PT1494693E - Cripto ¿ anticorpos especificos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO CRIPTO - Anticorpos especificos

Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Internacional PCT/US02/11950, arquivado a 24 de Abril de 2002, que reivindica a prioridade dos Pedidos dos Estados Unidos N°. 60/367.002, arquivado a 22 de Março de 2002; N° 60/301.091, arquivado a 26 de Junho de 2001; N° 60/293.020, arquivado a 17 de Maio de 2001; e N° 60/286.782, arquivado a 26 de Abril de 2001.

Campo Técnico da Invenção A presente invenção refere-se, em termos gerais, aos campos de genética e biologia celular e molecular. Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos anti-Cripto.

Fundamento da Invenção O Cripto é uma proteína de superfície celular de 188 resíduos de aminoácido, que foi isolada de forma acidental numa análise de cDNA de uma biblioteca de carcinoma embriónico humano (Ciccodicola e outro, 1989, EMBO J,, vol. 8, pp. 1987 - 1991). A proteína cripto tem pelo menos dois domínios notáveis: um domínio rico em cisteína, e um primeiro domínio caracterizado como similar ao domínio encontrado na família de factor de crescimento epidérmico (EGF). Cripto foi originalmente classificado como um membro da família EGF (Ciccodicola e outro, supra); entretanto, análises subsequentes demonstraram que Cripto não se liga a qualquer dos receptores de EGF conhecidos e que, na verdade, o seu domínio tipo EGF divergiu da família EGF (Bianco e outro, 1999, J. Biol. Chem., 274: 8624 a 8629). 1 A via de sinalização Cripto não tem registado progressos, apesar da continua investigação. A literatura apoia a activação de diferentes vias, incluindo uma via de cinase de MAP (DeSantis e outro, 1997, Cell Growth Differ., 8: 1257 a 1266; Kannan e outro, 1997, J. Biol. Chem., 272: 3330 a 3335), a via de TGF-β (Gritsman e outro, 1999, Development, 127: 921 a 932; Schier e outro, 2000, Nature, 403: 385 a 389), interacções possíveis com a via Wnt (Salomon e outro, Endocr Relat Câncer. 7: 199 a 226; e diafonia com a via de EGF (Bianco e outro, 1999, J. Biol. Chem., 274: 8624 -8629). A Patente dos Estados Unidos n° 5.256.643 e dois pedidos também relacionados com ela (Patentes dos Estados Unidos nos 5.654.140 e 5.792.616) descrevem um gene Cripto humano, proteína Cripto, e anticorpos para Cripto. A Patente dos Estados Unidos n° 5.264.557 e três patentes relacionadas (Patentes dos Estados Unidos n°s 5.620.866, 5.650.285 e 5.854.399) descrevem um gene e proteína relacionada com o Cripto humano. Também são descritos anticorpos que se ligam à proteína relacionada com Cripto, mas que não reagem ligando-se à proteína de Cripto em si. A expressão aumentada da proteína de Cripto está associada a tumores em muitos tecidos diferentes (incluindo, mas não se limitando ao tecido cerebral, mamário, testicular, do cólon, pulmão, ovário, bexiga, útero, cervical, pancreático e do estômago), como foi demonstrado por imunomanchamento de tecido humano com anticorpos policlonais de coelho criado contra pequenos peptídeos de Cripto . Pânico e outro, 1996, Int. J. Câncer, 65: 51 - 56; Byrne e outro, 1998, J. Pathology, 2 185: 108 - 111: De Angelis e outro, 1999, Int J.

Oncology, 14: 437 - 440. A técnica está, portanto, a necessitar de métodos de controlo, restrição e/ou prevenção de tal expressão aumentada, inibindo a actividade do Cripto, e inibindo as consequências de propagação de Cripto (isto é, promoção e/ou manutenção de transformação celular).

Sumário da Invenção A presente invenção fornece novos anticorpos que se ligam especificamente a Cripto, e a métodos de produzir e utilizar tais anticorpos. A invenção também fornece anticorpos que se ligam a Cripto, e inibem a actividade de Cripto ou a interacção de proteína, por exemplo, um anticorpo que se liga a Cripto de tal modo que o sinal resultante de uma interacção de proteína com Cripto seja modulado de forma descendente. A invenção também fornece anticorpos que se ligam a Cripto e bloqueiam a interacção entre Cripto e ALK4. A invenção fornece também anticorpos que se ligam a Cripto e bloqueiam a interacção entre Cripto e Activina B. A invenção também fornece anticorpos que se ligam a Cripto e inibem o crescimento do tumor. A invenção também fornece anticorpos que se ligam a Cripto, inibem a actividade de Cripto e inibem o crescimento de tumor. A invenção fornece também anticorpos que se ligam à Cripto, bloqueiam a interacção entre Cripto e ALK4 e/ou entre Cripto e Activina B, e inibem o crescimento do tumor.

Num aspecto da invenção, o anticorpo da invenção liga-se especificamente a um epítopo selecionado do grupo de epítopos ao qual se ligam os anticorpos A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317) .

Noutro aspecto da invenção, o anticorpo desta 3 invenção liga-se especificamente a um epitopo no domínio de ligação de ligante/receptor. 0 Cripto pode ser seleccionado de CR-1 (ID SEQ N° 1) ou CR-3 (ID SEQ N° 2). Os anticorpos que se ligam especificamente ao epitopo no domínio de ligação de ligante/receptor incluem, por exemplo, o A6C12.il, o A6F8.6 (ACESSO ATCC n° PTA-3318), 0 A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317), ο A19A10.30, A8H3.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3315), o A27F6.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3310), o A40G12.8 (ACESSO ATCC n° PTA-3316), o A17G12.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3314), o A18B3.il (ACESSO ATCC n° PTA-3312) e o B6G7.10 (ACESSO ATCC n° PTA-3313), 1- 1 a4C.2, 2-2C9.2, 2-3H9.2, 2-4E5.6, 2-4D1.3, 3-4E8.3, 3-3G1.1, 4-2F6, 4-3A7 e 4-1E2.

Nalgumas modalidades, o epitopo ao qual os anticorpos da presente invenção se ligam encontra-se num domínio tipo EGF. Os anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo no domínio tipo EGF incluem, mas não estão limitados, ao A40G12.8 (ACESSO ATCC n° PTA-3316), ao A8H3.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3315), ao A27F6.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3310) , ao B6G7.10 (ACESSO ATCC n° PTA-3313), ao A17G12.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3314) e ao A18B3.11 (ACESSO ATCC n° PTA-3312), ao 1-1A4C.2, 2-2C9.2 e ao 2-4D1.3.

Noutras modalidades, o epitopo ao qual os anticorpos da presente invenção se ligam encontram-se num domínio rico em cys. Os anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo no domínio rico em cys incluem, mas não se limitam, ao A19A10.30, ao A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317), ao A6F8.6 (ACESSO ATCC n° PTA-3318) ao A6C12.11, ao 1-1A4C.2 e ao 2-2C9.2.

Os anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo no amino terminal incluem, mas não estão 4 limitados ao A10B2.17.

Os anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo no domínio abrangendo resíduos de aminoácidos 46-62 de Cripto incluem mas não estão limitados a A10B2.18(ATCC ACCESSION NO PTA-3311) B3F6.17 (ATCC ACCESSION NO. PTA 3319) A 17a2.16, 2-3H 9.2, 2-4E5.6, 2-4D1.3, 3-4E8.3, 3-1E7.2 e 3-3G1.1.

Noutras modalidades, o epitopo ao qual os anticorpos da presente invenção se ligam está nos polipeptídeos CR40 (ID SEQ N0:3); CR41 (ID SEQ NO: 4) ; CR4 3 (ID SEQ NO: 5); CR44 (ID SEQ NO: 6); CR49 (ID SEQ NO: 7); CR50 (ID SEQ NO:8) ou CR51 (ID SEQ NO: 9). Os anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo num desses polipeptídeos incluem, mas não se limitam, ao A6C12.il, A6F8.6, A7H1.19, A8F1.30, A8G3.5, A8H3.1, A8H3.2, A10A10.30, A19A10.30, A10B2.17, A10B2.18, A27F6.1, A40G12.8, A2D3.23, A7A10.29, A9G9.9, A15C12.10, A15E4.14, A17A2.16, A17C12.28, A17G12.1, A17H6.1, A18B3.il, A19E2.7, B3F6.17, B6G7.10, 1-1A4C.2, 2-2C9.2, 2-3H9.2, 2-4E5.6, 2-4D1.3, 3-4E8.3, 3-3G1.1, 4-2FG, 4-3A7 e 4-1E2.

Esta invenção inclui também anticorpos que se ligam especificamente a Cripto e são capazes de inibir a actividade de Cripto. Estes anticorpos incluem, mas não estão limitados, ao A40G12.8 (ACESSO ATCC n° PTA-3316), A8H3.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3315), A27F6.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3310), E A6C12.il, 1-1A4C.2 e 2-2C9-2. Nalgumas modalidades, os anticorpos da presente invenção que se ligam especificamente a Cripto e que são capazes de inibir a actividade de Cripto, ligam-se a um epitopo num domínio tipo EGF ou num domínio de Cripto rico em cys.

Esta invenção também inclui anticorpos que se 5 ligam especificamente a Cripto e que bloqueiam a interacção entre Cripto e ALK4. Os anticorpos que se ligam especificamente a Cripto e são capazes de bloquear a interação entre Cripto e ALK4 incluem, mas não estão limitados a A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317), A6F8.6 (ACESSO ATCC n° PTA-3318) e A6C12.il, 1-1A4C.2 e 2-2C9.2. Nalgumas modalidades, os anticorpos da presente invenção que se ligam especificamente a Cripto e são capazes de bloquear a interacção entre Cripto e ALK4 ligam-se a um epítopo num dominio tipo EGF ou num domínio de Cripto rico em cys.

Esta invenção também inclui anticorpos que se ligam especificamente ao Cripto e bloqueiam a interacção entre Cripto e a Activina B. Os anticorpos que se ligam especificamente ao Cripto e são capazes de bloquear a interacção entre Cripto e a Activina B, incluem, mas não se limitam ao A8G3.5 (ACESSO ATCC NO. PTA-3317) e ao 1-1A4C.2. Nalgumas modalidades, os anticorpos da invenção que se ligam especificamente ao Cripto e são capazes de bloquear a interacção entre Cripto e a Activina B ligam-se a um epítopo num domínio de Cripto rico em cys.

Noutro aspecto, esta invenção inclui anticorpos que se ligam especificamente a Cripto e são capazes de inibir o crescimento de tumores. Os anticorpos que se ligam especificamente a Cripto e são capazes de inibir o crescimento de tumores incluem, mas não se limitam a, A27F6.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3310), B6G7.10 (ACESSO ATCC n° PTA-3313) E A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317), 1-1A4C.2 e 2-2C9.2.

Nalgumas modalidades, os anticorpos da presente invenção que se ligam especificamente a Cripto e são capazes de inibir o crescimento de tumores ligam-se a um 6 epítopo num domínio do tipo EGF ou num domínio de Cripto rico em cys.

Noutro aspecto, esta invenção inclui anticorpos que se ligam especificamente a Cripto e que são capazes de inibir a actividade de Cripto e que são capazes de inibir o crescimento do tumor. Os anticorpos que se ligam especificamente a Cripto, que são capazes de inibir a actividade de Cripto, e que são capazes de inibir o crescimento do tumor incluem, mas não estão limitados a A27F6.1 (ACESSO ATCC n° PTA-3310), A8G3.5, 1-1A4C.2 e 2-2C9.2.

Nalgumas modalidades, os anticorpos da presente invenção que se ligam especificamente a Cripto, que são capazes de inibir a actividade do Cripto, e que são capazes de inibir o crescimento do tumor, ligam-se a um epítopo num domínio tipo EGF ou num domínio de Cripto rico em cys.

Noutro aspecto, a presente invenção inclui anticorpos que se ligam especificamente a Cripto, que são capazes de bloquear a interacção entre Cripto e ALK4, e que são capazes de inibir o crescimento do tumor. Os anticorpos que se ligam especificamente a Cripto, que são capazes de bloquear a interacção entre Cripto e ALK4, e que são capazes de inibir o crescimento do tumor, incluem mas não estão limitados a A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317), 1-14AC.2 e 2-2C9.2.

Noutro aspecto, a presente invenção inclui anticorpos que se ligam especificamente a Cripto, que são capazes de bloquear a interacção entre Cripto e a Activina B, e que são capazes de inibir o crescimento do tumor. Os anticorpos que se ligam especificamente a Cripto, que são capazes de bloquear a interacção entre 7

Cripto e a Activina B, e que são capazes de inibir o crescimento do tumor incluem mas não são limitados a, A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317) e 1-14AC.2.

Em outro aspecto, a invenção inclui um método para inibir a ligação de Cripto com a Activina B numa amostra, compreendendo a adição à amostra de um anticorpo que se liga especificamente com Cripto e que é capaz de bloquear a interacção entre Cripto e a Activina B. Num aspecto relacionado, a invenção baseia-se na inibição da ligação de Cripto com Activina B num mamífero, compreendendo a utilização de um anticorpo que se liga especificamente com Cripto e que é capaz de bloquear a interacção entre Critpo e Activina B no tratamento de um mamífero.

Noutra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo produzido por um hibridoma seleccionado do grupo consistido por A8G3.5 (ACESSO ATCC n° PTA-3317).

