PT1540335E - Métodos de identificação de estimuladores cognitivos - Google Patents

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PT1540335E
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creb
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Timothy P Tully
Roderick E M Scott
Rusiko Bourtchouladze
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Helicon Therapeutics Inc
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Description

ΡΕ1540335 1 DESCRIÇÃO "MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE ESTIMULADORES COGNITIVOS"
FUNDAMENTO DO INVENTO
Calcula-se que 4 a 5 milhões (cerca de 2% de todas as idades e 15% daqueles com idade superior a 65 anos) possuam alguma forma e grau de falência cognitiva. A falência cognitiva (distúrbio ou perda das funções cognitivas, o processo através do qual o conhecimento é adquirido, retido e usado) normalmente ocorre em associação com alterações ou condições do sistema nervoso central (SNC), incluindo perda de memória associada à idade, delírio (por vezes designado estado de confusão aguda), demência (por vezes classificado como do tipo Alzheimer ou não Alzheimer), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington (coreia), doença cerebrovascular (e.g., choque, isquemia) , distúrbios afectivos (e.g., depressão), distúrbios psicóticos (e.g., esquizofrenia, autismo (Síndrome de Kanner)), distúrbios neuróticos (e.g., ansiedade, distúrbios obsessivo-compulsivos), distúrbios de déficit de atenção (ADD), hematoma subdural, hidrocefalia de pressão normal, tumor cerebral, trauma da cabeça ou do cérebro.
Os distúrbios cognitivos sao tipicamente 2 ΡΕ1540335 manifestados por um ou mais déficits cognitivos, os quais incluem perda de memória (perda da capacidade para aprender nova informação ou para recordar informação previamente aprendida), afasia (distúrbios de linguagem/discurso), apraxia (perda de capacidade para realizar actividades motoras apesar da função motriz intacta), agnosia (incapacidade para reconhecer ou identificar objectos apesar da função sensorial intacta), distúrbios no funcionamento executivo (i.e., planeamento, organização, ordenação, abstracção). A disfunção cognitiva causa perda significativa do funcionamento social e/ou ocupacional, que pode interferir com a capacidade de um indivíduo para desempenhar actividades da vida diária e tem grande impacto na autonomia e qualidade de vida do indivíduo. Assim, existe um interesse considerável na identificação de candidatos clínicos para usar na reabilitação de um animal com qualquer forma de distúrbio cognitivo.
SUMARIO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado com métodos (ensaios) baseados em células e em grande número de testes para identificar ou rastrear estimuladores cognitivos que actuam através do aumento da função da via CREB. 0 invento permite a identificação de estimuladores cognitivos que possuam pouco ou nenhum efeito na função da via CREB, mas que actuam de forma a aumentar (estimular) a função da via 3 ΡΕ1540335 CREB em combinação com um agente estimulador da função de CREB. Espera-se que os estimuladores cognitivos identificados de acordo com o invento originem candidatos clínicos eficazes para usar na reabilitação de um animal com distúrbios cognitivos e para usar na estimulação de memória ou desempenho (capacidade ou função) cognitivo normal num animal normal. Os "estimuladores cognitivos" são igualmente referidos como "compostos capazes de estimular a função da via CREB" e "fármacos estimuladores da função de CREB". Os "agentes estimuladores da função de CREB" são igualmente aqui referidos como "agentes que estimulam a função da via CREB". Compreende-se que, nalguns casos, um estimulador cognitivo identificado de acordo com o presente invento possa ser um agente estimulador da função de CREB. Assim, um agente estimulador da função de CREB pode ser identificado como um estimulador cognitivo usando os métodos aqui descritos.
Como aqui descrito, os métodos de identificação ou triagem de estimuladores cognitivos compreendem uma triagem primária, uma triagem secundária e uma triagem terciária. De preferência, a triagem primária é um método baseado em células usado para identificar compostos candidatos; a triagem secundária é um método baseado em células usado para identificar compostos candidatos confirmados; e a triagem terciária usa um modelo de comportamento para identificar estimuladores cognitivos. A triagem primária compreende: (a) contacto das 4 ΡΕ1540335 células hospedeiras (particularmente células de origem neural {e.g., neuroblastomas, células estaminais neuro-nais)), compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE, com um composto a testar e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB (e.g., forscolina); (b) determinação da actividade indicadora em células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o composto a testar e com o agente estimulador da função de CREB; (c) comparação da actividade indicadora no passo (b) com a actividade indicadora em células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o composto a testar (i.e., células testemunhas que estiveram em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho); (d) selecção do composto a testar se (1) a actividade indicadora determinada no passo (b) for estatisticamente significativa superior relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas do passo (c); e (2) a actividade indicadora em células testemunhas que não tenham sido colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que foram colocadas em contacto com o composto a testar (i.e., células testemunhas que foram colocadas em contacto com o composto a testar apenas) não for diferente de forma estatisticamente significativa em relação à actividade indicadora em células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou com o composto a testar (i.e., células testemunhas que não tiveram contacto com qualquer composto); (e) repetição dos passos (a) a (d) 5 ΡΕ1540335 com uma gama de diferentes concentrações (e.g., 2 ou mais) do composto a testar seleccionado no passo (d) ; e (f) selecção do composto a testar se: (1) a actividade indicadora for proporcionalmente aumentada, de forma estatisticamente significativa na gama de concentrações diferentes para o referido composto a testar, relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho; e (2) a actividade indicadora nas células testemunhas em que foi introduzida a gama de diferentes concentrações do composto a testar sozinho não for significativamente diferente em relação à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou com o composto a testar, em que o composto a testar é identificado como um composto candidato. Numa realização particular, as células hospedeiras são colocadas em contacto com o composto a testar antes do contacto com o agente estimulador da função de CREB. Numa outra realização, o gene indicador codifica luciferase. Um gene indicador operacionalmente ligado ao promotor CRE é igualmente referido como gene indicador mediado por CRE. Um gene indicador mediado por CRE é um exemplo de um transgene mediado por CRE.
Como alternativa, a triagem primária compreende: contacto das células hospedeiras (particularmente células de origem neuronal (e.g. neuroblastomas, células estaminais neuronais) ) com um composto a testar e com uma dose sub- 6 ΡΕ1540335 óptima de um agente estimulador da função de CREB (e.g., forscolina); (b) avaliação da expressão endógena de genes dependente de CREB nas células hospedeiras que tenham sido colocadas em contacto com o composto a testar e com o agente estimulador da função de CREB; (c) comparação da expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo (b) com a expressão endógena de genes dependentes de CREB em células testemunhas que tenham sido colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que não tenham sido colocadas em contacto com o composto a testar (i.e., células testemunhas que tenham sido colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho); (d) selecção do composto a testar se (1) a expressão endógena de genes dependente de CREB determinada no passo (b) for aumentada de forma estatisticamente significativa relativamente à expressão endógena de genes dependentes de CREB do passo (c) ; e (2) a expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que tenham sido colocadas em contacto com o composto a testar (i.e., células testemunhas que tenham sido colocadas em contacto com o composto a testar sozinho) não for significativamente diferente em relação à expressão dos genes dependentes de CREB nas células testemunhas que tenham sido colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou do composto a testar (i.e., células testemunhas que não tenham sido colocadas em contacto com qualquer composto); (e) repetição dos passo (a) a (d) com uma gama de diferentes concentrações (e.g., 2 ou mais) do 7 ΡΕ1540335 composto a testar seleccionado no passo (d); e (f) selecção do composto a testar se: (1) a expressão de genes dependente de CREB aumentar proporcionalmente, de forma estatisticamente significativa na gama de diferentes concentrações para o referido composto a testar, relativamente à expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho; e (2) a expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas nas quais foi introduzida a gama de diferentes concentrações do composto a testar sozinho não for significativamente diferente relativamente à expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou do composto a testar, em que o composto a testar é identificado como um composto candidato. Numa realização particular, as células hospedeiras são colocadas em contacto com o composto a testar antes do contacto com o agente estimulador da função de CREB. A triagem secundária compreende: (a) contacto das células de origem neuronal (particularmente neurónios primários (e.g., células primárias do hipocampo)) com um composto candidato identificado na triagem primária e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB nas células que foram colocadas em contacto com o composto candidato e com o agente estimulador da função de CREB; e (c) comparação da expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo (b) com a expressão ΡΕ1540335 endógena de genes dependentes de CREB nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o composto candidato (i.e., células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho). Uma diferença estatisticamente significativa na expressão de genes dependente de CREB no passo (b) comparado com a expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho e nenhuma diferença significativa na expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que foram colocadas em contacto com o composto candidato (i.e. células testemunhas colocadas em contacto com o composto candidato sozinho) relativamente à expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou com o composto candidato (i.e., células testemunhas não colocadas em contacto com qualquer composto) identifica o composto candidato como um composto candidato confirmado. Numa realização particular, as células foram colocadas em contacto com o composto candidato antes de serem colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB.
Como alternativa, a triagem secundária compreende: (a) contacto das células de origem neuronal (particularmente neurónios primários (e.g., células 9 ΡΕ1540335 primárias do hipocampo)), compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE, com um composto candidato identificado na triagem primária e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB: (b) determinação da actividade indicadora nas células que foram colocadas em contacto com o composto candidato e com o agente estimulador da função de CREB; e (c) comparação da actividade indicadora avaliada no passo (b) com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o composto candidato (i.e., células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho). Uma diferença estatisticamente significativa na actividade indicadora determinada no passo (b) comparado com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e nenhuma diferença significativa na actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agentes estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o composto candidato (i.e., células testemunhas que foram colocadas em contacto com o composto candidato sozinho) relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou com o composto candidato (i.e., células testemunhas que não foram colocadas em contacto com qualquer composto) identifica o composto candidato como um composto candidato confirmado. 10 ΡΕ1540335
Numa realização particular, as células foram colocadas em contacto com o composto candidato antes do contacto com o agente estimulador da função de CREB.
Numa realização particular, as células de origem neuronal usadas na triagem secundária são diferentes das células hospedeiras usadas na triagem primária. Numa outra realização, o gene endógeno mediado por CRE ou o transgene mediado por CRE na triagem secundária é diferente do transgene mediado por CRE ou do gene endógeno mediado por CRE na triagem primária. Por exemplo, numa realização as células hospedeiras na triagem primária são de neuroblastoma e as células na triagem secundária não são de neuroblastoma. Numa outra realização, o transgene mediado por CRE na triagem primária é a luciferase (CRE operacionalmente ligado ao gene da luciferase) e o transgene mediado por CRE na triagem secundária não é luciferase. Numa realização particular, as células hospedeiras na triagem primária são células em proliferação (tais como neuroblastomas e células estaminais neuronais) e as células na triagem secundária são células diferenciadas de origem neuronal (como sejam neurónios ou células da glia) . Numa outra realização particular, o gene mediado por CRE na triagem primária é um gene indicador mediado por CRE (um transgene mediado por CRE) e o gene mediado por CRE na triagem secundária é um gene endógeno mediado por CRE.
Numa realização, a triagem terciária é um método comportamental, para avaliação da formação de memória a 11 ΡΕ1540335 longo prazo num animal, compreendendo: (a) administração de uma quantidade eficaz de um composto candidato confirmado identificado na triagem secundária no animal (e.g., ser humano, outro mamífero, vertebrado ou invertebrado); (b) treino do animal a que se administrou o composto candidato confirmado nas condições adequadas para produzir formação de memória a longo prazo no animal; (c) avaliação da formação de memória a longo prazo no animal treinado no passo (b) ; e (d) comparação da formação de memória a longo prazo avaliada no passo (c) com a formação de memória a longo prazo produzida no animal controlo ao qual o composto candidato confirmado não foi administrado. Se se notar um aumento da formação da memória a longo prazo avaliada no animal tratado com o composto candidato confirmado relativamente à formação de memória a longo prazo avaliada no animal testemunha, o composto candidato confirmado é identificado como um estimulador cognitivo. Existem outras triagens terciárias com protocolos muito semelhantes que usam métodos comportamentais (modelos) para outros distúrbios cognitivos. 0 invento também está relacionado com métodos de avaliação do efeito de um composto na expressão de genes dependentes de CRE (expressão de genes mediada por CRE) compreendendo: (a) contacto das células de origem neuronal (particularmente neurónios primários (e.g., células primárias do hipocampo) com um composto a ser avaliado e com uma dose sub-óptima de um agentes estimulador da função CRE; (b) avaliação endógena da expressão de genes 12 ΡΕ1540335 dependente de CREB nas células que foram colocadas em contacto com o composto e com o agente estimulador da função de CREB; e (c) comparação da expressão de genes dependente de CREB avaliada no passo (b) com a expressão endógena de genes dependentes de CREB em células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o composto (i.e. células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho). Uma diferença estatisticamente significativa na expressão de genes dependente de CREB no passo (b) comparado com a expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho e sem diferença significativa na expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que foram colocadas em contacto com o composto (i.e., as células colocadas em contacto com o composto sozinho) relativamente à expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou com o composto (i.e., células testemunhas não colocadas em contacto com qualquer composto) identifica o composto como possuindo um efeito na expressão de genes dependente de CREB. Numa realização particular, as células foram colocadas em contacto com o composto a ser avaliado antes do contacto com o agente estimulador da função de CREB. De preferência, o composto a ser avaliado é um composto candidato identificado na triagem primária. 13 ΡΕ1540335
Como alternativa, os métodos para avaliar o efeito de um composto na expressão de genes dependente de CREB compreende: (a) contacto das células de origem neuronal (particularmente neurónios primários {e.g., células primárias do hipocampo), compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE, com um composto a ser avaliado e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função CRE; (b) determinação da actividade indicadora nas células que foram colocadas em contacto com o composto e com o agente estimulador da função CRE; e (c) comparação da actividade indicadora determinada no passo (b) com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função CRE e que não foram colocadas em contacto com o composto (i.e., células testemunhass que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função CRE sozinho). Uma diferença estatisticamente significativa na actividade indicadora determinada no passo (b) comparativamente com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função CRE sozinho e sem diferença significativa na actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função CRE e que foram colocadas em contacto com o composto (i.e., células testemunhas colocadas em contacto com o composto sozinho) relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da 14 ΡΕ1540335 função CRE ou com o composto (i.e., células testemunhas não colocadas em contacto com qualquer composto) identifica o composto como tendo efeito na expressão de qenes dependente de CREB. Numa realização particular, as células foram colocadas em contacto com o composto a ser avaliado antes do contacto com o agente estimulador da função de CREB. De preferência, o composto a ser avaliado é um composto candidato identificado na triagem primária.
