especial cerca de 50 s e 70 s a temperaturas entre 18 °C e 25 °C. A eliminação por dissolução do cloreto de sódio é realizada por exemplo com água ou soluções aquosas. Assim, pode-se aplicar água na mistura compactada (peça em bruto da matriz) durante cerca de 1 h a 80 h, vantajosamente cerca de 12 h a 62 h e especialmente cerca de 36 h a 60 h.

Além disso, é vantajoso guardar a mistura compactada, antes da dissolução do cloreto de sódio, primeiro sob uma atmosfera de C02. Deste modo é possível aplicar à mistura compactada por exemplo uma pressão de C02 entre cerca de 140 psi, e 1650 psi, vantajosamente entre cerca de 360 e 1120 psi e especialmente entre cerca de 800 psi a 900 psi, tendo-se constatado como sendo vantajosos tempos entre cerca de 1 h a 180 h, vantajosamente entre cerca de 3 h a 60 h e especialmente entre cerca de 12 h e 36 h. Seguidamente diminui-se a pressão, influenciado a velocidade de diminuição da pressão a formação de poros. Muito embora seja preferida a utilização de C02, outros gases como ar, azoto, hélio, néon, crípton, árgon, xénon ou oxigénio podem ser igualmente adequados.

De seguida remove-se a água ou a solução aquosa para secagem de modo conhecido em si. Com este fim, pode-se aplicar a matriz sobre papel absorvente. 21

Numa forma de realização preferida, adiciona-se à mistura de partículas de polímero e partículas de cloreto de sódio uma solução polimérica e remove-se o solvente ates da compactação. Neste caso, as partículas de polímero e solução polimérica podem ser à base do mesmo polímero. E também possível tratar-se de diferentes polímeros, em especial com diferentes taxas de biodegradação. A aplicação de solução polimérica tem a vantagem de quase inserir pilares na matriz, permitindo melhorar as propriedades mecânicas da matriz. Uma matriz deste género apresenta em especial uma tendência reduzida para se esboroar. 0 solvente utilizado deve dissolver o polímero mas não o sal. Este processo é conseguido afectando pouco ou apenas marginalmente as características porogénicas do sal. Acetona, acetato de etilo, cloreto de metileno, clorofórmio, hexafluoroisopropanol, hidrocarbonetos clorados e fluoretados, alifáticos e aromáticos, tetra-hidrofurano, etilmetilcetona, dietilcetona bem como misturas destes são adequados por exemplo para dissolver os polímeros anteriormente mencionados. Para dissolver o poli (ácido glicólico) , poli(ácido láctico) ou poli(ácido glicólico-ácido láctico) e prevendo uma aplicação médica é especialmente adequado o clorofórmio.

Juntando-se a solução polimérica e a mistura de partículas de polímero/partículas de sal, obtém-se primeiro um caldo agitável que pode depois solidificar rapidamente com a remoção do solvente. A concentração do polímero na solução deve ser seleccionada adequadamente de modo a que, por um lado o polímero fique completamente dissolvido e, por outro lado, o solvente possa ser rapidamente removido 22 sem dissolver as partículas de polímero com um alcance mencionável.

Constatou-se ser favorável uma proporção em peso de partículas de polímero para o polímero dissolvido de 10:1 a 1:100, vantajosamente 2:1 a 1:25 e especialmente 1:1 a 1:10.

No que se refere à proporção em peso de partículas de polímero para partículas de cloreto de sódio, pode-se seleccionar, no âmbito desta forma de realização, uma proporção em peso maior favorável de cloreto de sódio até 1:200, 1:500 ou 1:1000, sendo a proporção em peso de polímero total para cloreto de sódio superior a 1:100. Deste modo é possível ajustar porosidades acima dos 98%.

