PT1635806E

PT1635806E - Método para tratamento de hepatite alcoólica

Info

Publication number: PT1635806E
Application number: PT04776447T
Authority: PT
Inventors: Mitchell P Fink; Runkuan Yang
Original assignee: Univ Pittsburgh
Priority date: 2003-06-13
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2008-09-09
Also published as: JP2007500752A; EP1635806A2; ES2310755T3; US20050032891A1; WO2005002563A3; WO2005002563A2; AU2004253460A1; DE602004014140D1; AU2004253460B2; EP1635806B1; ATE396717T1; CA2528913A1

Description

ΕΡ 1 635 806/ΡΤ

DESCRIÇÃO

"Método para tratamento de hepatite alcoólica" ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hepatite alcoólica está associada com uma morbidade considerável. A taxa de mortalidade a curto prazo que resulta da hepatite alcoólica aguda pode ser tão elevada quanto 46% (Akriviadis et al., "Pentoxifylline improves short-term survival in severe acute alcoholic hepatitis: a double-blind placebo-controlled trial", Gastroenterology 119:1637-1648 (2000); e Akriviadis et al., "Failure of colchicines to improve short-term survival in patients with alcoholic hepatitis", Gastroenterology 99:811-8.18(1990)).

As medidas gerais para o tratamento da hepatite alcoólica incluem abstinência de álcool e cuidados de suporte tais como suporte nutritivo, alivio de deficiências vitamínicas e ajustes da dieta se estiverem presentes ascites ou encefalopatia hepática. Embora a hepatite alcoólica seja reversível se o paciente parar de beber, usualmente demora vários meses a resolver. Assim, há uma urgente necessidade de novos métodos de prevenção e/ou melhoria dos efeitos da hepatite alcoólica. WO 02/074301 descreve um método de utilização de piruvato e/ou seus derivados para o tratamento de condições inflamatórias mediadas por citoquinas.

Uesugi et al (Journal of Immunology, vol. 168(6), 2002, páginas 2963-2969) descrevem a hipótese de a proteína de ligação a LPS (LBP) poder desempenhar um papel importante na lesão precoce do fígado induzida pelo álcool aumentando a transdução de sinal induzida por LPS.

Naveau et al (The American Journal of Gastroesterology, vol. 96(12), 2001, páginas 3361 a 3367) descrevem que em pacientes com hepatite alcoólica aguda, TNFSRP55 medeia provavelmente a citotoxicidade do TNF-α, e que o efeito citotóxico pode ser amplificado por esgotamento de tGSH aumentando a peroxidação lipídica. 2

ΕΡ 1 635 806/PT

Nanji AA (Alcohol, Vol. 27, no. 1, 2002, páginas 13 a 15) revelam que um papel combinado para o factor-alfa de necrose tumoral e a ciclo-oxigenase-2 é importante na patogénese da hepatite alcoólica.

Yang et al (Am J Physiol Gastrointe Liver Physiol, 283; G212-221, 2002) descrevem que o piruvato de etilo modula a expressão de genes inflamatórios em ratinhos sujeitos a choque hemorrágico. WO 01/24793 revela uma composição de éster de piruvato e um método de utilização para ressuscitação após eventos de isquemia e reperfusão.

Antosiewicz et al. (Free Radical Biology and Medicine, Vol. 29, suplemento n.° 1, 2000, página 528) descrevem que o piruvato protege a pancreatite aguda induzida por ceruleina. WO 03/088955 revela uma composição farmacêutica compreendendo um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico ou uma amina e ácido láctico ou um sal de ácido láctico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Verificou-se que certos α-cetoésteres e a-cetoamidas podem ser utilizados para melhorar os efeitos da hepatite alcoólica aguda. Por exemplo, quando foi administrada Solução de Piruvato de Etilo de Ringer (REPS) a ratinhos C57/BL6 de laboratório após indução de uma lesão aguda no fígado de acordo com um modelo de excesso de bebida, a REPS diminuiu a ocorrência de hepatite alcoólica aguda, comparativamente com ratinhos de controlo a que se administrou Solução de Lactato de Ringer (Exemplos 2-5) . Assim, é aqui revelado um método para tratamento de indivíduos que têm ou estão em risco de desenvolver hepatite, e.g., hepatite causada por álcool e outras toxinas. A presente invenção refere-se a um método de tratamento ou melhoria dos efeitos da hepatite. Tipicamente, a hepatite é causada por uma toxina tal como álcool, drogas ou químicos. O método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico 3 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ ou uma amida de um ácido alfa-cetoalcanóico. Mais comummente, o método é utilizado para tratar hepatite causada por álcool, aqui adiante referida como "hepatite alcoólica". 0 método da presente invenção tem várias vantagens. 0 tratamento terapêutico ou profiláctico da hepatite alcoólica aguda utilizando os compostos aqui descritos alivia os sintomas da hepatite alcoólica aguda. Em adição, tratando a hepatite alcoólica aguda como aqui descrito, o tempo de recuperação para pacientes com hepatite alcoólica pode ser reduzido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 0 anterior e outros objectos, caracteristicas e vantagens da invenção serão evidentes da descrição mais particular que se segue de concretizações preferidas da invenção, como ilustrado nos desenhos anexos nos quais caracteres de referência iguais se referem às mesmas partes em todas as diferentes vistas. Os desenhos não estão necessariamente à escala, sendo antes dada ênfase à ilustração dos princípios da invenção. A FIG. 1 é um gráfico que mostra os efeitos da Solução de

Lactato de Ringer (RLS) ou da Solução de Piruvato de Etilo de

Ringer (REPS) sobre a expressão de TNF-a hepático em ratinhos com hepatite alcoólica. A FIG. 2 é um gráfico que mostra os efeitos da Solução de

Lactato de Ringer (RLS) ou da Solução de Piruvato de Etilo de

Ringer (REPS) sobre o teor de malondialdeído hepático em ratinhos com hepatite alcoólica. A FIG. 3 é um gráfico que mostra os efeitos da Solução de