Os anticorpos desta invenção incluem, mas não se limitam a anticorpos monoclonais, policlonais, humanizados, quiméricos e humanos.

Esta invenção também fornece uma composição para administração a um mamífero que apresenta um tumor que expressa Cripto, compreendendo pelo menos um dos anticorpos acima descritos. Nalgumas modalidades, o mamífero é humano. A composição pode incluir um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os anticorpos acima descritos podem ser conjugados com um agente quimioterapêutico ou fornecidos em combinação com um quimioterapêutico não conjugado.

Incluídos noutro aspecto da invenção encontram-se métodos de inibição do crescimento de células tumorais in vitro numa amostra que compreende a etapa de adicionar 8 à amostra as composições acima descritas.

Incluem-se também as utilizações em métodos de inibição do crescimento de células tumorais in vivo num mamífero, compreendendo a aplicação no mamífero de uma quantidade eficaz das composições acima descritas. Nalgumas modalidades o mamífero é humano.

Outro aspecto da invenção é a utilização num método de tratamento dum mamífero que apresenta um tumor com uma expressão aumentada de Cripto compreendendo a aplicação no mamífero de uma composição acima descrita numa quantidade eficaz. A composição para administração pode incluir excipientes farmaceuticamente aceitáveis, anticorpos conjugados com agentes quimioterapêuticos e anticorpos administrados em combinação com agentes quimioterapêuticos não conjugados. Os métodos da presente invenção são particularmente úteis na inibição do crescimento de células tumorais e/ou no tratamento de um mamífero (por exemplo, um ser humano) que apresenta um tumor onde a célula tumoral é seleccionada a partir de células tumorais do cérebro, cabeça, pescoço e da próstata.

Noutra modalidade, a presente invenção inclui métodos para determinar se um tecido expressa Cripto, compreendendo a etapa de analisar o tecido do mamífero num imunoensaio empregando qualquer um dos anticorpos acima descritos. Também incluídos estão os métodos para determinar se uma linha celular aumenta a expressão do Cripto, compreendendo a etapa de analisar a linha celular num imunoensaio empregando qualquer um dos anticorpos acima descritos.

Noutro aspecto, a invenção fornece um método de preservar ou manter a inibição induzida por Activina B de 9 uma célula tumoral, o que inclui expor a célula tumoral a um anticorpo da invenção. Em certas modalidades, a célula tumoral é uma célula tumoral humana. Em algumas modalidades a célula tumoral é seleccionada de a partir de células tumorais do cérebro.

Noutro aspecto, a invenção fornece um método de identificação dum composto capaz de bloquear a interacção entre Critpo e a Activina B, compreendendo as etapas de contactar Critpo e Activina B na presença de um composto candidato e detectar uma alteração na interacção entre Critpo e a Activina B. Em algumas modalidades o composto é um anticorpo.

Estes e outros aspectos da invenção são mencionados pormenorizadamente na Descrição Detalhada da Invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

Esta invenção baseia-se na descoberta de que certos anticorpos específicos do Cripto podem afectar a actividade do Cripto, como por exemplo através da inibição da interacção entre Cripto e a ALK4 e/ou a interacção entre Cripto e a Activina B, e podem ser usados para inibir o crescimento de células tumorais. Alguns desses anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo no domínio de ligação de ligante/receptor de uma proteína nativa de Cripto ou de uma forma desnaturada de Cripto. Por exemplo, podem ligar-se a um domínio tipo EGF, a um domínio rico em cys, ou a um peptídeo (por exemplo, de entre cerca de 3 a 20 aminoácidos) da região compreendendo os resíduos de aminoácido 46 a 150 de Cripto.

Os anticorpos desta invenção são úteis na terapia de tumores malignos ou benignos de mamíferos onde 10 o crescimento do tumor depende, pelo menos parcialmente de Cripto. Este crescimento apresenta, de forma geral, uma taxa de crescimento anormal superior à requerida para a homeostase normal e superior à dos tecidos normais da mesma origem.

Definições São apresentadas várias definições ao longo do presente documento. A maioria das palavras tem o significado que lhes seria atribuído por alguém especializado nesta área. As palavras que apresentam uma definição específica na parte interior da página ou noutra localização no presente documento têm o significado fornecido no contexto da presente invenção como um todo e o significado típico dos especialistas nesta área. 0 termo "região" utilizado no presente documento significa uma porção fisicamente contígua à estrutura primária de uma biomolécula. No caso de proteínas, uma região é definida por uma porção contígua à sequência de aminoácidos dessa proteína. 0 termo "domínio" utilizado no presente documento refere-se a uma parte estrutural de uma biomolécula que contribui para uma função da biomolécula conhecida ou que se suspeita que exista. Os domínios podem ser coextensivos com regiões ou porções desta; estes podem também incorporar uma porção de uma biomolécula que seja distinta numa região particular, adicionado a toda ou parte daquela região. Exemplos de domínios de proteína incluem, mas não se limitam ao domínio extracelular (variando desde o resíduo 31 ao resíduo 188 de Cripto, incluindo CR-1 (ID SEQ N° 1) e CR-3 (ID SEQ N° 2)) e ao domínio de transmembrana (variando 11 de cerca do resíduo 169 até ao resíduo 188 de Cripto, incluindo CR-1 e CR-3) . Um domínio de ligação de ligante/receptor da proteína de Cripto varia de cerca do resíduo 75 a cerca do resíduo 150 de Cripto, incluindo o CR-1 e o CR-3. Este domínio inclui o domínio tipo EGF, que varia, por exemplo, do resíduo 75 ao resíduo 112 de Cripto, incluindo CR-1 e CR-3, e o domínio rico em cisteína, que varia, por exemplo, do resíduo 114 até ao resíduo 150 de Cripto, incluindo o CR-1 e o CR-3. Muitos anticorpos monoclonais da presente invenção foram identificados como ligados aos domínios tipo EGF ou rico em cys. Além disso, os anticorpos monoclonais A10B2.18 (ACCESSÃO ATCC n° PTA-3311), B3F6.17 (ACCESSÃO ATCC n° PTA-3319) e A17A2.16 têm sido identificados como estando ligados a um epítopo formado num domínio na região abrangendo os resíduos de aminoácido 46-62 de Cripto a montante do domínio tipo EGF. Veja o Exemplo 3 abaixo.

Um epítopo ao qual um anticorpo da anti-Cripto da invenção se liga pode estar presente na proteína nativa de Cripto conformacional ou na proteína de Cripto desnaturada. Além disso, um epítopo pode ser formado por sequências não contíguas no polipeptídeo de Cripto.

De acordo com as definições do presente documento, um anticorpo desta invenção pode, por exemplo, ser um anticorpo murino, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano ou um anticorpo quimérico. Este pode ser um anticorpo inteiro (isto é, com duas cadeias leves completas e duas cadeias pesadas completas) de quaisquer isótopos e subtipos (por exemplo, IgM, IgD, IgGl, lgG2, lgG3, IgG4, igE, IgAl e lgA2; com cadeia leve de Kappa ou lambda). Em alternativa, o anticorpo desta invenção refere-se a um fragmento com ligação ao antígeno 12 (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv de cadeia única) de um anticorpo inteiro.

Qualquer um dos anticorpos da invenção pode, opcionalmente, ser conjugado com um quimioterapêutico, como se define abaixo.

De acordo com as definições do presente documento, "um anticorpo capaz de interiorizar Cripto" significa um anticorpo que penetra na célula ao mesmo tempo em que remove Cripto da superfície celular. Podem analisar-se os anticorpos de Cripto capazes de internalizar Cripto, por exemplo, empregando anticorpos monoclonais de Cripto marcados com fluorescência. Para determinar quais os anticorpos que podem ser internalizados nas células positivas de Cripto, pode-se testar quanto à captação do sinal fluorescente dos anticorpos marcados nas células examinando as células com a utilização de um microscópio fluorescente e/ou confocal. Os anticorpos internalizados serão visionados como sinais fluorescentes nas vesículas citoplásmicas e/ou celulares. Exemplos não limitativos de anticorpos de Cripto capazes de internalizar Cripto incluem A27F6.1, B3F6.17 e 1-1A4C.2.

De acordo com as definições do presente documento, o termo "composto" significa qualquer química ou molécula identificável, incluindo, mas não se limitando a um íon, átomo, molécula pequena, peptídeo, proteína, açúcar, nucleotídeo e ácido nucléico. Este composto poderá ser natural ou sintético.

De acordo com as definições do presente documento, os termos "modular" ou "modificar" significam um aumento ou decréscimo na quantidade, qualidade, ou efeito de uma determinada actividade ou proteína. 13

De acordo com as definições do presente documento, o termo "inibir" que significa uma diminuição na quantidade, qualidade ou efeito de uma determinada actividade ou proteína.

De acordo com as definições do presente documento, "actividade modulada de Cripto" significa um aumento ou decréscimo na quantidade, qualidade, ou efeito da actividade de Cripto. 0 aumento ou decréscimo na quantidade, qualidade, ou efeito da actividade de Cripto poderá corresponder por exemplo a, pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%. Aumentos superiores a 100% também são considerados, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 10, 20 ou mais vezes. A actividade pode ser medida através de ensaios conhecidos na técnica, tal como o ensaio de célula nula demonstrado no Exemplo 3. Em algumas modalidades, a interacção de proteína entre Cripto e outra proteína é inibida por meio de ligação aos anticorpos da invenção.

De acordo com as definições do presente documento, "bloquear a interacção entre Cripto e ALK 4" ou "modular a interacção entre Cripto e ALK4" significa um aumento ou decréscimo na interacção, isto é, da ligação, entre Cripto e ALK4. O aumento ou decréscimo na interacção pode corresponder pelo menos a, por exemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%.

Aumentos superiores a cerca de 100% também são considerados, por exemplo, de cerca de 3, 4, 5, 10, 20 ou mais vezes. A actividade pode ser medida através de ensaios conhecidos na técnica, tal como o ensaio de ligação demonstrado no Exemplo 8.

De acordo com as definições do presente documento, "bloquear a interacção entre Cripto e Activina 14 B" ou "modular a interacção entre Cripto e Activina B" significa um aumento ou decréscimo na interacção, isto é, na ligação entre Cripto e Activina B. 0 aumento ou decréscimo na interacção pode corresponder pelo menos a, por exemplo 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%. Aumentos superiores a cerca de 100% também são considerados, por exemplo, de cerca de 3, 4, 5, 10, 20 ou mais vezes. A actividade pode ser medida por ensaios conhecidos na técnica, tal como o ensaio de ligação demonstrado no Exemplo 11.

De acordo com as definições do presente documento, "crescimento modulado de células tumorais in vitro" significa um aumento ou decréscimo no número de células tumorais in vitro. O aumento ou decréscimo no número de células tumorais pode corresponder pelo menos a, por exemplo 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%. Aumentos superiores a cerca de 100% também são considerados, por exemplo, de cerca de 3, 4, 5, 10, 20 ou mais vezes. A modulação in vitro do crescimento de célula tumoral pode ser medida através de ensaios conhecidos na técnica, tal como o ensaio ágar macio de célula GEO demonstrado no Exemplo 4.

De acordo com as definições do presente documento, "crescimento modulado de células tumorais in vivo" significa um decréscimo no número, angiogénese, e/ou metástase de células tumorais in vivo. O decréscimo no número de células tumorais pode corresponder, pelo menos, a, por exemplo 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100%. A modulação in vivo do crescimento de células tumorais pode ser medida através de ensaios conhecidos na técnica, tal como o demonstrado no Exemplo 5. 15

De acordo com as definições do presente documento o termo "efeito terapêutico" refere-se à inibição de uma condição anormal. Um efeito terapêutico alivia até um determinado ponto um ou mais sintomas da condição anormal. No que se refere ao tratamento de condições anormais, um efeito terapêutico pode referir-se a um ou mais dos seguintes: (a) um aumento ou decréscimo na proliferação, crescimento, e/ou diferenciação de células; (b) inibição (isto é, reduzir ou paralisar) ou promoção (isto é, aumentar ou iniciar) da morte celular; (c) inibição de degeneração; (d) alivio até determinado ponto de um ou mais sintomas associados com a condição anormal; e (e) realce da função de uma população de células. Podem identificar-se compostos que demonstram eficácia contra condições anormais de acordo com a descrição do presente documento.

De acordo com as definições do presente documento, o termo "administrar" refere-se a um método de incorporar um composto nas células ou tecidos de um organismo. A condição anormal pode ser prevenida ou tratada quando as células ou tecidos do organismo existem no interior do organismo (in vivo) ou fora do organismo (ex vivo) . As células existentes fora do organismo podem ser mantidas ou desenvolvidas em placas de cultura de célula, ou noutro organismo. Para células alojadas dentro do organismo, existem muitas ao dispor dos especialistas para administrar compostos, incluindo (mas não se limitando a) aplicações orais, parenterais, dérmicas, injecções, e aerossóis. Para as células existentes fora do organismo, existem múltiplas técnicas para administrar os compostos, incluindo (mas não se limitando a) técnicas de microinjecção de célula, técnicas de transformação e 16 técnicas transportadoras. A administração pode ser realizada por muitos modos conhecidos na técnica, por exemplo, por oral, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, e outros. Quando utilizados na terapia in vivo, os anticorpos da invenção são administrados a um paciente em quantidades eficazes. De acordo com as definições do presente documento, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para obter os resultados benéficos ou clínicos desejados (isto é, quantidades que eliminam ou reduzem o volume do tumor do paciente). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. No âmbito da aplicação da presente invenção, uma quantidade eficaz dos anticorpos da presente invenção refere-se a uma quantidade de anticorpos suficiente para melhorar, estabilizar, prevenir ou retardar o desenvolvimento do estado de doença associado com Cripto ou Activina-B, particularmente tumores associados com Cripto ou activina-B.