Numa realização particular, as células usadas nos métodos para avaliação do efeito de um composto na expressão de genes dependente de CREB são diferentes das células hospedeiras na triagem primária. Numa outra realização, o gene endógeno mediado por CRE e o transgene mediado por CRE usados nos métodos para avaliação do efeito de um composto na expressão de genes dependente de CREB são diferentes do transgene mediado por CRE ou do gene endógeno mediado por CREB na triagem primária. 0 invento ainda está relacionado com métodos para avaliação do efeito de um estimulador cognitivo na formação de memória a longo prazo num animal compreendendo: (a) administração de uma quantidade eficaz de estimulador cognitivo a um animal (e.g., ser humano, outro mamífero, vertebrado ou invertebrado); (b) treino do animal a que foi administrado o estimulador cognitivo em condições adequadas para produzir formação de memória a longo prazo no animal; (c) avaliação da formação de memória a longo prazo no animal treinado no passo (b); e (d) comparação da formação 15 ΡΕ1540335 de memória a longo prazo avaliada no passo (c) com a formação de memória a longo prazo produzida no animal testemunha a que o estimulador cognitivo não foi administrado. Se a diferença for notada na formação de memória a longo prazo avaliada no animal tratado com o estimulador cognitivo relativamente à formação de memória a longo prazo avaliado no animal testemunha, o estimulador cognitivo pode ser classificado como estimulador (melhoramento, aumento) da formação da memória a longo prazo no animal.
Os estimuladores cognitivos identificados de acordo com o invento podem ser usados para reduzir a duração e/ou número de sessões de treino necessárias para a indução, num ou mais circuitos neuronais específicos, de um padrão de actividade neuronal ou para reduzir a duração e/ou número de sessões de treino necessárias para induzir a alteração da estrutura/função a longo prazo (i.e. duradoira) dependente de CREB entre as ligações sinápticas do circuito neuronal. Os estimuladores cognitivos identificados de acordo com o invento podem ser usados para reduzir o número de sessões de treino necessárias para induzir um ganho de desempenho relativamente ao obtido apenas com treino ou para permitir intervalos mais pequenos ou sem descanso entre as sessões de treino para induzir um ganho de desempenho ou para aumentar o nível global de desempenho. 16 ΡΕ1540335
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico de barras que mostra os resultados da estimulação (parcial) de memória induzida por fármaco em murganhos normais por rolipram, um inibidor de fosfodiesterases (PDE) protótipo. A retenção de cinco dias após treino fraco (2x) é mais baixa do que no treino forte (5x). Apenas a memória após treino semanal é estimulada por injecções bilaterais no hipocampo (1 μΐ) de rolipram imediatamente após o treino. Rolipram reduziu o número de sessões de treino necessárias para produzir memória. % Congelação = % do tempo de observação em que os ratos permaneceram congelados/sem movimento.
Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando que as alterações dependentes de experiência na actividade neuronal modulam a expressão dos genes. Algumas destas alterações na expressão dos genes origina alterações estruturais e funcionais nas ligações sinápticas entre neurónios. Desta forma, os circuitos neuronais são constantemente afinados para optimizar as respostas de percepção, cognição e comportamentais.
Figura 3 é um gráfico de barras que mostra os resultados de uma triagem de "antisense" de ácidos
nucleicos trancados (LNA) pra CREB. Os oligos CREB LNB estão numerados de acordo com a ordem em que foram desenhados. Os oligos CREB LNB que não foram testados (i.e., CREB 4, 10, 11, 13 e 14) não estão apresentados. 17 ΡΕ1540335
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O factor de transcrição CREB desempenha um papel essencial na formação de memória a longo prazo e na plasticidade sináptica a longo prazo. Os estudos genéticos de comportamento da aprendizagem ofalctiva Pavloviana em Drosophila estabeleceram que CREB é um interruptor central para a conversão de informação adquirida recentemente a partir da memória a curto prazo para memória a longo prazo (Tully T. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94 (9):4239-4241 (1997)). 0 treino espaçado após uma tarefa de associação de choque odorífero induz uma memória a longo prazo dependente da síntese proteica (Tully, T. et al., Cell, 79(1):35-47 (1994)), a formação da qual é especificamente bloqueada pela expressão induzida de um transgene repressor de CREB (Yin, J.C. et al., Cell, 79(1):49-58 (1994)). A aprendizagem e a memória a curto prazo (mais recente) são normais nestas moscas transgénicas (Tully, T. et al., Cell, 79(1):35-47 (1994); e Yin, J.C. et al., Cell, 79 (1): 49-58 (1994)). Ao contrário destes resultados de perda de função, a expressão induzida de um transgene activador de CREB aumenta a memória a longo prazo especificamente através da anulação da necessidade de sessões de treino repetitivas e de um intervalo de descanso entre cada sessão (Yin, J.C. et al., Cell, 81(1):107-115 (1995)). Uma sessão de treino é suficiente para formar memória a longo prazo máxima em moscas transgénicas que expressam em excesso o activador CREB (Yin, J.C. et al., 18 ΡΕ1540335
Cell, 81(1):107-115 (1995)). Não é produzida mais memória a longo prazo. Pelo contrário, a memória a longo prazo é induzida com menos prática. WO0213867 discute o treino de murganhos transgénicos, portadores de um gene repórter dependente de CRE (betagalactosidase) no hipocampo induzindo assim a transcrição de genes dependentes de CRE em áreas anatómicas especificas do cérebro de mamífero. Assim, a formação de memória a longo prazo (LTM) encontra-se ligada à transcrição de genes dependentes de CRE em áreas anatómicas específicas do cérebro de mamífero. Mais à frente no texto, o pedido de patente descreve o facto de para se tratar déficits cognitivos associados a um distúrbio ou condição do SNC num animal, ser necessário administrar o chamado agente estimulador (também designado "fármacos estimuladores da via CREB" mais à frente no texto) que aumenta a função da via CREB (página 15) . Por "aumento da função da via CREB" WO0213867 pretende significar a capacidade de aumentar ou melhorar a expressão de genes dependente de CREB. A expressão de genes dependente de CREB pode ser estimulada ou melhorada através do aumento da produção endógena de CREB, por exemplo através da estimulação directa ou indirecta do gene endógeno para produzir quantidades crescentes de CREB ou através do aumento de CREB funcional (descrito na página 10), consultar também as reivindicações 1-27. forscolina como agente estimulador da função de CREB é particularmente mencionado na página 17, segundo e último parágrafo e na página 18. 19 ΡΕ1540335
Este aumento de memória também é específico da associação temporal de dois estímulos. Níveis elevados do activador CREB foram induzidos em todas as células da mosca devido à utilização de um promotor de choque térmico com o transgene. Na ausência de treino, não foi observado efeito mensurável no comportamento das moscas. Ainda, as apresentações espaçadas de odor e choque, desencontradas no tempo, não produziram memória a longo prazo em moscas activadoras de CREB (moscas induzidas para expressarem níveis elevados de activador CREB). Estes resultados sugerem que a aprendizagem associativa induz a sinalização a montante necessária para activar (fosforilar) o interruptor CREB durante a formação de memória olfactiva a longo prazo.
Uma quantidade crescente de evidência alarga estes resultados de invertebrados para mamíferos. Por exemplo, em Aplysia, as manipulações moleculares da expressão de CREB, semelhante às das moscas, suprimem ou aumentam (1) a memória a longo prazo de uma resposta electrofisiológica facilitadora numa mono-sinapse sensorimotora em culturas celulares e (2) as ligações sinápticas entre neurónios sensoriais e motores que são normalmente produzidas após aplicações espaçadas do estímulo facilitador (Bartsch, D. et ai., Cell, 83(6):979-992 (1995)). Num estudo focado numa forma de memória traumática, referido como condicionamento pelo medo (Bourtchuladze, R. et al., Cell, 79(1):59-68 (1994)), 20 ΡΕ1540335 murganhos mutantes portadores de uma inactivação parcial de CREB mostraram aprendizagem e memória a curto prazo normais mas a memória a longo prazo foi abolida. Pelo contrário, os murganhos normais necessitaram de apenas um ensaio de treino para formar uma memória a longo prazo desta experiência. Estes resultados sugerem que (1) para a experiência de condicionamento pelo medo, murganhos normais formaram memória a longo prazo mais como as moscas do activador CREB e (2) a mutação CREB nos murganhos foi parcial, reduzindo a quantidade de isoformas do activador relativamente às isoformas repressoras. Isto indicou que os murganhos mutantes CREB podem ter um interruptor CREB funcional que é estabelecido num nível semelhante ao das moscas normais. Como tal, o treino espaçado recuperará o déficit de memória a longo prazo em murganhos mutantes para CREB. De facto, Kogan et al., mostraram que a memória a longo prazo pode formar-se normalmente em murganhos mutantes para CREB sujeitos a treino espaçado mas não intensivo, proporcionando assim forte apoio ao modelo do interruptor CREB (Kogan J.H. et al., Curr. Biol., 7(1):1-11 (1997)).
Nos ratos, as injecções de oligonucleótidos de RNA "antisense" no hipocampo ou amígdala bloqueiam a formação de memória a longo prazo de duas tarefas diferentes que são dependentes da actividade destas regiões anatómicas, respectivamente (Guzowski, J.F. e McGaugh, J.L., Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 94(6):2698 (1997); e
Lamprecht, R., et al., J. Neurosci., 17(21): 8443-8450 21 ΡΕ1540335 (1997)). Em particular, as experiências com RNA "antisense" revelaram um papel de CREB durante a formação da memória a longo prazo de uma tarefa de labirinto aquático (dependente do hipocampo) e aversão condicionada pelo gosto (dependente da amígdala) em ratos (Guzowski J.F. e McGaugh, J.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94(6):2693-2698 (1977); e Lamprecht, R. et al., J. Neurosci., 17(21):8443-8450 (1997)).
Experiências mais recentes expressaram em excesso o activador CREB na amígdala e observaram aumento da formação de memória para uma resposta ao susto potenciada pelo medo em ratos, com uma assinatura CREB semelhante ao observado em moscas (Josselyn, S.A. et al., Society for Neuroscience, 28th Annual Meeting, Vol. 24, Abstract 365. 10 (1998); e Josselyn, S.A. et ai., J. Neurosci., 21(7):2404-2412 (2001)).
As observações celulares em murganhos e ratos reforçaram estes resultados de comportamento ao revelarem que a função neuronal CREB (fosforilação ou regulação de genes) foi modulada numa forma dependente de experiência (Impey, S. et ai., Neuron, 16(5):973-982 (1996); Taubenfeld S. M. et ai., Nat. Neurosci., 2(4):309-310 (1999); e
Taubenfeld, S.M. et ai., J. Neurosci., 21(1):84-91 (2001)).
Para além de estar envolvido na formação de memórias experimentais, CREB também parece funcionar no desenvolvimento e plasticidade celular de várias regiões corticais (Ahn, S. et al., Neuron, 23(3):559-568 (1999); 22 ΡΕ1540335
Barth, A.L. et al. , J. Neurosci., 20 (11):4206-4216 (2000); Glazewski, S. et al., Cerebral Córtex, 9(3):249-256 (1999); Pharm, T.A. et al., Neuron, 22 (1):63-72 (1999); e Pham, T.A. et al., Neuron, 31(3):409-420 (2001)). A actividade neuronal aumenta a actividade CREB no córtex (Moore, A.N. et al., J. Biol. Chem., 271(24):14214-14220 (1996)). CREB também medeia a plasticidade do desenvolvimento no hipocampo Murphy, D.D. e Segai, M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94(4):1482-1487 (1997)), no córtex somato-sensorial (Glazewski, S. et ai., Cerebral Córtex, 9(3):249-256 (1999)) no stratium (Liu, F.C. and Graybiel, A.M., Neuron, 17(6):1133-1144 (1996)) e no córtex visual (Pham, T.A. et al., Neuron, 22 (1):63-72 (1999)). Estes dados apoiam a ideia de que CREB é um interruptor molecular de um modo geral envolvido na conversão da actividade neuronal em alterações estruturais nas sinapses. Como tal, a via CREB representa (1) um alvo significativo para a descoberta de novos fármacos e (2) uma cabeça-de-ponte genética para a identificação de genes a jusante que também participam na plasticidade sináptica dependente de actividade. O presente invento proporciona métodos para identificar ou detectar estes fármacos, também aqui referidos como estimuladores cognitivos. O invento proporciona métodos (ensaios) baseados em células para um grande número de amostras para identificar ou testar estimuladores cognitivos que actuam através da estimulação da função da via CREB. 23 ΡΕ1540335
Os estimuladores cognitivos podem aumentar, estimular ou melhorar a função da via CREB através de uma variedade de mecanismos. Por exemplo, um estimulador cognitivo pode afectar uma via de transdução de sinal que leva à indução da expressão de genes dependente de CREB. A expressão de genes dependente de CREB pode ser conseguida, por exemplo, através da regulação positiva de efectores positivos da função de CREB e/ou regulação negativa de efectores da função de CREB. Os efectores positivos da função de CREB incluem ciclases de adenilato e activadores CREB. Os efectores negativos da função de CREB incluem fosfodiesterase de cDMAP (cAMP PDE) e repressores de CREB.