Com o presente processo descrito, o cloreto de sódio constitui um material porogénico, pretendendo-se de acordo com a definição um material pelo menos semi-sólido que é primeiro conjugado numa mistura com o polímero que forma a matriz e depois é novamente removido da mistura criando espaços ocos (poros) . Além disso é adequado que o material porogénico seja solúvel em pelo menos um solvente e substancialmente insolúvel em pelo menos um outro solvente. Um material é essencialmente insolúvel quando é solúvel em menos de 30% em peso, de preferência em menos de 20% em peso, especialmente em menos de 10% em peso, por exemplo em menos de 5, 4, 3, 2 e 1% em peso em condições de processamento, isto é em regra a temperaturas entre 18 °C e 25 °C e à pressão normal. A estrutura e características das matrizes resultantes são determinadas principalmente mediante o material porogénico utilizado para a sua preparação. Nesta operação 23 não só é importante o tipo de material porogénico como principalmente a distribuição da granulometria da partícula porogénica. Portanto, em geral, aplica-se que quanto maior a granulometria aumenta não só a dimensão do poro como também a conectividade, isto é a reticulação entre os espaços ocos comunicantes. Esta rede, também designada macroestrutura ou estrutura macroporosa, distingue-se dos poros obtidos pela formação de espuma, os quais são normalmente fechados e constituem assim uma estrutura designada microestrutura ou estrutura microporosa.

Podem ser obtidas matrizes especiais segundo um processo para a preparação de uma matriz porosa à base de um polímero ou mistura de polímeros biocompatíveis, que é caracterizado por se compactar uma mistura de partículas de polímero e partículas de um material porogénico e uma solução de polímero e depois se dissolver o material porogénico.

Este processo não está limitado às características anteriormente descritas. Portanto, o polímero pode ser seleccionado de entre polianidridos, poli (ortoésteres), poli(α-hidroxiésteres), poli(ésteramidos), poliamidos, poli (éster-éteres), policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicóis, polialquilenóxidos, polialquilentereftalatos, alcóois polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, halogenetos de polivinilo, polivinilpirrolidonas, polissiloxanos, polistiróis, poliuretanos, celuloses derivatisadas, polímeros e copolímeros de ácido (met)acrílico. 0 material porogénico é seleccionado de preferência entre sais hidrossolúveis, por exemplo cloreto de sódio, cloreto de potássio, fluoreto de sódio, fluoreto de potássio, iodeto 24 de sódio, iodeto de potássio, nitrato de sódio, sulfato de sódio, citrato de sódio, tartarato de sódio, açúcares (por exemplo sacarose, frutose, glucose) e misturas destes, mas pode também ser constituído por substâncias de tipo cera como parafina, cera de abelha e semelhantes. 0 polímero, material porogénico e o solvente utilizado para elaborar a solução estão adaptados entre si de tal forma que a solução contém o polímero dissolvido e as partículas de polímero em estado sólido, bem como o material porogénico essencialmente não dissolvido.

As matrizes obtidas segundo o processo presentemente descrito são empregues de preferência, de acordo com a presente invenção.

De acordo com a presente invenção são utilizados para ensaios de substâncias equivalentes de tecido, que incluem pelo menos uma das matrizes presentemente descritas e pelo menos uma célula. Conforme o fim em vista, as células podem ser seleccionadas de entre células hepáticas, células do pâncreas, células gordas, células intestinais, células dérmicas, células de vasos, neurónios, células musculares, células da tiróide e células da raiz do dente. Formas de realização especiais do equivalente de tecido de acordo com a presente invenção envolvem células hepáticas e células do pâncreas.

De acordo com a presente invenção, são preferidas para testes de substâncias equivalentes de tecido que incluem pelo menos uma matriz à base de um polímero biocompatível e células de pelo menos dois tipos de células, sendo as células do primeiro tipo hepatócitos e as células do segundo tipo ilhéus de Langerhans. 25

Conforme o fim em vista, isto é especialmente a função a cumprir, serão vantajosas proporções especificas de hepatócitos para ilhéus de Langerhans. Assim, uma forma de realização da invenção refere-se à utilização de equivalentes de tecido que apresentam as caracteristicas endócrinas de um equivalente do pâncreas. Neste contexto constatou-se ser vantajosa uma proporção de hepatócitos para ilhéus de Langerhans de cerca de 106:3000 . Uma outra forma de realização da invenção refere-se à utilização de equivalentes de tecido que cumprem as funções metabólicas de um fígado. Neste contexto constatou-se ser vantajosa uma proporção de hepatócitos para ilhéus de Langerhans de cerca de 106:3-200, vantajosamente de 106:10-100, especialmente de 10δ:20-80 e com especial vantagem de cerca de 10δ:35-45.

