PT1405082E - Processo para a identificação de compostos para a terapia de processos de envelhecimento do sistema cardiovascular - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS PARA A TERAPIA DE PROCESSOS DE ENVELHECIMENTO DO SISTEMA CARDIOVASCULAR" A invenção refere-se a um processo in vitro para a identificação de um composto que modifica a actividade do receptor de urotensina II e com isso influencia processos de envelhecimento do sistema cardiovascular. A urotensina II (UII) é um péptido que actua sobre vasos sanguíneos. Ela produz efeitos vasodilatadores e vasoconstritores de acordo com o respectivo tipo de vasos e espécies em questão. Em vários aspectos, a actividade é comparável com a da angiotensina II (AII). A urotensina II, bem como o seu receptor GPR14, são expressos no sistema cardiovascular humano, por exemplo em células endoteliais, células musculares lisas de artérias coronárias, do miocárdio ou do ateroma coronário. A ambos os factores está por conseguinte atribuído um papel importante na organização cardiovascular no plano celular e com isso em processos patofisiológicos. A urotensina II é conhecida como ligando natural de GPR14. 0 GPR14 pertence ao grupo dos GPCR (receptores acoplados à proteína G).

Experiências com urotensina II em macacos anestesiados conduziram a alterações dramáticas dos parâmetros hemodinâmicos. 0 aumento da resistência periférica em conjunto com um enfraquecimento da contractilidade cardíaca e um volume de expulsão reduzido conduziu a um colapso do sistema 1 cardiovascular. Processos comparáveis decorrem também em humanos.

Os receptores acoplados à proteína G (GPCR) desempenham um papel central numa multiplicidade de processos fisiológicos diferentes. É assumido que no genoma humano cerca de 1000 genes codificam para esta família de receptores. Aproximadamente 40 - 50% dos medicamentos presentemente disponíveis, sujeitos a prescrição, actuam como agonistas ou antagonistas de GPCR. Isto sublinha o papel importante desta classe de receptores para a indústria de pesquisa em medicamentos.

Devido ao tamanho e importância da família de proteínas e atendendo ao facto de ainda não ser conhecido qualquer ligando fisiológico para vários GPCR (GPCR órfãos) pode daí deduzir-se que esta classe de receptores venha a ser no futuro um dos reservatórios mais importantes para proteínas alvo adequadas na pesquisa de novas substâncias farmacêuticas.

Os GPCR são uma família de proteínas de membrana integrais que estão localizados sobre a superfície celular de células. Eles recebem sinais de substâncias de sinal extracelulares (p. ex. hormonas, neurotransmissores, péptidos, lípidos) e transportam estes sinais através de uma família de proteínas ligantes do nucleótido guanina, as assim designadas proteínas G, para o interior da célula. Neste caso eles activam diferentes vias de transdução de sinal na dependência da especificidade do receptor, da proteína G activada e do tipo de célula. As cadeias polipeptídicas de todos os GPCR enrolam-se em sete hélices a, que se estendem através da dupla camada fosfolipídica da membrana celular. Devido às sete passagens de membrana formam-se loops extra e intracelulares que possibilitam a ligação 2 extracelular de ligandos e o acoplamento intracelular de proteínas G. Por este motivo, os GPCR também são designados como receptores sete - transmembranares.

Todos os receptores acoplados à proteína G funcionam de acordo com um padrão de base comum: a ligação de um ligando extracelular conduz a uma alteração de conformação da proteína receptora, de modo a que esta possa estabelecer contacto com uma proteína G. Através de cascatas de transdução de sinal mediadas por proteína G no interior da célula chega-se no final a uma resposta biológica da célula.

As proteínas G são proteínas heterotriméricas, que são compostas pelas subunidades α, β e γ e que, devido a âncoras lipídicas, estão localizadas no lado interno da membrana celular. 0 acoplamento de GPCR activados a proteínas G provoca uma troca de GDP/GTP da subunidade Ga e a dissociação do heterotrímero numa subunidade α e uma subunidade βγ· Tanto a subunidade α activada, como também o complexo βγ podem influenciar proteínas efectoras intracelulares. A activação da adenilato ciclase (AC) localizada na membrana por proteínas G do tipo Gas conduz, por exemplo, ao aumento do nível de AMPc intracelular ou à sua queda no caso da activação de proteínas G do tipo Gai. As proteínas G do tipo Gq activam a fosfolipase C (PLC), que catalisa a formação de 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). Estas moléculas conduzem, por sua vez, à libertação de Ca2+ a partir de reservatórios intracelulares ou à activação da proteína cinase C (PKC), com efeitos adicionais em ambos os casos. A par dos tipos de proteína G indicados acima (Gai/s, Gq) , existem ainda tipos adicionais que são designados como G16, G12/13, etc. A variedade 3 destas proteínas G reflecte a multiplicidade das mais diferentes funções de GPCR.

