PT1608400E

PT1608400E - Elevation of adenosine level by cytokine-induced expression of cd73

Info

Publication number: PT1608400E
Application number: PT04721913T
Authority: PT
Inventors: Sirpa Jalkanen
Original assignee: Faron Pharmaceuticals Oy
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2010-08-18
Also published as: JP2006522075A; DK1608400T3; FI20030467A0; ES2346882T3; JP4809762B2; SI1608400T1

Description

11

DESCRIÇÃO AUMENTO DO NÍVEL DE ADENOSINA POR EXPRESSÃO DE CD73 INDUZIDA POR CITOQUINAS"DESCRIPTION INCREASE IN ADENOSIN LEVEL BY EXPRESSION OF CD73 INDUCED BY CYTOKINES "

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

Esta invenção refere-se a métodos de tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios que beneficiam de um nível elevado de adenosina, como definido na reivindicação 1.This invention relates to methods of treating or preventing diseases or disorders benefiting from a high level of adenosine as defined in claim 1.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A interacção entre linfócitos e células endoteliais é um processo de passos múltiplos. Para serem capazes de penetrar na parede dos vasos e atingir o sítio alvo, as células em circulação utilizam um conjunto de moléculas de adesão muito finamente reguladas. Uma maior adesão ao endotélio e a transmigração subsequente de leucócitos recirculantes através do revestimento endotelial da parede dos vasos para o tecido são características da inflamação. Além disso, a libertação de citoquinas pró- e anti-inflamatórias ocorre numa grande extensão em locais de inflamação. Aquelas citoquinas são reguladores potentes da expressão de moléculas de adesão. A CD73 (ecto-5'-nucleotidase) é uma molécula da superfície celular ancorada em glicosil-fosfatidil-inositol de 70-kD com actividade ecto-enzimática. É abundantemente expressada no endotélio vascular e, a níveis baixos, em determinadas subpopulações de linfócitos humanos. Faz parte da via de recurso de purinas ao degradar nucleósido-5'-monofosfatos (AMP e IMP) em nucleótidos como adenosina e inosina (1). 2 A adenosina, um produto de nucleósido de purina da actividade da enzima CD73, liga-se a receptores específicos na superfície celular. Está descrito que a adenosina possui um papel em muitos eventos fisiológicos e patológicos. Até à data foram clonados quatro subtipos diferentes de receptores de adenosina acoplados a proteína G AIR, A2aR, A2bR e A3R. Devido à diversidade dos receptores e à sua localização abundante em tecidos diferentes, a interacção adenosina-receptor de adenosina leva a várias respostas fisiológicas. A adenosina, ao ligar-se aos receptores AI e A2, regula as consequências patológicas da inflamação ao controlar a ligação de leucócitos ao endotélio e actua como um agente anti-inflamatório ao ligar-se aos receptores A2 e A3, através da inibição da desgranulação de neutrófilos (2). A adenosina também diminui a migração de eosinófilos através da activação do receptor A3. Este efeito promotor de 5'-AMP é mediado pela CD73 e é seguido de um aumento de AMPc intracelular. Recentemente foi demonstrado um papel crítico para o receptor A2a na diminuição de respostas inflamatórias sistémicas e específicas do tecido in vivo. A adenosina previne a lesão celular durante a isquemia cardíaca e do sistema nervoso central (3-5). Após hipoxia, a actividade ecto-5'-nucleotidase aumenta devido a fenómenos conhecidos como pré-condicionamento. Isto resulta na libertação de grandes quantidades de adenosina levando a uma maior resistência das células ao enfarte, por exemplo, na hipoxia cardíaca.BACKGROUND OF THE INVENTION The interaction between lymphocytes and endothelial cells is a multi-step process. To be able to penetrate the vessel wall and reach the target site, the circulating cells utilize a set of very finely regulated adhesion molecules. Increased adhesion to the endothelium and subsequent transmigration of recirculating leukocytes through the endothelial lining of the vessel wall into the tissue are characteristic of inflammation. In addition, the release of pro- and anti-inflammatory cytokines occurs to a large extent at sites of inflammation. Those cytokines are potent regulators of the expression of adhesion molecules. CD73 (ecto-5'-nucleotidase) is a cell surface molecule anchored in 70-kD glycosyl phosphatidylinositol with ecto-enzymatic activity. It is abundantly expressed in vascular endothelium and, at low levels, in certain subpopulations of human lymphocytes. It is part of the purine resource pathway when degrading nucleoside-5'-monophosphates (AMP and IMP) into nucleotides such as adenosine and inosine (1). Adenosine, a purine nucleoside product of the activity of the CD73 enzyme, binds to specific receptors on the cell surface. It has been reported that adenosine plays a role in many physiological and pathological events. To date four different subtypes of G protein AIR-coupled adenosine receptors A2aR, A2bR and A3R have been cloned. Due to the diversity of receptors and their abundant localization in different tissues, the adenosine-adenosine receptor interaction leads to various physiological responses. Adenosine, when bound to the A 1 and A 2 receptors, regulates the pathological consequences of inflammation by controlling the binding of leukocytes to the endothelium and acts as an anti-inflammatory agent by binding to A2 and A3 receptors by inhibiting degranulation of neutrophils (2). Adenosine also decreases the migration of eosinophils through activation of the A3 receptor. This 5'-AMP promoter effect is mediated by CD73 and is followed by an increase in intracellular cAMP. Recently, a critical role for the A2a receptor in decreasing systemic and tissue-specific inflammatory responses in vivo has been demonstrated. Adenosine prevents cell damage during cardiac and central nervous system ischemia (3-5). After hypoxia, the ecto-5'-nucleotidase activity is increased due to phenomena known as preconditioning. This results in the release of large amounts of adenosine leading to increased resistance of the cells to infarction, for example, in cardiac hypoxia.

Até à data, não se sabe praticamente nada sobre a regulação da expressão e função da CD73 endotelial. No entanto, na inflamação podem existir alguns indutores segregados que controlam especificamente a expressão de CD73 endotelial in VIVO . 3To date, virtually nothing has been known about the regulation of endothelial CD73 expression and function. However, in the inflammation there may be some secreted inducers that specifically control the expression of endothelial CD73 in VIVO. 3

Como a adenosina, ao ter um efeito anti-inflamatório e protector da célula, desempenha um papel importante no controlo da extensão e consequências da inflamação, este trabalho foi concebido para identificar factores responsáveis pela regulação da expressão da CD73 e pela produção de adenosina mediada pela ecto-5'-nucleotidase. A adenosina poderia ser administrada tal e qual a doentes que sofrem de condições inflamatórias ou condições que quando não tratadas levam muito provavelmente à inflamação do tecido. No entanto, uma desvantagem critica da administração directa de adenosina é a eliminação rápida da adenosina in vivo. Por conseguinte, este trabalho oferece uma via nova para se atingir níveis elevados de adenosina ao longo de um período de tempo prolongado.As adenosine, having an anti-inflammatory and protective effect on the cell, plays an important role in controlling the extent and consequences of inflammation, this work was designed to identify factors responsible for the regulation of CD73 expression and adenosine production mediated by ecto-5'-nucleotidase. Adenosine could be administered as it does to patients suffering from inflammatory conditions or conditions that when untreated most likely lead to inflammation of the tissue. However, a critical disadvantage of the direct administration of adenosine is the rapid elimination of adenosine in vivo. Therefore, this work offers a novel way to achieve high adenosine levels over an extended period of time.

OBJECTOS E SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 objecto principal da presente invenção é proporcionar um método para aumentar o nível de adenosina num indivíduo e para manter o nível de adenosina elevado ao longo de um período de tempo prolongado e desse modo prevenir ou tratar condições inflamatórias ou condições que quando não tratadas levariam à inflamação do tecido.OBJECTS AND SUMMARY OF THE INVENTION The main object of the present invention is to provide a method for increasing the level of adenosine in an individual and for maintaining the adenosine level elevated over an extended period of time and thereby preventing or treating inflammatory conditions or conditions that when left untreated would lead to inflammation of the tissue.

Assim, esta invenção refere-se à utilização de uma citoquina que é capaz de induzir a expressão de CD73 endotelial em que a referida citoquina é o interferão beta, em associação com uma quantidade eficaz de monofosfato de adenosina, para o fabrico de uma composição farmacêutica útil para a prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio, o qual é traumatismo do tecido; uma lesão de reperfusão resultante de enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral, transplante de órgãos ou uma outra intervenção cirúrgica; cancro ou metástase de cancro, ou uma condição inflamatória. 4Thus, this invention relates to the use of a cytokine which is capable of inducing expression of endothelial CD73 wherein said cytokine is interferon beta in combination with an effective amount of adenosine monophosphate for the manufacture of a pharmaceutical composition useful for the prevention or treatment of a disease or disorder, which is tissue trauma; a reperfusion injury resulting from myocardial infarction or stroke, organ transplantation or another surgical intervention; cancer or metastasis of cancer, or an inflammatory condition. 4

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Figura 1 é uma representação gráfica que mostra que a indução da expressão superficial de CD73 em HUVEC por IFN-a é dependente do tempo e da dose. No Painel (a) HUVEC foram expostas a lOOOU/mL de IFN-a durante os períodos de tempo indicados. (b) HUVEC foram cultivadas com concentrações diferentes de IFN-α durante 72 horas. São mostradas as médias relativas de MFI ± EPM de 3-9 experiências. A expressão de controlo é a expressão de CD73 sem IFN-α em cada ponto no tempo. Foi subtraído o fundo (a revelação do controlo negativo). *P < 0,05; ** P< 0,01Figure 1 is a graphical representation which shows that the induction of surface expression of CD73 in HUVEC by IFN-Î ± is time and dose dependent. In Panel (a) HUVEC were exposed to 10000 / ml IFN-Î ± for the stated periods of time. (b) HUVEC were cultured at different concentrations of IFN-α for 72 hours. Relative means of MFI ± EPM of 3-9 experiments are shown. The control expression is the expression of CD73 without IFN-α at each point in time. The background was subtracted (the development of the negative control). * P <0.05; ** P < 0.01

Figura 2 é uma fotografia em microscópio que mostra que a indução de CD73 com IFN-alfa leva a um aumento da expressão em vez de alterações na sua distribuição. As HUVEC foram desenvolvidas em meio ou induzidas com IFN-alfa durante 72 horas e a expressão de CD73 na superfície celular foi detectada com mAb 4G4 contra anticorpo anti-IgG de rato conjugado com CD73 e FITC. (a) Nas HUVEC de controlo, a CD73 é expressada na superfície da célula num padrão salpicado de pontos, (b) Após indução por IFN-α, a CD73 é mais intensa, mas a distribuição na superfície é semelhante às HUVEC de controlo. Revelação com um anticorpo de controlo negativo 3G6 em HUVEC de controlo (c) e após indução com IFN-α (d) . Ampliação original 400X, Barra de escala 10 pm.Figure 2 is a microscope photograph showing that the induction of CD73 with IFN-alpha leads to an increase in expression rather than changes in its distribution. HUVECs were grown in medium or induced with IFN-alpha for 72 hours and expression of CD73 on the cell surface was detected with mAb 4G4 against anti-mouse IgG antibody conjugated to CD73 and FITC. (a) In the control HUVEC, CD73 is expressed on the surface of the cell in a dotted pattern, (b) After induction by IFN-α, CD73 is more intense, but surface distribution is similar to control HUVEC. Revealing with a 3G6 negative control antibody in control HUVEC (c) and after induction with IFN-α (d). Original magnification 400X, Scale bar 10 pm.