Observou-se que este tipo de equivalente de tecido inclui normalmente, a par dos hepatócitos e dos ilhéus de Langerhans, outras células, nomeadamente outras células hepáticas e do pâncreas, isoladas em conjunto.

As células utilizadas na colonização das matrizes de acordo com a presente invenção podem ser obtidas de modo conhecido. Assim, é possível, por exemplo, colher de um indivíduo um tecido adequado, por exemplo um pedaço de fígado ou pâncreas, e processá-lo de modo adequado para a inoculação e cultura in vitro da matriz. Neste contexto é importante que as células apresentem uma taxa de vitalidade o mais elevada possível.

Obtidas as células hepáticas de tecidos hepáticos é necessário ter em atenção que as células hepáticas podem estar envolvidas por uma grande camada de tecido conjuntivo. Para se poder isolar as células hepáticas com 26 uma fracção o maior possível de células vitais são empregues, de acordo com a presente invenção, soluções com composição específica.

Em especial, pode-se empregar uma composição A aguosa contendo NaCl, KC1 e HEPES com um valor de pH de cerca de 7,4, bem como utilizar para perfundir um excerto hepático ou do pâncreas. Em especial, 1.000 ml desta solução contém cerca de 8,3 g de NaCl, 0,5 g de KC1 e 2,38 g de HEPES. A perfusão é efectuada de preferência a uma temperatura de cerca de 37 °C e a uma velocidade de cerca de 30 ml/min. Bastam poucos minutos, em especial cerca de 5 a 120 minutos, por exemplo cerca de 7 minutos para perfundir o bastante o excerto de tecido com a velocidade mencionada.

Em alternativa, é também possível utilizar uma composição A' aquosa, contendo ácido etilenoglicolicotetraacético (EGTA) para perfundir um excerto hepático ou de pâncreas.

Além disso, pode-se empregar uma composição B aquosa, com um valor de pH de cerca de 7,3 a 7,4, contendo de preferência NaCl, KC1, HEPES, CaCl2, colagenase e inibidor de tripsina, bem como utilizar para perfundir um excerto hepático ou do pâncreas. De preferência, 1.000 ml da solução contêm 8,3 g de NaCl, 0,5 g de KC1, 2,38 g de HEPES, 0,7 g de CaCl2 x 2 H20 500 mg de colagenase H e 7,5 mg de inibidor de tripsina. Mesmo neste caso constatou-se ser vantajoso perfundir a cerca de 37 °C e a uma velocidade de cerca de 30 ml/min. Bastam poucos minutos, em especial cerca de 5 a 10 minutos, por exemplo cerca de 6 a 7 minutos para perfundir o bastante o excerto de tecido. 27

Em alternativa, é também possível utilizar uma composição B' para perfundir um excerto hepático ou de pâncreas, contendo colagenase e hialuronidase. De preferência, 1.000 ml da solução contêm 5 a 10 U/ml de colagenase e 5 a 10 U/ml de hialuronidase.

Para a vitalidade das células que se deseja obter, é vantajoso tratar o excerto de tecido primeiro com composição A e depois com composição B. Em alternativa, é possível empregar primeiro uma composição A' e depois uma composição B'.

Logo a seguir à perfusão o excerto de tecido pode então ser livremente preparado e ser cuidadosamente agitado em meio adequado, por exemplo meio E de Williams. Se a suspensão de células resultante contém ainda detritos de células de grandes dimensões, estes podem ser removidos de modo conhecido, por exemplo filtrando a suspensão de células por uma rede de nylon (200 pm) . As células do filtrado podem então ser cuidadosamente agregadas, tendo-se verificado ser vantajosa uma centrifugação durante 3 minutos a 50 g e 4 °C. A transferência das células obtidas para as matrizes é efectuada de modo conhecido em si. Normalmente, as células são transferidas para a matriz sob a forma de uma solução contendo células e depois, normalmente em condições de cultura celular, são incubadas até as células aderirem à matriz. Se forem transferidos para a matriz mais do que um tipo de células, por exemplo hepatócitos e ilhéus de Langerhans, em princípio estes diferentes tipos de células podem ser transferidos conjuntamente ou sucessivamente. Numa forma de realização especial, transferem-se primeiro 28 os ilhéus de Langerhans e depois os hepatócitos, incubando-se depois da aplicação das células até pelo menos uma parte destas ter aderido à matriz.