Lactato de Ringer (RLS) ou da Solução de Piruvato de Etilo de

Ringer (REPS) sobre a concentração da alanina-aminotransferase (ALT) plasmática em ratinhos com hepatite alcoólica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Segue-se uma descrição de concretizações preferidas da invenção. A presente invenção refere-se a um método de 4 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ tratamento da hepatite num indivíduo por administração de um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico ou de uma amida de um ácido alfa-cetoalcanóico dissolvidos num veículo fisiologicamente aceitável. 0 método revelado pode ser utilizado para tratar hepatite causada por álcool, i.e. hepatite alcoólica. Alternativamente, o método revelado é utilizado para tratar hepatite causada por venenos, agentes químicos e drogas. A "hepatite alcoólica" é um precursor de cirrose e é causada pelo álcool. A imagem histológica típica inclui necrose hepatocelular e degeneração com distensão e corpos hialinos de Mallory alcoólicos (agregações anómalas de proteínas de filamentos intermediários celulares indicativas de fibrose) . A colestase é proeminente. A hepatite alcoólica pode variar desde uma hepatite moderada, com testes laboratoriais anómalos como a única indicação de doença, até disfunção grave do fígado com complicações tais como icterícia (pele amarela causada por retenção de bilirrubina), encefalopatia hepática (disfunção neurológica causada por insuficiência hepática), ascite (acumulação de fluido no abdómen), varizes esofágicas sangrantes (veias varicosas no esófago), coagulação sanguínea anormal e coma. A hepatite alcoólica é reversível se o paciente parar de beber, mas normalmente demora vários meses a resolver. A hepatite alcoólica pode conduzir a cicatriz hepática e cirrose. Se as anomalias no fígado durarem menos do que cerca de seis meses, a doença será considerada hepatite aguda; se a evolução da doença for mais longa do que cerca de seis meses, a hepatite é considerada crónica.

Muitas drogas e agentes químicos podem causar danos no fígado e induzir hepatite, tais como ametopterina, tetraciclina, acetaminofeno, fenoprofeno, e semelhantes. 0 grau e a gravidade dos danos no fígado dependem da dosagem, do tempo de evolução e da constituição do indivíduo. A exposição de longo prazo a drogas e/ou químicos pode induzir hepatite crónica, e mesmo cirrose. Os métodos revelados são eficazes no tratamento de hepatite causada por estes agentes. Normalmente, existe um período de tempo entre a exposição a estes agentes (ou exposição inicial) a estes agentes e o início dos sintomas 5 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ associados à hepatite, e.g., pelo menos uma semana, um mês, dois meses, seis meses ou um ano.

Os métodos revelados são igualmente eficazes na melhoria dos efeitos de agentes antivirais tais como interferão alfa e ribavirina, que podem causar ou exacerbar a hepatite. A co-administração das composições aqui descritas com estes agentes antivirais está também dentro do âmbito da invenção revelada.

Os métodos revelados podem também ser utilizados profilacticamente, í.e., para tratar indivíduos em risco de desenvolver certos tipos de hepatite. Por exemplo, indivíduos com hepatite alcoólica moderada ou crónica ou um indivíduo infectado com uma hepatite virai tal como hepatite C, estão em grande risco de outras complicações hepáticas quando expostos a agentes tóxicos ou em tratamento com certas drogas, como discutido anteriormente. O método revelado pode ser utilizado profilacticamente antes desta exposição ou tratamento começarem. 0 método da presente invenção pode também ser administrado antes ou subsequentemente a excesso de bebida para prevenir, inibir ou reduzir a ocorrência de hepatite alcoólica aguda.

Num aspecto, o agente terapêutico utilizado no método aqui revelado é uma quantidade eficaz de um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico, por exemplo, um ácido alfa-cetoalcanóico C3-C8 de cadeia linear ou ramificada. Os exemplos incluem alfa-cetobutirato, alfa-cetopentanoato, alfa-ceto-3-metilbutirato, alfa-ceto-4-metilpentanoato ou alfa-ceto-hexanoato. Prefere-se o piruvato. Uma variedade de grupos tais como alquilo, aralquilo, alcoxialquilo, carbalcoxialquilo ou acetoxialquilo são adequados para a posição éster da molécula. Os exemplos específicos incluem etilo, propilo, butilo, carbometoximetilo (-CH2COOCH3), carboetoximetilo (-CH2COOCH2CH3), acetoximetilo (-CH2OC (0) CH3) , carbometoxietilo (-CH2CH2C00CH3) , carboetoxietilo (-CH2CH2COOCH2CH3) , metoximetilo (-CH2OCH3) e etoximetilo (-CH2OCH2CH3) . Preferem-se os ésteres etílicos. Estão também incluídos tiolésteres (e.g., em que a porção tiol é cisteína ou homocisteína) e ésteres de glicerilo (e.g., em que um ou mais dos grupos álcool no glicerol são substituídos com um grupo α-cetoalcanoato). Outros grupos adequados para esterificação 6 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ de ácidos alfa-cetoalcanóicos incluem: 1) ésteres de di-hidroxiacetona de fórmula: H2C-O- h2c—o—r2 em que Ri é um grupo α-cetoalcanoato tal como piruvilo e R2 é H, um grupo α-cetoalcanoato tal como piruvilo ou um grupo acilo C1-C3 tal como acetilo ou propionilo; e 2) ésteres de monossacáridos tais como ésteres de ribosilo e glucosilo:

em que cada R é independentemente H, um grupo a-cetoalcanoato tal como piruvilo ou um grupo acilo C1-C3 tal como acetilo ou propionilo, desde que pelo menos um R seja um grupo α-cetoalcanoato.

Os exemplos específicos de ésteres alfa-cetoalcanóicos adequados para utilização no método revelado incluem piruvato de etilo, piruvato de propilo, piruvato de carbometoximetilo, piruvato de acetoximetilo, piruvato de carboetoximetilmetilo, piruvato de etoximetilo, alfa-cetobutirato de etilo, alfa-cetopentanoato de etilo, alfa-ceto-3-metilbutirato de etilo, alfa-ceto-4-metilpentanoato de etilo ou alfa-ceto-hexanoato de etilo. 0 piruvato de etilo é um éster de alfa-cetoácido preferido.

Ainda noutro aspecto, o agente terapêutico utilizado no método aqui revelado é uma quantidade eficaz de uma amida de um ácido alfa-cetoalcanóico. As amidas adequadas de ácidos alfa-cetoalcanóicos para utilização nos métodos da presente invenção incluem compostos possuindo a seguinte fórmula estrutural: RC0C0NR1R2. R é um grupo alquilo; Rl e R2 são independentemente -H, alquilo, aralquilo, alcoxialquilo, carbalcoxialquilo ou -CHR3C00H (i.e. uma "amida de aminoácido" 7 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ de um ácido alfa-cetoalcanóico); e R3 é a cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural. Preferivelmente, a amida de um ácido alfa-cetoalcanóico é uma piruvamida.

Os grupos alquilo adequados incluem um grupo alquilo Ci-C8 de cadeia linear ou ramificada, preferivelmente grupos alquilo Οι-Οε de cadeia linear.