Figura 3 é uma representação gráfica da expressão relativa de ARNm de CD73 em HUVEC. As HUVEC foram incubadas com ou sem IFN-alfa durante 72 horas. As análises por RT-PCR em tempo real foram realizadas com TaqMan. A figura representa a expressão relativa do ARNm de CD73 entre o controlo e as células tratadas com IFN-alfa. A normalização foi realizada utilizando o gene de vigilância GAPDH. Os dados representam 5 as médias de três experiências feitas em duplicado ± EPM, * P < 0,05.Figure 3 is a graphical representation of the relative expression of CD73 mRNA in HUVEC. HUVEC were incubated with or without IFN-alpha for 72 hours. Real-time RT-PCR analyzes were performed with TaqMan. The figure represents the relative expression of CD73 mRNA between the control and the cells treated with IFN-alpha. Normalization was performed using the GAPDH surveillance gene. The data represent 5 the means of three experiments done in duplicate ± EPM, * P < 0.05.

Figura 4 é um gráfico que mostra que a regulação da expressão de CD73 linfóide difere daquela das células endoteliais. Células U266B 1 e PBL foram desenvolvidos em meio com ou sem 1000 U/mL de IFN-α durante períodos de tempo diferentes. Não são observadas quaisquer alterações significativas nos PBL (barras brancas) ou U266B1 (barras pretas) quando expostas a IFN-α durante os períodos de tempo indicados quando comparadas com células de controlo não tratadas. São mostradas as médias relativas de MFI ± EPM de 3-6 experiências/ponto no tempo.Figure 4 is a graph showing that the regulation of lymphoid CD73 expression differs from that of endothelial cells. U266B 1 and PBL cells were grown in medium with or without 1000 U / ml IFN-α for different time periods. No significant changes are observed in the PBL (white bars) or U266B1 (black bars) when exposed to IFN-α for the stated periods of time when compared to untreated control cells. Relative means of MFI ± EPM of 3-6 experiments / time point are shown.

Figura 5 é um resumo da análise semiquantitativa das revelações imuno-histoquímicas de amostras de bexiga de (Painel a) áreas saudáveis e Painel b) áreas com tumor antes e depois de ser realizado tratamento com IFN.Figure 5 is a summary of the semiquantitative analysis of the immunohistochemical revelations of bladder samples from Panel (a) healthy areas and Panel (b) tumor areas before and after IFN treatment.

Figura 6 mostra fotografias em microscópio que mostram o efeito de IFN-α na expressão de CD73 no cancro da bexiga, (a) Um espécime de cancro da bexiga revelado com mAb anti-CD73 4G4 antes de tratamento com IFN-oí. Alguns vasos sanguíneos expressam levemente ou moderadamente CD73. (b) O mesmo tumor revelado com mAb anti-CD73 4G4 após tratamento com IFN-alfa. Os vasos sanguíneos expressam moderadamente ou abundantemente CD73. (c) Revelação com um anticorpo de controlo negativo 3G6. d-f, Um exemplo de um tumor (t) que expressa CD73 antes (d) e após (e) tratamento com IFN-alfa. Também neste caso o IFN-alfa aumentou a expressão de CD73 em células endoteliais. (f) Revelação de controlo negativo. Alguns vasos estão marcados com setas. Ampliação original 100X, barra de escala 20 pm. 6Figure 6 shows microscopic photographs showing the effect of IFN-α on CD73 expression in bladder cancer, (a) A bladder cancer specimen developed with anti-CD73 mAb 4G4 prior to IFN-Î ± treatment. Some blood vessels express CD73 slightly or moderately. (b) The same tumor developed with anti-CD73 mAb 4G4 after treatment with IFN-alpha. The blood vessels express moderately or abundantly CD73. (c) Disclosure with a 3G6 negative control antibody. d-f, An example of a tumor (t) which expresses CD73 before (d) and after (e) treatment with IFN-alpha. Also in this case IFN-alpha increased the expression of CD73 in endothelial cells. (f) Disclosure of negative control. Some vases are marked with arrows. Original Magnification 100X, 20pm scale bar. 6

Figura 7 mostra que o IFN-α aumenta a actividade da ecto-5'-nucleotidase da superfície celular. As HUVEC (a) e os PBL (b) foram pré-tratados durante 48 horas sem (barras abertas) ou com 1000 U/mL de IFN-α (barras fechadas). A actividade ecto-5'-nucleotidase foi avaliada utilizando 300 pmol/L de [3H]AMP e exprimida em ordenadas como nmoles de substrato desfosforilado por 106 células por hora (média ± EPM; n=4-5) . *P<0,05 por comparação com células de controlo, (c) Gráfico da velocidade de hidrólise de [3H]AMP por HUVEC de controlo (círculos a cheio) e tratadas com IFN-α (círculos vazios) versus concentração de substrato. Os valores são exprimidos como média ± EPM para duas experiências independentes. Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram calculados a partir das curvas representadas e resumidos no texto.Figure 7 shows that IFN-α increases the activity of the cell surface ecto-5'-nucleotidase. HUVEC (a) and PBL (b) were pretreated for 48 hours without (open bars) or 1000 U / ml IFN-α (closed bars). The ecto-5'-nucleotidase activity was assessed using 300 pmol / L [3 H] AMP and expressed on ordinates as nmoles of dephosphorylated substrate per 106 cells per hour (mean ± SEM; n = 4-5). * P < 0.05 by comparison to control cells, (c) Graphic of hydrolysis rate of [3H] AMP per HUVEC control (filled circles) and IFN-α treated (void circles) versus substrate concentration. Values are expressed as mean ± SEM for two independent experiments. The kinetic parameters (Vmax and Km) were calculated from the curves represented and summarized in the text.

Figura 8 mostra o efeito de IFN-α na permeabilidade de monocamadas de HUVEC. a, HUVEC foram aplicadas em membrana de poliestireno poroso (tamanho de poro de 0,4 pm) e desenvolvidas até à confluência. As HUVEC foram desenvolvidas em meio ou tratadas com 100 U/mL de IFN-a durante 72 horas. Quinze minutos depois de adicionar AMP, a função da membrana foi analisada medindo o fluxo de FITC 70 kDa-dextrano através da monocamada de HUVEC para a câmara inferior com um fluorómetro. O fluxo de FITC-dextrano foi medido até 100 min. Os valores são as médias ± EPM, n=3. *P < 0,05 por comparação com células tratadas com IFN-α. b, Monocamadas confluentes foram expostas a AMPCP (100 μΜ), um inibidor específico de ecto-5'-nucleotidase, 30 min antes da adição de FITC-dextrano. Os dados apresentados são os valores médios ± EPM, n=3. *P < 0,05 por comparação com células tratadas com IFN-a. 7Figure 8 shows the effect of IFN-α on the permeability of HUVEC monolayers. a, HUVEC were applied on porous polystyrene membrane (pore size 0.4 pm) and developed to confluence. HUVECs were grown in medium or treated with 100 U / ml IFN-Î ± for 72 hours. Fifteen minutes after AMP was added, membrane function was analyzed by measuring the flow of FITC 70 kDa-dextran through the HUVEC monolayer to the lower chamber with a fluorometer. The FITC-dextran flux was measured up to 100 min. Values are means ± SEM, n = 3. * P < 0.05 by comparison with IFN-α treated cells. b, Confluent monolayers were exposed to AMPCP (100 μΜ), a specific inhibitor of ecto-5'-nucleotidase, 30 min prior to the addition of FITC-dextran. The data presented are mean ± SEM, n = 3. * P < 0.05 compared to IFN-α treated cells. 7

Figura 9 são histogramas representativos que representam a regulação positiva de CD73 em células endoteliais umbilicais humanas após incubação com IFN-β e -γ. Durante 20 horas de incubação, o IFN-β aumentou a intensidade de fluorescência média (MFI) de 26 para 50, enquanto durante 48 horas de incubação o IFN-γ regulou positivamente a MFI de 26 para 94. O eixo dos X é a intensidade de fluorescência numa escala logarítmica e o eixo dos y é o número relativo de células.Figure 9 are representative histograms representing the upregulation of CD73 in human umbilical endothelial cells after incubation with IFN-β and -γ. During 20 hours of incubation, IFN-β increased the mean fluorescence intensity (MFI) from 26 to 50, while for 48 hours incubation the IFN-γ positively regulated the MFI from 26 to 94. The X-axis is the intensity fluorescence on a logarithmic scale and the y-axis is the relative number of cells.

Figura 10 mostra as vias metabólicas que regulam os níveis de adenosina. São representadas as reacções enzimáticas que levam à formação e degradação de adenosina. A quantidade de adenosina pode ser aumentada de 1. Regulação positiva/quantidade crescente de CD73; 2. proporcionado mais AMP; 3. adenilato-cinase inibidora, e 4. adenosina-desaminase inibidora, ou combinações destas.Figure 10 shows the metabolic pathways that regulate adenosine levels. Enzymatic reactions leading to the formation and degradation of adenosine are shown. The amount of adenosine may be increased by 1. Positive regulation / increasing amount of CD73; 2. provided more AMP; 3. inhibitory adenylate kinase, and 4. inhibitory adenosine deaminase, or combinations thereof.

Figura 11 mostra as revelações com hematoxilina-eosina de secções, embutidas em parafina, fixadas com formalina, de pulmões de ratazanas com falência de órgãos múltiplos sem tratamento (A) ou com tratamento com IFN-beta e AMP (B).Figure 11 shows hematoxylin-eosin revelations of formalin-fixed paraffin embedded sections of rat lungs with multiple organ failure without treatment (A) or with IFN-beta and AMP (B) treatment.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Esta divulgação baseia-se no rastreio de uma gama de mediadores potenciais e na determinação que os IFN-α, β e gama são activadores potentes da expressão de CD73. O IFN-alfa foi escolhido para estudos mais detalhados. O IFN-a produziu uma regulação positiva específica in vitro, dependente do tempo e da dose, de expressão da CD73 no endotélio mas não em PBL e de modo ainda mais importante, ele regulou positivamente a expressão de CD73 em vasos sanguíneos tumorais de doentes com cancro da bexiga in vivo. A regulação positiva de CD73 endotelial após indução por IFN-α foi enzimaticamente funcional produzindo 8 adenosina a partir de 5'-AMP levando a uma melhor função de barreira em células endoteliais. Além disso foi constatada uma diferença especifica para o tipo de célula na regulação das CD73 endotelial e linfocitária.This disclosure is based on the screening of a range of potential mediators and in determining that the IFN-α, β and gamma are potent activators of CD73 expression. IFN-alpha was chosen for more detailed studies. IFN-Î ± produced a time-dependent and dose-specific in vitro positive regulation of CD73 expression in the endothelium but not in PBL, and more importantly, it upregulated CD73 expression in tumor blood vessels of patients with bladder cancer in vivo. Positive regulation of endothelial CD73 following induction by IFN-α was enzymatically functional producing 8 adenosine from 5'-AMP leading to improved barrier function in endothelial cells. In addition, a specific difference was detected for the cell type in the regulation of endothelial and lymphocytic CD73.