As matrizes e equivalentes de tecido de acordo com a presente invenção apresentam vantagens decisivas. Permitem uma colonização eficiente das dimensões internas das matrizes pelas células. Por um lado, as matrizes podem ser livremente moldadas e por outro proporcionam suficiente estabilidade e rigidez. As matrizes de acordo com a presente invenção podem ser elaboradas sem ter de empregar solventes fisiologicamente perigosos, por exemplo formaldeido, de forma que não é necessário qualquer processo especial de eliminação do solvente e não existe o perigo de sobrarem resíduos deste solvente.

Os equivalentes de tecido de acordo com a presente invenção apresentam múltiplas possibilidades de utilização. Entre estas destacam-se em especial as utilizações in vitro. Um outro objecto da presente invenção consiste assim na utilização dos equivalentes de tecidos in vitro.

Uma utilização especial neste domínio baseia-se na formação de tecidos (engenharia de tecidos). Neste contexto, as matrizes de acordo com a presente invenção quase servem de estrutura (Scaffold), na qual as células penetram e/ou aderem.

Além disso, é possível inocular as matrizes, por exemplo, in vitro com as células desejadas, por exemplo misturar e incubar com uma solução contendo células até as células aderirem à matriz. Uma matriz assim, com células aderidas (designada por equivalente de tecido) pode depois ser sujeita a outros processos, por exemplo prosseguir a 29 cultura, eventualmente com introdução de substâncias activas, por exemplo para aumentar a expansão das células ou para modulação das respectivas características, e/ou até utilização de modo adequado, por exemplo sobe gelo ou num reactor Bioflux e em condições normalizadas. No âmbito desta utilização é vantajoso poder isolar primeiro as células especificas para o ensaio de substâncias in vitro e eventualmente mesmo expandi-las. Em especial, possibilita-se assim a aplicação de diferentes tipos de células, tal como os hepatócitos e os ilhéus de Langerhans anteriormente mencionados sobre uma matriz.

Os exemplos seguintes destinam-se a esclarecer a invenção sem limitar o respectivo alcance.

Exemplo 1

Preparação da matriz a) Sem solução de polímero

Pellets de polímero (Resomert® RG 858, adquiridas junto da Boehringer, Ingelheim) são congeladas em azoto líquido e fragmentadas em estado congelado (batedor da Dãschle; 12000 U/min 2 min) . As partículas fragmentadas do polímero são tamisadas. As partículas com um tamanho entre 108 pm e 250 μ são empregues na preparação da matriz. Assim, 16% em peso do polímero empregue possui uma dimensão de partícula entre 108 pm e 140 pm, 22% em peso do polímero empregue possui uma dimensão de partícula entre 145 pm e 180 pm, 46% em peso do polímero empregue possui uma dimensão de partícula entre 185 pm e 220 pm e 16% em peso do polímero utilizado possui uma dimensão de partícula entre 225 e 250 pm. O cloreto de sódio é tamisado e as partículas de cloreto de sódio com uma granulometria entre 250 pm e 425 pm sao ΒΟ empregues na preparação da matriz. Assim, 25% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 250 pm e 320 pm, 44% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 330 pm e 380 pm, 31% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 390 pm e 425 pm. Misturam-se 760 mg de partículas de cloreto de sódio e 40 mg de partículas de polímero. A mistura é aplicada numa matriz de corte e é prensada numa prensa hidráulica a uma pressão de estampagem de 1000 psi durante 1 minuto. De seguida, colocam-se as matrizes em bruto num prato de teflon e submete-se a uma atmosfera de C02 (850 psi) . Então, coloca—se as peças em bruto durante 24 horas em água para dissolver os grãos de sal inclusos. Finalmente secam-se as matrizes durante 12 horas em papel absorvente. A matriz de polímero resultante apresenta uma porosidade de 95 +/- 2% e um tamanho de poro, determinado por microscopia electrónicas de varrimento de 250 pm +/-120 pm. b) Com solução de polímero