Um estimulador cognitivo pode aumentar, estimular ou melhorar a função da via CREB através da actuação bioquímica a montante ou actuando directamente numa forma de activador ou de repressor de uma proteína CREB e/ou num complexo de transcrição contendo uma proteína CREB. Por exemplo, a função da via CREB pode ser afectada através do aumento dos níveis de proteína CREB a nível da transcrição, pós-transcrição ou ambos; através da alteração da afinidade da proteína CREB para outros componentes necessários do complexo de transcrição, tais como, por exemplo, para a proteína de ligação a CREB (proteína CBP); através da alteração da afinidade de um complexo de transcrição contendo a proteína CREB para elementos de DNA que respondem a CREB na região do promotor; ou através da indução de imunidade passiva ou activa contras as isoformas da proteína CREB. 0 mecanismo particular pelo qual um ΡΕ1540335 - 24 - estimulador cognitivo aumenta, estimula ou melhora a função da via CREB não é critico para a realização do invento.
Através do "aumento da função da via CREB" ou "estimulação da função da via CREB" pretende-se significar a capacidade para aumentar, estimular ou melhorar a expressão de genes dependente de CREB. Através da "modulação da função da via CREB" pretende-se significar a capacidade para modular a expressão de genes dependente de CREB. A expressão de genes dependente de CREB pode ser aumentada, estimulada ou melhorada através do aumento da produção endógena de CREB, por exemplo através da estimulação directa ou indirecta do gene endógeno para produzir quantidades crescentes de CREB ou através do aumento de CREB funcional (biologicamente activo). Ver, e. g., Patente US N° 5929223; Patente US N° 6051559; e a Publicação Internacional N° WO96/11270 (publicado em 18 de Abril, 1996). Por "aumento de CREB funcional (biologicamente activo)" pretende-se incluir a capacidade para aumentar a capacidade de ligação a DNA, estado de fosfo-rilação, estabilidade proteica, localização subcelular, etc. A expressão de genes dependente de CREB pode ser modulada através do aumento ou diminuição da produção endógena de CREB, por exemplo através da estimulação directa ou indirecta do gene endógeno para produzir quantidades crescentes ou inferiores de CREB ou através do aumento ou diminuição de CREB funcional (biologicamente activo). 25 ΡΕ1540335
Como aqui descrito, os métodos de identificação ou triagem de estimuladores cognitivos compreendem uma triagem primária, uma triagem secundária e uma triagem terciária. De preferência, a triagem primária é um método baseado em células para identificar compostos candidatos; a triagem secundária é um método baseado em células usado para identificar compostos candidatos confirmados; e a triagem terciária usa um modelo de comportamento para identificar estimuladores cognitivos. As triagens primária e secundária incluem métodos baseados em células de elevado número de testes. A triagem primária compreende: (a) contacto das células hospedeiras compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE com um composto a testar e com uma dose sub-óptima de agente estimulador que activa as vias de sinalização de CREB; (b) determinação da actividade indicadora nas células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o composto a testar e com o agente estimulador; (c) comparação da actividade indicadora determinada no passo (b) com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador e que não foram colocados em contacto com o composto a testar (células testemunhas que foram colocadas em contacto o agente estimulador sozinho); (d) selecção do composto a testar se (1) a actividade indicadora determinada no passo (b) for aumentada de forma estatisticamente significativa relativamente à actividade indicadora nas células testemunhasdo passo (c) ; e (2) a 26 ΡΕ1540335 actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas com o agente estimulador e que foram colocadas em contacto com o composto a testar (as células testemunhas colocadas em contacto com o composto a testar sozinho) não for diferente de forma estatisticamente significativa relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador ou com o composto a testar (células testemunhas que não foram colocadas em contacto com qualquer composto); (e) repetição dos passos (a) a (d) com uma gama de diferentes concentrações do composto a testar seleccionado no passo (d); e (f) selecção do composto a testar se: (1) a actividade indicadora for aumentada proporcionalmente de forma estatisticamente significativa na gama de diferentes concentrações do referido composto a testar relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas, as quais foram colocadas em contacto com o agente estimulador sozinho; e (2) a actividade indicadora nas células testemunhas nas quais foi introduzida a gama de diferentes concentrações do referido composto a testar sozinho não for significativamente diferente relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas as quais não foram colocadas em contacto com o agente estimulador ou com o composto a testar, em que o composto a testar é identificado como um composto candidato. Numa realização particular, o composto a testar é seleccionado no passo (f) se (1) a actividade indicadora for aumentada proporcionalmente de forma significativa na gama linear de diferentes concentrações para o composto a testar; e (2) a actividade 27 ΡΕ1540335 indicadora nas células testemunhas nas quais foi introduzida a gama de diferentes concentrações do composto a testar sozinho não for significativamente diferente relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador ou com o composto a testar. Numa outra realização, as células hospedeiras foram colocadas em contacto com o composto a testar antes do contacto com o agente estimulador.
Como alternativa, a triagem primária compreende: (a) contacto das células hospedeiras com um composto a testar e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador que activa as vias de sinalização de CREB; (b) avaliação da expressão endógena de genes dependentes de CREB nas células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o composto a testar e com o agente estimuladora; (c) comparação da expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo (b) com a expressão endógena de genes dependentes de CREB em células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador e que não foram colocadas em contacto com o composto a testar (células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador sozinho); (d) selecção do composto a testar se (1) a expressão endógena de genes dependente de CREB determinada no passo (b) for aumentada de forma estatisticamente significativa relativamente à expressão endógena dependente de CREB nas células testemunhas do passo (c) ; e (2) a expressão de genes dependente de CREB nas células 28 ΡΕ1540335 testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador e que foram colocadas em contacto com o composto a testar (células testemunhas que foram colocadas com o composto a testar sozinho) não for diferente de forma estatisticamente significativa relativamente à expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador ou com o composto a testar (células testemunhas que não foram colocadas em contacto com qualquer composto); (e) repetição dos passos (a) a (d) com uma gama de concentrações diferentes do composto a testar seleccionado no passo (d); e (f) selecção do composto a testar se: (1) a expressão de genes dependente de CREB for aumentada proporcionalmente, de forma estatisticamente significativa, na gama de diferentes concentrações do referido composto relativamente à expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador; e (2) a expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas nas quais foi introduzida a gama de diferentes concentrações do composto a testar sozinho não for significativamente diferente em relação à expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador nem com o composto a testar, em que o composto a testar é identificado como um composto candidato. Numa realização particular, o composto a testar é seleccionado no passo (f) se (1) a expressão de genes dependente de CREB for aumentada proporcionalmente de forma estatisticamente significativa na gama linear de diferentes concentrações do 29 ΡΕ1540335 composto a testar; e (2) a expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas nas quais foi introduzida a gama de diferentes concentrações do composto a testar sozinho não for estatisticamente diferente relativamente à expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador ou com o composto a testar. Noutra realização, as células hospedeiras são colocadas em contacto com o composto a testar antes do contacto com o agente estimulador.
De preferência, o "agente estimulador que activa as vias de sinalização de CREB" usado na triagem primária é um agente estimulador da função de CREB. Um agente estimulador da função de CREB é um agente que é capaz de estimular a função da via CREB. Por "estimular a função da via CREB" pretende-se significar a capacidade de estimular, directa ou indirectamente, genes endógenos para produzirem quantidades crescentes de CREB ou através do aumento de CREB funcional (biologicamente activo). Ver, e.g., Patente US N° 5929223; Patente US N° 6051559; e Publicação Internacional N° WO96/11270 (publicado em 18 de Abril, 1996). "Os agentes estimuladores das funções CREB" incluem fármacos, compostos químicos, compostos iónicos, compostos orgânicos, ligandos orgânicos, incluindo cofactores, sacáridos, péptidos recombinantes e sintéticos, proteínas, peptóides, sequências de ácidos nucleicos, incluindo genes, produtos de ácidos nucleicos e outras moléculas e composições. Os agentes estimuladores da função de CREB 30 ΡΕ1540335 podem ser activadores de adenilato-ciclase 1 (AC1) (e.g., forscolina); análogos de cAMP que entrem na célula {e.g., 8-bromo cAMP); agentes (neurotransmissores) que afectem o receptor ligado a proteína G, como seja, mas não estando limitado a receptores adrenérgicos e receptores opióides e seus ligandos (e.g., isoproterenol, fenetilaminas); moduladores da concentração de cálcio intracelular (e.g., cloreto de potássio, tapsigargina, agonistas do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA); inibidores (antagonistas) das fosfodiesterases responsáveis pela degradação de cAMP (e.g., rolipram (que inibe a fosfodiesterase-4) , iso-buto-meto-xantina (IBMX) (que inibe as fosfodiesterases 1 e 2)); moduladores (agonistas) das cinases de proteínas e fosfatases de proteínas, que medeiam a activação da proteína CREB e a expressão de genes dependente de CREB. Os agentes estimuladores da função de CREB podem também ser compostos capazes de aumentar a função de CREB no sistema nervoso central (CNS). Tais compostos incluem mas não estão limitados a compostos que afectam a estabilidade e a fluidez de membranas e a imuno-estimulação específica.
As vias de sinalização que activam CREB incluem a via de sinalização de cinases de proteínas activadas por mitogénios (MAPK) e a cinase de proteínas A (PKA). Assim, os agentes estimuladores que activam as vias de sinalização de CREB incluem inibidores da cinase MAPK/Erk (MEK). Outros agentes estimuladores que activam as vias de sinalização de CREB são conhecidos e facilmente acessíveis aos familiarizados com a área. 31 ΡΕ1540335
Numa outra realização, a triagem primária pode ser substituída com um método de triagem usando Drosophila, em que o referido método de triagem compreende: (a) administração do composto a testar a Drosophila tendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE: (b) avaliação da actividade indicadora na Drosophila a que foi administrado o composto a testar; e (c) comparação da actividade indicadora avaliada no passo (b) com a actividade indicadora na Drosophila testemunha a que não foi administrado o composto a testar. Uma diferença estatisticamente significativa na actividade indicadora no passo (b) , comparativamente com a actividade indicadora na Drosophila testemunha a que não foi administrado o composto a testar, identifica o composto a testar como composto candidato. Células hospedeiras compreendendo um gene indicador ligado operacionalmente a um promotor CRE podem ser produzidas através da introdução nas células de uma construção compreendendo um gene indicador ligado operacionalmente a um promotor CRE. As construções de DNA podem ser introduzidas de acordo com métodos conhecidos na área (e.g., transformação, internalização directa, precipitação com fosfato de cálcio, electroporação, bombardeamento com projécteis, utilização de lipossomas). Tais métodos estão descritos mais detalhadamente, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (New York; Cold Spring Harbor University Press) (1989); e 32 ΡΕ1540335
Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons) (1998) .
Drosophila compreendendo um gene indicador ligado operacionalmente a um promotor CRE pode ser produzida como descrito por Belvin et al., Neuron, 22(4):777-787 (1999).
Construções de DNA compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CREB podem ser produzidas como descrito em, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons) (1998); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (New York; Cod Spring Harbor University Press (1989).
Como aqui usado, o termo "promotor" refere-se a uma sequência de DNA, geralmente a montante (5') da região codificadora de um gene estrutural, a qual controla a expressão da região codificadora ao proporcionar locais de reconhecimento e ligação para a polimerase de RNA e outros factores que podem ser necessários para a iniciação da transcrição. Os promotores CRE são conhecidos na área. 0 termo "gene indicador", como aqui usado, refere-se a uma sequência de ácido nucleico cujo produto pode ser facilmente testado, por exemplo colorimetricamente como um produto de reacção enzimática, como seja o gene codificador de luciferase. Outros exemplos de genes indicadores largamente usados incluem os que codificam 33 ΡΕ1540335 enzimas, tais como β-galactosidase, β-glucoronidase e β-glucosidase; moléculas luminescentes, tais como proteína fluorescente verde e luciferase de pirilampo; e marcadores auxotróficos tais como His3p e Ura3p. Ver, e.g., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons, Inc.), Capítulo 9 (1998)).
As células (e.g., células hospedeiras, células de origem neuronal, etc.) colocadas em contacto com um composto a testar e/ou um agente estimulador da função de CREB internalizarão o composto a testar e/ou o agente estimulador da função de CREB.