Os resultados dos vários efeitos do IFN-α em CD73 endotelial e linfocitária demonstram ainda a diferença entre os tipos de células para regular a expressão de CD73. Neste contexto vale a pena mencionar que a quantidade de CD73 varia acentuadamente entre os linfócitos e as células endoteliais. Apenas 10 a 15 % dos linfócitos expressam CD73 e o nível de expressão é baixo em comparação com, por exemplo, as HUVEC as quais são todas positivas para CD73. Este tipo de diferenças, específicas em relação às células, na quantidade e regulação de CD73 pode ser fundamental para o comportamento apropriado de linfócitos, cujo papel é desaminar activamente a adenosina existente e extravasar para tecidos linfóides ou para sítios de inflamação. Pelo contrário, a adenosina é necessária para as células endoteliais manterem a sua função de barreira.The results of the various effects of IFN-α on endothelial and lymphocytic CD73 further demonstrate the difference between cell types to regulate CD73 expression. In this context it is worth mentioning that the amount of CD73 varies markedly between lymphocytes and endothelial cells. Only 10 to 15% of the lymphocytes express CD73 and the level of expression is low compared to, for example, the HUVECs which are all CD73 positive. This type of cell-specific differences in the amount and regulation of CD73 may be critical for appropriate lymphocyte behavior, which role is to actively deaminate the existing adenosine and to extravasate to lymphoid tissues or to sites of inflammation. In contrast, adenosine is required for endothelial cells to maintain their barrier function.

Em conclusão, este trabalho demonstra como a CD73 pode ser regulada positivamente tanto in vitro como in vivo por citoquinas, especialmente interferões. Como a adenosina é extremamente anti-inflamatória por natureza, a manipulação da sua produção endógena via regulação positiva de CD73 pode ser uma via potencial para tratar condições inflamatórias prejudiciais como, por exemplo, lesões de reperfusão com respeito a enfarte do miocárdio e acidente vascular cerebral, transplante de órgãos e várias lesões e traumatismos de tecidos.In conclusion, this work demonstrates how CD73 can be upregulated both in vitro and in vivo by cytokines, especially interferons. Because adenosine is extremely anti-inflammatory in nature, the manipulation of its endogenous production via upregulation of CD73 may be a potential pathway for treating harmful inflammatory conditions, such as reperfusion injury with respect to myocardial infarction and stroke , organ transplantation and various lesions and tissue trauma.

Definições:Definitions:

Como aqui utilizado, o termo "mediador" pretende incluir qualquer factor solúvel que tem um efeito no aparecimento da inflamação. Como aqui utilizado, o termo "indutor" pretende ainda significar um factor que aumenta a expressão e melhora a função de determinadas moléculas. 0 termo "tratamento" ou "tratar" deverá ser entendido como incluindo a cura completa de uma doença ou distúrbio, bem como o melhoramento ou alivio da referida doença ou distúrbio. 0 termo "prevenção" deverá ser entendido como incluindo a prevenção total, profilaxia, bem como a redução do risco do indivíduo ficar doente com a referida doença ou distúrbio. Este termo também deverá ser entendido como incluindo o pré-condicionamento de tecido aumentando o nível de adenosina de acordo com esta invenção numa fase muito precoce (por exemplo antes de cirurgias, antes do diagnóstico completo de acidente vascular cerebral e enfarte em doentes) de modo a impedir que o tecido sofra lesões. 0 termo "indivíduo" refere-se a um indivíduo humano ou animal. A expressão "quantidade eficaz" pretende incluir qualquer quantidade de um agente de acordo com a presente invenção que é suficiente para extrair um resultado terapêutico desejado, especialmente após administração num indivíduo animal ou humano. 0 texto "nível elevado de adenosina" deverá ser interpretado como um nível de adenosina que é pelo menos 2 % superior, preferencialmente pelo menos 20 % superior, muito preferencialmente pelo menos 30 % superior ao nível que seria normal no tecido sem as medidas tomadas de acordo com esta invenção. 10 O texto "doença ou distúrbio que requer ou beneficia de um aumento do nivel de adenosina" significa que a prevenção ou tratamento da referida doença ou distúrbio é facilitada por um nivel elevado de adenosina. A expressão "condição inflamatória" pretende incluir qualquer resposta inflamatória prejudicial e indesejada num tecido num indivíduo, em que a referida condição inflamatória pode resultar de uma condição aguda como traumatismo do tecido, uma lesão de reperfusão resultante de enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral, transplante de órgãos ou uma outra intervenção cirúrgica, ou de uma condição crómica incluindo condições alérgicas, doenças auto-imunes e doenças inflamatórias.As used herein, the term " mediator " is intended to include any soluble factor which has an effect on the onset of inflammation. As used herein, the term " inducer " is still intended to mean a factor that enhances expression and enhances the function of certain molecules. The term " treatment " or " treat " should be understood as including complete cure of a disease or disorder, as well as the amelioration or alleviation of said disease or disorder. The term " prevention " should be understood as including total prevention, prophylaxis, as well as reducing the risk of the individual becoming ill with said disease or disorder. This term should also be understood as including preconditioning of tissue by raising the level of adenosine according to this invention at a very early stage (for example prior to surgeries, prior to the complete diagnosis of stroke and infarction in patients) to prevent tissue from being injured. The term " individual " refers to a human or animal subject. The " effective amount " is intended to include any amount of an agent according to the present invention which is sufficient to extract a desired therapeutic result, especially after administration to an animal or human subject. The text " high adenosine level " should be interpreted as a level of adenosine which is at least 2% higher, preferably at least 20% higher, most preferably at least 30% higher than would be normal in the tissue without the measures taken in accordance with this invention. The text " disease or disorder requiring or benefiting from an increase in the level of adenosine " means that prevention or treatment of said disease or disorder is facilitated by a high level of adenosine. The term " inflammatory condition " is intended to include any harmful and undesirable inflammatory response in a tissue in an individual, wherein said inflammatory condition may result from an acute condition such as tissue trauma, a reperfusion injury resulting from myocardial infarction or stroke, organ transplantation or another surgical intervention, or a chromic condition including allergic conditions, autoimmune diseases and inflammatory diseases.

Nesta invenção, tratamento de traumatismos do tecido ou de lesões de reperfusão deverá ser particularmente entendido como a prevenção de condições inflamatórias que muito provavelmente se seguirão se os referidos traumatismos ou lesões de reperfusão forem deixados sem tratamento.In this invention, treatment of tissue trauma or reperfusion injury should be particularly understood as the prevention of inflammatory conditions most likely to follow if said trauma or reperfusion injury is left untreated.

Formas de realização preferíveis: como umaPreferred embodiments: as a

Embora se possa induzir um nível elevado de adenosina num indivíduo administrando a proteína CD73 recombinante, ou por uma citoquina ou outro factor capaz de induzir a expressão de CD73 endotelial ou por uma associação de ambas as terapias, em muitos casos seria preferível utilizar uma citoquina ou outro factor com capacidade semelhante. No entanto, em traumatismos graves seria útil a administração de proteína CD73 recombinante, para se conseguir rapidamente uma maior produção de adenosina, terapia alternativa ou adicional. 11Although a high level of adenosine can be induced in a subject by administering the recombinant CD73 protein, or by a cytokine or other factor capable of inducing endothelial CD73 expression or by an association of both therapies, in many cases it would be preferable to use a cytokine or another factor with similar capacity. However, in severe traumatisms, the administration of recombinant CD73 protein would be useful to rapidly achieve greater production of adenosine, alternative or additional therapy. 11

Um agente adequado para ser utilizado nesta invenção é o interferão beta o qual regula positivamente a transcrição do gene CD73.One suitable agent to be used in this invention is interferon beta which positively regulates the transcription of the CD73 gene.

As doenças ou os distúrbios típicos que requerem ou beneficiam do aumento dos níveis de adenosina num indivíduo são: traumatismo do tecido; lesões de reperfusão resultantes de enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral, transplante de órgãos ou outras intervenções cirúrgicas; cancro ou metástase de cancro; ou condições inflamatórias resultantes dos traumatismos ou lesões de reperfusão supramencionados ou de condições crónicas incluindo condições alérgicas, doenças auto-imunes e doenças inflamatórias. Como exemplos de tais condições crónicas podem ser mencionadas a artrite, condições alérgicas como a asma, condições inflamatórias como a doença inflamatória do intestino ou uma condição inflamatória da pele, psoríase, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doenças auto-imunes, diabetes de tipo I ou tipo II, aterosclerose, esclerose múltipla, doença de Crohn ou reacções de rejeição devido a transplante de órgãos.Typical diseases or disorders that require or benefit from increased levels of adenosine in an individual are: tissue trauma; reperfusion injury resulting from myocardial infarction or stroke, organ transplantation or other surgical interventions; cancer or metastasis of cancer; or inflammatory conditions resulting from the abovementioned trauma or reperfusion injury or chronic conditions including allergic conditions, autoimmune diseases and inflammatory diseases. As examples of such chronic conditions may be mentioned arthritis, allergic conditions such as asthma, inflammatory conditions such as inflammatory bowel disease or an inflammatory condition of the skin, psoriasis, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, autoimmune diseases, diabetes of type I or type II, atherosclerosis, multiple sclerosis, Crohn's disease or rejection reactions due to organ transplantation.

De acordo com a invenção, a administração de interferão beta, opcionalmente associado a proteína CD73 recombinante, é associada a uma administração de monofosfato de adenosina (AMP) para salvaguardar a fonte de adenosina a ser produzida em consequência do nível elevado de CD73, obtido por expressão elevada ou por administração directa da proteína CD73 recombinante.According to the invention, the administration of interferon-beta, optionally associated with recombinant CD73 protein, is associated with administration of adenosine monophosphate (AMP) to safeguard the source of adenosine to be produced as a consequence of the elevated level of CD73, obtained by expression or by direct administration of the recombinant CD73 protein.

Uma forma de realização preferível é a administração associada de interferão beta e opcionalmente proteína CD73 recombinante, com AMP e um inibidor de adenilato-cinase, o 12 que impede que o AMP se converta em difosfato de adenosina (ADP) ou trifosfato de adenosina (ATP) .A preferred embodiment is the associated administration of interferon beta and optionally recombinant CD73 protein, with AMP and an adenylate kinase inhibitor, which prevents AMP from converting to adenosine diphosphate (ADP) or adenosine triphosphate (ATP ).

Ainda outra forma de realização preferida é a administração associada de interferão beta, e opcionalmente proteína CD73 recombinante, com AMP e um inibidor de adenosina-desaminase, o qual impede a decomposição da adenosina. Também pode ser possível uma outra associação opcional com um inibidor de adenilato-cinase.Yet another preferred embodiment is the associated administration of interferon beta, and optionally recombinant CD73 protein, with AMP and an adenosine deaminase inhibitor, which prevents the breakdown of adenosine. Another optional combination with an adenylate kinase inhibitor may also be possible.

As vias metabólicas que regulam os níveis de adenosina são mostradas na Figura 10.The metabolic pathways that regulate adenosine levels are shown in Figure 10.

De acordo com uma outra forma de realização preferível, a administração de interferão beta, opcionalmente associado a proteína CD73 recombinante, em associação com a administração de monofosfato de adenosina, é iniciada logo que o doente com traumatismo ou enfarte ou acidente vascular cerebral é trazido para ser assistido, opcionalmente mesmo que o diagnóstico não esteja totalmente clarificado. Pela presente, o nível de adenosina pode ser aumentado tão rapidamente quanto possível. No caso de intervenções cirúrgicas, pode ser útil começar essa administração, já antes da cirurgia, por exemplo 12 h antes do começo da cirurgia. Também nestes casos poderia ser administrado um inibidor da adenilato-cinase e/ou um inibidor da adenosina-desaminase além dos agentes mencionados acima.According to a further preferred embodiment, the administration of interferon beta, optionally associated with recombinant CD73 protein, in association with the administration of adenosine monophosphate, is initiated as soon as the patient with trauma or infarction or stroke is brought to be assisted, optionally even if the diagnosis is not fully clarified. By the present, the level of adenosine can be increased as rapidly as possible. In the case of surgical interventions, it may be useful to start this administration, even before surgery, for example 12 hours before the start of surgery. Also in these cases an adenylate kinase inhibitor and / or an adenosine deaminase inhibitor could be administered in addition to the agents mentioned above.