Um exemplo de um tratamento típico inclui a administração por infusão intravenosa de anticorpos da invenção semanalmente de uma dose de cerca de 2 a 5 mg/kg. Os anticorpos são administrados numa unidade de quimioinfusão em ambulatório, a menos que o paciente necessite de hospitalização. Incluem-se também outras formas de administração conhecidas na técnica. A condição anormal pode também ser prevenida ou tratada administrando um anticorpo da invenção a um grupo de células com uma anomalia numa via de transdução de sinal para um organismo. 0 efeito de administrar um composto numa função do organismo pode ser então monitorizado. 0 organismo deverá ser humano, de 17 preferência.

De acordo com as definições do presente documento, "Expressão aumentada de Cripto" significa a expressão de Cripto por um tecido ou célula cuja expressão é mais elevada (por exemplo, em pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, ou mesmo em pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5 ou 10 vezes) do que a expressão de Cripto de tecido ou células normais que seja significativo em termos estatísticos.

De acordo com as definições do presente documento "quimioterapêuticos" refere-se a quaisquer agentes identificados na técnica como tendo efeito terapêutico sobre a inibição de crescimento do tumor, manutenção de crescimento inibido de tumor, e/ou a indução de remissão, tal como compostos naturais, compostos sintéticos, proteínas, proteínas modificadas, e compostos radioactivos. Os agentes quimioterapêuticos contemplados também incluem agentes que podem ser conjugados com os anticorpos da presente invenção ou, em alternativa, a agentes que podem ser utilizados em combinação com os anticorpos da presente invenção sem serem conjugados com o anticorpo. Os exemplos de quimioterapêuticos que podem ser conjugados com os anticorpos da presente invenção incluem, mas não estão limitados, aos radioconjugados (90Y, 131I, "mTc, inIn, 186Rh, e outros), prodrogas activadas por tumor (maitansinoides, análogos de CC-1065, derivados de cliqueamicina, antraciclinas, alcaloides vinca, e outros), ricina, toxina de difteria, exotoxina de pseudomonas.

Os agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados em combinação com os anticorpos da invenção, 18 em vez de sere conjugados entre si (isto é, quimioterapêuticos não conjugados), e incluem, mas sem estarem limitados aos seguintes: platina (isto é, platina cis), antraciclinas, análogos de nucleosideo (purina e pirimidina), taxanos, camptotecinas, epipodofilotoxinas, agentes de alquilação de ADN, antagonistas de folato, alcaloides vinca, inibidores de redutase de ribonucleotideo, inibidores de estrogénio, inibidores de progesterona, inibidores de androgénio, inibidores de aromatase, interferons, interleucinas, anticorpos monoclonais, taxol, camptosar, adriamicina (dox), 5-FU e gencitabina. Tais quimioterapêuticos podem ser empregues na prática da invenção em combinação com os anticorpos da invenção por co-administração do anticorpo e o quimioterapêutico não conjugado.

De acordo com as definições do presente documento um "portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável" refere-se a compostos biologicamente inertes conhecidos na técnica e empregues na administração dos anticorpos da invenção. Os portadores aceitáveis são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Reminqton's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 1990. Os portadores aceitáveis podem incluir sais biocompativeis, inertes ou bioabsorviveis, agentes de tamponamento, oligo- ou polissacarideos, polímeros, composto viscoelástico tal como ácido hialurónico, agentes de melhora da viscosidade, conservantes, e outros.

Anticorpos da Invenção

Os anticorpos da invenção ligam-se especificamente à Cripto: De acordo com as definições do presente documento, Cripto inclui a proteína Cripto CR-1, 19 a proteína Cripto CR-3, e fragmentos das mesmas. Tais fragmentos podem ser domínios inteiros, tais como domínios extracelulares ou intracelulares, o domínio tipo EGF, o domínio rico em cys, o domínio de ligação do receptor, e outros. Tais fragmentos podem também incluir epítopos contíguos e não contíguos em qualquer domínio da proteína de Cripto. Exemplos de antígenos usados para alcançar anticorpos específicos para Cripto incluem, mas não são limitados a CR40 (ID SEQ NO: 3), CR41 (ID SEQ NO: 4), CR43 (ID SEQ NO: 5), CR44 (ID SEQ NO: 6), CR49 (ID SEQ NO: 7), CR50 (ID SEQ NO: 8) e CR51 (ID SEQ NO: 9), a sequência de aminoácidos que se demonstra no Exemplo 2. A sequência de 188 aminoácidos para CR-1 é a seguinte [ID SEQ N° 1]:

X WFQSEPA Ϊ rOHSKELNRTCCDNOOTCMLÍsSf CACPRS A sequência de 188 aminoácidos para CR-3 é a seguinte [ID SEQ N° 2] : GLyMDEHbVASRTFSLPFSMTTTFMI^lCl.S IQSY*

Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção ligam-se a um epítopo no domínio tipo EGF de Cripto. 0 domínio tipo EGF vai do resíduo de aminoácido 75 ao resíduo de aminoácido 112 da proteína madura de Cripto. Os epítopos no domínio tipo EGF podem compreender espaços lineares ou não lineares de resíduos de aminoácido. Exemplos de epítopos lineares contemplados incluem, mas sem estarem limitados a estes, resíduos de cerca de 75-85, 80-90, 85-95, 90-100, 95-105, 100-110 ou 105-112. Em algumas modalidades, o epítopo no domínio de 20 EGF é um epítopo formado na proteína nativa de Cripto conformacional versus uma proteína desnaturada de Cripto.

Noutras modalidades, os anticorpos da invenção ligam-se a um epítopo no domínio de Cripto rico em cys. 0 domínio rico em cys varia de cerca do resíduo de aminoácido 114 ao resíduo de aminoácido 150 da proteína madura de Cripto. Os epítopos no domínio rico em cys podem compreender vazios lineares ou não lineares de resíduos de aminoácido. Exemplos de epítopos lineares contemplados incluem, mas não se limitam ao resíduos de cerca de 114-125, 120-130, 125-135, 130-140, 135-145 ou 140-150. Em certas modalidades, o epítopo no domínio rico em cys é um epítopo formado na proteína nativa de Cripto conformacional versus uma proteína desnaturada de Cripto

Assim que os anticorpos são gerados, a ligação dos anticorpos a Cripto pode ser testada empregando-se técnicas padrão conhecidas na técnica, tal como ELISA, enquanto que a presença de Cripto sobre uma superfície celular pode ser testada utilizando citometria de fluxo (FACS), como demonstra o Exemplo 2. Poderá utilizar-se, em alternativa, qualquer outra técnica para medir tal ligação. A presente invenção fornece anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, anticorpos de cadeia simples, anticorpos quiméricos, anticorpos bifuncionais/biespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, e anticorpos enxertados por (CDR) de região de determinação complementar, incluindo compostos que incluem sequências de CDR que reconhecem especificamente um polipeptídeo da invenção) específicos 21 para Cripto ou para os seus fragmentos. Os termos "específico" e "selectivo", quando empregues para descrever a ligação dos anticorpos da invenção, indicam que as regiões variáveis dos anticorpos da invenção reconhecem e ligam polipeptídeos de Cripto. Entende-se assim que anticorpos específicos da invenção podem também interagir com outras proteínas (por exemplo, a proteína A de S. aureus ou outros anticorpos em técnicas ELISA) através de interacções com sequências fora da região variável dos anticorpos, e, em particular, na região constante da molécula.

Ensaios de avaliação para determinar a especificidade de ligação de um anticorpo da invenção (isto é, anticorpos que ligam especificamente a um epítopo o domínio de ligação de ligante/receptor ou o domínio abrangendo os resíduos de aminoácido 46-62) são bem conhecidos e utilizados normalmente na técnica. Para uma abordagem abrangente destes ensaios, ver Harlow e outro (Eds.), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6. Os anticorpos que reconhecem e ligam fragmentos de proteína de Cripto também são incluídos, contanto que os anticorpos sejam específicos para polipeptídeos de Cripto. Os anticorpos da invenção podem ser produzidos utilizando qualquer método conhecido e normalmente empregue na técnica.

Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo no domínio de Cripto de ligação de ligante/receptor. A especificidade do anticorpo é descrita detalhadamente abaixo. No entanto, deve ser salientado que anticorpos que podem ser gerados a partir de outros polipeptídeos 22 que foram previamente descritos na literatura e que são capazes de reagir de forma fortuita com Cripto (por exemplo, devido a uma existência fortuita de um epitopo similar em ambos os polipeptideos) são considerados anticorpos "reactivos". Estes anticorpos reactivos não são anticorpos "específicos" para Cripto. A determinação do facto de um anticorpo em particular se ligae a um epitopo de Cripto obtém-se através da utilização de qualquer um dos diversos ensaios, tal como ensaios de Western-blot, que são bem conhecidos na técnica. Para identificar células que expressam Cripto e também para modular a actividade de ligação de ligante/receptor de Cripto, os anticorpos que se ligam especificamente a um epitopo extracelular da proteína de Cripto (isto é, porções da proteína de Cripto encontradas fora da célula) são particularmente úteis. A invenção fornece também uma composição livre de célula, compreendendo anticorpos policlonais, onde pelo menos um dos anticorpos é um anticorpo da invenção. Um exemplo de tal composição são anti-soros isolados de um animal, que compreendem uma fracção de anticorpo de um anti-soro que foi ressuspenso em água ou noutro diluente, excipiente ou transportador.

Noutras modalidades, a invenção fornece anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direccionados contra um sítio antigénico simples. Além disso, ao contrário das preparações policlonais que incluem de forma geral anticorpos diferentes direccionados contra diferentes epítopos, cada anticorpo monoclonal é direccionado contra um determinante simples sobre o antígeno. Os anticorpos monoclonais são úteis para melhorar a selectividade e 23 especificidade de métodos de ensaio, diagnóstico e analítico utilizando ligações de antígeno-anticorpo. Outra vantagem dos anticorpos monoclonais é que estes são sintetizados por uma cultura de hibridoma, não contaminada por outras imunoglobulinas. Consideram-se as células recombinantes e os hibridomas que produzem estes anticorpos também como aspectos da invenção. Ver as discussões abaixo

Noutras modalidades relacionadas, a invenção fornece um anticorpo antiidiotípico específico para um anticorpo específico para Cripto. Para uma discussão mais detalhada de anticorpos antiidiotípicos, consulte por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos nos 6.063.379 e 5.780.029.

Sabe-se que os anticorpos contêm domínios de ligação de antígeno relativamente pequenos que podem ser isolados quimicamente ou através de técnicas recombinantes. Tais domínios são, em si mesmo, moléculas de ligação a Cripto úteis, que também podem ser reintroduzidos em anticorpos humanos, ou fundidos num quimioterapêutico ou polipeptídeo. Consequentemente, noutra modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo compreendendo um fragmento de um anticorpo específico de Cripto, onde o fragmento e molécula associada, no caso de esta existir, liga-se ao Cripto. A título de exemplo, embora não se limitando a ele, a invenção fornece polipeptídeos que são anticorpos de cadeia simples e anticorpos enxertados de CDR. Para uma discussão mais detalhada de anticorpos enxertados de CDR, veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 5.859.205.

Noutras modalidades, anticorpos não humanos podem ser humanizados através de qualquer um dos métodos 24 conhecidos na técnica. Anticorpos humanizados são úteis para aplicações terapêuticas in vivo. Além disso, anticorpos "humanizados" recombinantes podem ser sintetizados. Anticorpos humanizados são anticorpos inicialmente derivados de um mamífero não humano, no qual foi utilizada a tecnologia do ADN recombinante para substituir parte ou a totalidade dos aminoácidos não necessários para a ligação de antígeno por aminoácidos de regiões correspondentes de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina humana. Ou seja, são quimeras compreendendo sobretudo sequências de imunoglobulina humana onde as regiões responsáveis pela ligação de antígeno específico foram substituídas.

Podem produzir-se várias formas de anticorpos utilizando técnicas padrão de ADN recombinante (Winter a Milsteinm 1991, Nature 349:293-99). Por exemplo, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser gerados por uma tecnologia hibridona bem conhecida. Por exemplo, animais (por exemplo, ratazanas, ratos ou coelhos) são imunizados com preparações brutas ou purificadas de Cripto, as células podem ser transfectadas com construções de cADN codificando Cripto, células que construtivamente expressam Cripto, e similares. Além disso, o antígeno pode ser distribuído como proteína purificada, proteína expressa em células , fragmentos de proteínas ou peptídeos do mesmo, ou como ADN nu ou vectores virais codificando a proteína, fragmentos de proteína, ou peptídeos. 0 soro de animais imunizados é então testado para a presença de anticorpos anti-Cripto. As células B são isoladas de animais com teste positivo, e os hibridomas são feitos com essas células B.