Por "dose sub-óptima de agente estimulador da função de CREB pretende-se significar a quantidade ou dose de agente estimulador da função de CREB necessária para estimular (induzir) a função da via CREB até um nível que está acima dos níveis endógenos (basais), de forma que mais um aumento estatisticamente significativo na função da via CREB devido à indução por um estimulador cognitivo pode ser medido e a medição nao é atribuível a flutuações ou variações celulares naturais como uma consequência de flutuações celulares naturais. Uma dose sub-óptima do agente estimulador da função de CREB é a dose ou concentração em que a quantidade do efeito (actividade indicadora, expressão de genes dependente de CREB) é proporcional à dose ou à concentração e a quantidade do efeito não se altera quando a dose ou a concentração se altera. A dose sub-óptima do agente estimulador da função 34 ΡΕ1540335 de CREB é determinada empiricamente e variará de acordo com uma variedade de factores, incluindo as caracteristicas farmacodinâmicas do agente estimulador da função de CREB particular e das células particulares usadas. Por exemplo, a dose sub-óptima do agente estimulador da função de CREB pode ser determinada por (a) contacto de diferentes amostras de uma célula hospedeira, compreendendo um gene indicador ligado operacionalmente a um promotor CRE, com uma concentração diferente do agente estimulador da função de CREB; e (b) determinação da gama de concentrações do agente estimulador da função de CREB necessária para afectar até à resposta máxima a actividade indicadora relativamente à linha de base, através da avaliação da actividade indicadora nas amostras da célula hospedeira. A dose sub-óptima do agente estimulador da função de CREB será qualquer concentração que dê origem a (1) 50% ou menos da actividade indicadora e (2) uma actividade indicadora acima das flutuações celulares naturais. A determinação da dose sub-óptima do agente estimulador da função de CREB está dentro da capacidade dos familiarizados com a matéria. Por "dose sub-óptima de agente estimulador que activa as vias de sinalização de CREB" pretende-se significar a quantidade ou dose do agente estimulador que é necessária para estimular (induzir) uma via de sinalização de CREB.
Por "gama de diferentes concentrações do composto a testar" pretende-se significar 2 ou mais (i.e., 2, 3, 4, 5, etc.) concentrações diferentes do composto a testar. A gama de concentrações seleccionadas geralmente delimita a 35 ΡΕ1540335 concentração do composto a testar no passo (a) da triagem primária. Por "gama linear de (diferentes) concentrações" pretende-se significar as concentrações em que o efeito (actividade indicadora, expressão de genes dependente de CREB) aumenta com a concentração mas até antes do efeito deixar de variar com as alterações da concentração. A selecção de gamas de concentração está dentro da capacidade dos familiarizados com a matéria.
Por "CREB funcional (biologicamente activo)" pretende-se incluir a capacidade de ligação a DNA da proteína, estado de fosforilação, estabilidade proteica, localização subcelular, etc. "Expressão de genes dependente de CREB" é igualmente aqui referida como "expressão de genes mediada por CRE". A expressão de genes dependente de CREB pode ser determinada por métodos conhecidos na área (e.g., transferências Northern, transferências Western). Tais métodos estão descritos mais detalhadamente, por exemplo, em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons) (1998); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (New York; Cold Spring Harbor University Press) (1989). "Genes endógenos mediados por CRE" são igualmente aqui referidos como "genes endógenos dependentes de CREB". Tais genes são conhecidos na área e incluem, por exemplo, c-fos, prodinorfina, tPA e factor neurotrófico derivado do 36 ΡΕ1540335 cérebro (BDNF) (Barco, A. et al., Cell, 108 (5):689-703 (2002)). Os genes mediados por CRE podem ser igualmente identificados pelos familiarizados com a área usando métodos conhecidos e facilmente disponíveis (ver, e.g., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons) (1998); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (New York; Cold Spring Harbor University Press) (1989)). A triagem secundária compreende: (a) contacto das células de origem neuronal com um composto candidato identificado na triagem primária e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador que activa as vias de sinalização de CREB; (b) avaliação da expressão endógena de genes dependente de CREB nas células que foram colocadas em contacto com o composto candidato e com o agente estimulador; e (c) comparação da expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo (b) com a expressão endógena de genes dependente de CREB em células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador e que não foram colocadas em contacto com o composto candidato (células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador sozinho). Uma diferença estatisticamente significativa na expressão de genes dependente de CREB avaliada no passo (b) comparativamente com a expressão de genes dependente de CREB foi obtida na expressão dependente de CREB em células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador e que foram colocadas em contacto com o 37 ΡΕ1540335 composto candidato (células testemunhas que foram colocadas em contacto com o composto candidato sozinho) relativamente à expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas que não foram colocadas em contacto nem com o agente estimulador nem com o composto candidato (células testemunhas que não colocadas em contacto com qualquer composto). Numa realização particular, as células foram colocadas em contacto com o composto candidato antes do contacto com o agente estimulador.
Como alternativa, a triagem secundária compreende: (a) contacto das células de origem neuronal compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE com um composto candidato identificado na triagem primária e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador que activa as vias de sinalização de CREB; (b) determinação da actividade indicadora nas células que foram colocadas em contacto com o composto candidato e com o agente estimulador; e (c) comparação da actividade indicadora avaliada no passo (b) com a actividade indicadora nas células testemunhass que foram colocadas em contacto com agente estimulador e que não foram colocadas em contacto com o composto a testar (células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador sozinho). Uma diferença estatisticamente significativa na actividade indicadora determinada no passo (b) comparativamente com a actividade indicadora nas células testemunhas identifica o composto candidato como um composto candidato confirmado. De preferência, não se obtém 38 ΡΕ1540335 diferença significativa na actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador e que foram colocadas em contacto com o composto candidato (células testemunhas que foram colocadas em contacto com o composto candidato sozinho) relativamente à actividade indicadora em células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador ou com o composto candidato (células testemunhas que não foram colocadas em contacto com qualquer composto). Numa realização particular, as células foram colocadas em contacto com o composto candidato antes do contacto com o agente estimulador.
De preferência, o "agente estimulador que activa as vias de sinalização de CREB" usadas na triagem primária é um agente estimulador da função de CREB.
Numa outra realização, a triagem secundária pode ser substituída por um método de triagem usando Drosophila, em que o referido método de triagem compreende: (a) administração de um composto candidato identificado na triagem primária de Drosophila com um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE; (b) avaliação da actividade indicadora na Drosophila a que foi administrado o composto candidato; e (c) comparação de uma actividade indicadora avaliada no passo (b) com a actividade indicadora na Drosophila testemunha a que não foi administrado o composto candidato. Uma diferença estatisticamente significativa na actividade indicadora no passo 39 ΡΕ1540335 (b) comparativamente com a actividade indicadora em Drosophila testemunha, a que não foi administrado o composto candidato, identifica o composto candidato como composto candidato confirmado.
Numa realização particular, as células usadas na triagem secundária são diferentes das células hospedeiras usadas na triagem primária. Numa outra realização, o gene endógeno mediado por CRE ou o transgene mediado por CRE na triagem secundária é diferente do transgene mediado por CRE ou do gene endógeno mediado por CRE na triagem primária. Por exemplo, numa realização, as células hospedeiras na triagem primária são de neuroblastoma e as células para a triagem secundária não são de neuroblastoma. Numa outra realização, o transgene mediado por CRE na triagem primária é luciferase (CRE ligado operacionalmente ao gene da luciferase) e o transgene mediado por CRE na triagem secundária não é luciferase.
De preferência, as células hospedeiras na triagem primária (tais como neuroblastoma) são células em divisão e as células na triagem secundária são células diferenciadas de origem neuronal que não estão em proliferação (tais como neurónios (e.g., células primárias do hipocampo e células da glia). Numa realização particular, o gene mediado por CRE na triagem primária é um gene indicador mediado por CRE (um transgene mediado por CRE) e o gene mediado por CRE na triagem secundária é um gene endógeno mediado por CRE. 40 ΡΕ1540335
Como aqui usado, uma célula refere-se a uma célula animal. A célula pode ser uma célula estaminal ou uma célula somática. Células animais adequadas podem ter, por exemplo, origem em mamíferos. Exemplos de células de mamífero incluem células humanas (tais como células HeLa), bovinas, ovinas, porcinas, de roedores (tais como rato, murganho (tais como células estaminais embrionárias), coelho, etc.) e macaco (tais como células COSI). De preferência, a célula tem origem neuronal (como seja neuroblastoma, neurónio, células estaminais neuronais, célula da glia, etc.). A célula pode também ser uma célula embrionária, célula estaminal da medula óssea ou outra célula progenitora. Quando a célula é uma célula somática, a célula pode ser, por exemplo, uma célula epitelial, fibroblasto, célula de músculo liso, célula do sangue (incluindo uma célula hematopoiética, eritrócito, célula T, células B, etc.), célula tumoral, célula de músculo cardíaco, macrófago, célula dendrítica, célula neuronal (e.g., uma célula da glia ou astrócito) ou célula infectada com um agente patogénico (e.g., as infectas por bactérias, vírus, virusóides, parasitas ou priões). As células podem ser adquiridas comercialmente ou num depositário ou obtidas directamente de um animal, como seja por biopsia.
Numa realização, a triagem terciária é um método comportamental para avaliação da formação de memória a longo prazo num animal compreendendo: (a) administração ao animal (e.g., ser humano, outro mamífero, vertebrado ou invertebrado) de uma quantidade eficaz de um composto 41 ΡΕ1540335 candidato confirmado identificado na triagem secundária; (b) treino do animal a que foi administrado o composto candidato confirmado em condições adequadas para produzir a formação de memória a longo prazo no animal; (c) avaliação da formação de memória a longo prazo no animal treinado no passo (b) ; e (d) comparação da formação de memória a longo prazo avaliada no passo (c) com a formação de memória a longo prazo no animal controlo ao qual foi administrado o composto candidato confirmado. Se se registar um aumento na formação de memória a longo prazo avaliada no animal tratado com o composto candidato confirmado relativamente à formação de memória a longo prazo avaliada no animal controlo, o composto candidato confirmado é identificado como um estimulador cognitivo. Existem triagens terciárias com protocolos semelhantes usando métodos comportamentais (modelos) para outros distúrbios cognitivos.
Numa realização particular, o método para identificação ou triagem de estimuladores cognitivos compreende: (a) contacto das células hospedeiras compreendendo o gene repórter da luciferase operacionalmente ligado a um promotor CRE com um composto a testar, produzindo assim a amostra a testar; (b) contacto da amostra a testar produzida no passo (a) com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB (e.g., forscolina, cloreto de potássio); (c) determinação da actividade de CRE-luciferase nas células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o composto a testar e com o agente estimulador da função de CREB; (d) comparação da actividade CRE-luciferase 42 ΡΕ1540335 determinada no passo (c) com a actividade de CRE-luciferase nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com um agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o composto a testar (células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB sozinho); (e) selecção do composto a testar se tiver pouco ou nenhum efeito e se aumentar mais os níveis de CRE-luciferase (actividade) nas células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB, seleccionando assim um composto "Hit Activo"; (f) repetição dos passos (a) a (e) usando uma gama de diferentes concentrações do composto "Hit Activo" seleccionado no passo (e) ; e (g) selecção do composto "Hit Activo" se tiver pouco ou nenhum efeito e se ainda alterar proporcionalmente os níveis de CRE-luciferase (actividade) nas células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB, numa gama linear de concentrações do composto "Hit Activo", seleccionando assim um composto "Activo Confirmado". As células hospedeiras compreendendo o gene repórter da luciferase ligado operacionalmente a um promotor CRE (gene repórter luciferase dirigido por CRE) podem ser geradas através da transfecção das células com um gene repórter da luciferase dirigido por CRE. Tais células são também referidas aqui como células CRE-luci. Numa realização particular, as células hospedeiras são células de neuroblastoma humano. As células de neuroblastoma humano transfectadas com o gene repórter luciferase dirigido por CRE são igualmente referidas como células de neuroblastoma 43 ΡΕ1540335 CRE-luci. Um composto "Hit Activo" confirmado é também aqui referido como um composto candidato.
Um composto activo confirmado (ou um composto candidato) pode ser testado ou avaliado pelo seu efeito na expressão endógena de genes mediados por CRE (expressão de genes endógeno dependente de CREB) através de (a) contacto dos neurónios (particularmente as células do hipocampo) com o composto Activo Confirmado (ou o composto candidato), produzindo assim uma amostra; (b) contacto da amostra com uma dose sub-óptima do agente estimulador da função de CREB; (c) avaliação da expressão endógena de genes dependente de CREB nos neurónios que foram colocados em contacto com o composto Activo Confirmado (ou composto candidato) e o agente estimulador da função de CREB; e (d) comparação da expressão endógena de genes dependente de CREB avaliada no passo (c) com a expressão endógena de genes dependentes de CREB nos neurónios testemunha que foram colocados em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que não foram colocados em contacto com o composto Activo Confirmado (ou composto candidato). Uma diferença estatisticamente significativa na expressão de genes dependente de CREB avaliada no passo (c) comparativamente com a expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas identifica o composto Activo Confirmado (ou composto candidato) como tendo um efeito na expressão de genes dependente de CREB e como um composto candidato confirmado. De preferência, não é obtida diferença significativa na expressão dependente de CREB nas 44 ΡΕ1540335 células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que tinham sido colocados em contacto com o composto Activo Confirmado (ou composto candidato) (células testemunhas que tinham sido colocadas em contacto com o composto Activo Confirmado (ou composto candidato sozinho) relativamente à expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas que não tinham sido colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou com o composto Activo Confirmado (composto candidato) (células testemunhas que não foram colocadas em contacto com qualquer composto). 0 composto candidato confirmado pode ser testado ou avaliado num modelo animal (comportamental) da formação de memória a longo prazo dependente de CREB para identificar estimuladores cognitivos. Tais métodos para testar ou avaliar um composto candidato confirmado para identificar estimuladores cognitivos compreendem (a) administração de uma quantidade eficaz de um composto candidato confirmado a um animal; (b) treino do animal a que foi administrado o composto candidato confirmado nas condições adequadas para produzir formação de memória a longo prazo no animal; (c) avaliação da formação de memória a longo prazo no animal treinado no passo (b) ; e (d) comparação da formação de memória a longo prazo avaliada no passo (c) com a formação de memória a longo prazo produzida no animal controlo ao qual não foi administrado o composto candidato confirmado. Caso seja observado um aumento estatisticamente significativo na formação de memória a 45 ΡΕ1540335 longo prazo avaliada no animal tratado com o composto candidato confirmado relativamente à formação de memória a longo prazo avaliada no animal controlo, o composto candidato confirmado pode ser categorizado como estimulador da formação de memória a longo prazo (melhoria, aumento) no animal e é identificado como um estimulador cognitivo.