Cloreto de sódio (analiticamente puro) é moído (batedor Dáschle; 12000 U/min 2 min) e depois tamisado e as partículas de cloreto de sódio com uma granulometria de 108 a 425 pm são empregues na preparação da matriz. Neste contexto, 8% do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 108 pm e 140 pm, 6% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 145 pm e 180 pm, 12% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 185 pm e 220 pm, 6% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 225 pm e 250 pm, 25% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 31 250 μιη e 320 pm, 26% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 330 pm e 380 pm e 17% em peso do sal empregue possui uma dimensão de partícula entre 390 pm e 425 pm. 96 g de partículas de cloreto de sódio são misturadas com 1 g de partículas de polímero descritas no exemplo 1 a) e depois são misturadas com 100 ml de uma solução de clorofórmio que contém dissolvido 4 g do polímero. A mistura obtida é aquecida entre 45 °C e 65 °C, evaporando-se o clorofórmio no espaço de 25 minutos. A mistura de sal-polímero restante é então prensada numa prensa hidráulica, a uma pressão de 1000 psi durante 1 minuto e depois exposta a água durante 24 horas para dissolver os grãos de sal inclusos. Em seguida, a matriz é sujeita a atmosfera de gás como descrito anteriormente e finalmente seca durante 12 horas sobe papel absorvente. A matriz de polímero resultante apresenta uma porosidade de 96%.

Misturando 98,5 g de partículas de sal com 0,5 g de partículas de polímero e misturando-se a mistura com 100 ml de uma solução de clorofórmio que contém 1 g de polímero obtém-se uma matriz com uma porosidade de 99%.

Misturando 99,2 g de partículas de sal com 0,1 g de partículas de polímero e misturando-se a mistura com 100 ml de uma solução de clorofórmio que contém 0,9 g de polímero obtém-se uma matriz com uma porosidade de 99%.

Exemplo 2 a) Revestimento da matriz com fibronectina A matriz descrita no exemplo 1 é submergida numa solução de tampão carbonato contendo 3 pg/ml de fibronectina de plasma humano (Sigma) com um valor de pH de 32 9,4. Passados cerca de 60 s a matriz é retirada da solução, liofilizada e esterilizada com raios γ.

Exemplo 3

Isolamento de células

Um fragmento hepático de um dador humano é primeiro sujeito a perfusão durante 7 minutos a uma velocidade de 30 ml/min e 37 °C com uma solução de (8,3 g de NaCl, 0,5 g de KC1; 2,38 g de HEPES, água destilada até 1.000 ml; valor de pH 7,4) . Em seguida, o fragmento hepático continua a receber perfusão durante 6 a 7 minutos a uma velocidade de 30 ml/min e 37 °C com uma solução de colagenase-inibidor de tripsina (8,3 g de NaCl, 0,5 g de KC1; 2,38 g de HEPES, 0,7 g de CaCl2 x 2 H20 500 mg de colagenase (Collagenase H, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha), 7,5 mg de inibidor de tripsina (ICN, Eschwege, Alemanha); água destilada até 1.000 ml; valor de pH 7,35). Uma vez concluída a perfusão prepara-se o fragmento hepático e agita-se cuidadosamente em meio de Williams E. A suspensão de células é filtrada (rede de nylon; 200 pm e depois é lavada com meio E de Williams. Em seguida as células são centrifugadas a 3 min durante 50 g e 4 °C. A vitalidade celular determinada com azul de tripano era de 95%.

Do mesmo modo procedeu-se ao isolamento de ilhéus de Langerhans de um fragmento do pâncreas.

Exemplo 4

Colonização com células

As matrizes revestidas no exemplo 2 são incubadas, numa primeira fase, com ilhéus de Langerhans, que foram isoladas conforme o exemplo 3. 33

Além disso suspenderam-se 3000 ilhéus por ml numa solução mista de M199 e soro fetal de bovino (proporção de 19:1). Determinou-se o indice celular, contando as células num microscópio de sistema invertido Olympus, num tubo contador de 0,25 mm. Então aplica-se 8 ml a 10 ml desta solução com uma pipeta sobre a matriz. A solução excedente, que não permanece na matriz, é eliminada. A matriz tratada é depois colocada em estufa de cultura celular durante 4 horas para as células aderirem. Em seguida aplica-se na matriz uma solução constituída por meio E de Williams, que contém por ml uma suspensão de células hepáticas não purificada com cerca de 5,0 x 107 hepatócitos vitais e cerca de 1,0 x 108 células hepáticas não-perenquimatosas. Aplica-se 8 ml a 12 ml de solução com uma pipeta, a solução excedentária não absorvida pela matriz é eliminada.