Os anticorpos secretados por hibridomas são 25 testados quanto à sua capacidade de se ligarem especificamente ao Cripto (isto é, ligar-se a células transfectadas de Cripto e a células mãe não transfectadas) e quanto a qualquer outra caracteristica desejada, por exemplo, possuindo as sequências CDR de consenso desejadas , inibindo (ou não no caso de não-bloqueadores) a ligação entre Cripto e ALK4 ou entre Cripto e Activina B.

As células hibridomas com resultados positivos nos ensaios de testes são cultivadas num meio nutriente em condições que permitem ás células secretar anticorpos monoclonais no meio de cultura. A cultura de hibridoma condicionada sobrenadante é então recolhida e os anticorpos contidos na fração sobrenadante são purificados. Em alternativa, o anticorpo desejado pode ser produzido injectando as células de hibridomas na cavidade peritoneal do animal imunizado (por exemplo, um rato). As células hibridomas proliferam na cavidade peritoneal secretando o anticorpo que se acumula como fluido ascitico. 0 anticorpo pode então ser coletado retirando o fluido ascitico da cavidade peritoneal com uma seringa.

Os anticorpos monoclonais também podem ser gerados isolando os ADNs codificadores de anticorpos dos hibridomas desejados, transfectando células do hospedeiro mamifero (por exemplo, células CHO ou NSO) com os ADNs, cultivando as células hospedeiras transfectadas e recuperando o anticorpo do meio de cultura.

Os anticorpos monoclonais desta invenção também podem ser gerados produzindo um anticorpo hibridoma cognato (por exemplo, murideo, ratazana ou coelho). Por exemplo, um anticorpo cognato pode ser alterado através 26 de uma tecnologia recombinante de ADN para que parte ou a totalidade da articulação e/ou regiões constantes de cadeias leves e/ou pesadas sejam substituídas pelos componentes correspondentes de um anticorpo de outra espécie (por exemplo, humana). Em termos gerais, os domínios variáveis do anticorpo produzido permanecem idênticos ou substancialmente iguais aos domínios variáveis do anticorpo cognato. Tal anticorpo produzido é denominado de anticorpo quimérico e é menos antigénico do que o anticorpo cognato quando administrado num indivíduo da espécie da qual deriva a articulação e/ou região constantea (por exemplo, humana). Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são bem conhecidos na técnica. As regiões constantes humanas incluem as derivadas de IgGl e IgG4.

Os anticorpos monoclonais desta invenção também incluem anticorpos completamente humanos, que podem ser preparados usando esplenócitos humanos preparados in vitro, como descrito por Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95, ou utilizando bibliotecas de anticorpos apresentadas em fagos, como se descreve, por exemplo, na Patente US n° 6.300,064.

Em alternativa, anticorpos completamente humanos podem ser preparados por clonagem conforme se descreve em Parson et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2432-36, e Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141:227-36. Além disso, a Patente US n° 5.798,230 descreve a preparação de anticorpos monoclonais humanos a partir de células B humanas, onde as células B produtoras de anticorpos humanos são imortalizadas através de infecção com um virus Epstein-Barr, ou um seu derivado, que expressa o antígeno nuclear 2 do vírus 27

Epstein Barr (EBNA2), uma proteína necessária para imortalização. A função do EBNA2 é subsequentemente interrompida, resultando no aumento da produção de anticorpos.

Outros métodos para a produção de anticorpos completamente humanos envolvem o uso de animais não-humanos que possuem Ig loci endógeno inactivados e são transgénicos para genes de cadeias leves e pesadas de anticorpos humanos não-reagrupadas. Tais animais transgénicos podem ser imunizados com Cripto e hibridomas feitos a partir de células B derivadas. Estes métodos encontram-se descritos, por exemplo, nas várias publicações/patentes da GenPharm/Medarex (Paio Alto, CA) referentes a ratos trangénicos contendo miniloci Ig humana (por exemplo, Patente US 5.789.650), nas várias publicações/patentes da Abgenix (Fremont, CA) relativas ao XENOMICE™ (por exemplo, a Patente US 6.075.181, 6.150.584, e 6.162.963; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; e Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-56); e as várias publicações/patentes da Kirin (Japão) referentes ao rato "transómico" (por exemplo, EP 843 961, e Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16:1433-43). Veja também, por exemplo, a Patente US 5.569.825, WO00076310, WO00058499 e WO00037504.

Os anticorpos monoclonais desta invenção também incluem versões humanizadas de anticorpos cognatos anti-cripto derivados de outras espécies. O anticorpo humanizado é um anticorpo produzido por uma tecnologia de ADN recombinante, na qual alguns ou todos os aminoácidos das cadeias leves ou pesadas de imunoglobulina humana não são necessárias para a ligação de antígenos (por exemplo, as regiões constantes e as regiões de estrutura dos 28 domínios variáveis) são usados para substituir os correspondentes aminoácidos para a cadeia leve ou pesada do anticorpo cognato não-humano. Por exemplo, uma versão humanizada do anticorpo murino para um certo antígeno possui em ambas as suas cadeias pesadas e leves (1) regiões constantes de anticorpos humanos; (2) regiões de estrutura de domínios variáveis de um anticorpo humano e (3) CDRs do anticorpo murino. Quando necessário, um ou mais resíduos nas regiões de estrutura humanas podem ser alteradas para resíduos nas posições correspondentes no anticorpo murino de forma a preservar a afinidade de ligação do anticorpo humanizado com o antígeno. Esta alteração é por vezes denominada de "mutação reversa". Os anticorpos humanizados são geralmente menos propícios a elicitar uma resposta imune em humanos comparativamente com anticorpos quiméricos humanos, porque os anteriores contêm consideravelmente menos componentes não-humanos.

Os métodos para a produção de anticorpos humanizados estão descritos em, por exemplo, Winter EP 239 400; Jones et al. 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann et al. 1988, Nature 332:1534-36, Queen et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-33; Patente US n° 6.180,370; e Orlandi et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3833-37. Veja também, por exemplo, Aplicação de Patente PCT 94/04679. Os anticorpos primatizados podem ser produzidos de forma similar através da utilização de genes de anticorpo de primata (por exemplo, reso, babuíno, chimpanzé). Outras alterações podem ser então introduzidas na estrutura de anticorpo para modular a afinidade ou a imunogenicidade. Ver, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos nos 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.180.370. 29

Em termos gerais, a transplantação de CDRs murinos (ou outros não-humanos) num anticorpo humano é obtida da seguinte forma: os cDNAs codificando domínios variáveis de cadeias leves e pesadas são isolados a partir de um hibridoma. As sequências de ADN dos domínios variáveis, incluindo os CDRs, são determinados através de sequenciamento. Os ADNs codificando os CDRs são transferidos para as regiões correspondentes de sequências de codificação de domínios variáveis de uma cadeia leve ou pesada de anticorpos humanos por mutagenese direcionada ao local. Então são adicionados os segmentos de genes humanos de regiões constantes de um isótipo desejado (por exemplo, yl para CH e k para CL) . Os genes humanizados de cadeias leves e pesadas são co-expressos em células hospedeiras de mamíferos (por exemplo, células de CHO ou NSO) para produzir anticorpos humanizados solúveis. Para facilitar a produção em grande escala, costuma ser preferível produzir tais anticorpos humanizados em bio-reactores contendo as células que expressam os anticorpos, ou produzir mamíferos transgênicos ( por exemplo, cabras, vacas ou ovelhas) que expressam o anticorpo no leite (consulte, por exemplo, a Patente US 5.827,690).

Por vezes, as transferências directas de CDRs para uma estrutura humana leva a uma perda de afinidade de ligação do antígeno do anticorpo resultante. Isto acontece porque em alguns anticorpos cognatos, certos aminoácidos no interior de certas regiões de estruturas interagem com os CDRs, influenciando portanto a afinidade geral de ligação do antígeno do anticorpo. Em tais casos as "mutações reversas" (supra) deverão ser introduzidas nas regiões de estrutura do anticorpo receptor para reter 30 a actividade de ligação ao antígeno do anticorpo cognato. A abordagem geral da realização de mutações reversas é conhecida na técnica. Por exemplo, Queen et ai. 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 100029-33, Co et ai. 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869-73, e WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) descrevem uma abordagem que envolve duas etapas fundamentais. Primeiro as regiões de estruturas humanas V são escolhidas através de análise computorizada para uma homologia de sequência de proteína ideal para a região de estrutura V do anticorpo murino cognato. Então, a estrutura terciária da região V do murino é modelada por computador para visualizar os resíduos de aminoácido da estrutura que têm probabilidade de interagir com os CDRs murinos, e estes resíduos aminoácido murinos são então sobrepostos na estrutura humana homóloga.

Nesta abordagem de duas etapas, existem vários critérios para o desenvolvimento de anticorpos humanizados. O primeiro critério é utilizar como receptor humano a estrutura de uma imunoglobulina humana determinada que é normalmente homóloga à imunoglobulina doadora não-humana, ou utilizar um consenso entre vários anticorpos humanos. O segundo critério é o de utilizar o aminoácido doador em vez do receptor se o resíduo do receptor humano for incomum e o resíduo do doador for típico para sequências humanas num resíduo especifico de uma estrutura. O terceiro critério é o de utilizar o resíduo aminoácido da estrutura doadora em vez do receptor em posições imediatamente adjacentes aos CDRs.

Pode utilizar-se também uma abordagem diferente conforme se descreve em, por exemplo, Tempest 1991, 31

Biotechnology 9:266-71. Nesta abordagem, as estruturas da região V derivadas de cadeias leves e pesadas de NEWM e REI, respectivamente, são usadas para a enxerto de CDR sem uma introdução radical de resíduos de rato. Uma vantagem da utilização desta abordagem é que as estruturas tridimensionais de regiões variáveis de NEWM e REI são reconhecidas através de cristalografia de raio-X, e portanto as interacções específicas interações entre os CDRs e resíduos das estruturas da região V podem ser rapidamente modeladas. 0 anticorpo humanizado desta invenção pode conter uma mutação (por exemplo, remoção, substituição ou adição) numa ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8) de determinadas posições na cadeia pesada que provoque a alteração da função efectora do anticorpo (por exemplo, a capacidade do anticorpo de se ligar a um receptor Fc ou um factor complementar) sem afectar a capacidade do anticorpo de se ligar ao Cripto (Patente US 5.648,260). Estas posições de cadeias pesadas incluem, sem limitação, os resíduos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 (sistema de numeração da UE) . O anticorpo humanizado pode, por exemplo, conter certas mutações L234A (por exemplo, substituindo a leucina na posição 234 de um anticorpo não modificado por uma alanina) e L235A (sistema de numeração da UE) na sua cadeia pesada.

Além disso, o anticorpo humanizado desta invenção pode conter uma mutação (por exemplo, remoção ou substituição) num resíduo de aminoácido que é um local para a glicosilação, que leve à eliminação do local para glicosilação é eliminado. Esse anticorpo pode ser benéfico m termos clínicos por possuir funções efectoras reduzidas ou outras funções indesejadas enquanto mantém a 32 sua afinidade de ligação com o Cripto. As mutações de locais de glicosilação também podem ter benefícios para os processos de desenvolvimento (por exemplo, expressão e purificação de proteína). Por exemplo, a cadeia pesada do anticorpo pode conter a mutação N297Q (sistema de numeração da EU) de forma a que a cadeia pesada já não possa ser glicosilada neste local.

Noutras modalidades, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo da invenção contêm mutações que aumentam a afinidade de ligação ao Cripto, aumentando assim a capacidade de tratar distúrbios mediados por Cripto.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem incluir ainda outros grupos funcionais para efectuar ou aumentar uma função desejada. Por exemplo, os anticorpos podem incluir um grupo funcional de toxinas (por exemplo, toxóide tetânico ou ricina) ou um radionuclídeo (por exemplo, mIn ou 90Y) para matar células-alvo através dos anticorpos (ver, por exemplo, a Patente US 6.307.026). Os anticorpos podem incluir um grupo funcional (por exemplo, biotina, grupos funcionais fluorescentes, moléculas radioactivas, identificador de histidina ou outros identificadores de peptídeo) para um isolamento ou detecção mais fácil. Os anticorpos também podem incluir um grupo funcional que pode prolongar a meia-vida de soro, por exemplo, uma molécula de polietileno glicol (PEG), e um membro da família de super imunoglobulina ou fragmento da mesma (por exemplo, uma porção da região constante de cadeia pesada de IgGl humana como as regiões CH2 e CH3; de articulação) .

Os fragmentos de anticorpos e anticorpos univalentes também podem ser usados nos métodos e 33 composições da presente invenção. Os anticorpos univalentes compreendem um dimero de cadeia pesada / leve ligado à região Fc (ou de derivação) de uma segunda cadeia pesada. A "região Fab" refere-se às porções das cadeias que são praticamente equivalentes, ou análogas às sequências que compreendem as porções de ramificação Y da cadeia pesada e cadeia leve na sua totalidade, e que colectivamente (em agregados) demonstraram actividade de anticorpos. Uma proteína de Fab inclui agregados de uma cadeia pesada e leve (vulgarmente conhecidos como Fab'), bem como tetrâmeros que correspondem aos dois segmentos da ramificação do anticorpo Y (vulgarmente conhecido como F (ab)2) quer qualquer uma das acima referidas sejam covalentemente ou não-covalentemente agregadas, conquanto que a agregação seja capaz de reagir especificamente com um antígeno particular ou uma família de antígeno. III. Modulação de Sinal

Os anticorpos da invenção podem inibir a actividade Cripto e / ou as interacções Cripto com os seus ligantes. A expressão aumentada da actividade Cripto pode levar a um estado desdiferenciado, promovendo as características de células mesquinhais, o aumento da proliferação e migração celular (Salomon et al., 1999, BioEssays 21: 61-70; Ciardiello et al., 1994, Oncoqene 9: 291-98; e Baldassarre et al., 1996, Int. J. Câncer 66: 538-43), fenótipos associados à transformação celular observados em neoplasia.