Como aqui descrito, os compostos candidatos confirmados e os estimuladores cognitivos de várias classes quimicas avançam para modelos vivos de formação de memória.
Pensa-se que os compostos activos não estimulem a função da via CREB por si sós mas antes após co-estimulação com um agente estimulador da função de CREB. Este requisito foi introduzido para simular resultados das experiências de voo originais: (1) a sinalização de cAMP está envolvida na formação de memória de voo e (2) é necessário treino para estimular a formação de memória quando o activador CREB é expresso em excesso.
Os compostos a serem avaliados ou testados relativamente à sua capacidade para aumentar a função da via CREB, como sejam agentes farmacêuticos, fármacos, compostos químicos, compostos iónicos, compostos orgânicos, ligando orgânicos, incluindo cofactores, sacáridos, péptidos sintéticos e recombinantes, proteínas, peptóides, sequências de ácidos nucleicos, incluindo genes, produtos de ácidos nucleicos e outras moléculas e composições, podem ser individualmente testados ou um ou mais compostos pode 46 ΡΕ1540335 ser testado simultaneamente relativamente à capacidade para aumentar a função da via CREB de acordo com os métodos aqui descritos. Sempre que uma mistura de compostos é testada, os compostos seleccionados pelos métodos descrito podem ser separados (conforme adequado) e identificados por métodos adequados (e.g., cromatografia, sequenciação, PCR) . A presença de um ou mais compostos numa amostra a testar tendo a capacidade para aumentar a função da via CREB pode também ser determinada de acordo com estes métodos. Os compostos a serem testados relativamente à sua capacidade para aumentar a função da via CREB estão, de um modo geral, numa concentração entre cerca de 1CT9 molar e cerca de 10~3 molar.
Grandes bibliotecas combinatórias de compostos (e.g., compostos orgânicos, péptidos recombinantes ou sintéticos, peptóides, ácidos nucleicos) produzidos por síntese química combinatória ou outros métodos podem ser testados (ver e.g., Zuckerman, R.N. et al., J. Med. Chem., 37:2678-2685 (1994) e referências aqui citadas; ver também, Ohlmeyer, M.H.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:10922-10926 (1993) e DeWitt, S.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6909-6913 (1993) relacionados com compostos marcados; Rutter, W.J. et al. Patente U.S. N° 5010175; Huebner, V.D. et al., Patente U.S. N° 5182366; e Geysen, H.M., Patente U.S. N° 4833092). Quando os compostos seleccionados de uma biblioteca combinatória são portadores de marcas únicas, é possível a identificação de compostos individuais por métodos cromatográficos. 47 ΡΕ1540335
Bibliotecas químicas, caldos de cultura microbianos e bibliotecas de apresentação fágica podem ser igualmente testados (triados) relativamente à presença de um ou mais compostos capazes de estimular a função da via CREB de acordo com os métodos aqui apresentados. 0 invento também está relacionado com métodos para avaliação do efeito de um composto candidato na expressão de genes dependente de CREB (expressão de genes mediada por CRE) compreendendo: (a) contacto das células de origem neuronal com o composto candidato e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB; (b) avaliação da expressão endógena de genes dependente de CREB nas células que foram colocadas em contacto com o composto candidato e com o agente estimulador da função de CREB; e (c) comparação da expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo (b) com a expressão endógena de genes dependentes de CREB em células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agentes estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto o composto candidato. Uma diferença estatisticamente significativa na expressão de genes dependente de CREB avaliada no passo (b) comparativamente com a expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas identifica o composto candidato como um que possui efeito na expressão de genes dependente de CREB. De preferência, não foi obtida diferença significativa na expressão dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas com o agente 48 ΡΕ1540335 estimulador da função de CREB e que foram colocados em contacto com o composto candidato relativamente à expressão de genes dependente de CREB em células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou o composto candidato (células testemunhas que não foram colocadas em contacto com qualquer composto). Numa realização particular, as células foram colocadas em contacto com o composto a testar antes do contacto com o agente estimulador da função de CREB.
Como alternativa, os métodos de avaliação do efeito de um composto candidato na expressão de genes dependente de CREB compreende: (a) contacto das células de origem neuronal, possuindo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE, com o composto candidato e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB; (b) determinação da actividade indicadora nas células que foram colocadas em contacto com o composto candidato e com o agente estimulador da função de CREB; e (c) comparação da actividade indicadora determinada no passo (b) com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o composto candidato. Uma diferença estatisticamente significativa na actividade indicadora determinada no passo (b) comparativamente com a actividade indicadora em células testemunhas identifica o composto candidato como um que tem efeito na expressão de genes dependente de CREB. De preferência, não foi obtida dife- 49 ΡΕ1540335 rença significativa na actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB e que tenham sido colocadas em contacto com o composto candidato relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o agente estimulador da função de CREB ou com o composto candidato (células testemunhas que não foram colocadas em contacto com qualquer composto). Numa realização particular, as células são colocadas em contacto com o composto a testar antes do contacto com o agente estimulador da função de CREB.
Tal como na triagem secundária, numa realização particular, as células usadas nos métodos para avaliação do efeito de um composto candidato na expressão de genes dependente de CREB são diferentes das células hospedeiras na triagem primária. Numa outra realização, o gene endógeno mediado por CREB ou o transgene mediado por CREB usado nos métodos de avaliação do efeito de um composto candidato na expressão de genes dependente de CREB é diferente dos usados para o transgene mediado por CRE ou do gene endógeno mediado por CRE na triagem primária. Numa outra realização, as células usadas nos métodos para avaliação do efeito de um composto candidato na expressão de genes dependente de CREB são células diferenciadas, quiescentes, de origem neuronal, células diferenciadas de origem neuronal (como sejam neurónios (e.g., células primárias do hipocampo) e células da glia). Numa realização particular, o gene mediado por CRE nos métodos de avaliação do efeito de um 50 ΡΕ1540335 composto candidato na expressão de genes dependente de CREB é um gene endógeno mediado por CRE. A estimulação da formação de memória a longo prazo pode ser definida como (a) um aumento nos níveis de desempenho comportamental; (b) um decréscimo no número de ensaios de treino necessários para produzir um nível de desempenho comportamental. Assim, o invento também está relacionado com métodos para avaliação do efeito de um estimulador cognitivo na formação de memória a longo prazo num animal compreendendo: (a) administração de uma quantidade eficaz de estimulador cognitivo a um animal; (b) treino do animal a que foi administrado o estimulador cognitivo em condições adequadas para produzir formação de memória a longo prazo no referido animal; (c) avaliação da formação de memória a longo prazo no animal treinado no passo (b) ; e (d) comparação da formação de memória a longo prazo avaliada no passo (c) com a formação de memória a longo prazo produzida no animal controlo a que não foi administrado o estimulador cognitivo. Se se observar um aumento na formação de memória a longo prazo avaliada no animal tratado com o estimulador cognitivo relativamente à formação de memória a longo prazo avaliada no animal testemunha, o estimulador cognitivo pode ser classificado com estimulador da formação de memória a longo prazo no animal. Espera-se que os estimuladores cognitivos identificados como estimuladores da formação de memória a longo prazo no animal sejam candidatos eficazes para usar na reabilitação de um animal com disfunções cognitivas e para 51 ΡΕ1540335 usar na estimulação de memória ou do desempenho cognitivo normal (capacidade ou função) num animal normal. Compre-ende-se que, em determinadas circunstâncias, um estimulador cognitivo identificado de acordo com o presente invento pode ser um agente estimulador da função de CREB. Assim, um agente estimulador da função de CREB pode ser identificado como um estimulador cognitivo de acordo com o presente invento.
As frases "desempenho comportamental" e "desempenho cognitivo" são frases reconhecidas na área e são usadas de acordo com o seu significado normalmente aceite na área.
Como aqui usado, o termo "animal" inclui mamíferos, assim como outros animais, vertebrados e invertebrados (e.g., aves, peixes, répteis, insectos (e.g., espécies de Drosophila), moluscos (e.g., Aplysia). Os termos "mamífero" e "de mamífero", como aqui usado, refere-se a qualquer animal vertebrado, incluídos monotremados, marsupiais e placentários, que aleitam as suas crias e dão à luz jovens nados vivos (mamíferos eutérios ou placentários) ou põem ovos (metatérios ou mamíferos não placentários). Exemplos de espécies de mamíferos incluem humanos e primatas (e.g., macacos, chimpanzés) roedores (e.g., ratos, murganhos, cobaios) e ruminantes (e.g., vacas, porcos e cavalos). 0 animal pode ser um animal com alguma forma e 52 ΡΕ1540335 grau de distúrbio cognitivo ou um animal com desempenho cognitivo normal (i.e., um animal sem qualquer forma de falência cognitiva (distúrbio ou perda de qualquer função cognitiva)) .
Uma quantidade eficaz de estimulador cognitivo ou composto candidato confirmado é a quantidade, ou dose, administrada a um animal que é necessária para efectuar uma alteração (aumento ou decréscimo) na expressão de genes dependente de CREB, particularmente nas células de origem neuronal. A dosagem administrada a um animal, incluindo a frequência de administração, variará dependendo de uma variedade de factores, incluindo caracteristicas farmaco-dinâmicas e farmacocinéticas do estimulador cognitivo particular ou composto candidato confirmado, modo e via de administração; tamanho, idade, sexo, saúde, peso do corpo e dieta do recipiente; natureza e grau dos sintomas a serem tratados ou natureza e grau dos distúrbios cognitivos a serem estimulados ou modificados, tipo de tratamento em simultâneo, frequência de tratamento e o efeito pretendido. 0 treino de animais para a formação de memória a longo prazo é conduzido com métodos conhecidos de um modo geral na área (e.g., Josselyn et al., Siciety for Neurosci., 24:926, Resumo 365. 10 (1998); Casella e Davis, Physiol. Behav., 36:377-383 (1986); Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:2693-2698 (1997); Lamprech et al., J. Neuroscience, 17 (21):6443-6450 (1997); Bourthuladze et al., Cell, 79:59-68 (1994); Kogan et al. , Curr. Biol., 7 :1-11 (1996) ; 53 ΡΕ1540335
Tully ans Quinn, J. Comp. Physiol. A Sens. Neural. Behav. Physiol., 157:263-277 (1985); Tully et ai. , Cell 79:35-47 (1994)) . 0 treino pode compreender uma ou mais sessões de treino. Por "múltiplas sessões de treino" pretende-se significar duas ou mais sessões de treino. O invento ainda está relacionado com métodos para avaliação do efeito de um estimulador cognitivo sobre a formação de memória olfactiva em Drosophila compreendendo: (a) administração de uma quantidade eficaz de estimulador cognitivo a Drosophila; (b) exposição de Drosophila a condicionamento clássico e a pelo menos um odor e choque eléctrico; e (c) avaliação do índice de desempenho do condicionamento clássico, em que o efeito do estimulador cognitivo ocorre quando o composto altera o índice de desempenho relativamente ao índice de desempenho obtido pela Drosophila do passo (a) na ausência do estimulador cognitivo. O invento também está relacionado com cada uma das triagens primária, secundária e terciária compreendendo os métodos de identificação ou triagem de estimuladores cognitivos aqui descritos. 0 invento antecipa um novo tipo de estimulador de cognitivo que aumenta a função da via CREB e aumenta os efeitos terapêuticos do treino cognitivo. Tais estimuladores cognitivos podem ser usados como uma terapia geral para várias formas de disfunção cognitiva que surgem 54 ΡΕ1540335 da hereditariedade, doença, lesões, danos e idade através da estimulação do processo molecular, contribuindo para a plasticidade do cérebro e para estimular a memória ou desempenho cognitivo normal (capacidade ou função).
Os estimuladores cognitivos identificados de acordo com os métodos do invento são compostos com actividade farmacológica e incluem fármacos, compostos químicos, compostos iónicos, compostos orgânicos, ligandos orgânicos, incluindo cofactores, sacáridos, péptidos recom-binantes e sintéticos, proteínas, peptóides, sequências de ácido nucleico, incluindo genes, produtos de ácidos nucleicos e outras moléculas e composições.
Por "modular" pretende-se incluir a capacidade para induzir, estimular, potenciar, reduzir, bloquear, inibir (total ou parcialmente) e regular uma acção ou efeito bioquímico ou fisiológico. Por "regular", como o termo é aqui usado pretende-se significar a capacidade para controlar a velocidade e o grau a que um processo ocorre. Por "estimular" ou "estimulação" pretende-se significar a capacidade para estimular, aumentar, melhorar ou tornar maior ou melhor, relativamente ao normal, uma acção ou efeito biomédico ou fisiológico.