Quantidades terapeuticamente eficazes, vias de administração e formas de dosagem: A quantidade terapeuticamente eficaz dos componentes de acordo com esta divulgação a ser administrada a um doente necessitado desse tratamento pode depender de um número de 13 factores incluindo, por exemplo, a idade e peso do doente, da condição precisa que requer tratamento e da sua gravidade, e da via de administração. A quantidade precisa estará, em última análise, à discrição do médico assistente. Assim, a prática da presente divulgação pode envolver qualquer dose, associação com outros fármacos terapeuticamente eficazes, formulação farmacêutica ou sistema de administração para administração oral, tópica, inalável ou parentérica.Therapeutically effective amounts, routes of administration and dosage forms: The therapeutically effective amount of the components according to this disclosure to be administered to a patient in need of such treatment may depend upon a number of factors including, for example, the age and weight of the drug. patient, the precise condition requiring treatment and its severity, and the route of administration. The precise amount will ultimately be at the discretion of the attending physician. Thus, the practice of the present disclosure may involve any dose, combination with other therapeutically effective drugs, pharmaceutical formulation or administration system for oral, topical, inhalable or parenteral administration.

As quantidades e os regimes para administração dos agentes de acordo com a presente divulgação podem ser prontamente determinados pelos técnicos médios na matéria de tratamento de distúrbios relacionados com inflamação, como as lesões de reperfusão, acidente vascular cerebral, transplante de órgão, traumatismos, cancro ou metástase de cancro, ou doenças inflamatórias crónicas.Amounts and regimens for administration of the agents according to the present disclosure can be readily determined by the skilled artisan in the matter of treatment of inflammation-related disorders, such as reperfusion injury, stroke, organ transplantation, trauma, cancer or metastasis of cancer, or chronic inflammatory diseases.

Com base nesta divulgação pode assumir-se que as citoquinas, como os interferões ou outros factores, administradas por via subcutânea, intramuscular, intravenosa ou transdérmica induzem a regulação positiva de CD73 e aumentam, desse modo , a concentração local de adenosina, o que é anti-inflamatório. Isto supera os problemas relacionados com a utilização de adenosina, a qual tem uma semivida muito curta e, portanto, não é óptima para utilização terapêutica.Based on this disclosure it may be assumed that cytokines, such as interferons or other factors, administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously or transdermally induce the upregulation of CD73 and thereby increase the local concentration of adenosine, which is anti-inflammatory. This overcomes the problems related to the use of adenosine, which has a very short half life and therefore is not optimal for therapeutic use.

De acordo com a presente invenção, o interferão beta pode ser preferencialmente administrado por infusão ou por injecção. As infusões intravasculares são normalmente realizadas utilizando soluções parentéricas contidas num saco ou frasco de infusão, e podem estar ligados a sistemas diferentes para controlar a velocidade de administração da solução parentérica. De acordo com a presente invenção, o 14 interferão beta pode ser alternativamente administrado como um aerossol.In accordance with the present invention, interferon beta may be preferably administered by infusion or by injection. Intravascular infusions are usually performed using parenteral solutions contained in an infusion bag or vial, and may be attached to different systems to control the rate of administration of the parenteral solution. In accordance with the present invention, interferon beta can alternatively be administered as an aerosol.

As formulações preferidas para infusão ou injecção podem incluir veículos, como albumina de soro humano, sais farmaceuticamente aceitáveis, tampões como fosfatos e/ou outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 0 ingrediente activo pode ser proporcionado em quantidades que variam desde, por exemplo, 1-50 x 106 IU por mL. A formulação pode ser preferencialmente proporcionada como pó liofilizado na forma de dosagem, a ser preparada pela adição de água ou de outras soluções adequadas para injecção antes da administração. O interferão beta pode ser administrado aos doentes que sofrem ou estão em risco de sofrer inflamações. Estes tipos de condições inflamatórias são, por exemplo, lesões de reperfusão isquémica durante o acidente vascular cerebral e enfarte do miocárdio. Também o transplante de órgãos e o traumatismo são ocasiões frequentemente associadas a componentes inflamatórias principais. Devido às suas características únicas, as várias citoquinas têm os seus alvos patológicos preferenciais: os interferões beta são os interferões mais adequados para lesões de reperfusão isquémica no acidente vascular cerebral e enfarte do miocárdio.Preferred formulations for infusion or injection may include carriers, such as human serum albumin, pharmaceutically acceptable salts, buffers such as phosphates and / or other pharmaceutically acceptable excipients. The active ingredient may be provided in amounts ranging from, for example, 1-50 x 106 IU per ml. The formulation may preferably be provided as lyophilized powder in dosage form, to be prepared by the addition of water or other solutions suitable for injection prior to administration. Interferon beta can be given to patients who are or are at risk for inflammation. These types of inflammatory conditions are, for example, ischemic reperfusion injury during stroke and myocardial infarction. Also organ transplantation and trauma are occasions often associated with major inflammatory components. Because of their unique characteristics, the various cytokines have their preferred pathological targets: beta interferons are the most suitable interferons for ischemic reperfusion injury in stroke and myocardial infarction.

No caso de ser adicionalmente administrada a proteína CD73 recombinante, uma via de administração adequada seria a infusão ou injecção. Uma dose diária adequada situa-se na gama de 0,1 até 5,0 mg/kg de massa corporal. O monofosfato de adenosina pode ser administrado, por exemplo, por via subcutânea, intramuscular, intravenosa ou 15 transdérmica. Uma dose diária típica pode estar na gama de 0,1 até 100 mg/kg de massa corporal.In case the recombinant CD73 protein is additionally administered, a suitable route of administration would be infusion or injection. A suitable daily dose is in the range of 0.1 to 5.0 mg / kg body weight. The adenosine monophosphate may be administered, for example, subcutaneously, intramuscularly, intravenously or transdermally. A typical daily dose may be in the range of 0.1 to 100 mg / kg body weight.

De igual modo um inibidor de adenilato-cinase ou um inibidor de adenosina-desaminase opcionalmente utilizado pode ser, por exemplo, administrado por via subcutânea, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. Uma dose diária típica de tais inibidores pode situar-se na gama de 0, 1 até 100 mg/kg de massa corporal.Likewise an optionally used adenylate kinase inhibitor or adenosine deaminase inhibitor may be, for example, administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously or transdermally. A typical daily dose of such inhibitors may be in the range of 0.1 to 100 mg / kg body weight.

SECÇÃO EXPERIMENTALEXPERIMENTAL SECTION

Nos exemplos seguintes, dados para descrever a invenção em mais pormenor, foram utilizados os seguintes materiais e métodos. Células, anticorpos e reagentes. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram isoladas e cultivadas em meio completo em balões de cultura de células revestidos com gelatina. Os linfócitos de sangue periférico humano (PBL) de voluntários saudáveis foram isolados utilizando Ficoll-Hypaque (Histopague-1077; Pharmacia, Uppsala, Suécia) . Os PBL, a linha de células U266B1 e a linha de células endoteliais HEC (equivalente à EaHy-926) foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS, L-glutamina 4 mM, 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. Foram utilizados mAb anti-CD73 4G4 (IgGl de rato), mAb anti-ICAM-1 5C3 (IgGl) e mAb 3G6 (IgGl de rato) contra células T de galinha como um anticorpo de controlo negativo. Os 5'-difosfato de a, β-metilenoadenosina (AMPCP) e 5'-monofosfato de adenosina (5'-AMP) foram de Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).In the following examples, the following materials and methods were used to describe the invention in more detail. Cells, antibodies and reagents. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated and cultured in complete medium in gelatin-coated cell culture flasks. Human peripheral blood lymphocytes (PBLs) from healthy volunteers were isolated using Ficoll-Hypaque (Histopague-1077; Pharmacia, Uppsala, Sweden). PBL, U266B1 cell line and HEC endothelial cell line (equivalent to EaHy-926) were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FCS, 4 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100æg / ml streptomycin. Anti-CD73 mAb 4G4 (mouse IgG1), anti-ICAM-1 mAb 5C3 (IgG1) and 3G6 mAb (mouse IgG1) against chicken T cells were used as a negative control antibody. A, β-methyleneadenosine 5'-diphosphate (AMPCP) and adenosine 5'-monophosphate (5'-AMP) were from Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Induções e revelações de imunofluorescência. Os detalhes sobre as induções estão indicados no Quadro 1. Para cada 16 ponto no tempo foi incubado um balão de controlo sem indutores.Immunofluorescence inducitions and revelations. Details on the inductions are given in Table 1. For each 16 point in time a control balloon was incubated without inducers.

Foram utilizados três protocolos diferentes para as revelações de imunofluorescência: A) Para estudar o efeito de um painel de indutores diferentes na expressão superficial de CD73 foram realizadas análises de imunofluorescência. Resumidamente, HUVEC foram tratadas com ou sem indutores e desprendidas com EDTA 5mM-tripsina. Incubou-se 5 X 105 células para cada revelação com concentrações saturantes de mAb 3G6 (controlo negativo), 4G4 (anti-CD73) e 5C3 (anti-ICAM-1) como sobrenadantes de hibridoma ou anticorpo purificado (concentração final, 10 microgramas/mL) durante 20 min a 4°C e lavou-se duas vezes. Em seguida, as células foram incubadas durante 20 min a 4°C com mAb anti-IgG de rato de ovelha conjugado com FITC (Sigma) contendo 5% de soro AB diluído a 1:100. Finalmente, as células foram lavadas duas vezes e fixadas com paraformaldeído a 1%. Todas as incubações e lavagens foram realizadas com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo 2% de FCS e NaN3 lmM. A fluorescência foi então detectada utilizando um classificador de células activado por fluorescência (FACS, Becton-Dickinson, San Jose, CA). A diferença entre as células de controlo e tratadas foi calculada de: N° vezes diferença = Células tratadas fMFL «CD73 - MFI.cont- neg) Células não tratadas (MFI, aCD73 - MFI,cont. neg.)Three different protocols were used for the immunofluorescence disclosures: A) To study the effect of a panel of different inducers on the surface expression of CD73, immunofluorescence assays were performed. Briefly, HUVEC were treated with or without inducers and detached with 5mM EDTA-trypsin. 5 X 105 cells were incubated for each development with saturating concentrations of mAb 3G6 (negative control), 4G4 (anti-CD73) and 5C3 (anti-ICAM-1) as hybridoma or purified antibody supernatants (final concentration, 10 micrograms / mL) for 20 min at 4 ° C and washed twice. The cells were then incubated for 20 min at 4 ° C with FITC-conjugated sheep anti-mouse IgG mAb (Sigma) containing 5% AB serum diluted 1: 100. Finally, the cells were washed twice and fixed with 1% paraformaldehyde. All incubations and washes were performed with phosphate buffered saline (PBS) containing 2% FCS and 1mM NaN3. Fluorescence was then detected using a fluorescence activated cell sorter (FACS, Becton-Dickinson, San Jose, CA). The difference between the control and treated cells was calculated from: No. times difference = treated cells fMFLÂ® CD73 - MFI.contrib) Untreated cells (MFI, aCD73 - MFI, cont. Neg.)