Os grupos arilo adequados incluem grupos carbociclicos (e.g.f fenilo e naftilo) e heterocíclicos (e.g., furanilo e tiofenilo) aromáticos, preferivelmente fenilo.

Um grupo alcoxi é -0R4, em que R4 é um grupo alquilo, como definido acima. Um grupo alcoxialquilo é um grupo alquilo substituído com -0R4.

Um grupo aralquilo é -XY, em que X é um grupo alquilo e Y é um grupo arilo, ambos como definido acima.

Um grupo carboxialquilo é um grupo alquilo substituído com -COOH. Um grupo carbalcoxialquilo é um grupo alquilo substituído com -C(0)0R, em que R é um grupo alquilo, como definido acima.

Um grupo acilo é -C (0)-R, em que R é um grupo alquilo, como definido acima.

Um grupo acetoxialquilo é um grupo alquilo substituído com -0-C(0)-R, em que R é um grupo alquilo, como definido acima.

Os termos "terapêutico" e "tratamento", como aqui utilizados, referem-se à melhoria de sintomas associados a uma doença ou condição, incluindo a prevenção, inibição ou atraso do início dos sintomas de doença, e/ou diminuição da gravidade, duração ou frequência de sintomas da doença.

Um "indivíduo" é preferivelmente um paciente humano, mas pode também ser um animal de companhia (e.g., cão, gato e semelhantes), um animal de criação (e.g., cavalo, vaca, ovelha, e semelhantes) ou animal de laboratório (e.g., rato, ratinho, porquinho-da-índia, e semelhantes). 8

ΕΡ 1 635 806/PT A formulação de um agente terapêutico a administrar variará de acordo com a via de administração seleccionada (e.g., solução, emulsão, cápsula). Uma composição apropriada compreendendo o agente a administrar pode ser preparada num veículo ou transportador fisiológica ou farmaceuticamente aceitável. Um veículo fisiológica ou farmaceuticamente aceitável para a composição utilizada no método da presente invenção pode ser qualquer veículo transportador geralmente reconhecido como seguro para administração de um agente terapêutico a um mamífero, e.g., uma solução tampão para infusão ou injecção de bolus, um comprimido para administração oral ou na forma de gel, micela ou lipossoma para entrega no local. Uma solução tampão preferida é a água ou solução salina isotónica ou hipertónica com bicarbonato, fosfato, lactato ou citrato de 0,1 M a 0,2 M. Alternativamente, o agente terapêutico é administrado num extensor plasmático, microcoloide ou solução microcristalina. Um transportador preferido é a solução salina isotónica de Ringer compreendendo NaCl de cerca de 105 mM a 110 mM, KCl de cerca de 3,8 mM a cerca de 4,2 mM, e CaCl2 de cerca de 2,5 a 2,9 mM. Mais preferivelmente, o transportador é solução de Lactato de Ringer compreendendo NaCl de cerca de 105 mM a 110 mM, KCl de cerca de 3,8 mM a cerca de 4,2 mM, e CaCl2 de cerca de 2,5 a 2,9 mM, e de cerca de 25 mM a cerca de 30 mM de um sal lactato tal como lactato de sódio. Preferivelmente, a acidez da formulação é ajustada numa gama de pH de cerca de 4 a cerca de 8, ainda mais preferivelmente a um valor de pH de cerca de 5 a cerca de 7. Outros transportadores para os compostos da presente invenção incluem soluções salinas isotónicas tamponadas com citrato, por exemplo, citrato a aproximadamente 100 mM a 200 mM.

Uma gama de concentração preferida do agente terapêutico é de cerca de 0,1 a cerca de 10% em peso. Num aspecto particularmente preferido, a composição farmacêutica compreende aproximadamente 10 mg/ml de piruvato de etilo. Um exemplo preferido da formulação utilizada para o tratamento de hepatite alcoólica compreende 2% a 3% de piruvato de etilo em peso, tampão de citrato aproximadamente 100 mM (ou cerca de 25 mM a cerca de 30 mM de lactato de sódio), KCl a cerca de 4 mM e, opcionalmente, CaCl2 2,7 mM. A formulação administrada para o tratamento de hepatite alcoólica aguda pode ser formada 9 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ por mistura dos componentes de uma formulação em duas partes, uma parte contendo, por exemplo, piruvato de etilo (puro), e a segunda parte consistindo nos restantes componentes de uma formulação aquosa desejada, por exemplo, os reagentes descritos acima.

As composições farmacêuticas utilizadas no método da presente invenção podem opcionalmente incluir um agente de enolização quando o agente terapêutico é um α-cetoéster. 0 agente de enolização e um α-cetoéster estão contidos num transportador fisiologicamente aceitável. Um "agente de enolização" é um agente quimico, que induz e estabiliza a forma de ressonância enólica de um alfa-cetoéster ao pH ou próximo do pH fisiológico (e.g., entre cerca de 4,0 e cerca de 8,0, mais preferivelmente entre cerca de 4,5 e cerca de 6,5). Os agentes de enolização incluem um material catiónico, preferivelmente um catião bivalente tal como cálcio ou magnésio ou, por exemplo, um aminoácido catiónico tal como ornitina ou lisina. Os catiões bivalentes são introduzidos na formulação farmacêutica na forma de sal, e.g., na forma de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio. O agente de enolização na composição da invenção está numa concentração apropriada para induzir enolização da funcionalidade alfa-ceto da quantidade de agente éster activo na composição administrada, e.g., de 0,0 a 4,0 equivalentes molares relativamente ao éster. A dose precisa a empregar na formulação de um agente terapêutico dependerá da via de administração, e da gravidade das condições, e deverá ser decidida de acordo com a opinião de um médico e das circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou modelo animal.

De acordo com o método, um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico ou uma amida de um ácido alfa-cetoalcanóico podem ser administrados a um indivíduo por uma via apropriada, quer sozinhos quer em combinação com outra droga. Administra-se uma quantidade eficaz de um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico ou de uma amida de um ácido alfa-cetoalcanóico. Uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para 10 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ conseguir ο efeito terapêutico ou profiláctico desejados, sob as condições de administração, tal como uma quantidade suficiente para tratar (terapeuticamente ou profilacticamente), prevenir, melhorar ou retardar o inicio dos sintomas de hepatite alcoólica.