0 distúrbio cognitivo, normalmente associado ao distúrbio cerebral e a distúrbios ou condições do sistema nervoso central (SNC), surge devido a hereditariedade, doença, lesões e/ou idade. Os distúrbios e condições do SNC 55 ΡΕ1540335 associadas a alguma forma e grau de falência cognitiva (distúrbio) incluem, mas não estão limitados ao seguinte: 1) perda de memória associada à idade ou dependente da idade; 2) atraso mental devido a um defeito hereditário, como seja, mas não estando limitado ao associado (ou devido) a anormalidades cromossómicas, incluindo sindrome de Rubinstein-Taybi, sindrome de Down, sindrome do X frágil, sindrome "crie du chat", sindrome de Klinefelter, sindrome de Turner, mosaicismo, sindrome de Patau (trissomia 13) e sindrome de Edward (trissomia 18); anormalidades metabólicas genéticas, incluindo sindrome de Coffin-Lowry, distúrbios autossómicos recessivos, tais como aminoacidúrias e acidemias, distúrbios de pesoxissomas, tais como galactosemia, doença da urina xarope de ácer e fenilcetonúria, defeitos lisossomais, tais como doença de Gaucher, sindrome de Hurler (mucopolissacáridose), doença de Niemann-Pick e doença de Tay-Sachs, e distúrbios recessivos ligados a X, como seja sindrome de Lesch-Nyham (hiperuricemia), sindrome de Hunter (uma variante de mucopolissacáridose) e sindrome oculocerebrorenal; anormalidade neurológicas genéticas, incluindo distúrbios autossómicos dominantes, tais como distrofia miotónica, neurofibromatose e esclerose tuberosa e distúrbios autossómicos recessivos, tais como microcefalia; 3) perda da função cognitiva dependente de trauma, como seja, mas não estando limitado à associada (devida) a doenças cerebro-vasculares, incluindo choque e isquemia; trauma cerebral, 56 ΡΕ1540335 incluindo hematoma subdural e tumor cerebral; lesão da cabeça; 4) distúrbios neurodegenerativos, tais como delírio (estado de confusão aguda); demência, incluindo doença de Alzheymer e demências do tipo não Alzheymer, tais como, mas não estando limitado a demência do corpo Lewy, demência vascular, demência Binswanger (encefalopatia arterios-clerótica subcortical) , demência associada a doença de Parkinson, palsia supranuclear progressiva, doença de Huntington (coreia), doença de Pick, hidrocefalia de pressão normal, doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Gerstmann-Staussler-Scheinker, neuro-sífilis (parese geral) ou infecção por HIV, síndromes de demência do lóbulo frontal, demência associada a trauma da cabeça, incluindo demência do pugilista, trauma cerebral, hematoma subdural, tumor cerebral, hipotiroidismo, deficiência em vitamina B12, radiação intracraniana; outras doenças e perturbações neurodegenerativas; 5) distúrbios psiquiátricos, incluindo distúrbios afectivos (distúrbios humorais), tais como, mas não estando limitado a depressão, incluindo pseudodemência depressiva; distúrbios psicóticos, tais como, mas não estando limitado a esquizofrenia e autismo (síndrome de Kanner); distúrbios neuróticos, tais como, mas não estando limitado a ansiedade e distúrbio obsessivo-compulsivo; distúrbio de déficit de atenção; e 6) dificuldades de aprendizagem, linguagem ou leitura, particularmente em crianças. Por "dificuldades de aprendizagem" pretende-se significar distúrbios de processos psicológicos básicos que afectam a forma como um indivíduo aprende. As dificuldades de aprendizagem podem causar dificuldades de audição, 57 ΡΕ1540335 pensamento, fala, leitura, escrita, soletração, aritmética ou combinações de qualquer um dos anteriores. As dificuldades de aprendizagem incluem desvantagem perceptual, dislexia e afasia do desenvolvimento.
Os estimuladores cognitivos e compostos candidatos confirmados podem ser administrados directamente a um animal numa variedade de formas. Numa realização preferida, os estimuladores cognitivos e compostos candidatos confirmados são administrados sistemicamente. Outras vias de administração são, de um modo geral, conhecidas na área e incluem as vias de infusão intravenosa e/ou injecção de bolus, intracerebroventricular, intratecal, parentérica, nas mucosas, implantes, intraperitoneal, oral, intradér-mica, transdérmica (e.g., em polímeros de libertação controlada), intramuscular, subcutânea, tópica, epidural, etc. Outras vias de administração adequadas também podem ser usadas, por exemplo, para conseguir absorção através da barreira epitelial ou mucocutânea. Estimuladores cognitivos particulares e compostos candidatos confirmados podem ser igualmente administrados por terapia génica, em que uma molécula de DNA codificadora de uma proteína ou péptido terapêutico particular é administrada ao animal, e.g., através de um vector, o qual faz com que a proteína ou o péptido particular seja expresso e secretado em níveis terapêuticos in vivo.
Um vector, como o termo é aqui usado, refere-se a um vector de ácido nucleico, e.g., um plasmídeo de DNA, 58 ΡΕ1540335 vírus ou outro replicão adequado (e.g., vector virai). Os vectores virais incluem retrovírus, adenovírus, parvovírus (e.g., vírus adeno-associados), coronavírus, vírus de RNA de cadeia negativa tais como ortomixovirus (e.g., vírus da gripe), rabdovírus (e.g., vírus da raiva e da estomatite vesicular), paramixovírus (e.g., sarampo e Sendai), vírus de RNA de cadeia positiva tais como picornavírus e alfavírus e vírus de DNA de cadeia dupla incluindo adenovírus, herpesvírus (e.g., vírus herpes simples tipos 1 e 2, vírus Epstein-Barr, citomegalovírus) e poxvírus (e.g., vacinia, poxvírus das galinhas e poxvírus dos canários). Outros vírus incluem vírus de Norwalk, togavírus, flavi-vírus, reovírus, papovavírus, hepadnavírus e vírus da hepatite, por exemplo. Os exemplos de retrovírus incluem: sarcoma da leucose aviaria, vírus tipo C e tipo B de mamíferos, vírus tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivírus, espumavírus (Coffin, J.M., Retroviridae: The viruses and their replication, in Fundamental Virology, Third Edition, B.N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Outros exemplos incluem vírus da leucemia murina, vírus do sarcoma murino, vírus do tumor mamário de murganho, vírus da leucemia bovina, vírus da leucemia felina, vírus do sarcoma felino, vírus da leucemia aviária, vírus da leucemia das células T humanas, vírus endógenos dos babuínos, vírus da leucemia do macaco gibão, vírus do macaco Mason Pfizer, vírus da imunodeficiência símia, vírus do sarcoma símio, vírus do sarcoma de Rous e lentivírus. São descritos outros exemplos de vectores, por exemplo, em McVey et al., Patente US N° 5801030. 59 ΡΕ1540335 O modo de administração é, preferencialmente, no local onde estão situadas as células alvo. Numa realização particular, o modo de administração é a células de origem neuronal. As células de origem neuronal incluem células estaminais neuronais, células de neuroblastoma, neurónios e células da glia.
Os estimuladores cognitivos e compostos candidatos confirmados podem ser administrados juntamente com outros componentes de agentes biologicamente activos, tais como tensioactivos farmaceuticamente aceitáveis (e.g., glicéridos), excipientes (e.g., lactose), estabilizadores, preservativos, humidificantes, emolientes, anti-oxidantes, veículos e diluentes. Caso se pretenda, podem também ser adicionados determinados agentes edulcorantes, aromatizan-tes e/ou corantes.
Os estimuladores cognitivos e compostos candidatos confirmados podem ser formulados como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável. São exemplos de tais veículos, água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução isotónica de cloreto de sódio, solução de dextrose e 5% de albumina sérica bovina. Podem ser igualmente usados lipossomas e veículos não aquosos tais como óleos fixados. 0 veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (e.g., cloreto de 60 ΡΕ1540335 sódio, manitol) e a estabilidade química (e.g., tampões e preservativos). A formulação pode ser esterilizada através de técnicas normalmente usadas. Veículos farmacêuticos adequados estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences.
Os estimuladores cognitivos e compostos candidatos confirmados podem ser administrados em doses únicas ou repartidas (e.g., uma série de doses separadas por intervalos de dias, semanas ou meses) ou numa forma de libertação sustentada, dependendo de factores tais como a natureza e grau dos sintomas, tipo de tratamento em simultâneo e do efeito pretendido. Podem ser usados outros regimes ou agentes terapêuticos em conjunção com o presente invento. será agora ilustrado pelo não é considerado de forma invento o qual 0 presente exemplo que se segue, alguma limitante.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
Após o programa de descoberta de fármacos aqui descrito, os compostos protótipos de várias classes químicas passam aos modelos in vivo de formação de memória. 61 ΡΕ1540335
Descoberta de fármacos
Dois princípios básicos guiam o programa de descoberta de fármacos. Primeiro, pensa-se em compostos activos que não estimulam a função de CREB por si sós mas antes após co-estimulação com forscolina, um activador de ciclase de adenililo. Este requisito foi introduzido para simular resultados das experiências originais com
Drosophila: (1) a sinalização de cAMP está envolvida na formação de memória na mosca e (2) é necessário treino para estimular a formação de memória quando o activador CREB é expresso em excesso. Segundo, CREB parece funcionar de forma semelhante em neurónios de várias espécies de vertebrados e invertebrados. Para capitalizar nesta conservação evolutiva, foi desenvolvida uma via de progressão do fármaco que inclui ensaios com moscas, roedores e seres humanos.
Triagem primária
Uma triagem de elevado número de testes (HTS) baseada em células foi projectada para avaliar os efeitos de compostos na função de via CREB. As células de neuro-blastoma humano (SKN-MC) foram transfectadas estavelmente com uma construção repórter, em que a luciferase foi colocada sob o controlo de um promotor CRE. Com este repórter, aumentos na função da via CREB foram monitorizados através da produção de fluorescência. Esta linha celular do ensaio foi totalmente avaliada usando activadores CREB conhecidos. 62 ΡΕ1540335
Para avaliar a actividade do composto, a linha celular do ensaio foi pré-incubada na presença de composto e depois foi estimulada com uma dose sub-óptima de forscolina antes da lise. A concentração e cinética da co-estimulação com forscolina foram calibradas para se obter reprodutivelmente 30% de saturação, dando um gama de 300% para os efeitos dos compostos. Os compostos que produziram um aumento >100% no sinal de luciferase relativamente às células testemunhas estimuladas com forscolina sozinho seguiram para um segundo ciclo de triagem para excluir falsos positivos estatísticos. Finalmente, estes compostos foram avaliados em quatro concentrações diferentes com ou sem co-estimulação com forscolina.
Até à data, foram testados 155000 compostos com esta abordagem, dando cerca de 180 Activos Confirmados.
Triagens secundárias
Oitenta e seis dos 180 Activos Confirmados foram escolhidos para posterior análise baseada na sua estrutura e potência. Para excluir quaisquer potenciais efeitos artificiais da construção do gene repórter, usou-se PCR quantitativo em tempo real (QPCR) para avaliar os níveis de expressão de genes endógenos dependentes de CREB conhecidos na linha celular do ensaio. A maioria dos activos confirmados mostrou perfis de potência comparáveis para a expressão do gene repórter da luciferase e expressão do 63 ΡΕ1540335 gene endógeno. As análises estruturais destes 86 Activos Confirmados revelaram que 10 estão relacionados com digitoxigenina, 26 são derivados de feniletilamina, 4 são derivados de aminopropanodiol, 3 são inibidores de fosfodiesterase e 3 são análogos da cafeína. Os restantes 40 eram novas estruturas químicas sem semelhança óbvia com outros compostos conhecidos. Destes, 11 "Hits Activos" foram escolhidos para posteriores estudos baseados na potência, solubilidade e facilidade de derivatização. Para estes 11 "Hits Activos", foi confirmado o aumento da expressão endógena de genes dependente de CREB em neurónios primários do hipocampo de rato em cultura. As análises funcionais (enzimáticas, afinidade de ligação, etc.) revelaram 8 como sendo inibidores de PDE IV e 2 tendo como alvo outras moléculas.
Ensaios in vivo
Os 11 "Hits Activos" foram dados na alimentação a moscas transgénicas, portadoras do transgene CRE-luciferase. Experiências anteriores estabeleceram que: (1) a actividade do gene repórter poderá ser quantificada em moscas isoladas e (2) o repórter CRE-luciferase normalmente mostraram um ciclo circadiano de expressão (Belvin, M.P. etal., Neuron, 22(4):777-787 (1999)). Estas observações revelaram um ensaio in vivo inicial eficiente com o qual determinar as concentrações de fármacos necessárias para afectar a expressão de CRE-luciferase em tecido cerebral de moscas alimentadas com os fármacos. Os 11 Candidatos — 64 — ΡΕ1540335
Protótipos produziram um aumento significativo nos níveis de expressão de CRE-luciferase. Um destes compostos foi testado relativamente aos seus efeitos na formação de memória olfactiva da mosca. Apresentou um aumento parcial da memória após treino intensivo e nenhum efeito na memória após treino espaçado, um resultado reminiscente da assinatura CREB.
Estes "Hits Activos" foram avaliados em modelos in vivo de roedores para a formação de memória. Para o fazer de modo eficiente, foi validado um novo protocolo de treino comportamental, o qual logicamente foi afectado pela modulação a montante da via CREB. Durante as fases iniciais de aquisição, os ensaios de treinos repetidos conduziram a níveis aumentados de cAMP. Algures, os níveis de cAMP passam um patamar e PKA activado (subunidade catalítica) é translocado para o núcleo, onde fosforila CREB directamente ou origina um estado permissivo para a fosforilação de CREB por um cofactor. Neste contexto, os inibidores de fosfodiesterase (PDE) actuam de forma a aumentar os níveis de cAMP para lá do patamar com ensaios de menos treinos, produzindo assim mais memória a longo prazo com treino mais fraco. Usando o inibidor PDE protótipo, rolipram, este efeito foi estabelecido como previsto (Figura 1).
Considerados em conjunto, estes dados indicam que PDE é um alvo eficaz do fármaco para estimular a função de CREB. 65 ΡΕ1540335 EXEMPLO 2 Método para a identificação de oligos "antisense" para CREB funcionais.