Um método para testar a actividade de anticorpos anti-Cripto e a sua capacidade de inibir a actividade Cripto é através da utilização de uma linha celular de Knock-out (KO) de F9-Cripto (Minchiotti at al, 2000, Mech. Dev. 90:133 -42). O cripto estimula a fosforilação 34 smad2 e o factor de transcrição FAST em embriões de Xenopus, e a actividade do factor de transcrição FAST pode ser controlada através da medição da actividade da enzima a partir de um gene repórter luciferase elemento regulador FAST (Saijoh et al. 2000, Mol. Cell 5 : 35-47). As células F9-Cripto KO apresentam mutações nulas no gene Cripto e não podem transduzir sinalização Cripto-dependente (Minchiotti et al. supra). A actividade de Cripto pode ser avaliada nas células F9-Cripto KO por transfecção das mesmas com Cripto, FAST, e os construtos de gene da luciferase - elemento de regulação de FAST. Nenhuma actividade luciferase Cripto-dependente FAST será vista nestas linhas celulares a menos que o Cripto do cDNA e o FAST cDNA sejam transfectados para eles. Os anticorpos capazes de bloquear a sinalização nodal dependente de cripto são os anticorpos que bloqueiam a actividade de Cripto.

Outros ensaios capazes de medir a actividade de Cripto podem ser utilizados pelos técnicos, tal como um crescimento no ensaio ágar suave (ver Exemplo 4) . A capacidade das células crescerem em ágar suave é associada à transformação das células e o ensaio é um ensaio in vitro clássico que mede a inibição do crescimento de células tumorais. Outros ensaios úteis para determinar a inibição da actividade incluem ensaios in vitro em plástico, e semelhantes.

Em certas modalidades, os anticorpos da invenção ligam-se ao Cripto e inibem as interacções de Cripto-Activina B. Verificámos que o Cripto pode ligar-se à Activina B e inibir a via de sinalização da Activina B. A Activina B pode inibir a proliferação de células tumorais (Risbridger et al., 2001, Endocr Rev. 22:836-58). A 35 ligação de Cripto com a Activina B também pode perturbar a inibição da proliferação induzida pela Activina B.

Um método para testar a actividade dos anticorpos anti-Cripto e a sua capacidade de inibir as interacções de Cripto-Activina B é através da medição da capacidade do anticorpo de evitar interrupções mediadas pelo Cripto da inibição de proliferação induzida pela Activina B. Este método encontra-se descrito no Exemplo 9. 0 Exemplo 11 descreve um método para testar directamente a capacidade de anticorpos anti-Cripto de inibir interacções de Cripto-Activina B.

Utilizações Terapêuticas

Os anticorpos da invenção são também úteis em termos terapêuticos, tais como na inibição de desenvolvimento da célula tumoral, para fins de diagnóstico para detectar ou quantificar Cripto, e para purificar Cripto.

Em algumas modalidades da invenção, são fornecidos os anticorpos que são capazes de se ligarem especificamente a Cripto e que inibem o crescimento de células tumorais num paciente, especialmente quando o crescimento do tumor é mediado pela perda ou decréscimo da sinalização de Activina B. Em certas modalidades, as células tumorais são células tumorais do cérebro, da cabeça, do pescoço ou da próstata.

Noutras modalidades, são fornecidos anticorpos que são capazes de se ligarem especificamente a Cripto e que inibem o crescimento de células tumorais que superexpressam Cripto. Noutra modalidade, as células tumorais são linhas de células que têm uma expressão aumentada de Cripto, tais como linhas de células derivadas de cancro do cérebro. 36

Os anticorpos anti-Cripto podem ser analisados quanto à actividade in vivo como agentes anticancerigenos potenciais seguindo protocolos padronizados utilizados pelos técnicos, conforme se ilustra no Exemplo 4 abaixo. Exemplos de tais protocolos são delineados pelo National Câncer Institute (NCI) nos seus protocolos de "análise de modelos de cancro in vivo", publicação NIH n° 84-2635 (Fev. 1984) .

Noutras modalidades da invenção, os anticorpos da invenção são utilizados para tratar um paciente que apresenta um tumor canceroso.

Os anticorpos da presente invenção podem ser combinados com um excipiente farmaceuticamente aceitável e administrados numa dose terapeuticamente eficaz ao paciente. Para uma abordagem de métodos de inibição do crescimento de tumores, veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 6.165.464.

Também se incluem métodos de tratamento de um mamífero que sofra de um distúrbio associado a níveis elevados de Cripto ou níveis reduzidos de Activina B, onde o método compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo no domínio de ligação de ligante/receptor de Cripto, incluindo, mas não se limitando a onde o epítopo está num domínio tipo EGF ou num domínio rico em cys de Cripto.

Também se incluem as utilizações no tratamento de um mamífero que sofre de um distúrbio associado a níveis elevados de Cripto onde a utilização compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo que forma especificamente um complexo com Cripto e é direcionado ao epítopo ao qual é dirigido um anticorpo seleccionado do 37 grupo consistido por A8G3.5 (Acesso ATCC n°. PTA-3317). 0 diagnóstico por meio de detecção de Cripto é facilmente realizado através de ensaios de ligação padrão utilizando os novos anticorpos da invenção, permitindo que os técnicos detectem a presença de Cripto especificamente numa grande variedade de amostras, culturas, e similares.

Também se incluem Kits compreendendo um anticorpo da invenção para qualquer um dos objectivos aqui descritos. Em termos gerais, um kit inclui também um antigeno de controlo para o qual o anticorpo é imunoespecifico. As modalidades incluem kits compreendendo todos os reagentes e instruções para a sua utilização.

V. EXEMPLOS

Caracteristicas adicionais da invenção serão evidentes a partir dos seguintes Exemplos. Deve compreender-se que os exemplos seguintes possuem apenas uma finalidade ilustrativa, e não devem ser considerados, de forma alguma, limitadores do âmbito desta invenção. Exemplo 1: Expressão e Purificação de Cripto

Um plasmideo de expressão designado pSGS480 foi construído por subclonagem de um cDNA codificando resíduos de aminoácidos de 1 a 169 de uma proteína de

Cripto humano (aminoácidos 1 - 169 de ID SEQ N° 1) , fundidos ao domínio Fc de IgGi humano (isto é, "CR(del C)-Fc") no vector pEAGUOO. Para uma descrição mais detalhada deste vector, ver o Pedido de Patente dos

Estados Unidos n° 60/233.148, depositado em 18 de Setembro de 2000. O vector pEAGUOO é um derivado do plasmideo pCMV-Sport-betagal da GIBCO-BRL Life Technologies, cuja utilização em transfecções 38 transitórias de CHO foi descrito por Schifferli e outro, 1999, Focus 21: 16. Foi realizado através da remoção do fragmento Notl de beta-galactosidase de gene repórter que provém do plasmideo pCMV-Sport-Betagal (catálogo n° 10586-014) da seguinte forma: o plasmideo foi digerido com Notl e EcoRV, o fragmento de cadeia principal de vector Notl de 4,38 kb foi purificado por gel e ligado. O ADN ligado foi transformado em competente E. coli DH5alfa. O pEAGUOO foi isolado como um plasmideo contendo o recombinante desejado de uma única colónia isolada. Confirmou-se a sequência de pEAGUOO abrangendo o promotor, o poliligador, e o sinal de terminação de transcrição. O plasmideo pSGS480 foi transitoriamente transfectado para as células CHO e as células foram desenvolvidas a 28°C durante 7 dias. A presença da proteína CR(del F)-Fc nestas células e dos veículos condicionados foi examinada por análise de Western blot. Para a análise de Western blot, os veículos condicionados e células de células transfectadas de Cripto foram submetidos a SDS-PAGE em 4 a 20% de géis gradientes em condições de redução, transferidas electroforeticamente para nitrocelulose, e a proteína de fusão de Cripto foi detectada com um anti-soro policlonal de coelho cultivado contra um peptídeo 17-mero de Cripto (compreendendo resíduos 97-113 de ID SEQ N° 1) - conjugado de hemocianina do keyhole limpet (KLH). Após a centrifugação para remoção das células, a análise de Western blot mostrou que a proteína CR(del C)-Fc foi eficientemente direccionada nos veículos condicionados (sobrenadante) . O sobrenadante foi aplicado a uma Proteína A-Sefarose® (Pharmacia). A proteína ligada foi eluída com 25 mM de 39 fosfato de sódio pH 2,8, NaCl 100 mM. A proteína eluída foi neutralizada com fosfato de sódio 0,5 M a pH 8.6, e analisada quanto ao total de proteína de medições de absorvência a 240-340 nm, e para purificação por SDS-PAGE. A proteína eluída foi filtrada através de um filtro de 0,2 mícron, e armazenada a -70°C.

Exemplo 2: Geração e Avaliação de Anticorpos A proteína CR(del C)-Fc eluída, bem como outros polipeptídeos de Cripto são injectados nos ratos, e são utilizadas técnicas padronizadas normalmente utilizadas pelos técnicos para gerar hibridomas e anticorpos monoclonais. A. Geração de Anticorpos

Os ratos Rotersonian fémeas (Jackson Labs) foram imunizados intraperitonealmente com 25 μς de CR del C-Fc humano purificados emulsificados com adjuvante completo de Freud ("FCA"; GibcoBRL # 15721-012). Foram estimulados duas vezes intraperitonealmente (IP) com 25 pg de CR del C-Fc emulsificado com adjuvante de Freud incompleto ("FIA"; Gibco BRL # 15720-014) e uma vez com esferas de Proteína A. Os soros foram analisados e, 3 semanas após o último reforço, o rato com a melhor evolução foi estimulado intraperitonealmente com 50 μρ de CR (del C)-Fc solúvel três dias antes da fusão. O rato foi estimulado intraperitonealmente (IV) com 50pg de CR (del C)-Fc um dia antes da fusão.

As células de baço de rato foram fundidas com uma célula de mieloma FL653 numa relação de 1 baço : 6 mielomas e foram transferidas para placas a 100.000, 33.000 e 11.000 células por cuba em placas de cultura de tecido com 96 cavidades. As cubas positivas para desenvolvimento foram analisadas pelo método FACS e ELISA 40 uma semana mais tarde. Foram realizadas duas fusões. B. Detecção de Anticorpos

Os sobrenadantes resultantes da primeira ou segunda fusão foram analisados primeiro sobre placas de ELISA para reconhecimento de proteínas de domínio tipo EGF de Cripto e/ou del C de Cripto. Uma proteína de fusão de controlo (LT-receptor beta-Fc) foi revestida sobre placas ELISA para descartar anticorpos monoclonais que reconheceram o epítopo Fc humano. 0 ELISA foi realizado como descrito abaixo na secção C. Na primeira fusão, as fases líquidas primárias foram também analisados quanto à sua capacidade para reconhecer a proteína de Cripto na linha de células NCCIT de tumor testicular. No caso da segunda fusão, a capacidade de sobrenadante para reconhecer Cripto sobre duas linhas de célula tumoral, NCCIT e a linha de cancro de mama, DU4475 foi analisada por FACs. As avaliações secundárias incluíram testar a capacidade de sobrenadante de anticorpo monoclonal para reconhecer Cripto de superfície celular sobre um grupo de linhas de célula tumoral (ver as Tabelas 1 e 2 para os resultados), capacidade de anticorpos monoclonais para reconhecer Cripto humano imunohistoquimicamente sobre secções de tecido tumoral de mama e cólon humanos, capacidade de anticorpos monoclonais bloquearem em ensaio de sinalização de Cripto-Nodal, capacidade de bloquear o desenvolvimento de linhas de célula tumoral sobre plástico ou em ensaios de ágar suave, e capacidade para interiorizar Cripto de superfície celular.

C. ELISA

Os ensaios ELISA foram realizados da seguinte forma:

Materiais: 41

Placas: placas de 96W de Fácil lavagem de ligação elevada Costar (07-200-642)

Anticorpo secundário: Pierce Gt anti- Ms IgG (H+L)- HRP (P131430).

Substracto: Pierce TMB Substrate Kit (34021)

Solução de Paragem: H2SO4 IN

Tampões:

Tampão de ligação: 0,1 M de NaHP04 pH 9.0

Tampão de bloqueio: PBS + 10% de Soro de Bezerro

Doador

Tampão de lavagem: PBS + 0,1% de Tween-20®.