As composições terapêuticas da invenção podem ser administradas através de uma variedade de vias, por exemplo, as vias de administração oral, alimentar, tópica, intravenosa, intramuscular, ou por inalação (e.g., inalação intra-brônquica, intranasal ou oral, gotas intranasais), dependendo do agente e da doença ou condição a tratar, utilizando métodos de rotina em substâncias transportadoras inertes fisiologicamente aceitáveis. Outros métodos de administração adequados podem também incluir dispositivos recarregáveis ou biodegradáveis, e dispositivos poliméricos de libertação lenta. Por exemplo, as composições terapêuticas podem ser administradas numa formulação de libertação sustentada utilizando um polímero biodegradável biocompatível, ou por entrega no local utilizando micelas, géis, lipossomas, ou uma solução tampão. Preferivelmente, a composição farmacêutica é administrada na forma de infusão numa concentração de, e.g., 10 mM a 200 mM, preferivelmente 20 mM a 90 mM do agente activo, a uma taxa de 1 mg/kg de peso corporal/dia a 200 mg/kg de peso corporal/dia, numa solução tampão como aqui descrito. Mais preferivelmente, a composição farmacêutica é administrada na forma de infusão numa concentração de cerca de 2 6 a 30 mM do agente activo numa dose de 100 mg/kg de peso corporal/dia a 150 mg/kg de peso corporal/dia de ácido alfa-cetoalcanóico, numa solução tampão. Na forma de bolus, o agente activo pode ser administrado numa dosagem similar, e.g., 1 mg/kg de peso corporal/dia a 200 mg/kg de peso corporal/dia de agente activo, onde a dosagem é dividida em alíquotas e entregue 1 a 4 vezes por dia (para uma dosagem total de 1 mg/kg de peso corporal/dia a 200 mg/kg de peso corporal/dia), com a concentração do agente activo ajustada em conformidade. A dosagem e modos de administração óptimos podem ser prontamente determinados por protocolos convencionais.

As α-cetoamidas e os α-cetoésteres aqui revelados para o tratamento de hepatite podem ser administrados como monoterapia (i.e., sozinhos como únicos agentes terapêuticos 11 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ utilizados para tratar a hepatite) ou em combinação com outros agentes farmacêuticos, e.g., agentes utilizados no tratamento de hepatite tais como interferão alfa e ribavirina. Em adição, as α-cetoamidas e os α-cetoésteres podem ser administrados em combinação com agentes antimicrobianos, anti-inflamatórios, analgésicos, agentes antivirais, antifúngicos, anti-histaminas e semelhantes.

Os exemplos de agentes antimicrobianos adequados incluem drogas sulfamidas, penicilinas (e.g., Benzilpenicilina, P-hidroxibenzilpenicilina, 2-pentenilpenicilina,

Feneticilina, Dicloxacilina, Amoxicilina, Piperacilina, Amdinocilina), N-heptilpenicilina, fenoximetilpenicilina,

Meticilina, Oxacilina, Cloxacilina,

Flucloxacilina, Nafcilina, Ampicilina,

Ciclacilina, Carbenicilina, Ticarcilina,

Azlocilina, Meczlocilina, Mecilinam,

Cefalosporina e seus derivados (e.g., Cefalotina, Cefapirina, Cefacetrilo, Cefazolina, Cafalexina, Cefradina, Cefadroxilo, Cefamandole, Cefuroxima, Ceforanida, Cefoxitina, Cefotetano, Cefaclor, Cefotaxima, Ceftizoxima, Ceftriaxona, Ceftazidima,

Moxalactam, Cefoperazona, Cefixima, Ceftibuteno e Cefprozilo), Ácido Oxolinico, Amifloxacina, Temafloxacina, Ácido Nalidixico, Ácido Piromídico, Ciprofloxacina, Cinoxacina, Norfloxacina, Perfloxacina, Rosoxacina, Ofloxacina, Enoxacina, Ácido Pipemidico, Sulbactam, Ácido Clavulínico, Ácido β-Bromopenicilânico, Ácido β-Cloropenicilânico, Ácido 6-Acetilmetilenopenicilânico, Cefoxazole, Sultampicilina, Éster Hidrato Formaldeído de Adinocilina e Sulbactam, Tazobactam, Aztreonam, Sulfazetina, Isosulfazetina, Norcardicinas, Fenilacetamidometilfosfonato de m-carboxifenilo, Clortetraciclina, Oxitetracilina,

Tetraciclina, Demeclociclina, Doxiciclina, Metaciclina e Minociclina.

Os exemplos de agentes anti-inflamatórios adequados incluem exemplos de DAINE adequados incluem derivados do ácido aminoarilcarboxilico (e.g., Ácido Enfenâmico, Etofenamato, Ácido Flufenâmico, Isonixina, Ácido Meclofenâmico, Ácido Niflúmico, Talniflumato, Terofenamato e Ácido Tolfenâmico), derivados de ácido arilacético (e.g., Acematicina, Alclofenac, Amfenac, Bufexamac, Caprofeno, Cinmetacina, Clopirac, Diclofenac, Diclofenac de Sódio, Etodolac, Felbinac, 12

ΕΡ 1 635 806/PT

Fenclofenac, Fenclorac, Ácido Fenclózico, Fenoprofeno, Fentiazac, Flurbiprofeno, Glucametacina, Ibufenac, Ibuprofeno, Indometacina, Isofezolac, Isoxepac, Cetoprofeno, Lonazolac, Ácido Metiazinico, Naproxeno, Oxametacina, Proglumetacina, Sulindac, Tenidap, Tiramida, Tolectina, Tolmetina, Zomax e Zomepirac), derivados de ácido arilbutirico (e.g., Bumadizona, Butibufeno, Fenbufeno e Xenbucina) ácidos arilcarboxilicos {e.g., Clidanac, Cetorolac e Tinoridina), derivados de ácido arilpropiónico {e.g., Alminoprofeno, Benoxaprofeno, Ácido Buclóxico, Carprofeno, Fenoprofeno, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indoprofeno, Cetoprofeno, Loxoprofeno, Miroprofeno, Naproxeno, Oxaprozina, Picetoprofeno, Pirprofeno, Pranoprofeno, Ácido Protinizinico, Suprofeno e Ácido Tiaprofénico), pirazoles (e.g., Difenamizole e Epirizole), pirazolonas (e.g., Apazona, Benzpiperilon, Feprazona, Mofebutazona, Morazona, Oxifenbutazona, Fenilbutazona, Pipebuzona, Propifenazona, Ramifenazona, Suxibuzona e Tiazolinobutazona), derivados de ácido saliciclico (e.g., Acetaminosalol, Ácido 5-Aminossalicílico, Aspirina, Benorilato, BifenilAspirina, Bromosaligenina, Acetilsalicilato de Cálcio, Diflunisal, Étersalato, Fendosal, Flufenisal, Ácido Gentisico, Salicilato de Glicol, Salicilato de Imidazole, Acetilsalicilato de Lisina, Mesalamina, Salicilato de Morfolina, Salicilato de 1-Naftilo, Olsalazina, Parsalmida, Acetilsalicilato de Fenilo, Salicilato de Fenilo, Ácido 2-Fosfonoxibenzóico, Salacetamida, Salicilamida de Ácido O-Acético, Ácido Salicílico, Ácido SaliciloílSalicílico, Ácido Salicilsulfúrico, Salsalato e Sulfasalazina), tiazinocarboxamidas (e.g., Droxicam, Isoxicam, Piroxicam e Tenoxicam), Ácido ε-Acetamidocapróico, S-Adenosilmetionina, Ácido 3-Amino-4-hidroxibutírico, Amixetrina, Bendazac, Benzidamina, Bucolome, Difenpiramida, Ditazole, Emorfazona, Guaiazuleno, Cetorolac, Ácido Meclofenâmico, Ácido Mefenâmico, Nabumetona, Nimesulida, Orgoteina, Oxaceprol, Paranilina, Perisoxal, Pifoxima, Piroxicam, Proquazona e Tenidap.