Exemplo 5

Indução de um citocromo P450 com benzeno

Um equivalente de tecido obtido de acordo com o exemplo 4 (cerca de 124 mm x 45 mm x 5 mm) é dividido em 8 tiras. Coloca-se as tiras em cerca de 11 de meio E de Williams, que é movimentado. É proporcionada uma permuta gasosa suficiente e a temperatura do meio é mantida a 37 °C.

Assim que o sistema está equilibrado, retira-se uma primeira tira de equivalente de tecido e determina-se a actividade CYP2E1 nesta por meio do teste EFCOD. Com o processo mencionado determina-se a O-desalquilação de 7-etoxi-4-trifluormetilcumarin a em 7-hidroxi-4- trifluormetil-cumarina mediada por CYP2E1.

Em seguida adiciona-se ao meio benzeno até a concentração de benzeno atingir 0,005 mM. Deixa-se o 34 benzeno actuar durante várias horas, proporcionando-se ao meio, tal como anteriormente, movimento e permuta gasosa Depois determina-se, do modo anteriormente mencionado, novamente a actividade CYP2E1.

Em seguida aumenta-se a concentração de benzeno para 0,01, 0,02, 0,05 e 0,1 mM, determinando-se a actividade de CYP2E1 após o efeito de cada concentração de benzeno.

Uma comparação das actividades de CYP2E1 medidas desta forma revelam um claro aumento da actividade de base que acompanha a concentração de benzeno, uma modificação que reflecte a toxicidade hepática ao benzeno bem conhecida. 35

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista dos documentos apresentados pelo requerente destina-se exclusivamente à informação do leitor e não é parte integrante do documento da patente europeia. Embora elaborada com grande cuidado, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição

WO 9844027 A

WO 9909149 AI WO 0187575 A2

US 20040063206 AI

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição

Kaufmann P. M. et al. Transplantation, 1999, vol. 68 (2), 272-279

Hou Q. Biomaterials, 2003, vol. 24, 1937-47

Harris L. D. et al. J. Biomed. Mater. Res., 1998, vol. 42, 396-402

Lisboa, 24/09/2010

Claims (25)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de ensaio de uma ou várias substâncias, em que se cultiva um equivalente de tecido; se deixa actuar a(s) substância(s) no equivalente de tecido; e se determina se a acção da(s) substância(s) provocou uma alteração do equivalente de tecido e/ou da(s) substância (s), caracterizado por o equivalente de tecido incluir pelo menos uma célula do tecido e uma matriz porosa à base de um polímero ou mistura de polímeros biocompatíveis, possuindo a matriz cerca de 0,5% a 6% de poros com um diâmetro médio entre 70 e 100 pm; cerca de 2% a 8% de poros com um diâmetro médio entre 101 e 115 pm; cerca de 2% a 8% de poros com um diâmetro médio entre 116 e 130 pm; cerca de 1% a 7% de poros com um diâmetro médio entre 131 e 300 pm; cerca de 11% a 23% de poros com um diâmetro médio entre 301 e 330 pm; cerca de 4% a 10% de poros com um diâmetro médio entre 331 a 360 pm; cerca de 5% a 17% de poros com um diâmetro médio entre 361 a 390 pm; cerca de 7% a 19% de poros com um diâmetro médio entre 391 a 420 pm; cerca de 3% a 9% de poros com um diâmetro médio entre 421 a 450 pm; cerca de 12% a 24% de poros com um diâmetro médio entre 451 a 480 pm e cerca de 5% a 17% de poros com um diâmetro médio entre 481 a 510 pm, o grau de porosidade é de 93 a 98% e a matriz é obtida por meio de compactação de uma mistura de partículas de polímero e partículas de cloreto de sódio e subsequente dissolução do cloreto de sódio.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a matriz apresentar cerca de 1% a 5% de poros com um diâmetro médio entre 7 0 e 100 pm, cerca de 3% a 7% de 2 poros com um diâmetro médio entre 101 e 115 pm, cerca de 3% a 7% de poros com um diâmetro médio entre 116 e 130 μιη, cerca de 2% a 6% de poros com um diâmetro médio entre 131 e 300 pm, cerca de 13% a 21% de poros com um diâmetro médio entre 301 e 330 pm, cerca de 5% a 9% de poros com um diâmetro médio entre 331 e 360 pm, cerca de 7% a 15% de poros com um diâmetro médio entre 361 e 390 pm, cerca de 9% a 17% de poros com um diâmetro médio entre 391 e 420, cerca de 4% a 8% de poros com um diâmetro médio entre 421 e 450 pm, cerca de 14% a 22% de poros com um diâmetro médio entre 451 e 480 pm, cerca de 7% a 15% de poros com um diâmetro médio entre 481 e 510 pm.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a matriz apresentar cerca de 2% a 4% de poros com um diâmetro médio entre 70 e 100 pm, cerca de 4% a 6% de poros com um diâmetro médio entre 101 e 115 pm, cerca de 4% a 6% de poros com um diâmetro médio entre 116 e 130 pm, cerca de 3% a 5% de poros com um diâmetro médio entre 131 e 300 pm, cerca de 15% a 19% de poros com um diâmetro médio entre 301 e 330 pm, cerca de 6% a 8% de poros com um diâmetro médio entre 331 e 360 pm, cerca de 9% a 13% de poros com um diâmetro médio entre 361 e 390 pm, cerca de 11% a 15% de poros com um diâmetro médio entre 391 e 420, cerca de 5% a 7% de poros com um diâmetro médio entre 421 e 450 pm, cerca de 16% a 20% de poros com um diâmetro médio entre 451 e 480 pm, cerca de 9% a 13% de poros com um diâmetro médio entre 481 e 510 pm.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a matriz apresentar cerca de 3% de poros com um 3 diâmetro médio entre 70 e 100 pm, cerca de 5% de poros com um diâmetro médio entre 101 e 115 pm, cerca de 5% de poros com um diâmetro médio entre 116 e 130 pm, cerca de 4% de poros com um diâmetro médio entre 131 e 300 pm, cerca de 17% de poros com um diâmetro médio entre 301 e 330 pm, cerca de 7% de poros com um diâmetro médio entre 331 e 360 pm, cerca de 11% de poros com um diâmetro médio entre 361 e 390 pm, cerca de 13% de poros com um diâmetro médio entre 391 e 420, cerca de 6% de poros com um diâmetro médio entre 421 e 450 pm, cerca de 18% de poros com um diâmetro médio entre 451 e 480 pm, cerca de 11% de poros com um diâmetro médio entre 481 e 510 pm.

5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o polímero biocompatível ser um polímero biodegradável seleccionado de entre polímeros naturais como albumina, fibrinogénio, colagénio, gelatina, quitina, quitosano, alginato e agarose e polímeros sintéticos como polianidridos, ρο1ϊ(ε-caprolactona) e poli(α-hidroxiésteres).

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o polímero biodegradável poli(ácido glicólico-ácido láctico) possuir uma fracção de ácido láctico de cerca de 85% em mol e uma fracção de ácido glicólico de cerca de 15% em mol.

7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a superfície da matriz estar coberta com pelo menos uma proteína de matriz extracelular que foi seleccionada entre colagénios, laminina e f ibronectina. 4

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o revestimento conter uma mistura de colagénio de tipo I, laminina e colagénio de tipo IV.

9. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se obter a matriz porosa à base de um polímero ou mistura de polímeros biocompatíveis, compactando-se uma mistura de partículas de polímero com uma granulometria entre os 20 e 950 μιη, vantajosamente entre 50 e 760 pm e especialmente entre cerca de 108 e 250 pm e partículas de cloreto de sódio com uma granulometria entre cerca de 90 e 670 pm, vantajosamente entre cerca de 110 e 520 pm e especialmente entre cerca de 250 e 425 pm e dissolvendo-se depois o cloreto de sódio.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a mistura de partículas de cloreto de sódio ser constituída por 15 a 50% em peso, de preferência 18 a 42% em peso e especialmente 22 a 28% em peso de partículas com uma granulometria entre 250 pm e 320 pm, 20 a 65% em peso, de preferência 30 a 52% em peso e especialmente 42 a 46% em peso de partículas com uma granulometria entre 330 e 380 pm e 15 a 62% em peso, de preferência 25 a 42% em peso e especialmente 29 a 33% em peso de partículas com uma granulometria entre 390 pm e 425 pm.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a mistura de partículas de cloreto de sódio ser constituída por 1 a 15% em peso, de preferência 4 a 12% em peso e especialmente 7 a 9% em peso por partículas com uma granulometria de 108 pm a 140 pm, 1 a 11% em peso, de preferência 3 a 9% em peso e 5 especialmente 5 a 7% em peso de partículas com uma granulometria de 145 pm a 180 pm, 3 a 21% em peso, de preferência 7 a 17% em peso e especialmente 10 a 14% em peso de partículas com uma granulometria de 185 pm a 220 pm, 1 a 11% em peso, de preferência 3 a 9% em peso e especialmente 5 a 7% em peso de partículas com uma granulometria de 225 pm a 250 pm, 15 a 50% em peso, de preferência 18 a 42% em peso e especialmente 22 a 28% em peso de partículas com uma granulometria de 250 pm a 320 pm, 15 a 50% em peso, de preferência 18 a 42 e especialmente 22 a 28% em peso de partículas com uma granulometria entre 330 pm e 380 pm, 5 a 29% em peso, de preferência 10 a 24% em peso e especialmente 15 a 19% em peso de partículas com uma granulometria de 390 pm a 425 pm.

12. Processo de acordo com as reivindicações 9 a 11, caracterizado por a mistura de partículas de polímero ser constituída por 5 a 50% em peso, de preferência 10 a 30% em peso e especialmente 14 a 18% em peso de partículas com uma granulometria entre 108 pm a 140 pm, 10 a 55% em peso, de preferência 15 a 40% em peso e especialmente 20 a 24% em peso de partículas com uma granulometria entre 145 pm e 180 pm, 18 a 88% em peso, de preferência 32 a 76% em peso e especialmente 43 a 49% em peso de partículas com uma granulometria de 185 pm a 220 pm e 5 a 45% em peso, de preferência 10 a 28% em peso e especialmente 14 a 18% em peso de partículas com uma granulometria entre 225 pm e 250 pm.

13. Processo de acordo com uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado por a proporção em peso de partículas de polímero para partículas de cloreto de sódio ser 1:100 a 6 1:10, vantajosamente 1:50 a 1:15 e especialmente 1:20 a 1:18.

14. Processo de acordo uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado por, antes da compactação, se adicionar à mistura de partículas de polimero e partículas de cloreto de sódio uma solução de polímero e se remover o solvente.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o solvente dissolver o polímero mas não o sal.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o solvente ser seleccionado de entre acetona, acetato de etilo, cloreto de metileno, clorofórmio, hexafluoroisopropanol, hidrocarbonetos clorados e fluoretados alifáticos e aromáticos, tetra-hidrofurano, etilmetilcetona, dietilcetona bem como misturas destes.

17. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o polímero ser poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico) ou poli(ácido glicólico-ácido láctico) e o solvente ser clorofórmio.

18. Processo de acordo com uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado por a proporção em peso de partículas de polímero para polímero dissolvido ser 10:1 a 1:100, vantajosamente 2:1 a 1:25 e especialmente 1:1 a 1:10.

19. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se realizar a compactação mediante a acção de pressão.

20. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se deixar actuar água na mistura compactada para dissolver o cloreto de sódio. 7

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se retirar novamente a água.

22. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a mistura compactada ser colocada primeiro sob atmosfera de C02 e depois se dissolver o cloreto de sódio.

23. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o equivalente de tecido incluir células tecidulares de pelo menos dois tipos, sendo as células do primeiro tipo hepatócitos e as células do segundo tipo células dos ilhéus de Langerhans.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a proporção de hepatócitos para células dos ilhéus de Langerhans ser cerca de 106:3000.

25. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a proporção de hepatócitos para células dos ilhéus de Langerhans ser de cerca de 106:3-200, vantajosamente de 106:10-100, especialmente de 106:20-80 e com especial vantagem de cerca de 106:35-45. Lisboa, 24/09/2010