Antigenos CR-del-C-Fc e CR-EGF-fc, proteina de fusão de IgGl hu de controlo foram diluídos em tampão de ligação para 500 ng/ml. 100 μΐ foram adicionados por cavidade e incubados durante 1 hora a 37°C ou durante a noite a 4°C. O líquido foi decantado e a placa foi invertida e manchada até secar. 250 μΐ/cavidade de tampão de bloqueio foram então adicionados, seguido por incubação durante 30 minutos a 37°C. Mais uma vez, o líquido foi decantado e a placa invertida e o líquido absorvido até secar. Na fase líquida foram diluídos 1:50 em tampão de água, e transferidas para placas a 50 μΐ/cuba, seguido por incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3X vigorosamente com 250 μΐ/cavidade de tampão de lavagem. De seguida, 100 μΐ/cavidade de anticorpo secundário diluídos em tampão de lavagem a 1:10.000 foram adicionados, seguido de incubação durante 30 minutos em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 3X vigorosamente com 250 μΐ/cavidade de tampão de lavagem, sendo então adicionado o substrato a 100 μΐ/cavidade. Deixou-se desenvolver a cor até ficar suficientemente 42 escura. De seguida 100 μΐ/cavidade de solução de paragem foram adicionados e as placas lidas quanto à absorvência a 450 nm.

Em certas experiências, revestimos 96 placas de cavidades com proteínas Cripto através da adição de 100 μΐ de proteínas Cripto a 0,5 yg/ml em NaHP04 0,1 M (pH 9,0) e incubação a 37°C por 1 hora. As placas foram bloqueadas com PBS/10% DCS. Os anticorpos diluídos foram adicionados em PSB/0,05% Tween® 20 em 50 μΐ/ poço e incubados a 37°C por 1 hora. Lavou-se com PSB/0,05% Tween® 20 e testou-se com HRP-camundongo (Pierce). Anticorpos ligados pela adição de TMB foram detectados, a reação com H2SO4 foi parada e lida a 450 nm.

Ainda noutras experiências, placas de 96 cavidades foram revestidas através da adição em cada cavidade de 100 μΐ de Activina B 3-5 μg/ml ou outro ligante em carbonato a 50 mM (pH 9.5) . As placas foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente, bloqueadas durante a noite com TBS/1% BSA a 4°C. As placas foram incubadas com CR-Fc ou Alk4-Fc em tampão de bloqueio à temperatura ambiente, lavadas em TBST e testadas com AP-anti-humano (Jackson). As placaa foram lavadas em TBST, uma vez em tampão do substrato lOx (200 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, pH 9.8) e CSPD e Sapphire foram adicionados (Applied Biosystems). D. Citometria de Fluxo

As linhas de células positivas de Cripto podem ser utilizadas para ensaiar os anticorpos monoclonais quanto à ligação a Cripto utilizando manchamento de superfície celular e citometria de fluxo da seguinte forma:

Libertação de células de frascos T162 com 2 ml 43 de PBS" com EDTA 5 mM, 10 min, 37°C. Acrescentar até 20 ml com meio com soro, pipetando para cima e para baixo diversas vezes para desagrupar as células. Girar a 1200 rpm durante 5 minutos. As células de lavagem com 5 a 10 ml a 4°C de PBS com 0,1% de BSA (tampão de lavagem) .

Girar a 1200 rpm durante 5 minutos. Suspender novamente a 4 x 106 -107/ml em tampão de lavagem. Manter sobre o gelo.

Preparar anticorpos para manchamento. Os anticorpos purificados são diluídos para 1-10 μρ/ιηΐ em tampão de lavagem. Adicionar 50 μΐ de células para uma placa de base em V de 96 cavidades (ICN 7632105) .

Plaquear uma cavidade de células para cada controlo e para cada linha celular a ser analisada, incluindo células para nenhum anticorpo e apenas anticorpo secundário, veículos de hibridoma, sobrenadante de anticorpo de controlo positivo, se disponível, ou purificado, e um controlo de subclasse de IgG (se se utilizar anticorpos purificados).

Plaquear uma cavidade de células para cada amostra experimental para cada linha de célula a ser analisada. Girar a placa, 1200 rpm durante 5 minutos, aplicar uma centrifugação de topo de mesa a 4°C. Virar o tampão invertendo a placa e agitando até o líquido ser substancialmente descartado. Adicionar 40 - 50 μΐ de anticorpos (ou tampão de lavagem para as cavidades de controlo de nenhum anticorpo e 2o anticorpo apenas) às cavidades. Incubar pelo menos 30 minutos - 1 hora a 4°C. Girar a placa, 1200 rpm durante 5 minutos. Virar as soluções de anticorpo. Lavar as cavidades duas vezes com 200 μΐ de tampão de lavagem por cavidade, girando após cada lavagem. Virar o tampão. 44

Ressuspender as células em cada cavidade em 50 μΐ de diluição de 1:200 (em tampão de lavagem) de IgG anti-rato, de R-PE rotulado de cabra, Fc Específico (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat# 115-116-071) . Incubar 20 min., 4°C, no escuro. Adicionar 150 μΐ de tampão de lavagem às células em cada cavidade. Girar a placa a 1200 rpm durante 5 minutos. Lavar uma vez com 200 μΐ de tampão de lavagem por cavidade. Ressuspender as células em 150 μΐ de PFA a 1% em PBS. Transferir os conteúdos de cada cavidade para tubos separados (5 ml de tubo 352052 de base circular de poliestireno Falcon de 5 ml). Envolver os tubos em lâmina delgada de estanho.

Os conteúdos dos tubos são então lidos por citometria de fluxo.

Os resultados de duas avaliações de anticorpos monoclonais produzidos por este método produziram os reultados sintetizados nas Tabelas 1 e 2 abaixo, onde a primeira coluna fornece os nomes designados para os subclones de hibridoma, as outras duas colunas demonstram os resultados de avaliações ELISA, e as colunas restantes demonstram os resultados da análise de citometria de fluxo sobre as quatro linhas de célula positiva de Cripto. Os resultados são fornecidos em unidades de índice fluorescente médio (MFI). 45

Tabela 1: Caracterização de Anticorpo Monoclonal Anti-Cripto.

Subclone de hibridoma Número de Depósito ATCC Sups de dei C de Cripto de ELISA Sups. de domínio tipo EGF de Cripto de ELISA DU4475 MFI NCCIT MFI GEO MFI HT3 MFI Controlo-ELISA 0,06 0,07 Controlo- Ig de Rato 14 9 37 18 A6C12,11 2,21 0,07 11 35 29 8 A6F8,6 PTA-3318 2,23 0,08 11 50 29 10 A7H1,19 2,14 0,09 14 34 27 12 A8F1,30 2,15 0,1 17 27 32 28 A8G3,5 PTA-3317 2,39 0,09 9 30 25 15 A8H3,1 PTA-3315 2,4 1,7 9 44 23 10 A8H3,2 2,54 0,07 13 13 16 14 A19A10,30 2,02 0,09 9 40 20 10 A10B2,18 PTA-3311 2,36 0,07 40 63 100 43 A27F6,1 PTA-3310 2,28 Π9 9 44 26 17 A40G12,8 PTA-3316 2,27 1,59 10 47 26 16 46

Tabela 2: Caracterização de Anticorpo Monoclonal Anti-Cripto.

Subclone de hibridoma Número de Depósito ATCC delC de Cripto de ELISA domínio tipo EGF de Cripto de ELISA DU4475 MFI NCCIT MEI GEO MEI HT3 MFI Controlo-ELISA 0,05 0,05 Controlo- Ig de Rato 10 6 4 6 A2D3,23 0,93 0,90 73 138 37 27 A7A10,29 1,37 0,07 75 83 33 83 A9G9,9 1,39 0,07 52 62 32 82 A15C12,10 1,42 0,06 46 55 25 93 A15E4,14 1,38 0,06 50 63 23 95 A17A2,16 1,40 0,06 76 97 41 81 A17C12,28 0,96 0,97 6 16 3 22 A17G12,1 PTA-3314 1,30 1,37 61 66 28 78 A17H6,1 1,38 0,05 35 30 5 28 A18B3,11 PTA-3312 1,36 1,38 50 42 33 65 A19E2,7 1,40 0,06 53 59 26 99 B3F6,17 PTA-3319 1,37 0,06 77 51 39 89 B6G7,10 PTA-3313 1,38 1,40 28 22 22 56 B11H8,4 1,41 0,06 59 101 39 107 B12C12,5 1,10 1,04 27 14 23 59 B15A2,6 1,40 0,06 36 44 22 59 C4A2,16 1,40 0,06 24 36 22 65 47

Também foram empregues vários outros protocolos de imunização usando a proteína CR (del C) bem como peptídeos Cripto de regiões específicas como se descreve abaixo. Nestes casos, também se geraram hibridomas conforme foi descrito. Os peptídeos Cripto foram usados adicionalmente com ou no lugar da proteína CR (del C) -Fc. Estes protocolos identificaram alguns dos anticorpos da invenção. Como será analisado pelos técnicos, estas experiências indicam que podem ser utilizados múltiplos protocolos de imunização diversificados para gerar os anticorpos desta invenção.

Num exemplo de protocolo de imunização um camundongo fêmea RBF com oito semanas de idade (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foi imunizada intraperitonealmente (IP) com uma emulsão contendo ou 50 yg solúveis de proteína recombinante CR (del C)-Fc ou um peptídeo Cripto de região específica conjugado com a hemocianina keyhole limpet (KLH) e adjuvante completo de Freund (FCA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Especificamente, a proteína CR (del C)-Fc ou o peptídeo Cripto CR40 (aa36-42; ID SEQ N° 3) -KLH foi diluído em tampão fosfato-salino, pH 7.2 numa concentração estimada de 2 mg/ml. Para esta proteína, um volume igual de FCA foi adicionado antes da emulsificação e imunização. 50 μΐ contendo 50 yg de CR(del C)-Fc emulsificado ou peptídeo Cripto CR40-KLH foi administrado via IP em cada camundongo para a imunização primária. Todas as imunizações subsequentes tiveram a mesma dosagem utilizando o adjuvante incompleto de Freund (FIA) ou o adjuvante RIBI1.2 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como se descreve abaixo. As imunizações de reforço foram administradas a cada duas ou três semanas. Amostras de soro de ratos imunizados foram colhidas antes 48 da primeira imunização, 7 dias depois da imunização de reforço e novamente antes das fusões das células dos linfócitos. Mediram-se os títulos séricos utilizando o ensaio de ELISA e a citometría de fluxo abaixo descritos.

Descrevemos de seguida vários exemplos de protocolos de imunização com diferentes tipos de antigenos Cripto, bem como os anticorpos por eles identificados: 49 ANTÍGENO 1 - (CR(del C)-FC):

Protocolo A: 1° 50 pg CR(del C) - FC (IP) + FCA 2o 50 pg CR(del C) - FC (IP) + FIA 3o 50 pg CR(del C) - FC (IP) + FIA 4° 25 pg CR(del C) - FC (IV) em PBS

Tabela 3:

Caracterização de Anticorpo Monoclonal Anti-Cripto. mAbs Purificado dele de Cripto de ELISA dominio tipo EGF de Cripto de ELISA LS174T MFI NCCIT MFI GEO MFI H727 MFI HT3 MFI 1-1A4C.2 0,197 0, 682 141 371 441 503 596 2-2C9.2 0,567 0,796 305 407 309 820 205 2-3H9.2 0, 637 0,354 127 84 123 191 59 2-4E5.6 0, 626 0,328 90 71 127 183 47 2-4D1.3 0, 866 0, 946 31 18 67 197 104 Controlo IgG 0,05 0,05 33 16 47 74 19

Protocolo B: 1° 50 pg CR(del C) - FC (IP) + FCA 2o 50 pg CR(del C) - FC (IP) + FIA 3o 50 pg CR(del C) - FC (IP) + FIA 4° 50 pg CR(del C) - FC (IV) em PBS 5o 25 pg CR(del C) - FC (IV) em PBS ANTÍGENO 2 - (cr(del C)-Fc + CR40 peptídeo):

Protocolo C: 1° 50 pg CR(del C) - Fc (IP) + FCA 2o 50 pg CR(del C) - Fc (IP) + FIA 3o 50 pg CR(del C) - Fc (IP) + FIA 4° 50 pg A10B2 - KLH (IP) + FIA 50 5o

50 yg A10B2 - KLH (IP) + FIA

Tabela 4:

Caracterização de Anticorpo Monoclonal Anti-Cripto

Subclone de Hibridom a Cripto delC de ELISA domini o tipo CFC de Cripto de ELISA LS174T MFI NCCIT MFI GEO MFI H727 MFI HT3 MFI 3-4E8.3 0.6 0.3 ND ND ND ND ND 3-3G1.1 0.5139 0.9206 298 97 1099 677 1538 Controlo IgG 0.05 0.05 33 17 88 19 10 ND = não determinado ANTÍGENO 3 - (CR(dei C)-Fc + preparação da membrana do tumor LS174 T):

Protocolo D: 1° 50 yg CR(del C) - Fc (IP) + FCA 2o 50 yg CR(del C) - Fc (IP) + FIA 3o 50 yg CR(del C) - Fc (IP) + FIA 4° 50 yg LS174T Cripto (IP) + RIBI

Tabela 5:

Caracterização de Anticorpo Monoclonal Anti-Cripto

Subclone de Hibridom a Cripto delC de ELISA domini 0 tipo CFC de Cripto de ELISA H727 MFI HT3 MFI 4-2F6 0.6 0.3 ND ND 4-3A7 0.5139 0.9206 677 1538 4-1E2 0.13 0.3 53 24 Controlo IgG 0.05 0.05 8 5 ANTÍGENO 4 - (x = número de peptídeos conjugados para KLH; também injectámos peptídeos conjugados para KLH em ratos que foram pré-imunizados com CR (del C) - Fc conforme descrito, por exemplo no Protocolo C): 51

As sequências de peptídeos CRx exemplares que usamos e as suas posições na proteina Cripto de comprimento total são as seguintes: CR40 = FRDDSIWPQEEPAIRPR (aa46-42, A10.B2; ID SEQ N°: 3) CR41 = CPPSFYGRNCEHDVRKE (aa97-113; ID SEQ N°: 4) CR43 = GSVPHDTWLPKKC (AA 116-128; ID SEQ N°: 5) CR44 = SLCKSWHGQLRCFPQ (aal29-143; ID SEQ N°: 6) CR49 = N-SFYGRNCEHDVRRENCGSVPHDTWLPKK-COO acetilado (aalOO-aal27; ID SEQ N°: 7) CR50 = N-LNEGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRK-COO acetilado (aa84-aall2, inclui a região de fucosilação; ID SEQ N°: 8) CR51 = N-PHNTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCD-COO acetilado (aall9-aal50; ID SEQ N°: 9)

Protocolo E: 1° 50 yg CRx-KLH (IP) + FCA 2o 50 yg CRx-KLH (IP) + FIA 3o 50 yg CRx-KLH (IP) + FIA 4° 25 yg CR(del C) - Fc (Iv) em PBS

Protocolo F: 1° 50 yg CR(del C) - Fc (IP) + FCA 2o 50 yg CR(del C) - Fc (IP) + FIA 3o 50 yg CR(del C) - Fc (IP) + FIA 4° 25 yg CRx-KLH (IP) + FIA

Exemplo 3: Ensaio de Célula Nula para Inibição de Actividade de Cripto.