Os exemplos de analgésicos adequados incluem um opióide (e.g. morfina), um inibidor de COX-2 (e.g., Rofecoxib, Valdecoxib e Celecoxib), salicilatos (e.g., ASPIRIN, trissalicilato de colina e magnésio, salsalato, diflunisal e salicilato de sódio), derivados de ácido propiónico (e.g., fenoprofeno de cálcio, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno e 13 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ naproxeno de sódio, derivados de ácido indoloacético (e.g., indometacina, sulfindac, etodalac e tolmetina), fenamatos (e.g., ácido mefenâmico e meclofenamato), derivados de benzotiazina ou oxicams (e.g., mobic ou piroxicam) ou ácido pirroloacético (e.g., cetorolac).

Os exemplos de agentes antivirais adequados incluem interferão gama, ribavirina, fialuridina, aciclovir, ganciclovir, penciclovir, lamivudina, citaleno, carbociclicas, foscarnet, cisteina, destruxina N-butildesoxinoj irimicina. famciclovir, PMEA, bis-POM PMEA, oxetanocinas, oxetaoncinas

Phyllanthus amarus, N-acetil-L-B, hipericina, aucubina e

Os exemplos de antifúngicos adequados incluem anfotericina B, nistatina, itraconazole, fluconazole, cetoconazole, miconazole, flucitosina e dapsona. A presente invenção será agora ilustrada pelos Exemplos que se seguem.

Exemplo 1 Indução de Lesão Aguda do Fígado por um Modelo de Ratinho de Excesso de Bebida

Todos os animais foram alimentados com ração Standard de laboratório e deixados ambientar durante 7 dias. Após a ambientação, induziu-se lesão aguda no fígado utilizando um modelo de excesso de bebida originalmente descrito por Carson EJ, Pruett SB. "Development and characterization of a binge drinking model in mice for evaluation of the immunological effects of ethanol", Alcohol Clin. Exp. Res. 20: 132-138 (1996) e subsequentemente modificado por Zhou Z, et al. "Metallothionein protection against alcoholic liver injury through inhibition of oxidative stress" Exp. Biol. Med. 227: 214-222 (2002) e Zhou Z., et al., "Metallothionein-independent zinc protection from alcoholic liver injury", Am. J. Pathol. 160: 2267-2274 (2002), dos quais a totalidade dos ensinamentos são aqui incorporados por referência. Este modelo foi desenhado para conseguir níveis de álcool no sangue, efeitos comportamentais, e alterações fisiológicas comparáveis com o excesso de bebida em humanos. Os ratinhos foram divididos em três grupos (n=8-10 cada). Os ratinhos no grupo da solução de lactato de Ringer (RLS) receberam etanol (5 g/kg de peso corporal) de 12 em 12 horas, até um total de três doses. O 14 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ etanol foi administrado por gavagem na forma de uma solução aquosa a 25% (p/v) . Começando uma hora após a última dose de etanol, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente (i.p.) com 0,4 ml de RLS de seis em seis horas até um total de três doses. Os ratinhos no grupo da solução de piruvato de etilo de Ringer (REPS) receberam doses de álcool de acordo com o mesmo programa que os animais no grupo RLS. Subsequentemente, contudo, em vez de serem tratados com RLS, estes ratinhos receberam três injecções i.p. de REPS, que foi formulada como previamente descrito (Yang R, et al.r "Ethyl Pyruvate modulates inflammatory gene expression in mice subjected to hemorrhagic shock", Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283:G212-G22 (2002), aqui incorporado por referência na sua totalidade). Cada dose de REPS proporcionou 40 mg/kg de EP em 0,4 ml de uma solução que também continha NaCl 130 mM, KCl 4 mM e CaCl2 2,7 mM. A REPS foi injectada de 6 em 6 horas começando uma h após a administração da última dose de etanol. Os ratinhos no grupo de controlo (CONT) não receberam etanol mas receberam um volume igual de uma solução isocalórica de maltose. Os ratinhos neste grupo não foram tratados com RLS nem com REPS. Dezanove horas após a última dose de etanol ou maltose, todos os ratinhos foram anestesiados com pentobarbital (90 mg/kg i.p.), e aplicaram-se os seguintes procedimentos: um segmento de íleo foi colhido para determinação da permeabilidade mucosa; o complexo de nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) foi colhido para medir a translocação bacteriana; sangue foi aspirado do coração para medir a concentração plasmática de alanina-aminotransferase (ALT); e uma porção do fígado foi removida para determinação da activação de NF-kB utilizando o ensaio de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), expressão de ARNm de TNF utilizando RT-PCR semi-quantitativa e histopatologia. O tecido hepático a utilizar para EMSA ou RT-PCR foi imediatamente congelado a -80°C, enquanto o tecido para histopatologia foi imediatamente fixado em formalina a 10%.