B) Para a detecção de CD73 intracelular, os linfócitos foram permeabilizados antes das revelações de imunofluorescência incubando-os durante 2 min em acetona a -20 °C. Em seguida, as células foram lavadas com meio RPMI 17 1640 contendo 5% de FCS e revelados e analisados por FACS como descrito em (A). C) Para estudar a distribuição de CD73 em HUVEC ou PBL, as células foram inicialmente reveladas como em A) e em seguida centrifugadas utilizando 1000 RPM durante 5 minutos numa lamela de vidro, fixadas com formaldeido e montadas com Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL). Alternativamente, as monocamadas de HUVEC foram desenvolvidas em lamelas de vidro revestidas com gelatina e reveladas em relação a CD73, ICAM-1 ou controlo negativo incubando as células com concentrações saturantes de mAbs como descrito em (A) e analisado num microscópio de fluorescência (Olympus BX60).B) For detection of intracellular CD73, lymphocytes were permeabilized prior to immunofluorescence disclosure by incubating for 2 min in acetone at -20 ° C. The cells were then washed with RPMI 171640 medium containing 5% FCS and developed and analyzed by FACS as described in (A). C) To study the distribution of CD73 in HUVEC or PBL, the cells were initially developed as in A) and then centrifuged using 1000 RPM for 5 minutes on a glass slide, fixed with formaldehyde and mounted with Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates , Inc., Birmingham, AL). Alternatively, HUVEC monolayers were grown on gelatin coated glass slides and developed on CD73, ICAM-1 or negative control by incubating the cells with saturating concentrations of mAbs as described in (A) and analyzed on a fluorescence microscope (Olympus BX60).

Análise de ARN de CD73. As HUVEC foram desenvolvidas até à confluência em balões de cultura de células e os PBL foram isolados antes das induções utilizando Ficoll-Hypague. 1 X 107 células de HUVEC e PBL foram ambas incubadas com IFN-alfa 1000 U/mL em meio de cultura. Um número semelhante de células foi deixado por tratar. O ARN foi isolado utilizando o sistema de isolamento de ARN UltraspecTM-II (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX) segundo as instruções do fabricante. 1-2 pg de ARN total foi tratado com Dnase I (Tipo Amplificação, Gibco BRL, Life Technologies, Gathersburg, MD) . O ADNc foi preparado utilizando Transcriptase Inversa Superscript II (Gibco BRL, Life Technologies) segundo as instruções do fabricante. Antes da medição por RT-PCR de tempo real, as amostras foram tratadas com Rnase H (Gibco BRL, Life Technologies). Iniciadores e sondas para o gene de vigilância GAPDH foram utilizados como controlos internos. Os iniciadores e sondas de CD73 foram concebidos utilizando o software de computador Primer Express (PE Biosystems, Foster City, CA). 18RNA analysis of CD73. HUVEC were grown to confluency in cell culture flasks and PBL were isolated prior to induction using Ficoll-Hypague. 1 X 107 HUVEC and PBL cells were both incubated with 1000 U / ml IFN-alpha in culture medium. A similar number of cells were left untreated. RNA was isolated using the Ultraspec ™ -II RNA isolation system (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX) according to the manufacturer's instructions. 1-2 pg of total RNA was treated with Dnase I (Type Amplification, Gibco BRL, Life Technologies, Gathersburg, MD). The cDNA was prepared using Superscript II Reverse Transcriptase (Gibco BRL, Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. Prior to real-time RT-PCR measurement, the samples were treated with Rnase H (Gibco BRL, Life Technologies). Primers and probes for the GAPDH surveillance gene were used as internal controls. CD73 primers and probes were designed using Primer Express computer software (PE Biosystems, Foster City, CA). 18

Foram utilizados os iniciadores de CD73 5' CTG GGA GCT TAC GAT TTT GCA3 ' e 5'CCT CGC TGG TCT GCT CCA3' e a sonda de CD73 5'CCA ACG ACG TGC ACA GCC GG3' (MedProbe, St. Hanshaugen, Noruega). As medições de RT-PCR de tempo real foram realizadas utilizando a mistura TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey) e 0 Detector de Sequências ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). A expressão do gene de vigilância GAPDH foi utilizada como uma referência para normalização e calculado o aumento relativo da expressão de ARNm de CD73 entre o controlo e as células tratadas com IFN-oí.The primers of CD73 5 'CTG GGA GCT TAC GAT TTT GCA3' and 5'CCT CGC TGG TCT GCT CCA3 'and the CD73 5'CA ACCA ACG TGC ACA GCC GG3' probe (MedProbe, St. Hanshaugen, Norway) . Real-time RT-PCR measurements were performed using the TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey) and the ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Expression of the GAPDH surveillance gene was used as a reference for normalization and the relative increase in expression of CD73 mRNA between the control and the IFN-Î ± treated cells was calculated.

Ensaio de ecto-5'-nucleotidase. A actividade ecto-5'-nucleotidase foi avaliada por cromatografia em camada fina (TLC) como anteriormente descrito (19). Resumidamente, o ensaio padrão de enzima continha num volume final de 120 pL de RPMI 1640, 4-6 x 104 HUVEC desprendidas (ou 1 x 105 células linfóides), 5 mmol/L de β-glicerofosfato e as concentrações indicadas de 5'-AMP com rastreador [2_3H]AMP (actividade especifica 18,6 Ci/mmol; Amersham). Os tempos de incubação foram escolhidos para garantir a linearidade da reacção com o tempo, pelo que a quantidade do AMP convertido não excedeu 7-10% do substrato inicialmente introduzido. As aliquotas da mistura foram aplicadas a placas de TLC Alugram SIL G/UV254 (Macherey-Nagel) e separadas com isobutanol/ álcool isoamílico/ 2-etoxietanol/ amoníaco/ H20 (9:6:18:9:15) como solvente. O AMP marcado com 3H e os seus derivados nucleósidos desfosforilados foram visualizados em luz UV e quantificados utilizando um espectrómetro β Wallac-1409.Ecto-5'-nucleotidase assay. The ecto-5'-nucleotidase activity was assessed by thin layer chromatography (TLC) as previously described (19). Briefly, the standard enzyme assay contained in a final volume of 120 μl of RPMI 1640, 4-6 x 104 HUVEC (or 1 x 105 lymphoid cells), 5 mmol / L β-glycerophosphate and the indicated concentrations of 5'- AMP with [.sup.23 H] AMP (specific activity 18.6 Ci / mmol; Amersham). The incubation times were chosen to ensure the linearity of the reaction over time, whereby the amount of the converted AMP did not exceed 7-10% of the substrate initially introduced. Aliquots of the blend were applied to Alugram SIL G / UV254 (Macherey-Nagel) TLC plates and separated with isobutanol / isoamyl alcohol / 2-ethoxyethanol / ammonia / H 2 O (9: 6: 18: 9: 15) as solvent. 3H-labeled AMP and its dephosphorylated nucleoside derivatives were visualized in UV light and quantitated using a Wallac-1409 β-spectrometer.

Ensaios de permeabilidade. A fim de avaliar a função barreira de monocamadas confluentes, as HUVEC foram aplicadas (50 000 células/segmento inserido) em filtros de 19 policarbonato de segmento inserido Transwell (diâmetro 6,5-mm, tamanho de poro 0,4-μιη; Costar, Cambridge, MA). Os filtros foram tratados durante 1-2 h com fibronectina e secos ao ar antes de se aplicar células endoteliais. Tipicamente, as monocamadas foram estudadas 4-5 dias após aplicação. As HUVEC foram induzidas com IFN-a (100 U/mL) durante 72 horas antes dos estudos de permeabilidade da monocamada ou desenvolvidas em meio sem IFN-a. O transporte através das monocamadas endoteliais foi avaliado medindo o fluxo de dextrano marcado com FITC (500 pg/mL, massa molecular 70 000). As monocamadas endoteliais foram pré-tratadas com AMP (50 μΜ) durante 15 min antes de se ter iniciado o transporte de FITC-dextrano. Para se avaliar o papel da actividade enzimática da CD73 na permeabilidade de células endoteliais, o fluxo de FITC-dextrano foi medido na presença ou ausência de um inibidor especifico de ecto-5'-nucleotidase, AMPCP (100 μΜ). Em determinadas experiências, adicionou-se AMPCP às câmaras superior e inferior 30 min antes de se iniciar o transporte pela adição de dextrano marcado com FITC. Os segmentos inseridos foram removidos da câmara inferior (Visiplate, Perkin Elmer Life Sciences) aos pontos no tempo 10 min, 20 min, 30 min, 40 min e 100 min e o dextrano marcado com FITC foi medido directamente nas câmaras inferiores num fluorómetro (TECAN Ultra fluorescence reader, Tecan, Áustria) utilizando 485 e 535 nm como os comprimentos de onda de excitação e emissão, respectivamente.Permeability tests. In order to evaluate the barrier function of confluent monolayers, the HUVECs were applied (50,000 cells / inserted segment) to transwell inserts (6.5-mm diameter, 0.4-μιη pore size; Costar , Cambridge, MA). The filters were treated for 1-2 h with fibronectin and air dried before endothelial cells were applied. Typically, monolayers were studied 4-5 days after application. HUVEC were induced with IFN-Î ± (100 U / ml) for 72 hours prior to the monolayer permeability studies or grown in medium without IFN-Î ±. Transport through the endothelial monolayers was assessed by measuring the flux of FITC-labeled dextran (500æg / ml, 70,000 molecular mass). Endothelial monolayers were pretreated with AMP (50 μΜ) for 15 min prior to initiation of FITC-dextran transport. To assess the role of CD73 enzymatic activity in endothelial cell permeability, FITC-dextran flux was measured in the presence or absence of a specific inhibitor of ecto-5'-nucleotidase, AMPCP (100 μΜ). In certain experiments, AMPCP was added to the upper and lower chambers 30 min prior to initiation of transport by the addition of FITC-labeled dextran. The inserted segments were removed from the lower chamber (Visiplate, Perkin Elmer Life Sciences) at time points 10 min, 20 min, 30 min, 40 min and 100 min and the FITC-labeled dextran was measured directly in the lower chambers in a fluorometer (TECAN Ultra fluorescence reader, Tecan, Austria) using 485 and 535 nm as the excitation and emission wavelengths, respectively.

Análise estatística. Os dados são apresentados como média ± EPM de experiências individuais. As comparações estatísticas foram feitas utilizando o teste t de Student, e valores de P < 0,05 foram tidos como significativos. Os dados de experiências cinéticas foram submetidos a análises computacionais utilizando a equação de Michaelis-Menten 20 para determinar os valores de Km e Vmax (GraphPad Prism™ versão 3.0, San Diego CA).Statistical analysis. Data are presented as mean ± SEM of individual experiments. Statistical comparisons were made using Student's t-test, and P values < 0.05 were considered significant. Data from kinetic experiments were submitted to computational analysis using the Michaelis-Menten 20 equation to determine Km and Vmax values (GraphPad Prism ™ version 3.0, San Diego CA).