Em seguida descreve-se um ensaio de sinalização de célula nula de Cripto F9 utilizado para avaliar a inibição da actividade de Cripto.

Dia 0 Revestir placas de cavidade 6 com 0,1% de gelatina 2 ml/cavidade a 37°C durante 15 minutos.

Semear as células a 6xl05 de células NULAS de CRIPTO F9 por cavidade. DIA 1 Transfecção:

Cada uma das seguintes amostras é adicionada a 300 μΐ de OptiMeml para produzir a Solução para cada amostra: 52

Amostra 1: 0,5 μς de cDNA repórter FAST de luciferase (N2)7 mais 1,5 μς de cDNA vector vazio.

Amostra 2: LO O μρ de luciferase (N2)7, LO 0 μς de FAST, e 1 μg de cDNAs de : vector vazio. Amostra 3: 0,5 μg de luciferase (N2)7, 0,5 μς de Cripto ADD 0,5 FAST, e 40,5 μς de cDNAs de vector vazio. Amostra 4: 0,5 μg de luciferase (N2)7, 0,5 μς de Cripto, 0,5 FAST, e 0,5 μς de cDNAs de vector vazio. Amostra 5: 0,5 μρ de luciferase (n2)7, 0,5 μς de Cripto, 0,5 FAST, e 0,5 μς de cDNAs de vector vazio. Amostra 6: 0,5 μρ de luciferase (N2)7, 0,5 μς de Cripto, 0,5 FAST, e 0,5 μς de cDNAs de vector vazio. Amostra 7: 0,5 μρ de luciferase (n2)7, 0,5 μς de Cripto, 0,5 FAST, e 0,5 μς de cDNAs de vector vazio. Amostra 8: 0,5 μρ de luciferase (N2)7, 0,5 μς de Cripto, 0,5 FAST, e 0,5 μρ de cDNAs de vector vazio. Amostra 9: 0,5 μg de luciferase (N2)7, 0,5 μρ de Cripto, 0,5 FAST, e 0,5 μρ de cDNAs de vector vazio. A Solução B compreende 30 μΐ de Lipofectamina mais 270 μΐ de OptiMeml.

Para cada amostra, misturar a solução A e solução B conjuntamente. Incubar 45 minutos à temperatura ambiente. Enxaguar as cavidades com 2 ml/cavidade de OptiMeml. Aspirar imediatamente antes da etapa seguinte.

Adicionar 2,4 ml de OptiMeml a cada mistura de soluções A+B, misturar, adicionar 1,5 ml/cavidade para duplicar as cavidades. Incubar 5 horas a 37°C. Adicionar 1,5 ml/cavidade de DMEM + 20% de FCS, 2 mM de Gin, P/S às cavidades que receberam amostras 1-3. Adicionar anticorpos anti-Cripto da seguinte forma: Amostra 4 cavidades: A27F6.1, 10 μg/ml; Amostra 5 cavidades: A27F6.1, 2 μρ/ml; Amostra 6 cavidades: A40G12.8; 10 μg/ml, Amostra 7 cavidades: A40G12.8 2 μg/ml; Amostra 8 cavidades: A10B2.18, 53 10 μς/πιΐ; Amostra 9 cavidades: A10B2.18, 2 μg/ml.

Dia 2 Remover os veículos, lavar as células com PBS, 2 ml/cavidade. Adicionar DMEM + 0,5% FCS, 2 mM de Gin, P/S com as mesmas quantidades de anticorpos de Cripto como no dia anterior, para as mesmas cavidades.

Dia 3 Desenvolver o sinal de luciferase. Lavar células com PBS + Ca2+ e Mg2+, 2 ml/cavidade. Usar o kit

LucLite, Pacote cat# 6016911. Trazer tampão e substrato para a temperatura ambiente. Luzes escuras. Reconstituir o substrato com 10 ml de tampão. Diluir 1:1 com PBS + Ca2+ e Mg2+. Aspirar as cavidades. Rapidamente adicionar 250 μΐ de substrato diluído por cavidade aplicando com uma pipeta de forma repetida. Redemoinhar a solução e transferir 200 μΐ para cavidades de uma placa de base branco opaco de cavidade 96, Falcon 35-3296. Ler a placa em luminómetro utilizando Winglow e exportar os dados para o Excel.

Os resultados deste ensaio são sintetizados abaixo na Tabela 3.

Tabela 6:

Ensaio de Actividade de Cripto: Inibição com Anticorpos Monoclonais Anti-Cripto. cDNAs transfectados Anticorpo Anti-Cripto Unidades Luminescentes Relativas (N2) 7 luc nenhum 123 (N2) 7 luc, FAST nenhum 259 (N 2)7 luc, FAST, Cripto nenhum 3091 (N 2)7 luc, FAST, Cripto A27F6,1 ΙΟμρ/πιΙ 1507 (N2)7 luc, FAST, Cripto A27F6,1 2μg/ml 2297 (N2) 7 luc, FAST, A40G12,8 10μρ/ιη1 1213 54

Cripto (N2)7 luc, FAST, Cripto A40G12,8 2μρ/ιη1 2626 (N2)7 luc, FAST, Cripto A10B2,18 ΙΟμρ/ιηΙ 3466 (N2)7 luc, FAST, Cripto A10B2,18 2μρ/Γη1 3103

Também testámos outras concentrações de anticorpo A27F6.1. Observámos que a adição de 0.5-20 mg/ml mab A27F6.1 ao meio dessas células inibiu o sinal de luciferase induzido por Cripto em 34-95% (Figura 1) . Também testámos outros anticorpos da invenção e observamos que mabs A6C12.11 e A8G3.5 também inibiram a produção do sinal.

Como sistema de ensaio alternativo, testámos os mabs específicos de Cripto da invenção para inibição da actividade FAST/ (N2) 7-luc em células NCCIT. Esses ensaios foram semelhantes aos das células F9, excepto a expressão ectópica de Nodal e ALK4 que é requerida nessas células para activação do repórter. Observámos que mab A27F6.1 diminuiu a actividade de luciferase nessas células em 90% a 2 e 20 μρ/ηιΐ (Figura 2) .

Exemplo 4: Ensaio para Inibição In Vitro de Desenvolvimento de Célula tumoral. A inibição de Sinalização de Cripto pode também ser ensaiada por avaliação do desenvolvimento de células GEO em ágar macio. Ver, por exemplo, Ciardiello e outro, Oncogene. 1994 Jan; 9(1): 291-8; Ciardiello e outro, Câncer Res. 1991 Feb 1; 51(3): 1051-4.

Fundimos bacto ágar a 3%. Manter em 42°C em banho de água. Em seguida, misturámos a solução de bacto ágar a 3% com veículos completos pré-aquecidos para formar uma solução de bacto ágar a 0,6%, mantendo a 42°C. Colocámos numa placa 4 ml da solução num prato de 6 cm e deixámos 55 esfriar durante pelo menos 30 minutos para formar a camada de ágar de base. Tripsinizámos as células GEO e ressuspendemos a 105 de células/ml em veículos completos. Adicionámos anticorpos a serem ensaiados, ou controlos, às suspensões celulares, titulámos anticorpos de 20 pg a 1 μς. Misturámos volumes iguais das suspensões de célula GEO e 0,6% de bacto ágar e sobrepusemos 2 mis sobre o topo da camada de ágar de base. Deixámos arrefecer durante pelo menos 1 hora. Incubámos durante 14 dias a 37°C num incubador de CO2. Contámos as colónias visíveis sem o uso de um microscópio. A ausência de colónias, comparativamente com os controlos negativos, indica que o anticorpo testado inibe o desenvolvimento de célula tumoral in vitro.

Este ensaio foi utilizado para produzir os resultados mostrados na Tabela 4, para os anticorpos A27F6.1 e B6G7.10. Estes demonstram a capacidade de diminuir o desenvolvimento de colónias de célula GEO.

Tabela 7:

Resultados de desenvolvimento em ensaio de ágar macio

Anticorpo Número médio de colónias Nenhum 109,0 Nenhum 104,3 A27,F6 20μρ/ιη1 82,0 A27F6,1 10μρ/ιη1 78,3 A27F6,1 5μρ/ιη1 79,0 A27F6,1 Ιμρ/ιηΐ 108,7 B6G7,10 20μg ml 102,3 B6G7,10 10μρ ml 71,7

Também realizámos ensaios de inibição de desenvolvimento com células T-47D (ATCC), que é um carcinoma humano de mama, conforme se descreve no Exemplo 56 9.

Exemplo 5: Ensaio para Inibição In Vivo de Desenvolvimento de Célula tumoral.

Para avaliar a inibição de desenvolvimento de célula tumoral, uma linha de célula tumoral humana é implantada subcutaneamente em ratos nus de laboratório e os efeitos dos anticorpos da invenção são observados, com ou sem tratamentos quimioterapêuticos adicionais que podem fornecer efeitos sinérgicos ou aditivos sobre a inibição do tumor.

Este ensaio pode ser realizado alternativamente utilizando diferentes linhas de célula tumoral, como por exemplo o GEO (uma linha de célula in vitro de cancro de cólon humano bem diferenciada obtém-se junto da da Colecção de Tipo de Tecido Americana (ATCC) ) , a DU-4475 (uma linha de célula in vitro de cancro da mama obtida junto da ATCC), a NCCIT (uma linha de célula tumoral testicular obtida junto da ATCC), ou outras conhecidas na técnica. Descreve- se de seguida um exemplo de tais ensaios:

Os animais são individualmente marcados com furos na orelha. A linha de célula GEO é passada in vitro ou in vivo por 1-4 passagens. Implantam-se células GEO nos animais subcutaneamente na área de flanco direito. Podem utilizar-se os seguintes grupos de animais:

Grupo # Tratamento # de Ratos 1. Controlo de salina, 0,2 ml/rato, i.p. três vezes por semana (M, W, F) 20 2 . mAb, dose baixa, i.p. 10 3. mAb, dose média, i.p. 10 4 . mAb, dose elevada, i.p. 10 5. 5-FU, 30 mg/kg/inj, i.p., 3 Rx/semana (M, W, F) 10 6. Cisplatina, 2 mg/kg/inj, s.c., 3 Rx/semana (M, W, F) 57 10 7 . Adriamicina, 1,6 mg/kg,inj, i.p., 3 Rx/semana (M, W, F) 10 8. Irinotecan, 10 mg/kg/inj., i 10 .p., 5 Rx/semana (M - F) 9. mAb, dose baixa, i.p. + 5-FU (dose intermediária)10 10. mAb, dose média, i.p. + 5-FU (dose intermediária)10 11. mAb, dose elevada, i.p. + 5- FU (dose intermediária) 10 12. mAb, dose baixa, i.p. + Cisplatina (dose intermediária) 10 13. mAb, dose média, i.p. + Cisplatina (dose intermediária) 10 14. mAb, dose elevada, i.p. + Cisplatina (dose intermediária) 10 15. mAb, dose baixa, i.p. + Adriamicina (dose intermediária) 10 16. mAb, dose média, i.p. + Adriamicina (dose intermediária) 10 17. mAb, dose elevada, i.p. + Adriamicina (dose intermediária) 10 18. mAb, dose baixa, i.p. + Irinotecan (dose intermediária) 10 19. mAb, dose média, i.p. + Irinotecan (dose intermediária) 10 20. mAb, dose elevada, i.p. + Irinotecan (dose intermediária) 10

Dia 0: Implantar tumor, registar o peso corporal inicial dos animais.

Dia 1: Iniciar os tratamentos como acima indicado.

Dia 5: Começar as medições de tamanho do tumor e peso corporal e continuar duas vezes por semana até ao término da experiência.

As medições do peso corporal inicial, tamanho do 58 tumor e peso corporal, histologia em sacrifício, e análise de imuno-histoquímica sobre tumores são examinadas, analisando quanto à expressão de Cripto, desenvolvimento de tumor e sua inibição.