Exemplo 2 REPS Inibe a Resposta Inflamatória num Modelo de Ratinho de Hepatite Alcoólica como Medido por Activação de TNF-a

Uma expressão hepática aumentada de TNF-α tem sido implicada na patogénese da lesão no fígado precoce induzida por álcool em ratinhos. (Yin M. et al., "Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice", Gastroenterology 117: 942-952 (1999)). 15 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ

Após a indução de hepatite aguda como descrito no Exemplo 1, extraiu-se o ARN total de amostras de tecido hepático colhido com clorofórmio e Reagente TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) como indicado pelo fabricante. Tratou-se o ARN total com DNAFree® (Ambion, Houston, TX) como indicado pelo fabricante utilizando 10 unidades de ADNase 1/10 pg de ARN. Procedeu-se à transcrição inversa de 2 pg de ARN total num volume reaccional de 40 pl contendo 0,5 pg de oligo(dT)i5 (Promega), 1 mM de cada dNTP, 15 U de transcriptase inversa de AMV (Promega) e 1 U/pL de inibidor de ribonuclease RNasin recombinante (Promega) em MgCl2 5 mM, Tris-HCl 10 mM, KC1 50 mM, Triton X-100 a 0,1% (pH=8,0). Pré-incubaram-se as misturas reaccionais a 21°C durante 10 min antes da síntese do ADN. As reacções com transcriptase inversa (TI) foram realizadas durante 50 min a 42°C e aqueceu-se a 95°C durante 5 min para terminar a reacção. As misturas reaccionais (50 pL) para PCR foram montadas utilizando 5 pL de ADNc molde, 10 unidades de ADN-polimerase AdvanTaq Plus (Clontech, Paio Alto, CA), 200 pM de cada dNTP, MgCl2 1,5 mM e 1,0 pM de cada iniciador em tampão de PCR AdvanTaq Plus” 1χ. As reacções PCR foram realizadas utilizando um aparelho de ciclos térmicos Modelo 480 (Perkin Elmer, Norwalk, CT) . A amplificação do ADNc foi iniciada com 5 min de desnaturação a 94°C. As condições da PCR para amplificação do ADNc para TNF e IL-6 foram as seguintes: desnaturação a 94 °C durante 45 s, hibridação a 61°C durante 45s, e polimerização a 72°C durante 45 s. A amplificação do ADNc para iNOS foi realizada por desnaturação a 94°C durante 45 s, hibridação a 58°C durante 1 min e polimerização a 72°C durante 45 s. Para assegurar que a amplificação estava na gama linear, determinámos empiricamente que 25, 22, 20 e 33 eram os números óptimos de ciclos para o ADNc de TNF e IL-6 preparado a partir de extractos celulares de RAW 264.7, ADNc de iNOS preparado a partir de extractos celulares de RAW 264.7 e ADNc de TNF preparado a partir de extractos de tecido hepático, respectivamente. Após o último ciclo de amplificação, incubaram-se as amostras a 72°C durante 10 min e depois mantiveram-se a 4°C. Os iniciadores 5' e 3' para iNOS eram CAC CAC AAG GCC ACA TCG GAT T (SEQ ID NO:l) e CCG ACC TGA TGT TGC CAT TGT T (SEQ ID NO:2), respectivamente (Invitrogen, Carlsbad, CA); o comprimento do produto esperado era 426 pb. Os iniciadores 5' e 3' para TNF eram GGC AGG TCT ACT TTG GAG 16 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ TCA TTG C (SEQ ID Ν0:3) e ACA TTC GAG GCT CCA GTG ΑΑΤ TCG G (SEQ ID Ν0:4), respectivamente; ο comprimento do produto esperado era 307 pb. Os iniciadores 5' e 3' para IL-6 eram TTC CAT CCA GTT GCC TTC TTG G (SEQ ID NO:5) e TTC TCA TTT CCA CGA TTT CCC AG (SEQ ID NO:6), respectivamente; o comprimento do produto esperado era 174 pb. Amplificou-se ARN ribossómico 18S para verificar a igualdade da carga. Para esta reacção, os iniciadores 5' e 3' eram CCC GGG GAG GTA GTG ACG AAA AAT (SEQ ID NO: 7) e CGC CCG CTC CCA AGA TCC AAC TAC (SEQ ID NO: 8) , respectivamente; o comprimento do produto esperado era 209 pb. Procedeu-se à electroforese de dez microlitros de cada reacção PCR sobre um gel de agarose a 2%, efectuou-se o varrimento numa estação de trabalho de imagética NucleoVision (NucleoTech, San Mateo, CA), e quantificou-se utilizando GelExpert release 3.5.

Tal como representado na FIG.l, a RT-PCR semi- quantitativa mostrou que a expressão do ARNm hepático de TNF-a estava marcadamente aumentada quando os ratinhos foram tratados com RLS 1 h após a última de três doses de 5 g/kg de álcool administradas entericamente ao longo de um período de 12 h. Se os ratinhos eram tratados com REPS em vez de RLS, não era observada a supra-regulação da amplificação da expressão de ARNm hepático de TNF-a.

Exemplo 3 REPS Inibe a Resposta Inflamatória num Modelo de Ratinho de Hepatite Alcoólica como Medido por Activação de NF-kB

Sabe-se que a administração aguda ou sub-aguda de etanol promove activação hepática do factor de transcrição pró-inflamatório, NF-kB. (Nanji A.A. et al. "Curcumin prevents alcohol-induced liver disease in rats by inhibiting the expression of NF-kappaB dependent genes", Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol." (2002); Kono H. et al., "Diphenyleneiodonium sulfate, an NADPH oxidase inhibitor, prevents early alcohol-induced liver injury in the rat", Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280: G1005-G1012 (2002); Spitzer J.A. et al. "Ethanol and LPS modulate NF-kappaB activation, inducible NO synthase and COX-2 gene expression in rat liver cells in vivo", Front. Biosci. 7: a99-al08 (2002).) Deste modo, o EMSA foi utilizado para determinar 17 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ se ο tratamento com REPS modularia a activação de NF-κΒ no nosso modelo murino de consumo de excesso de álcool.

Após a indução de hepatite aguda como descrito no Exemplo 1, prepararam-se extractos nucleares, homogeneizaram-se amostras de tecido hepático com T-PER™ (Pierce, Rockford, IL), utilizando uma razão de 1:20 de tecido relativamente ao reagente de preparação da amostra, como indicado nas instruções do fabricante. Centrifugaram-se as amostras a 10 000 g durante 5 min para sedimentar os detritos de tecido. Recolheu-se o sobrenadante e congelou-se a -80°C. Determinou-se a concentração de proteína nuclear utilizando um ensaio Bradford comercialmente disponível (Bio-Rad, Hercules, CA) . O EMSA para ligação nuclear de NF-kB foi realizado utilizando uma sonda oligonucleotídica dúplice baseada no local de ligação de NF-kB a montante do promotor de iNOS murino como previamente descrito (Yang R, et al., "Ethyl Pyruvate modulates inflammatory gene expression in mice subjected to hemorrhagic shock", Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283: G212-G22 (2002)). A sequência do oligonucleótido de NF-kB de cadeia dupla foi como se segue: sentido directo: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3' (SEQ ID NO:9); anti-sentido: 3'-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5' (SEQ ID NO:10) (Promega; Madison, WI) . Os oligonucleótidos foram marcados nas extremidades com adenosina-trifosfato y-32P (New England Nuclear; Boston, MA) utilizando polinucleótido-quinase de T4 (Promega; Madison, WI) . Incubaram-se 6 pg de proteína nuclear à temperatura ambiente com sonda de NF-kB marcada com y-32P em 4 μΐ de tampão de ligação 5x (HEPES 65 mM, NaCl 325 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,7 mM, glicerol a 40%, pH=8,0) na presença de 2 pg de poliDI-DC durante 20 min, sendo o volume total da mistura da reacção de ligação de 20 pL. A mistura da reacção de ligação foi submetida a electroforese sobre géis de electroforese de poliacrilamida não desnaturante a 4%. Após a electroforese, secaram-se os géis e expuseram-se a filme X-Omat da Kodak (Rochester, NY) a -80°C. A especificidade da reacção de ligação tinha sido previamente verificada realizando os ensaios apropriados de competição a frio e super-desvio. 18 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ

Tal como avaliado por electroforese em gel, houve um aumento marcado na activação de NF-xB após a indução de hepatite em ratinhos tratados com RLS. Contudo, o tratamento dos ratinhos com REPS após ingestão de álcool infra-regulou a ligação de NF-kB-DNA.

Exemplo 4 REPS Previne a Peroxidação Lipídica como Medido num Modelo de Ratinho de Hepatite Alcoólica por Formação de Malondialdeído, um Marcador de Stress Redox A intoxicação aguda por álcool tem sido associada a peroxidação lipidica tanto em seres humanos como em roedores. Adicionalmente, em ratos sujeitos a choque hemorrágico e ressuscitação, o tratamento com EP diminui a peroxidação lipidica hepática. Assim, pensámos determinar se poderia ser observado um efeito benéfico similar do tratamento com EP no nosso modelo murino de excesso de bebida.

Após a indução de hepatite aguda como descrito no Exemplo 1, foi realizado o ensaio para peroxidação lipídica como descrito em Tawadrous Z.S., et al. "Resuscitation from hemorrhagic shock with Ringer's ethyl pyruvate solution improves survival and ameliorates intestinal mucosal hyperpermeability in rats", Shock 17: 473-477 (2002), aqui incorporado por referência na sua totalidade. Resumidamente, após descongelação dos espécimes de tecido, adicionaram-se 2 ml de tampão fosfato (0,05 M, pH=7,4) a 1,0 g de tecido. O tecido foi homogeneizado. Adicionaram-se ácido tricloroacético (solução a 20% v/v; 2,5 ml) e ácido tiobarbitúrico (solução a 0,67% p/v; 1,0 ml) a 0,5 ml do homogenato do tecido. A cor do pigmento do ácido tiobarbitúrico foi desenvolvida por incubação da mistura num banho de água a 100°C durante 30 min. Após arrefecimento da mistura à temperatura ambiente por imersão em água da torneira, adicionaram-se 4 ml de n-butanol e agitou-se vigorosamente. Após centrifugação, determinou-se a absorvância da camada de butanol a 535 nm. Correram-se as amostras em duplicado e calculou-se a média dos resultados. Utilizou-se 1,1,3,3-tetratoxipropano para gerar uma curva padrão. Os resultados foram expressos como nanomoles de malondialdeído (MDA) por grama de tecido. 19 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ A concentração média de MDA nos tecidos foi significativamente maior no grupo de RLS do que no grupo de controlo (FIG. 2). Contudo, o nivel médio deste marcador de peroxidação lipídica no figado foi significativamente menor no grupo do REPS do que no grupo do RLS, indicando melhoria da lesão do figado em ratinhos tratados com REPS.

Exemplo 5 Evidências de Indução de Danos Hepatocelulares num Modelo de Ratinho de Hepatite Alcoólica como Medido por Avaliação da Alanina-Aminotransferase Plasmática

Obtiveram-se 200 pL de sangue por punctura cardíaca e colocaram-se num tubo de centrífuga de 0,5 ml em gelo. Centrifugaram-se as amostras a 5000 g durante 3 min. Recolheu-se o soro e testou-se quanto à Alanina-Aminotransferase (ALT) utilizando um sistema de ensaio automático.

Como mostrado na FIG. 3, a concentração média plasmática de ALT, 19 horas após a última dose de álcool ou solução de maltose, foi significativamente maior no grupo de RLS do que no grupo de controlo (CONT) . Contudo, o nível médio em circulação deste marcador bioquímico de lesão hepatocelular foi significativamente menor no grupo de REPS do que no grupo de RLS.

Exemplo 6 Tratamento com PERS Previne Danos Hepatocelulares num Modelo de Ratinho de Hepatite Alcoólica como Evidenciado por Exame Histológico

Seccionou-se tecido hepático fixado em formalina, corou-se com hematoxilina e eosina, e examinou-se utilizando microscopia óptica a uma ampliação de 600x e lOOOx. O exame mostrou que no grupo do RLS, as secções hepáticas revelaram extensiva evidência de alteração gorda nas áreas portais e partes dos lóbulos. Com grande ampliação, o material de hialina vermelha globular era evidente no interior dos hepatócitos e era evidente necrose dispersa fragmentária dos hepatócitos. Em contraste, no grupo do REPS as alterações gordas e a necrose em lóbulos foram consideravelmente reduzidas e o material de hialina não era evidente. 20

ΕΡ 1 635 806/PT

Os resultados nos Exemplos 2-5 estão apresentados como médias ± SEM. As diferenças em CFU entre grupos foram analisadas utilizando o teste U de Wilcoxen. Outros resultados contínuos foram analisados utilizando o teste t de Student ou análise de variância seguida do teste LSD de Fisher, conforme apropriado. Valores P < 0,05 foram considerados significativos. Os resumos estatísticos estão apresentados para os resultados da densitometria dos estudos utilizando RT-PCR para estimar a expressão de ARNm de iNOS, TNF-α e IL-6, mas estes resultados não foram sujeitos a análise estatística pois o método empregue era apenas semiquantitativo e as dimensões das amostras (n=3-4) eram pequenas. (Ulloa L, et al. "Ethyl pyruvate prevents lethality in mice with established lethal sepsis and systemic inflammation", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 12351-12356 (2002); Sappington P.L., et al. "Ethyl pyruvate ameliorates intestinal epithelial barrier dysfunction in endotoxemic mice and immunostimulated Caco-2 enterocytic monolayers", J. Pharmacol. Exp. Ther. 304: 464-476 (2003); Yang R., et al. "Ethyl pyruvate modulates inflammatory gene expression in mice subjected to hemorrhagic shock", Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283:G212-G22 (2002).)