Exemplo 1Example 1

Regulação positiva da expressão de CD73 em células endoteliaisPositive regulation of CD73 expression in endothelial cells

Este trabalho foi concebido para encontrar reguladores potentes da expressão de CD73 ou da actividade enzimática de ecto-5'-nucleotidase com base em CD73. Deste modo, células endoteliais foram expostas a uma grande gama de indutores bem conhecidos de várias moléculas (Quadro 1). Os indutores incluíram, por exemplo, interferões e LPS. A presença de interferões (IFN-a, IFN-β e IFN-γ) levou a uma regulação positiva acentuada na expressão de CD73 em HUVEC com doses > 200 U/mL após indução durante 20-24 horas (Figuras 1 e 9).This work was designed to find potent regulators of CD73 expression or the ecto-5'-nucleotidase enzymatic activity based on CD73. In this way, endothelial cells were exposed to a wide range of well known inducers of various molecules (Table 1). Inducers included, for example, interferons and LPS. The presence of interferons (IFN-a, IFN-β and IFN-γ) led to a marked upregulation of CD73 expression in HUVEC at > 200 U / mL after induction for 20-24 hours (Figures 1 and 9).

Este exemplo mostra que a expressão de CD73 é regulada positivamente em células endoteliais utilizando interferões. Como o IFN-a é muito utilizado em medicina clínica, os seus efeitos foram avaliados em mais detalhe. 21 QUADRO 1This example shows that expression of CD73 is upregulated in endothelial cells using interferons. As IFN-a is widely used in clinical medicine, its effects have been evaluated in more detail. 21 TABLE 1

Reguladores utilizados para induzir a expressão de CD73Regulators used to induce expression of CD73

Indutor Concentração utilizada Tempo de incubaçãoInductor Concentration used Incubation time

Actuação rápida FMLP ícr9 e ícr7 m 5 min e 2 h db AMPc 0,5 e 5 microg/mL 5 min e 2 h histamina 1 e 10 microg/mL 5 min e 2 h PMA 1 e 10 ng/mL 5 min e 2 h Actuação lenta LPS 1 e 100 ng/mL 4 e 20 h 100 e 500 ng/mL 48 h IFN-alfa 1,5,10,50,100,200, 500 e 2000 U/mL 72 h 1000 u/mL 4,12,20,24,48, 60,72 e 96 h IFN-garaa 50 e 200U/mL 4 e 20 h 1000 U/mL 12, 20, 24,40,48,60 e 72 h IFN-β 1000 U/mL 20, 24, 40, 48 e 72 h FMLP = metionina-leucina fenilalanina formilada PMA = miristato acetato de forbol LPS = lipopolissacáridoFast acting FMLP Î »9 and Î» 5 m 2 min and 2 h db cAMP 0.5 and 5 microg / ml 5 min and 2 h histamine 1 and 10 microg / ml 5 min and 2 h PMA 1 and 10 ng / ml 5 min and 2 h Slow acting LPS 1 and 100 ng / mL 4 and 20 h 100 and 500 ng / mL 48 h IFN-alpha 1,5,10,50,100,200, 500 and 2000 U / mL 72 h 1000 u / mL 4,12,20 , 24.48, 60.72 and 96 h IFN-garaa 50 and 200U / ml 4 and 20 h 1000 U / ml 12, 20, 24, 40, 48, 60 and 72 h IFN-β 1000 U / ml 20, 24, 40, 48 and 72 h FMLP = formylated methionine-leucine phenylalanine PMA = phorbol myristate acetate LPS = lipopolysaccharide

Exemplo 2Example 2

Dependência da regulação positiva pelo IFN-α com o tempo e a dose (não faz parte da invenção reivindicada)Dependence of IFN-α positive regulation with time and dose (not part of the claimed invention)

Praticamente todas as HUVEC não activadas suportam CD73 na sua superfície quando analisadas por FACS. Por conseguinte, para medir o aumento na expressão de moléculas CD73 na superfície celular mediu-se a intensidade de fluorescência média (MFI) das HUVEC. 22Virtually all unactivated HUVECs support CD73 on their surface when analyzed by FACS. Therefore, to measure the increase in the expression of CD73 molecules on the cell surface the mean fluorescence intensity (MFI) of HUVEC was measured. 22

Para estudar ainda melhor a cinética da regulação positiva por IFN-α, monocamadas confluentes de HUVEC foram incubadas utilizando doses diferentes de IFN-α durante os períodos de tempo indicados. A expressão de CD73 aumentou quase duas vezes de modo dependente com o tempo (92,4 ± 11,5%; n=9) após 72 horas com 1000 U/mL de IFN-α (Figura la).To further study the kinetics of IFN-α positive regulation, confluent HUVEC monolayers were incubated using different doses of IFN-α for the indicated periods of time. Expression of CD73 increased almost twice over time (92.4 ± 11.5%; n = 9) after 72 hours with 1000 U / mL of IFN-α (Figure 1a).

Exposições mais longas das HUVEC ao IFN-α não provocaram qualquer aumento significativo adicional na expressão de CD73 (dados não mostrados) . Um padrão semelhante de regulação positiva de CD73 foi observado após indução com IFN-β e IFN-γ (Fig,9). A regulação positiva da expressão de CD73 também foi dependente da dose, já que em concentrações que vão desde 10 até 1000 U/mL o maior aumento na intensidade foi observado a 1000 U/mL (Figura lb).Longer exposures of HUVEC to IFN-α did not cause any additional significant increase in CD73 expression (data not shown). A similar pattern of CD73 positive regulation was observed after induction with IFN-β and IFN-γ (Fig, 9). Positive regulation of CD73 expression was also dose dependent, since at concentrations ranging from 10 to 1000 U / mL the greatest increase in intensity was observed at 1000 U / mL (Figure 1b).

As revelações de imunofluorescência seguidas de microscopia de fluorescência revelaram que o tratamento com IFN-α não induz quaisquer alterações significativas na distribuição ou polarização da CD73 na superfície das HUVEC. Em vez disso, a CD73 está distribuída mais intensamente mas de modo análogo na superfície da célula (Figura 2).Immunofluorescence disclosures followed by fluorescence microscopy revealed that IFN-α treatment did not induce any significant changes in the distribution or polarization of CD73 on the surface of HUVEC. Instead, CD73 is distributed more intensely but analogously at the cell surface (Figure 2).

Este exemplo mostra que o IFN-α aumenta a expressão de CD73 endotelial de um modo dependente com o tempo e a dose.This example shows that IFN-α increases endothelial CD73 expression in a time and dose-dependent manner.

Exemplo 3Example 3

Efeito de IFN-α na expressão de ARN de CD73 (não faz parte da invenção reivindicada) A seguir, determinou-se se o aumento na expressão de CD73 é mediada pelo aumento na expressão de ARN de CD73. Após 72 horas de indução das HUVEC com 1000 U/mL de IFN-α, o nível de ARN de CD73 era de 3,4 ± 0,5 (média de expressão 23 relativa ± EPM; n=3) relativamente às células de controlo após normalização à GAPDH (Figura 3).Effect of IFN-α on the expression of CD73 RNA (not part of the claimed invention) Next, it was determined whether the increase in CD73 expression is mediated by the increase in CD73 RNA expression. After 72 hours of induction of HUVECs with 1000 U / ml IFN-α, the CD73 RNA level was 3.4 ± 0.5 (relative expression mean 23 ± SEM, n = 3) relative to the control cells after normalization to GAPDH (Figure 3).

Isto confirma que o aumento na expressão de CD73 observada no Exemplo 1 é de facto mediada por um aumento na expressão de ARN.This confirms that the increase in CD73 expression observed in Example 1 is in fact mediated by an increase in RNA expression.

Exemplo 4Example 4

Especificidade da regulação positiva em relação ao tipo de célula (não faz parte da invenção reivindicada)Specificity of the upregulation relative to the cell type (not part of the claimed invention)

Apesar da semelhança estrutural das CD73 endotelial e linfóide, o IFN-α promove efeitos diferentes nestes dois tipos de células. Depois de se constatar que a expressão de CD73 em células endoteliais é induzida por IFN-a, determinou-se se a CD73 em linfócitos também se comportaria de modo análogo nas mesmas condições. 1000 U/mL de IFN-a não aumentou a expressão de CD73 em PBL de modo significativo (Figura 4) . Até mesmo com tempos de indução mais longos de até 48 horas observou-se alterações menores na expressão de CD73 na superfície dos linfócitos. Para excluir a possibilidade de que os linfócitos isolados de fresco não sobrevivessem bem nas condições de cultura e, por conseguinte, falhassem a regular positivamente a CD73, uma linha de células linfóides que expressa CD73 U266B1 também foi tratada com IFN-α. Elas também foram incapazes de regular positivamente a expressão do seu CD73 mesmo após 48 ou 72 horas de indução. Em vez disso, houve uma diminuição às 48 horas após tratamento com IFN-α em comparação com as células de controlo (MFI relativa 82,1 ± 5,6 % vs. 100 %; n=3) (Figura 4).Despite the structural similarity of endothelial and lymphoid CD73, IFN-α promotes different effects in these two cell types. After the expression of CD73 in endothelial cells is found to be induced by IFN-Î ±, it was determined whether CD73 on lymphocytes would also behave analogously under the same conditions. 1000 U / ml IFN-a did not significantly increase CD73 expression in PBL (Figure 4). Even with longer induction times of up to 48 hours minor changes in the expression of CD73 on the surface of the lymphocytes were observed. To exclude the possibility that freshly isolated lymphocytes did not survive well under culture conditions and therefore failed to positively regulate CD73, a lymphoid cell line expressing CD73 U266B1 was also treated with IFN-α. They were also unable to positively regulate the expression of their CD73 even after 48 or 72 hours of induction. Instead, there was a 48 h decrease after IFN-α treatment compared to control cells (relative MFI 82.1 ± 5.6% vs. 100%; n = 3) (Figure 4).

Para elucidar se também existe regulação positiva no nível de proteína CD73 intracelular, PBL e HUVEC foram permeabilizados com acetona antes da revelação com imunofluorescência após indução com IFN-α. Não pôde ser observada qualquer regulação positiva da expressão intracelular de CD73 em PBL. Resultados semelhantes foram obtidos quando as análises foram feitas com FACS e microscopia de fluorescência. Nas HUVEC foi observado um ligeiro aumento da revelação intracelular com mAb anti-CD73 após indução com IFN-α (dados não apresentados).To elucidate whether there is also positive regulation at the intracellular CD73 protein level, PBL and HUVEC were permeabilized with acetone prior to development with immunofluorescence following IFN-α induction. No positive regulation of intracellular expression of CD73 in PBL could be observed. Similar results were obtained when the analyzes were performed with FACS and fluorescence microscopy. In HUVEC, a slight increase in intracellular development with anti-CD73 mAb following IFN-α induction was observed (data not shown).

Exemplo 5Example 5

Expressão de CD73 em amostras clínicas de tumor (não faz parte da invenção reivindicada)Expression of CD73 in clinical tumor samples (not part of the claimed invention)

Para investigar se o IFN-α também regularia a expressão de CD73 in vivo, espécimes de tecido de cancros epiteliais superficiais da bexiga foram recolhidos antes e após tratamento com IFN-a2b, revelados e analisados.To investigate whether IFN-α would also regulate CD73 expression in vivo, tissue specimens from superficial bladder epithelial cancers were collected before and after treatment with IFN-Î ± 2b, revealed and analyzed.