Detecção de mRNA de CREB com o ensaio de bDNA. Células Neuro2a de Mus musculus foram adquiridas à American Type Culture Collection (ATCC, Cat. N° CCL-131; Manassas, VA) . As células foram semeadas em Meio Mínimo Essencial de Eagle Modificado (Meio mínimo essencial Eagle) com L-glutamina 2 mM e BSS de Earle ajustado para conter 1,5 g/1 de bicarbonato de sódio, aminoácidos não essenciais 0,1 mM e piruvato de sódio 1,0 mM, 90%; soro fetal bovino, 10%) num formato de 96 micro-alvéolos a 2 x 104 células por alvéolo. As células foram mantidas a 37°C e 5% CO2 durante a noite antes da transfecção com oligonucleótidos de ácidos nucleicos trancados para CREB.
As células foram transfectadas usando Lipo-fectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com modificações do protocolo do fabricante. Para cada amostra de transfecção, o oligonucleótido CREB LNA correspondente (ver sequências abaixo) foi diluído com 25 μΐ de meio com soro reduzido Opti-MEM (tampão HEPES, 2400 mg/1 de bicarbonato de sódio, hipoxantina, timidina, piruvato de sódio, L-glutamina, elementos raros, factores de crescimento e vermelho de fenol reduzido para 1,1 mg/1 (Invitrogen) para 66 ΡΕ1540335 uma concentração final de transfecção de 0,2 μΜ. A Lipof ectamine 2000 foi também diluída em 25 μΐ de meio Opti-MEM com soro reduzido de forma que a proporção de oligonucleótido LNA (μΐ) para Lipofectamine 2000 (μΐ) foi de 1:3, respectivamente. O oligonucleótido LNA diluído foi combinado com Lipofectamine 2000 diluída e incubado durante 15 minutos à temperatura ambiente para os complexos se formarem. Cinco μΐ de complexos oligonucleótido LNA-Lipofectamine 2000 foram adicionados a cada alvéolo. As transfecções foram realizadas em triplicado para cada oligonucleótido CREB LNA a 0,2 μΜ. As células foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante 24 horas. O meio de crescimento foi substituído após 5 horas com 100 μΐ de meio MEME . A quantificação directa do RNA mensageiro (mRNA) CREB após transfecção dos oligos "antisense", foi detectada usando o kit de expressão QuantiGene de acordo com o protocolo do fabricante (Bayer Corporation: Tarrytown, NY). Vinte e quatro horas após transfecção com oligonucleótidos LNA "antisense", as células foram lisadas com 50 μΐ de tampão de lise (Bayer Corporation) contendo o conjunto de Extensores de Captura (CE) específicos de CREB, Extensores da Marca (LE) e oligonucleótidos bloqueadores (BL) (descrito abaixo). Após uma incubação de 30 minutos, 100 μΐ da mistura de lise de cada alvéolo foram adicionados a um alvéolo de captura correspondente (Bayer Corporation). A placa de captura foi selada com um selante de placas com 67 ΡΕ1540335 adesivo no verso (Bayer Corporation) e incubada durante a noite a 50°C. Os alvéolos foram lavados três vezes com 390 μΐ de tampão de lavagem (SSC 0,1X e 0,03% de laurilsulfato de litio) numa lavador de placas ELx405 (BioTek Instruments) . 100 μΐ de reagente amplificador contendo a sonda amplificadora diluída a 1:1000 em diluente de amplifi-cador/sonda marcada (fornecida pela Bayer Corporation) foram imediatamente adicionados a cada alvéolo da placa de captura, a qual foi selada e incubada a 50°C durante 60 minutos. Os alvéolos foram lavados três vezes com tampão de lavagem como descrito atrás e 100 μΐ de reagente de marcação contendo a sonda marcada diluída a 1:1000 em diluente de amplificador/sonda marcada (Bayer Corporation) foram imediatamente adicionados a cada alvéolo da placa de captura. A placa de captura foi selada e incubada a 50°C durante 60 minutos. Os alvéolos foram lavados três vezes com tampão de lavagem como descrito atrás e 100 μΐ de solução de trabalho do substrato (0,003% de laurilsulfato de litio em reagente de trabalho do substrato; Bayer Corporation) foi imediatamente adicionado a cada alvéolo da placa de captura. A placa de captura foi selada e incubada a 50°C durante 30 minutos. A luminescência de cada alvéolo foi medida num luminómetro de placas Wallac Victor2V (Perkin Elmer) a 45°C. A Figura 3 mostra os efeitos de vários oligos LNA "antisense" para CREB nos níveis de RNA de CREB em células Neuro2a 131 após transfecção, relativamente a células 68 ΡΕ1540335 tratadas com veículo controlo (reagente de transfecção sem qualquer oligo). Cada oligo CREB LNA possui uma sequência única (ver abaixo) . Os oligos CREB LNB foram numerados de acordo com a ordem em que foram desenhados. Os oligos CREB LNB que não foram triados (testados) devido a não possuírem propriedades adequadas (e.g., temperatura de fusão) quando analisados (i.e., CREB 4, 10, 11, 13 e 14) não estão apresentados.
Os resultados demonstram que os oligos CREB1 e CREB17 reduzem os níveis endógenos de RNA de CREB em pelo menos 50%. 0 oligo CREB3 é uma sequência que foi anterior-mente usada para anular o RNA CREB (como um oligo fosfo-rotioato). Os resultados aqui apresentados demonstram que o oligo CREB3 também reduz os níveis de RNA de CREB endógeno, ainda que numa concentração mais elevada (0,5 μΜ).
Desenho de oligonucleótidos de ácidos nucleicos trancados para CREB.
Os oligonucleótidos "antisense" foram projectados para CREB usando a sequência do GenBank com o Número de Acesso M95106 com o Vector NTI Suite 8 (InforMax, Frederick, MD). As sequências dos oligonucleótidos de ácido nucleico trancado (LNA) (Proligo LLC, Boulder, CO) estão resumidos abaixo: ΡΕ1540335 69 1. CCTCCgCCgCgTCACTCA (SEQ ID N0.1) 2. CCACgTAACACACegCgT {SEQ 1D NO.:2) 3. TggTCATTTAgTTACGggTg (SEQ ID NO.:3)
4. gCTggTTgTCTgCACCAG (SEQ ID NQ.:4J 5. TTTTCAgCTTCTgTTAGA (SEQ fD NO. 5) 8. CTgggCTTgAACTglCAT (SEQ ID NO.:6) 7. gCTAATgTggCAATCTgl (SEQ ID N0.:7) 8. TgCTggCATggATACCTg (SEQ ID NO.:8) 9. gCAgATgATgTTgCATgA (SEQ ID NQ,:S) 10. TgTCTgCCOATTgggCAg (SEQ ID NO.:10) 11 gggCCgCCTggATMCgCC (SEQ ID NO,:11) 12. TTCACTTTCTgCÂÃTÃpT (SEQ ID NO.:12) 13. TCCÂCAgAGTCCTgTgAA (SEQ ID NO.:13) 14. AAAggATTTOCCTf CgTT (SEQ ID NO.:14) 15. CÂgAAgATAAfTCATTCA (SEQ ID N0.:15) 18. TTCTCAATCCTTggCAC (SEQ ID NO.: 18) 17. TggCAOTgTTAC AgTggT (SEQ ID NQ.:17) 18. CTgCCCACTgCTAgTTTg (SEQ ID NO.:1) 19. gCTCCTCCgTCACTgCTT (SEQ ID NO,:19) 20. TgCACTAAggTTACÂgTg (SEQ ID NQ.:20).
Os oligonucleótidos LNA individuais foram ressuspensos em TE IX (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 e EDTA 1 mM, pH 8,0) numa concentração de 200 μΜ.
Desenho de sondas de bDNA CREB.
Foram projectadas sondas oligonucleotidicas de captura e de amplificação do sinal do mRNA de CREB com QuantiGene Probe Designer Software (Bayer Corporation). As sequências de oligonucleótidos (Integrated DNA Technologies Inc; Coralville, IA) estão resumidas abaixo: 70 ΡΕ1540335 CE ggattteccttegí.ítttgggTTTTTcfcÍtggaaags^gt (SEQ iD NO.21) CE esaMtggesmxtggtTTTTTctcttggaaagssagt (SEQ ID NO.:22) CE agtcfectetteigacliitcttcttTTTWctdígigaaagaaagf: {SEQ ID NO.:23) CE tefccdggglaatggGaTTTTTcfet^gaaagaaagt {SEQ ID NO,:24) CE GcatígitfagcaigctgtaitgGlTTTTcidtggaaagaaagt {SEQ IO NG,:25) CE CGggctgagiggcagctgTTTTTcteffgg^agaaagt {SEQ ID NO.:28) CE gex^pggcagctlgaacaTTTTTctcilggaaagaaagt {SEQ ID NO.:27) CE tgctgcttctfmgcaggctTTTTTctct^igaaagsaagt {SEQ ID NO.:28) CE ftagacggaGctddcttccgTTTTTcieítggaaagaaagt (SEQ ID NO .,:29) LE ga.afcttcactttGtgcaatagttgaTTTTTaggGateggacGcgígM (SEQ ID N0.:3O) LE aatcagtfacacMGcacagaGtcctgtTTTTT ^tcataggacccgigtet (SEQID NO.:31) LE a^tadgc-ccactgda.gttiggteTTTTTaggcafeggacGcgigtct {SEQ ID NO.:32) LE ggecctgtaccccateegtaTTTTTaggca.taggacee-gtg:td. (SEQ IO NO.:33) LE cattggtcaiggttaalgtclgGaTTTTTag;g;cat:aggaceGg:fgtet (SEQ ID NQ.:34) LE glctgtgcala.clgtagaa^;gtagtacTTTTTaggcataggacccgígtct (S EQID NO. :3S) LE agaatetgctgtcGatcc:gígTTTTTagg;csitaggacccglgtd: (SEQ ID NO.:36) LE gtgcgaatcíggíalgtítglacateTTTTTaggeataggaoxg^gtet (SEQ ID NO.. :37) LE acgccateac^actcc^ggTTTTTaggcafeggacecglpIet (SEQ ID NO.:38) BL octgtaggaaggcetectlgaaa (SEQ ID N©.;38) BL gcato^aagataagícattcaaaatltí (SEQ S D NO. :40) BL {gglgatpgcaggggctga (SEQ SD NG ,.:41) BL aalgggiigttgígcactftfcícag (SEQ ID NQ.:42) BL acaactlggitgdgggcaet (SEQ ID NQ.;43) BL gea a Iggtgctagtggglgcl (SEQ ÍD NO.:44) BL qtqtaqgaagfgctegqgaqq {SEQ ID NO.:45)
As sondas individuais (CE) , (LE) e (BL) foram suspensas em TE IX, pH 8,0 numa concentração de 100 pmoles/μΐ. Os conjuntos de séries de sondas especificas de alvo (CE), (LE) e (BL) foram suspensos em TE IX numa concentração final de 50, 200 e 100 fmol/μΐ, respectivamente.
Efeito dos oligos LNA "antisense" para CREB na resposta de CRE-Luci a forscolina + HT0712 em células SK-N-MC. Células SK-N-MC humanas estavelmente transfectadas com uma (ver Exemplo 1), construção repórter 71 ΡΕ1540335 consistindo no promotor VIP, contendo 2 elementos CRE juntamente com 2 elementos CRE adicionais do gene da aminotransferase de tirosina, a dirigir a expressão de luciferase, foram semeadas em Meio de Eagle Modificação de Iscove (IMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA), L-glutamina 2mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, HEPES 0,1 mM, soro fetal bovino 10%, a uma densidade de 20000 células por alvéolo num formato de placa de 96 alvéolos. As células foram mantidas a 37°C, 5% CO2 durante a noite antes da trans-fecção com oligonucleótidos "antisense" CREB LNA 0,2 μΜ. Os oligos CREB funcionais foram identificados na triagem com bDNA descrita anteriormente. Os oligos CREB LNA utilizados foram: CREB1; CCTCCgCCgCgTCACTCA (SEQ ID NO.:46) CREB 3: CCÂCgTAACÂCÂCCgGgT (SEQ ÍD NO.;47) CREB 17: TggCACTgTTACÂgTggT fSEQ ID NQ.:48)
Os oligos CREB1 e CREB3 possuem homologia de sequências idêntica com murganho e humano. CREB 17 possui uma única base diferente. Demonstrou-se que os três oligos LNA são funcionais na anulação dos níveis de RNA de CREB humano num ensaio de bDBNA para CREB humano.
As células foram transfectadas com oligos CREB LNA humano usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com modificações do protocolo do fabricante. Para cada amostra de transfecção, os correspondentes oligonucleótidos CREB LNA (CREB oligos 1, 3 e 17) foram diluídos com 25 μΐ de meio Opti-MEM com soro reduzido (tampão HEPES, 2400 mg/1 de bicarbonato de sódio, hipoxantina, timidina, piruvato de 72 ΡΕ1540335 sódio, L-glutamina, elementos raros, factores de crescimento e vermelho de fenol reduzido para 1,1 mg/1; Invitrogen) para uma concentração final de transfecção de 0,2 μΜ. A Lipofectamine 2000 foi também diluída em 25 μΐ de meio Opti-MEM com soro reduzido, de forma que a proporção de oligonucleótido LNA (μΐ) para Lipof ectamine 2000 (μΐ) foi de 1:3, respectivamente. O oligonucleótido LNA diluído foi combinado com Lipofectamine 2000 diluída e incubado durante 15 minutos à temperatura ambiente para os complexos se formarem. 50 μΐ de complexos oligonucleótidos LNA-Lipofectamine 2000 foram adicionados a cada alvéolo. As células foram incubadas a 37°C e 5% CO2 durante 16-24 horas. O meio de crescimento foi substituído após 5 horas com 100 μΐ de meio IMEM. HT0712 ( (3S, 5S)-5-(3-ciclopentiloxi-4-metoxi-fenil)-3-(3-metil-benzil)-piperidin-2-ona; também conhecido como IPL 455903)) 5 μΜ foi adicionado a células transfectadas/tratadas com veículo e incubadas a 37°C, 5% CO2 durante 2 horas. HT0712 tem a seguinte fórmula:
73 ΡΕ1540335 em que "Me" significa "metilo" e "cPent" significa "ciclopentilo". HT0712 pode ser preparado usando a metodologia proporcionada na Patente U.S. N° 6458829B1, os ensinamentos da qual são aqui incluídos como referência. forscolina 2 μΜ foi então adicionado e as células incubadas durante mais 6 horas, lavadas rapidamente com PBS, lisadas na presença de luciferina e a actividade de luciferase medida usando um luminómetro Victor 5.