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Univeristy of Pittsburg of the Commonwealth System of Higher Education Mitchell P. Fink,

Runkuan Yang, <120> Método para Tratamento de Hepatite Alcoólica <130> 3403.1002004 <150> 60/478,637 <151> 2003-06-13 <150> 60/499,552 <151> 2003-09-02 <160> 10 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador para iNOS < 4 0 0 > 1 caccacaagg ccacatcgga tt 22 21 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ

< 210 > 2 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο >

<223> Iniciador para iNOS < 4 0 0 > 2 ttgttaccgt tgtagtccag cc 22

<210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador para TNF <400> 3 ggcaggtcta ctttggagtc attgc 25

<210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Iniciador para TNF < 4 0 0 > 4 ggcttaagtg acctcggagc ttaca 25

< 210 > 5 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador para IL-6 < 4 0 0 > 5 ttccatccag ttgccttctt gg 22

< 210 > 5 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador para IL-6 < 4 0 0 > 6 gaccctttag cacctttact ctt 23

< 210 > 7 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 22 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Iniciador para ARN ribossómico 18S <400> 7 cccggggagg tagtgacgaa aaat 24

< 210 > 8 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador para ARN ribossómico 18S <400> 8 catcaaccta gaaccctcgc ccgc 24

< 210 > 9 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Cadeia de sentido directo do oligonucleótido de NF-KB de cadeia dupla <400> 9 agttgagggg actttcccag gc 22

<210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Cadeia de sentido directo do oligonucleótido de NF-KB de cadeia dupla < 4 0 0 > 10 gcctgggaaa gtcccctcaa ct 22

Lisboa, 2008-08-28

Claims

ΕΡ 1 635 806/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico ou de uma amida de um ácido alfa-cetoalcanóico no fabrico de um medicamento para tratamento de hepatite num indivíduo.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que a hepatite é hepatite alcoólica aguda.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que a hepatite é hepatite alcoólica crónica.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que a hepatite é causada por um agente químico ou uma droga.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o referido medicamento é para o tratamento profiláctico de hepatite.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que é utilizado um éster de ácido alfa-cetoalcanóico e em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico é um éster de ácido alfa-cetoalcanóico C3-C8 de cadeia linear ou ramificada.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico é um éster alquílico, aralquílico, alcoxialquílico, carbalcoxialquílico ou acetoxialquílico.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico é seleccionado do grupo que consiste em piruvato de etilo, piruvato de propilo, piruvato de carboximetilo, piruvato de acetoximetilo, piruvato de carboetoximetilmetilo, e piruvato de etoximetilo.
9. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico é seleccionado do grupo que consiste em alfa-cetobutirato de etilo, alfa-cetopentanoato de etilo, alfa-ceto-3-metilbutirato de etilo, alfa-ceto-4-metilpentanoato de etilo e alfa-ceto-hexanoato de etilo. ΕΡ 1 635 806/ΡΤ 2/4
10. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico é um éster etílico.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico é um éster de ácido pirúvico.
12. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico é piruvato de etilo.
13. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico está contido em solução salina isotónica de Ringer.
14. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de um ácido alfa-cetoalcanóico está contido num transportador fisiologicamente aceitável, que adicionalmente compreende lactato.
15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido transportador fisiologicamente aceitável compreende ainda um agente de enolização fisiologicamente aceitável.
16. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido transportador fisiologicamente aceitável é solução salina isotónica de Ringer compreendendo ião de potássio e/ou ião de sódio.
17. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de ácido alfa-cetoalcanóico é um éster de glicerilo.
18. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de ácido alfa-cetoalcanóico é um éster de ribosilo representado pela seguinte fórmula: ΕΡ 1 635 806/ΡΤ 3/4 OR 0.

OR 0R OR em que cada R é independentemente H, um grupo alfa-cetoalcanoato ou um acilo C1-C3 e pelo menos um R é um grupo alfa-cetoalcanoato.
19. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de ácido alfa-cetoalcanóico é um éster de glucosilo descrito pelas fórmulas (I) ou (II): OR

em que cada R é independentemente H, um grupo alfa- cetoalcanoato ou um acilo C1-C3 e pelo menos um R é um grupo alfa-cetoalcanoato.
20. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de ácido alfa-cetoalcanóico é um éster de di-hidroxiacetona.
21. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido éster de ácido alfa-cetoalcanóico é um tioléster.
22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que uma porção tiol do referido tioléster é cisteina ou homocisteína.
23. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que é utilizada uma amida de um ácido alfa-cetoalcanóico.
24. Utilização de acordo com a reivindicação 23, em que a referida amida de um ácido alfa-cetoalcanóico é uma piruvamida. ΕΡ 1 635 806/ΡΤ 4/4
25. Utilização de acordo com a reivindicação 23, em que a referida amida é uma amida de aminoácido de um ácido alfa-cetoalcanóico.
26. Utilização de piruvato de etilo no fabrico de um medicamento para o tratamento de hepatite alcoólica.
27. Utilização de acordo com a reivindicação 26 em que a hepatite alcoólica é hepatite alcoólica aguda.
28. Utilização de acordo com a reivindicação 26 em que a hepatite alcoólica é hepatite alcoólica crónica. 29. Éster de um ácido alfa-cetoalcanóico ou amida de um ácido alfa-cetoalcanóico para utilização no tratamento de hepatite num indivíduo. 30. Éster de acordo com a reivindicação 29, em que é utilizado um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico e o referido éster é piruvato de etilo. 31. Éster de acordo com a reivindicação 29, em que é utilizado um éster de um ácido alfa-cetoalcanóico C3-C8 de cadeia linear ou ramificada e 0 referido éster está contido em solução salina isotónica de Ringer.
32. Piruvato de etilo para utilização no tratamento de hepatite alcoólica. Lisboa, 2008-08-28 ΕΡ 1 635 806/ΡΤ 1/3

00 Ω_ LU Cd

Φ e Ú cd ll

ο Η Ο U § υ I I 1 1 ί -,- —ι— -1- —ι— ο Ο ο ο ο ο Ο Ο ο UD CD LO ο LO ο LO Ο ιο οο οο CM CN τ— Densidade relativa ΕΡ 1 635 806/ΡΤ 2/3

*

'*

Ο Η Ο U § υ ι-1-1-1-1-1-1-1-1-r ω «3' Tf W Ο ΟΟ (Ο Tf Μ ο Malondialdeido (nmol/g) ΕΡ 1 635 806/ΡΤ 3/3

(Ί/η)πν