Doze doentes com cancro epitelial superficial da bexiga foram avaliados para cirurgia de uma até três semanas antes da cirurgia real. Com respeito à visita de avaliação, foram efectuada biopsias de área normal da bexiga e do tumor. Os doentes foram administrados com 50 milhões de unidades de IFN-a2b (IntronA, Schering-Plough) instilados na bexiga um dia antes da cirurgia. A cistectomia foi realizada e os doentes sofreram ureteroenterocutaneostomia, enterocistoplastia ou ureteroenteroumbilicostomia convencional como a operação reconstrutiva. Três doentes não receberam IFN-α antes da cirurgia. Dois deles receberam 100 mg de epirrubicina (Pharmorubicin, Pharmacia) instilada na bexiga um dia antes da cirurgia e um não recebeu nada. Os seus tumores foram analisados antes (biopsia) e após a cirurgia e utilizados como controlos. Todos os doentes eram 25Twelve patients with superficial epithelial bladder cancer were evaluated for surgery one to three weeks prior to the actual surgery. With respect to the evaluation visit, normal bladder and tumor area biopsies were performed. Patients were given 50 million units of IFN-α2b (IntronA, Schering-Plow) instilled in the bladder the day before surgery. Cystectomy was performed and patients underwent ureteroenterocutaneostomy, enterocystoplasty or conventional ureteroenterostomy as the reconstructive operation. Three patients did not receive IFN-α prior to surgery. Two of them received 100 mg of epirubicin (Pharmorubicin, Pharmacia) instilled in the bladder the day before surgery and one received nothing. Their tumors were analyzed before (biopsy) and after surgery and used as controls. All patients were 25

Caucasianos do género masculino. As caracteristicas dos doentes surgem no Quadro 2.Caucasian male. The characteristics of the patients are shown in Table 2.

Os espécimes de amostra da bexiga foram congelados instantaneamente em azoto líquido e cortados em secções de 5 pm. Subsequentemente, as secções foram reveladas com mAb anti-CD73 4G4 ou 3G6 (controlo negativo) como anticorpos primários e foi utilizada IgG anti-rato de coelho conjugada com peroxidase (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) como um anticorpo de segunda fase. A reacção foi desenvolvida adicionando tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina (Polysciences, Inc., Warrington, PA) em PBS. Todas as incubações foram 20 min com concentrações saturantes de mAb seguidas de duas lavagens com PBS. Foi contado o número de vasos positivos/campo microscópico (X200) e a intensidade da revelação foi avaliada semiquantitativamente. Foi dada uma classificação combinada de 0 até 3 a cada amostra. A classificação 0 foi atribuída a amostras sem vasos sanguíneos positivos e a classificação 3 a amostras com revelação igual à amígdala inflamada. As classificações 1 e 2 foram ajustadas para cobrir os padrões de revelação intermédios. Todas as amostras foram lidas de modo cego. QUADRO 2Sample bladder specimens were frozen instantly in liquid nitrogen and cut into sections of 5 μm. Subsequently, sections were developed with anti-CD73 mAb 4G4 or 3G6 (negative control) as primary antibodies and rabbit anti-mouse IgG conjugated to peroxidase (DAKO A / S, Glostrup, Denmark) was used as a second-stage antibody. The reaction was developed by adding 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Polysciences, Inc., Warrington, PA) in PBS. All incubations were 20 min with saturating mAb concentrations followed by two washes with PBS. The number of positive vessels / microscopic field (X200) was counted and the intensity of the development was evaluated semiquantitatively. A combined score of 0 to 3 was given to each sample. Classification 0 was attributed to samples without positive blood vessels and classification 3 to samples with equal development to the inflamed amygdala. Rankings 1 and 2 were adjusted to cover intermediate disclosure standards. All samples were read blindly. TABLE 2

Caracteristicas dos doentes tratados cora IFN-a Número do Idade Intervalo entre Histologia (grau HHO) doente (anos) biopsia e cistectomia 1 59 1 semana UCA grau 2 cistite eosinófila 2 73 1 semana UC grau 3 3 64 1 semana UC grau 2 4 66 3 semanas UC grau 3 5 70 1 semana SCCB grau 2 6 59 1 semana UC grau 3 cora componente de células escamosas 7 68 2 semanas UC grau 3 26Characteristics of patients treated with IFN-a Age Number Interval between histology (grade HHO) patient (years) biopsy and cystectomy 1 59 1 week UCA grade 2 eosinophil cystitis 2 73 1 week UC degree 3 3 64 1 week UC degree 2 4 66 3 weeks UC grade 3 5 70 1 week SCCB grade 2 6 59 1 week UC grade 3 with squamous cell component 7 68 2 weeks UC grade 3 26

Características dos doentes tratados cora IFN-oí Número do Idade Intervalo entre Histologia (grau HHO) doente (anos) biopsiae cistectomia 8 65 3 semanas UC grau 2 9 70 1 semana UG grau 1, invasivo UCA = Cancro urotelial SCCB = Cancro de células escamosasCharacteristics of patients treated with IFN-oi Age Number Interval between histology (HHO grade) patient (years) biopsy and cystectomy 8 65 3 weeks UC grade 2 9 70 1 week UG grade 1, invasive UCA = urothelial cancer SCCB = squamous cell cancer

Em dois tumores as células malignas foram positivas para CD73 reflectindo o facto de também algumas células epiteliais serem positivas para CD73. 0 IFN-α produziu uma regulação positiva clara de CD73 no endotélio vascular tanto em vasos de controlo como em vasos cancerosos in vivo quando comparado com os níveis de expressão antes e depois do tratamento em espécimes de controlo (Figura 5). No entanto, não foi detectada qualquer regulação positiva para CD73 entre os poucos linfócitos normais presentes nos tumores. Analogamente, o nível de expressão de células tumorais permaneceu constante durante o tratamento com IFN-a2b naqueles tumores que foram positivos para CD73 (Figura 6) . Três doentes, que não receberam IFN-oí e foram utilizados para controlar a possível regulação positiva de CD73 provocada pela biopsia e pela própria cirurgia, não exibiram qualquer aumento significativo na sua expressão de CD73 (um doente não mostrou qualquer alteração e dois doentes tiveram um aumento de 0,5 na expressão de CD73 endotelial no tecido tumoral). Assim, a alteração média nos doentes de controlo foi de 0,3 e nos doentes tratados de 1,3 (P =0,02).In two tumors the malignant cells were positive for CD73 reflecting the fact that also some epithelial cells were CD73 positive. IFN-α produced a clear up-regulation of CD73 in vascular endothelium both in control vessels and in cancerous vessels in vivo as compared to expression levels before and after treatment in control specimens (Figure 5). However, no CD73-positive regulation was detected among the few normal lymphocytes present in tumors. Similarly, the level of tumor cell expression remained constant during IFN-α2b treatment in those tumors that were CD73 positive (Figure 6). Three patients, who did not receive IFN-α and were used to control for possible positive regulation of CD73 caused by biopsy and surgery, did not exhibit any significant increase in their CD73 expression (one patient showed no change and two patients had one increase in the expression of endothelial CD73 in tumor tissue). Thus, the mean change in control patients was 0.3 and in treated patients 1.3 (P = 0.02).

Esta experiência mostra claramente que a CD73 é regulada positivamente nos indivíduos humanos em consequência da administração de IFN-α em quantidades clinicamente praticáveis. 27This experience clearly shows that CD73 is upregulated in human subjects as a consequence of the administration of IFN-α in clinically practicable amounts. 27

Exemplo 6Example 6

Efeito de IFN-α na actividade ecto-5'-nucleotidase (não faz parte da invenção reivindicada)Effect of IFN-α on the ecto-5'-nucleotidase activity (not part of the claimed invention)

Para determinar se o aumento na expressão de CD73 induzido por IFN-oí em HUVEC é acompanhado pela indução simultânea da actividade ecto-5'-nucleotidase, aplicou-se um ensaio radioquimico para medição directa da conversão de [3H]AMP em [3H]adenosina. 0 pré-tratamento de monocamadas de HUVEC com IFN-a (1000 U/mL durante 48 horas) provocou um aumento significativo na velocidade de hidrólise do [3H]AMP (Figura 7a) , enquanto não foi detectada qualquer activação significativa da actividade da enzima após tratamento de PBL com IFN-α (Figura 7b).To determine whether the increase in IFN-Î³1 -induced CD63 expression in HUVEC is accompanied by the simultaneous induction of ecto-5'-nucleotidase activity, a radiochemical assay for direct measurement of the conversion of [3 H] AMP into [3 H] adenosine. Pretreatment of HUVEC monolayers with IFN-α (1000 U / ml for 48 hours) caused a significant increase in [3 H] AMP hydrolysis rate (Figure 7a), whereas no significant activation of enzyme activity was detected after treatment of PBL with IFN-α (Figure 7b).

Para elucidar melhor o mecanismo de activação da ecto-5'-nucleotidase, realizou-se a análise cinética da hidrólise de [3H]AMP por HUVEC de controlo e tratadas com IFN e estas curvas de saturação podem ser observadas na Figura 7c. A análise estatística revelou que o IFN-α aumentou significativamente a velocidade de hidrólise máxima (Vmax) da 5'-nucleotidase em comparação com células não tratadas (525 ± 30 vs. 350 ± 29 nmol/106 células/hora) sem qualquer modificação da afinidade para a enzima (Km -50-60 pmol/L). Estes dados sugerem que o IFN-α aumenta o número de moléculas de 5'-nucleotidase enzimaticamente activas na superfície endotelial em vez de induzir alterações conformacionais do sítio catalítico da enzima.To better elucidate the mechanism of activation of the ecto-5'-nucleotidase, kinetic analysis of [3 H] AMP hydrolysis was performed by HUVEC control and IFN treated and these saturation curves can be seen in Figure 7c. Statistical analysis revealed that IFN-α significantly increased the maximal hydrolysis rate (Vmax) of the 5'-nucleotidase as compared to untreated cells (525 ± 30 vs. 350 ± 29 nmol / 106 cells / hour) without any modification of the affinity for the enzyme (Km -50-60 pmol / L). These data suggest that IFN-α increases the number of enzymatically active 5'-nucleotidase molecules on the endothelial surface rather than inducing conformational changes in the catalytic site of the enzyme.

De modo interessante, a utilização da mesma abordagem com outro nucleótido [3H]ATP não revelou alterações significativas nas actividades de hidrólise de ATP após tratamento das HUVEC com IFN-α (dados não apresentados) confirmando a especificidade da indução da ecto-5'- 28 nucleotidase. Para assegurar que a CD73 não é continuamente segregada a partir de linfócitos para o sobrenadante da cultura de células produzindo uma actividade enzimática aumentada, analisou-se a conversão de [3H]AMP em [3H]adenosina em meios de cultura de células de linfócitos induzidos com IFN-α e de células de controlo não tratadas. Não foi encontrada qualquer alteração significativa na actividade enzimática dos meios de cultura de células entre o controlo e o tratamento com IFN-α (dados não apresentados).Interestingly, the use of the same approach with another [3 H] ATP nucleotide did not reveal significant alterations in ATP hydrolysis activities after treatment of HUVEC with IFN-α (data not shown) confirming the specificity of ecto-5'- 28 nucleotidase. To ensure that CD73 is not continuously secreted from lymphocytes to the cell culture supernatant producing increased enzymatic activity, the conversion of [3 H] AMP into [3H] adenosine in culture media from induced lymphocyte cells with IFN-α and untreated control cells. No significant change in the enzymatic activity of the cell culture media was found between control and IFN-α treatment (data not shown).

Estas experiências mostram que o interferão-α aumenta a actividade ecto-5'-nucleotidase em células endoteliais.These experiments show that interferon-α enhances ecto-5'-nucleotidase activity in endothelial cells.