Lisboa, 17 de Junho de 2010

Claims (10)

  1. ΡΕ1540335 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a identificação de compostos candidatos para estimular a função da via CREB caracte-rizado pelos passos de: a) contacto das células hospedeiras compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE com um composto a testar e com uma dose sub-óptima de um agentes estimulador da função de CREB; b) determinação da actividade indicadora nas referidas células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o referido composto a testar e com o referido agente estimulador da função de CREB; c) comparação da actividade indicadora determinada no passo b) com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; d) selecção do referido composto a testar se: i) a actividade indicadora determinada no passo b) for aumentada relativamente à actividade indicadora nas referidas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de 2 ΡΕ1540335 CREB e que nao foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; e ii) a actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com a referido agente estimulador da função de CREB e que foram colocadas em contacto com o referido composto a testar não for significativamente diferente relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; e) repetição dos passos a) a d) com uma gama de concentrações diferentes do referido composto a testar seleccionado no passo d); e f) selecção do referido composto a testar se: i) a actividade indicadora aumentar na gama de concentrações do referido composto a testar relativamente à actividade indicadora nas referidas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; e ii) a actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que foram 3 ΡΕ1540335 introduzidas na referida gama de diferentes concentrações do referido composto a testar não for significativamente diferente da actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar, em que o referido composto a testar é identificado como um composto candidato para estimular a função da via CREB, facultativamente sendo as referidas células hospedeiras colocadas em contacto com o referido composto a testar antes do contacto com o referido agente estimulador da função de CREB.
  2. 2. 0 método da Reivindicação 1, em que a) as referidas células hospedeiras são células de neuroblastoma humano; e/ou b) o referido gene indicador codifica luciferase; e/ou c) o referido agente estimulador da função de CREB é forscolina.
  3. 3. 0 método da Reivindicação 1 ou 2, em que os passos a) a d) são repetidos com uma gama de quatro concentrações diferentes do referido composto a testar seleccionado no passo d) . 4 ΡΕ1540335
  4. 4. O método da Reivindicação 1 compreendendo ainda os passos de: g) contacto das células de origem natural com o referido composto candidato e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB, em que as referidas células de origem neuronal são diferentes das células hospedeiras do passo a); h) avaliação da expressão endógena dos genes dependentes de CREB nas referidas células que foram colocadas em contacto com o referido composto candidato e com o referido agente estimulador da função de CREB; e i) comparação da expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo h) com a expressão endógena de genes dependentes de CREB nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocados em contacto com o referido composto candidato, em que uma diferença na expressão de genes dependente de CREB no passo h) comparativamente com a expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhass confirma que o referido composto é um composto candidato para estimular a função da via CREB, identificando assim o referido composto candidato, facultativamente sendo as referidas células de origem neuronal colocadas em contacto com o referido composto candidato antes do contacto com o referido agente estimulador da função de CREB. 5 ΡΕ1540335
  5. 5. O método da Reivindicação 4, em que (a) as referidas células de origem neuronal são neurónios, facultativamente em que os referidos neurónios são células primárias do hipocampo; e/ou (b) o referido agente estimulador da função de CREB é forscolina.
  6. 6. 0 método para avaliação do efeito na expressão de genes dependente de CREB de um composto candidato para estimular a função da via CREB compreendendo os passos de: (a) contacto das células de origem neuronal com um composto candidato e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB; (b) avaliação da expressão endógena de genes dependente de CREB nas células que foram colocadas em contacto com o referido composto candidato e com o referido agente estimulador da função de CREB; e (c) comparação da expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo b) com a expressão endógena de genes dependente de CREB em células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o 6 ΡΕ1540335 referido composto candidato, facultativamente sendo as referidas células de origem neuronal colocadas em contacto com o referido composto candidato antes do contacto com o referido agente estimulador da função de CREB.
  7. 7. 0 método da Reivindicação 6, em que (a) as referidas células de origem neuronal são neurónios, facultativamente em que os referidos neurónios são células primárias do hipocampo; e/ou (b) o referido agente estimulador da função de CREB é forscolina.
  8. 8. Um método para a triagem de um composto relativamente à sua capacidade para estimular a função da via CREB compreendendo os passo de: a) contacto das células hospedeiras compreendendo um gene indicador operacionalmente ligado a um promotor CRE com um composto a testar, produzindo assim uma amostra a testar; b) contacto da amostra a testar produzida no passo a) com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB; c) determinação da actividade indicadora nas referidas células hospedeiras que foram colocadas em contacto com o referido composto a testar e com o referido agente estimulador da função de CREB; 7 ΡΕ1540335 (d) comparação da actividade indicadora determinada no passo c) com a actividade indicadora nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; e) selecção do referido composto a testar se: 1) a actividade indicadora determinada no passo c) for aumentada relativamente à actividade indicadora nas referidas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; e 2) a actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas com o referido agente estimulador da função de CREB e que foram colocados em contacto com o referido composto a testar não for significativamente diferente relativamente à actividade indicadora nas células testemunhass que não foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; f) repetição dos passos a) a e) com uma gama de diferentes concentrações do referido composto a testar seleccionado no passo e); ΡΕ1540335 g) selecção do referido composto a testar se: 1) a actividade indicadora for aumentada na gama de diferentes concentrações para o referido composto a testar relativamente à actividade indicadora nas referidas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto a testar; e 2) a actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas com o referido agente estimulador da função de CREB e que foram colocadas em contacto com a referida gama de diferentes concentrações do referido composto a testar não for significativamente diferente relativamente à actividade indicadora nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função da via CREB e que não foram colocadas com o referido composto a testar, seleccionando assim um composto candidato; h) contacto das células de origem neuronal com o referido composto candidato seleccionado no passo g) e com uma dose sub-óptima de um agente estimulador da função de CREB; i) avaliação da expressão endógena de genes dependente de CREB nas células que foram colocadas em contacto com o referido composto candidato e com o referido agente estimulador da função de CREB; 9 ΡΕ1540335 j) comparação da expressão endógena de genes dependente de CREB avaliada no passo i) com a expressão endógena de genes dependentes de CREB nas células testemunhas que foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocados em contacto com o referido composto candidato; k) selecção do referido composto candidato se: 1) a expressão endógena de genes dependentes de CREB avaliada no passo i) for aumentada relativamente à expressão endógena de genes dependente de CREB nas células testemunhas que foram colocadas com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto candidato; e 2) a expressão endógena de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto candidato não for significativamente diferente relativamente à expressão de genes dependente de CREB nas células testemunhas que não foram colocadas em contacto com o referido agente estimulador da função de CREB e que não foram colocadas em contacto com o referido composto candidato, seleccionando assim um composto candidato confirmado; 10 ΡΕ1540335 l) administração do referido composto candidato confirmado seleccionado no passo k) a um animal não humano (e.g. um mamífero); m) treino do referido animal a que foi administrado o referido composto candidato confirmado em condições adequadas para produzir formação de memória a longo prazo no referido animal; n) avaliação da formação de memória a longo prazo no referido animal treinado no passo m); e o) comparação da formação de memória a longo prazo avaliada no passo n) com a formação de memória a longo prazo produzida no animal controlo ao qual não foi administrado o referido composto candidato confirmado.
  9. 9. 0 método da Reivindicação 8, em que a) as referidas células hospedeiras são células de neuroblastoma e as referidas células de origem neuronal são neurónios, facultativamente em que os referidos neurónios são células primárias do hipocampo; e/ou b) o referido gene indicador codifica luciferase; e/ou c) o referido agente estimulador da função de CREB é forscolina. 11 ΡΕ1540335 que os quatro testar
  10. 10. O método da Reivindicação 8 ou 9 em passo a) a e) são repetidos com um gama de concentrações diferentes do referido composto a seleccionado no passo e). Lisboa, 17 de Junho de 2010
    ΡΕ1540335 2/2
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    4ϋ A*> % 1 ΡΕ1540335 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição WO 0213857 A US 5028223 Â US 6851553 A VSOS61127SA US S1823SS A Hueteter» ΆΟ. US 4>S33032 A, SeyseR» HM US 5831 §33 Af ftfcYey USS45SS2SB1 Literatura que não é de patentes citada na Descrição Ahí», 8. st si ílfiHimf; * Tsiffy, T. oi st Pfix &íí.AíM. Sd. ÍÍSA. 1937, voi. 54 ;9) 4239424# « TuKy, T &í si. CM. 1034. voi 73 rti. 3547 * Ym, j CL st st Cei. iSS4. voi ?0i1o. 40-58 * Yín, J C.otaLCi?;; 1 395. voi SI (5)- 7074 75 * Èkuissh, D, «I st Csê 5935, vot. 83 (61. 079-892: » SL st sí OaS, 1834,ysi 59-68 » Kâgsn, J.H. at aí. Ctífr 5«?, ISO?, vai. 7(IS, 1-11 « Otaawskt, J.F : McSaugO, J.L·. pwe, MM MM. Set IKS&. 1δ®7. voi. 94 5e; 282348888· « LssrepnachtR et si, J h^-sosa., 1837, voi 17 {21 í. 5447-455 * Joss«4Yn.S.A et aí. 5σ;&$?&ΜΜΤ<^·ΜϊΜ2βφ '.MwMfflsMng. 183S, vs. 24 » Joa&etyn. SA. «t st J. Nsisosd.,2081, voi, 2117)> 2404-2412 * impey. S. «tSi, 1986» vsi. 16 (5). 973-382 Isw&erifeikl S.S4. at aí. ,Vsi. freuro&ci.. 1983, yol· 2 (4;, 3ÔS-54 T*a6*aW4 SM eí si 2<>34,. ¥^-21 yxst-sst 199S:; woí. 23. (¾. 5·59-5ε·8 ·»· Sssnh, A.L aí si } 4206-4216 * Gtazewsài. &, st af C«wts»* 1938,,¾¾ 8 .3'. 249-2S5 4 Pham» T.A ei si Λί«Οτ®ί.: 1938, Vss!, 2S (t(. 83-72: * Pisam, 7,A, ai at OfesAnrç 2631» v«í, 31 (3). 499-420 * Moais. A.N. et aí. J. 8>M Ctusm 18SS. voi. 271 (24). 14214-14220 » Mwptsy, D.D.; SagaiSSiPíoe AU?Í 4 caí. SíIlíSA, 15S7 xoi 54 i4). 14S2-14S7 * Um, F.C.; Stayfofei., ΑΜφαφοα, 1386, voi, 17 (6;, 11334144 * .ftpànok et al. Cfossrsgr A ídfo&a&spf fêm&áL· CfM Saifsg Hatb# Uaès&âíy. pxçsA 1$88:; * ÃtiistiSeí et aí. Ci.srréfií Preíocsià sn Sfâe&ijsr Bloié-§)· John Wsfey & Sons. 1086 >: SÍeMn st -àL-NeimB. 199&. vet, 22 (4), T77-787 » Ausutseí «ê ai. Cm&& Ptoteccis ?« ifc4sciás? BfeA-e®?. iohsi VWtejs § .Sors, 1858 * Aásútó «í ai, CotsrI Pío!ísc<4s !i> Moí-scilai Ssji og>5 Wsfey & Ssns. í«e, 1858 « Sarço, A, «S si CB&-W0S!,· >>oi 158 (% §85-753 » SíBsissrTOSR.: R* s£M4 WM- Chmx íSS4, ml 3I> 2»378-2685 * Ohinseyw, «t ai, FM.MM Áesó; Sa. USA 1895. voí. 80.. 18322-10326 : * DaWiít S.H. et ai,. fTcc. sVaií. .Aasd. Set USO, 10S;3:. VÚ, 9*3., SíSOS-^IS * Josseiy» «t M §2S * CaseUaj Davis, Séésv:,,: 36; 377-383 : * 'φ&άφιίβ. st sf, Píòp NM. ÀeSçf.; Sm< fcíSA, 4^7, voí. 04, 26S33-263S * L«K^eeçM«i MJS· fS9?, i®i 17 pi,), 6443-6450 * Doasichuíadas et st ,Çí^ 1804, vc.4. 79. 59-68 * K&gá« »i ssá, €<Sfr flfoi. 1036, vsO- 7.; 1-11 ·*:. 7s^Sy; Qamn. J. Gomp. FftyMdiÁSsm. Neúiat Seftm Pàvsío1.. 1565, voi. 157,263-277 * TtOiy at ál. CeS 19S4, vsi,78< 364? > Rstivjvifkise: Ti» vtnjses má tOsr rapítealíGís, Cof* H», J.M. «i ai, Psjtndaasefsta! VsísOogy. co&RavanPubSslvefa; -1896 « Séíym,: íí#. staS, $íemx>. 19SS, voi. 22 (4), 777-7S7:
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