Exemplo 6: Modelo de Tumor em Xenoenxerto In Vivo -Anticorpo anti-Cripto de bloqueio rico em Cys

Para estimar a resposta de um NCCIT, foi implantada uma linha de célula de carcinoma testicular humana subcutaneamente com um anticorpo que se associa a um domínio de Cripto rico em cys. Os métodos experimentais são listados abaixo. Os resultados são identificados na Figura 3. Métodos e Materiais

Animais: Foram utilizados ratos machos nus de laboratório. Os animais foram individualmente numerados por furos na orelha.

Tumor: Linha de célula in vitro de carcinoma testicular humano de célula germinativa mista mediastinal, NCCIT, originalmente obtido da Colecção de Tipo de Tecido Americana. A linha de célula foi passada in vitro por seis passagens em RPMI-1640/FBS a 10% sem antibióticos. Animais implantados subcutaneamente com 5 x 106 células/0,2 ml de matrigel sobre o flanco direito dos animais.

Grupo # Tratamento # de Ratos 1 Veículo de Controlo, (25 mM de fosfato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, pH 7,2), 0,2 ml/rato, i.p., Q14D. Os tratamentos começam no dia 1 20 2. A8G3.5, 1 mg/kg/inj, i.p., Q14D. Os tratamentos começam no dia -1 10 3. A8G3.5, 3 mg/kg/inj, i.p., Q14D. OS tratamentos começam no dia -1 10 59 A8G3.5, 10 mg/kg/inj, i.p., Q14D. Os tratamentos 4 . começam no dia -1 10 5. Cis-platina, 2 mg/kg/inj, s.c., 3 x/semana (M, W, F) para 6 tratamentos 10

Os tratamentos começaram no dia 1.

Escala de Teste

Dia -1: Ratos aleatórios em grupos de controlo e tratamentos. Registado o peso corporal inicial dos animais. Administrados os primeiros tratamentos a grupos de anticorpo. Foram feitas dosagens de soluções. Os tratamentos não foram revelados aos técnicos até o ensaio terminar.

Dia 0: Implantado o tumor. Culturas bacterianas Ran sobre o tumor implantado no rato.

Dia 1: Administrado o primeiro tratamento ao grupo quimioterapêutico positivo.

Dia 4: Registadas as medições de tamanho de tumor inicial para a linha de base de tumor sobre matrigel. Continuou a registar-se o tamanho do tumor e os pesos corporais em ratos 2x/semana. Acompanhado o estudo diariamente e feitas anotações de qualquer observação invulgar sobre os animais.

Pontos finais: Peso corporal inicial Medições de tamanho de tumor e peso corporal. Exemplo 7: Em Modelo de Tumor em Xenoenxerto In Vivo -dominio tipo EGF bloqueando anticorpo anti-Cripto.

Para estimar a resposta de uma NCCIT, foi implantada uma linha de célula de carcinoma testicular humana subcutaneamente com um anticorpo que está ligado a um dominio de Cripto tipo EGF Os métodos experimentais são listados abaixo. Os resultados são apresentados na Figura 4 . 60 Métodos e Materiais

Animais: Foram utilizados ratos machos nus de laboratório. Os animais foram individualmente numerados por furos na orelha.

Tumor: Linha de célula in vitro de carcinoma testicular humana de célula germinativa mista mediastinal, NCCIT, originalmente obtida da Colecção de Tipo de Tecido Americana. A linha de célula foi passada in vitro por oito passagens em RPMI-1640/FBS a 10% sem antibióticos. Animais implantados subcutaneamente com 5 x 106 células/0,2 ml de matrigel sobre o flanco direito dos animais.

Grupo # Tratamento #

Ratos

1 Veiculo de Controlo, (25 mM de fosfato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio, pH 7,2), 0,2 ml/rato, i.p., Q14D. Os tratamentos começam no dia -1 18 2. A27F6.1, 1 mg/kg/inj, i.p., Q14D. Os tratamentos começam

no dia -1 com uma dose de carga de 21,2 mg/kg/ratolO 3. A27F6.1, 10 mg/kg/inj, i.p., Q14D. Os tratamentos começam no dia -1 10 4. Cis-platina, 2 mg/kg/inj, s.c., 3 x/semana (M, W, F) para 6 tratamentos 10

Os tratamentos começaram no dia 1.

Escala de Teste

Ratos aleatórios em grupos de controlo e tratamentos. Registado o peso corporal inicial dos animais. Administrados os primeiros tratamentos a grupos de anticorpo. Foram feitas dosagens de soluções . Os tratamentos não foram revelados aos 61 técnicos até o ensaio terminar.

Dia 0: Implantado o tumor. Culturas bacterianas Ran sobre o tumor implantado nos ratos. As culturas bacterianas foram negativas para contaminação 24 e 48 horas após a amostragem.

Dia 1: Administrado o primeiro tratamento ao grupo quimioterapêutico positivo.

Dia 4: Registadas as medições de tamanho de tumor inicial para a linha de base de tumor sobre matrigel. Continuou a registar-se o tamanho do tumor e os pesos corporais em ratos 2x/semana. Acompanhado o estudo diariamente e feitas anotações de qualquer observação invulgar sobre os animais.

Pontos finais: Peso corporal inicial

Medições de tamanho de tumor e peso corporal. Exemplo 8: mabs de Cripto que bloqueia a ligação de ALK4. A fim de estimar se os anticorpos monoclonais específicos de Cripto podem interferir com a capacidade de Cripto para se ligar a Alk4, o receptor tipo I de activina, foi usada a análise de citometria de fluxo utilizando uma linha de célula 293 que de forma estável expressa Alk4. Para gerar esta linha celular, 293 células foram co-transfectadas com um plasmídeo que expressa Alk4 rotulada na terminação C com um epítopo HA e um plasmídeo que expressa a droga, puromicina, numa relação de 10:1. As células transfectadas foram então seleccionadas em puromicina até as colónias estarem formadas. As colónias foram então colhidas, expandidas e em seguida analisadas quanto à expressão de Alk4 com o uso de análise de mancha do oeste para HA. Descobriu-se que o clone 21 (293-Alk4-21) expressa níveis elevados de Alk4 comparativamente com o controlo, células 293 não transfectadas.

Para analisar a ligação de Cripto-Alk4 por 62 citometria de fluxo, foi utilizada uma forma solúvel, purificada de Cripto humano (aa 1-169) fundido à porção Fc de IgG humano (CrdelC-Fc). Aproximadamente 5 mg/μΐ de CrdelC-Fc ou proteína Fc de controlo foram incubados com 3 x 105 células 293-Alk4-21 sobre gelo durante 30 minutos em 50 μΐ de volume total de tampão FACS (PBS com BSA a 0,1%) . Para amostras com anticorpos anti-Cripto, 5 μρ/ιηΐ de CrdelC-Fc foram pré-incubados com 50 μρ/ηιΐ de cada anticorpo de Cripto (A10.B2.18, A40.G12.8, A27.F6.1, A8.H3.1, A19.A10.30, A6.F8.6, A8.G3.5, A6.C12.il) sobre gelo antes da adição das células. As células foram então lavadas em tampão FACS e a proteína de Fc ligada foi detectada e as células incubadas com um IgG anti-humano de cabra conjugado com R-ficoeriterina (fragmento específico de Fc) de Jackson Immunologics. As amostras foram então lavadas novamente, fixadas em paraformaldeído a 1% em PBS, e analisadas, usando procedimentos de citometria de fluxo padrão. Os resultados do ensaio FACS são apresentados na Figura 5.

Exemplo 9: Cripto Interrompe a Supressão do Desenvolvimento de Células de Cancro de Mama Induzido por Activina B. Células T47D, mantidas em insulina RPMI/10%FCS/10 pg/ml, na passagem #2 do ATCC foram transfectadas com um plasmídeo de expressão para Receptor Ecotrópico (EcoR; B. Elenbaas) e seleccionadas em meio contendo higromicina 100 μ/ml. Foram cultivadas colónias de T-47D-EcoR que permitiram infecção do vírus de leucemia murina pBABE-GFP (MLV), infectadas com pBABE-hCr-PURO-MLV e seleccionadas em meio de puromicina. Esta linha oligoclonal (T-47D-hCr) foi analisada por FACS para expressão de hCr (Cripto humana) com anticorpos anti-Cripto específicos. Aproximadamente 4.000 células/cavidade de T-47D-EcoR- ou T-47D-hCr foram colocadas numa placa de 96 cavidades, em meio contendo 2% de soro com/sem 25 ng/ml de Activina B (R&D) ou 25 ng/ml de Activina 63 B plus 0,1 - 50 μς/πιΐ A8G3.5. Ο meio com factores foi substituído diariamente por 7 a 8 dias. A placa foi coletada adicionando-se 20 μΐ/cavidade CellTiter de solução aquosa (Promega) CellTiter, incubando por 2 horas a 37 °C e realizando leitura em 490 nm.

Cultivámos células T-47D e T-47D-EcoR em condições de baixo soro, com ou sem Activina A ou B. que foram analisadas para a proliferação de células usando um ensaio colorimétrico MTT. Observou-se que a proliferação de células T-47D foi inibida por Activina A ou B em cerca de 40% comparativamente com células não tratadas (Figura 6) .

Observámos também que as células T-47D-CR foram inibidos por Activina A, mas descobrimos que as células T-47D-CR não responderam à Activina B (Figura 6). Este resultado indica que o efeito ( experiências de controlo que as células T-47D e T-47D-CR não tratadas não diferiram nas taxas de proliferação em meio normal ou em condições de baixo soro.

Em seguida, testamos se os anticorpos da invenção podem inibir a interacçâo da Cripto-Activina B. Tratámos as células T—47] presença de 10 ou 20 μρ/ιηΐ de mab A8G3.5 (Figura 7) .

Observámos que o mab A27F6.1 foi incapaz de restaurar a supressão de crescimento de Activina B dessas células.

Exemplo 10: O Cripto Liga-se Directamente à Activina B

Descobrimos que o Cripto se liga directamente à Activina B. Revestimos placas ELISA com Activina B, Activina A, TGFpl, GDNF ou BMP2 purificados e incubados com o CR-Fc.

Em seguida, acrescentou-se o anticorpo anti-Fc conjugado à fosfatase alcalina e controlámos a ligação, adicionando um substrato de fosfatase alcalina e desenvolvendo-o. Observou-se que CR-Fc ligou às cavidades contendo Activina B, mas não Activina A ou outros ligantes (Figura 8) . Além disso, pré-incubamos CR-Fc com Activina A ou B em solução antes da adição de uma placa revestida com Activina B e observámos 64 que apenas a Activina B inibiu a ligação (Figura 9) . Estes resultados confirmaram que o Cripto se liga especificamente com a Activina B.

Também foi analisada a interação da Cripto-Activina B usando Biacore. Descobrimos que a Activina B se liga directamente à CR-Fc imobilizada num chip Biacore com uma intensidade elevada, mas não a uma proteína de controlo LTpR-Fc (Figura 10) . Observámos também que a ligação de Activina A com CR-Fc foi insignificante. Estes dados indicam que a Activina B se liga a Cripto a uma taxa FAST e uma afinidade aparente em solução mediu ensaio de formato de competição de cerca de 1 nM.

Os anticorpos Cripto anti-CFC monoclonais 2-2C9.2 e A8G3 modularam a interação de Cripto com Activina B. Isto foi comprovado através de experiências de coimunoprecipitação em que a ligação de Cripto com a Activina B foi inibida pela adição de A8G3 ou 2-2C9.2 . A inibição foi medida utilizando técnicas convencionais de western blotting com anticorpos anti-Activina B.

Algumas das modalidades da invenção acima descritas são descritas abaixo e incluem, mas não se limitam às seguintes modalidades. Como poderá ser constatado pelos técnicos, podem ser realizadas numerosas alterações e modificações às várias modalidades da invenção sem nos afastarmos da invenção. Pretende-se que todas essas variações se incluam no âmbito da invenção.

Lisboa, 16 de Fevereiro de 2011. 65

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo compreendido no domínio receptor-ligante abrangendo resíduos de aminoácido Cripto 75 a 150 de SEQ. ID. N° 1 ou SEQ. ID. N° 2 para ser utilizado no tratamento de tumor de cérebro, cabeça, pescoço ou próstata.
2. 2. O anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, que se liga especificamente a um epitopo de Cripto compreendido no domínio rico em cisteína abrangendo resíduos de aminoácidos de aminoácido 114 a aminoácido 150 de SEQ. ID. N° 1 ou SEQ. ID. N° 2.
3. 3. O anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, que se liga especificamente ao epitopo de Cripto a que se liga o anticorpo produzido por hibridoma A8G3.5 (ACESSO ATCC N° PTA-3317).
4. 4. O anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que é conjugado com um agente quimioterapêutico.
5. 5. O anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que é administrado em combinação com um agente quimioterapêutico não conjugado.
6. 6. O anticorpo, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, em que o agente quimioterapêutico é seleccionado a partir de um grupo consistido por um pró-fármaco activado por tumor, um radionuclídeo e uma toxina.
7. 7. O anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, em que o agente quimioterapêutico é um pró-fármaco activado 1 por tumor.
8. 8. 0 anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, em que o pró-fármaco activado por tumor é um maitansinoide.
9. 9. 0 anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, que é humano.
10. 10. O anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, que é monoclonal.
11. 11. O anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, que é humanizado. Lisboa,16 de Fevereiro de 2011. 2