Exemplo 7Example 7

Efeito de IFN-α na função da membrana de HUVEC (não faz parte da invenção reivindicada)Effect of IFN-α on HUVEC membrane function (not part of the claimed invention)

Para estudar se a expressão de CD73 regulada positivamente pelo IFN-α e o aumento na produção de adenosina mediada pela CD73 era capaz de regular a função da membrana de HUVEC, mediu-se o fluxo de dextrano marcado com FITC através de monocamadas endoteliais confluentes em poços de segmento inserido permeáveis. Em todos os pontos no tempo examinados, houve uma diferença significativa (P<0,05) nas permeabilidades das HUVEC tratadas com IFN-a (100 U/mL) durante 3 dias em comparação com HUVEC não tratadas como indicado por um menor fluxo de FITC-dextrano (Fig. 8a) . O pré-tratamento de monocamadas de HUVEC com um inibidor especifico da enzima CD73, AMPCP inverteu a diminuição na permeabilidade associada ao tratamento com IFN-α como demonstrado por um maior fluxo de FITC-dextrano (Fig. 8b). 29To study whether the expression of CD73 positively regulated by IFN-α and the increase in CD73-mediated adenosine production was able to regulate the function of the HUVEC membrane, the flow of FITC-labeled dextran was measured by confluent endothelial monolayers in permeable insert wells. At all time points examined, there was a significant difference (P < 0.05) in the permeabilities of HUVEC treated with IFN-α (100 U / ml) for 3 days compared to untreated HUVEC as indicated by a lower flow of FITC-dextran (Fig. 8a). Pre-treatment of HUVEC monolayers with a specific inhibitor of the CD73 enzyme, AMPCP reversed the decrease in permeability associated with IFN-α treatment as demonstrated by a higher flow of FITC-dextran (Fig. 8b). 29

Estes resultados confirmam que o IFN-α aumenta a função da membrana das HUVEC na presença de AMP. Sugerem fortemente que ao aumentar a expressão de CD73 e, deste modo, o nível de adenosina vascular, a permeabilidade diminui levando a um menor extravasamento das células inflamatórias para os tecidos.These results confirm that IFN-α increases the membrane function of HUVEC in the presence of AMP. They strongly suggest that by increasing the expression of CD73 and thus the level of vascular adenosine, the permeability decreases leading to less extravasation of the inflammatory cells into the tissues.

Os interferões produzem uma regulação positiva, a longo prazo e dependente do tempo e da dose, de CD73 em células endoteliais mas não em linfócitos tanto ao nível da proteína como ao nível do ARN. Além do mais, a produção de adenosina mediada por CD73 é aumentada após tratamento com IFN-oí em células endoteliais resultando numa diminuição da permeabilidade destas células.Interferons produce a long-term, dose-dependent, long-term and dose-dependent regulation of CD73 in endothelial cells but not in lymphocytes both at the protein level and at the RNA level. In addition, CD73-mediated adenosine production is increased following IFN-Î ± treatment in endothelial cells resulting in a decrease in the permeability of these cells.

Exemplo 8Example 8

Tratamento combinado de ratazanas com AMP e IFN-beta na falência de órgãos múltiplosCombined treatment of rats with AMP and IFN-beta in multiple organ failure

Modelo: A falência de órgãos múltiplos foi induzida em ratazanas (peso: 250 g) bloqueando a artéria mesentérica com um grampo durante 30 minutos. Depois disso, o tempo de reperfusão foi de duas horas. As ratazanas no grupo de tratamento foram injectadas por via subcutânea com 10 000 unidades de IFN-beta 18-20 horas antes do bloqueamento da artéria com um grampo. Ao longo da experiência os animais receberam 37,5 mg de AMP em 3 mL de soro fisiológico como uma infusão intravenosa contínua. Ratazanas com falência induzida de órgãos múltiplos mas sem tratamento serviram de controlos. No final da experiência, analisou-se a histologia dos pulmões, o qual é um dos órgãos alvos principais neste modelo experimental. 30Model: Multiple organ failure was induced in rats (weight: 250 g) by blocking the mesenteric artery with a staple for 30 minutes. Thereafter, the reperfusion time was two hours. The rats in the treatment group were injected subcutaneously with 10,000 IFN-beta units 18-20 hours prior to artery blockage with a staple. Throughout the experiment the animals received 37.5 mg of AMP in 3 mL of saline as a continuous intravenous infusion. Rats with induced failure of multiple organs but without treatment served as controls. At the end of the experiment, histology of the lungs was analyzed, which is one of the main target organs in this experimental model. 30

Resultados: Os pulmões das ratazanas de controlo sem tratamento mostraram espaço alveolar colapsado como se pode observar na Figura 11 (A) , enquanto as ratazanas que receberam IFN-beta e AMP não mostraram qualquer colapso acentuado do espaço alveolar (B) . Assim, o tratamento com IFN-beta e AMP protege das complicações associadas à falência de órgãos múltiplos.Results: The lungs of untreated control rats showed collapsed alveolar space as shown in Figure 11 (A), whereas rats receiving IFN-beta and AMP did not show any marked collapse of alveolar space (B). Thus, treatment with IFN-beta and AMP protects against complications associated with multiple organ failure.

Na globalidade, estes resultados sugerem que as citoquinas, e em especial os interferões são reguladores relevantes da CD73 in vivo no microambiente endotelial leucocitário e têm, deste modo, um papel fundamental no controlo da extensão da inflamação via produção de adenosina dependente de CD73.Overall, these results suggest that cytokines, and in particular interferons, are relevant regulators of CD73 in vivo in the leukocyte endothelial microenvironment, and thus play a key role in controlling the extent of inflammation via the production of CD73-dependent adenosine.

REFERÊNCIAS 1. Thompson, L.F., Ruedi, J.M., Glass, A., Moldenhauer, G., Moller, P., Low, M.G., Klemens, M.R., Massaia, M., e Lucas, A.H. 1990. Production and characterization of monoclonal antibodies to the glycosyl phosphatidylinositol-anchored lymphocyte differentiation antigen ecto-5'-nucleotidase (CD73). Tissue Antigens 35:9-19. 2. Bouma, M.G., Jeunhomme, T.M.M.A., Boyle, D.L., Dentener, M.A., Voitenok, N.N., van den Wildenberg, F.A.J.M., e Buurman, W.A. 1997. Adenosine inhibits neutrophil degranulation in activated human whole blood: involvement of adenosine A2 and A3 receptors. J. Immunol. 158:5400-5408 . 3. Olah, M.E., e Stiles, G.L. 1995. Adenosine receptor subtypes: characterization and therapeutic regulation. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35:581-606. 4. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., e Lazdunski, M. 1995. Essential role of adenosine, adenosine AI receptors, and ATP-sensitive K+ channels in cerebral 31 ischemic preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 : 4666-4670. 5. Linden, J. 2001. Molecular approach to adenosine receptors: receptor-mediated mechanisms of tissue protection. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41:775-787. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Jalkanen, Sirpa <120> Método de Tratamento ou Prevenção de condições pelo Aumento do Nivel de Adenosina num indivíduo <130> 3100-101 <16 0> 3 <170> Patentln version 3.0REFERENCES 1. Thompson, LF, Ruedi, JM, Glass, A., Moldenhauer, G., Moller, P., Low, MG, Klemens, MR, Massaia, M., and Lucas, AH 1990. Production and characterization of monoclonal antibodies to the glycosyl phosphatidylinositol-anchored lymphocyte differentiation antigen ecto-5'-nucleotidase (CD73). Tissue Antigens 35: 9-19. 2. Bouma, MG, Jeunhomme, TMMA, Boyle, DL, Dentener, MA, Voitenok, NN, van den Wildenberg, FAJM, and Buurman, WA 1997. Adenosine inhibits neutrophil degranulation in activated human whole blood: involvement of adenosine A2 and A3 receptors. J. Immunol. 158: 5400-5408. 3. Olah, M.E., and Stiles, G.L. 1995. Adenosine receptor subtypes: characterization and therapeutic regulation. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35: 581-606. 4. Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., and Lazdunski, M. 1995. Essential role of adenosine, adenosine AI receptors, and ATP-sensitive K + channels in cerebral 31 ischemic preconditioning. Proc. Natl. Acad. Know. USA 92: 4666-4670. 5. Linden, J. 2001. Molecular approach to adenosine receptors: receptor-mediated mechanisms of tissue protection. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41: 775-787. SEQUENCE LISTING < 110 > Jalkanen, Sirpa < 120 > Method of Treatment or Prevention of Conditions by Increasing Adenosine Level in an Individual < 130 > 3100-101 < 16 > 3 < 170 > Patentln version 3.0

<210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ctgggagctt acgattttgc a 21< 210 > 1 < 211 > 21 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 1 ctgggagctt acgattttgc a 21

<210> 2 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 cctcgctggt ctgctcca 18< 210 > 2 < 211 > 18 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 2 cctcgctggt ctgctcca ??? 18

<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 ccaacgacgt gcacagccgg 20< 210 > 3 < 211 > 20 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens < 400 > 3 ccaacgacgt gcacagccgg ??? 20

Lisboa, 11 de Agosto de 2010Lisbon, August 11, 2010

Claims

Use of a cytokine which is capable of inducing the expression of endothelial CD73, wherein said cytokine is interferon beta, in association with an effective amount of adenosine monophosphate, for the manufacture of a pharmaceutical composition useful for preventing or treating a disease or disorder, which is tissue trauma; a reperfusion injury resulting from myocardial infarction or stroke, organ transplantation or another surgical intervention; cancer or metastasis of cancer, or an inflammatory condition.

Use according to claim 1, wherein the disease or disorder is tissue trauma; a reperfusion injury resulting from myocardial infarction or stroke, cancer or cancer metastasis, or an inflammatory condition, and wherein administration of the cytokine is initiated as soon as the patient is brought in to be assisted.

Use according to claim 1, wherein the disease is a reperfusion injury resulting from organ transplantation or another surgical intervention, and administration of the cytokine is initiated prior to surgical intervention. Lisbon, August 11, 2010 1/11 to 250 ι

12 24 48 60 72 Incubation time (h) 250 -i

IFN-alpha U / ml Fig. 1 2/11

Fig. 2 3/11

IFNa Fig.

Incubation time (h) Fig. 4 5/11 b Φ _ TJ 2 ro Fig

Intensity of vessels of the tumor area tu XI (0 • g '(Λ c tu

- · - Patient 1 - · «- · > Patient 2 - - * - Patient 3 - - - Patient 4 Patient 5 - * - Patient 6 * - Patient 7 ..... 0 Patient 3 a " Patient 9 * -r-1 Patient 1 * -4- - Patient 2 * - Patient 3 = * Patient 4 -ii- 'Patient 5 - * - Patient 6' -o · - Patient 7 Patient 8 Patient 9 Fig.5 6/11

Fig. 6 7/11

Ο 250 500 750 [AMR] (pmoi / L) Fig. 7 8/11 Fitc-dextran flow; ng / mL FTITC-dextran flux; ng / mL

FIG. 8 to

AMPCP AMP Minutes FIG. 8 b 9 / 11Oh Oh 20h 20h Fig. 9 IFN-β IFN3 and A. coní. 10 ° 101 102 103 cont'd. EXAMPLE 10 10 10 101 102 103 cont'd. EXAMPLE 6 A-CD73 a-1MFI 26 M 10 101 101 103 1 Con. neg.MFI 410 ° 101 102 103 a-CD73MF! 26 10 101 101 103 neg.MFI 510 ° 101 102 103 k, a-CD73 w. a-11 MFI 50 JLL M10 10 1 10 103 103 48 h a-CD73MFI 94 48 h 10 ° 101 10 10 103 10/11 10/11

the dhH

ω CO 05 c or 0) as 05 -t-> J00 c o Έ ω CL Q < Z <N co <D co ω c E 05 to ω u 05 c co o c ω -o < 11/11

FIG. 11