No pedido internacional WO 01/14888 é revelado um processo que serve para a identificação de agonistas e antagonistas do receptor de urotensina II. Este processo aproveita-se de um sinal da cascata de transdução de sinal influenciada pelo receptor alterado, para perceber o estado do receptor relativamente à sua interacção com um agonista ou antagonista.

Na publicação de Douglas et al. em TCM vol. 10, n°. 6, 2000, encontra-se a indicação de que o receptor humano de urotensina II aumenta a expressão de ARNm oíi-aj-procolagénico. Daí se infere que pode existir a possibilidade, como no caso de outros espasmogénicos (p. ex. ET-1, angiotensina II, norepinefrina, entre outros), de o receptor produzir fibroses em vasos sanguíneos do coração e vasos periféricos.

Na publicação de Chen et al. em J. Mol. Cell. Cardiol. 32, 1802 - 1819 (2000) está descrito que TGF-β é um regulador específico de CTGF, tanto em miócitos e fibroblastos do coração. A indução de CTGF por TGF-β correlaciona-se neste caso com um aumento significativo de fibronectina, colagénio e infibroblastos PAI-1 do coração.

Em Atherosclerosis 145, 97 - 106 (1999) Fitzgerald et al. refere-se a que a heparanase e MMP2 activa em coelhos são simultaneamente induzidas quando a sua carótida é estimulada através de experiências balão, e que em doentes em estado final de lesões ateroscleróticas complexas é observada uma actividade simultânea da heparanase, MMP2 e MMP9. 4 0 receptor de urotensina II do ratinho é revelado no documento WO 00/75168. São igualmente conhecidos métodos para a identificação de agonistas e antagonistas para GPR14, como por exemplo a partir do documento WO 99/40192.

Até à data não é ainda considerado no estado da técnica relativamente a métodos de rastreio que o receptor de urotensina II possa ser utilizado em especial para a descoberta de compostos deste tipo, em que sejam utilizáveis genes ou produtos dos genes que estão envolvidos na formação, composição ou degradação da matriz extracelular. Com isso, do ponto de vista farmacêutico, não podem ser pesquisadas de forma suficientemente eficaz substâncias que actuem em oposição face a doenças que são acompanhadas por uma multiplicação de tecido conjuntivo. A invenção refere-se, por conseguinte, a um processo in vitro para a identificação de um composto que modifica a actividade do receptor de urotensina II de modo a que seja influenciada a actividade ou quantidade de um gene ou produto génico, que está envolvido na composição, formação ou degradação da matriz extracelular, em que a] é posta à disposição uma célula na qual é formado um receptor de urotensina II, b] é posto à disposição um composto químico, c] a célula de a] é posta em contacto com o composto químico de b], d] depois disso é determinada a actividade ou quantidade de um gene ou do seu produto génico a partir da célula de c], em que este gene ou produto génico está envolvido na composição, formação ou degradação da matriz extracelular, 5 e] é comparada a actividade da quantidade de d] com a actividade ou quantidade desse mesmo gene ou produto génico de uma célula controlo correspondente, que não tinha sido posta em contacto com o composto de b], em que em d] é seleccionado no mínimo um gene do grupo Col 1, MMP2, TGFbetal ou CTGF. A célula posta à disposição, na qual é formado um receptor de urotensina II é, de um modo preferido, uma célula de um mamífero, por exemplo aquela de um ratinho, rato ou cobaio, ou de um hamster. De um modo particularmente preferido é posta à disposição uma célula humana. Numa forma de realização particularmente preferida, esta célula é uma célula do coração. 0 composto químico posto à disposição para o processo tem, de um modo preferido, um peso molecular entre 100 e 50 000 kDa e, de um modo particularmente preferido, entre 100 e 5000 kDa.

Um composto químico deste tipo posto à disposição para o processo é, de um modo preferido, uma substância natural, uma proteína, um polinucleótido, um composto contendo açúcar ou um composto contendo gordura. Um composto deste tipo é adicionalmente, de um modo preferido, urotensina II. 0 gene do processo de acordo com a invenção ou o produto génico correspondente, para o qual devem ser determinadas a actividade ou quantidade é, de um modo preferido, o gene ou o produto génico para ColI (colagénio de tipo 1), MMP2 (metaloproteinase de tipo 2), TGFbeta (Factor Transformador de Crescimento beta) ou CTGF (Factor de Crescimento do Tecido Conjuntivo). 6 A determinação da actividade ou quantidade do gene ou produto génico do processo de acordo com a invenção efectua-se, de um modo preferido, por meio de PCR quantitativo, uma conversão enzimática ou com auxilio de anticorpos. A invenção refere-se, além disso, à utilização de um composto que foi identificado através de um processo de acordo com a invenção como descrito anteriormente, para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças do sistema cardiovascular. As doenças do sistema cardiovascular são neste caso por exemplo o enfarte cardíaco, uma doença vascular coronária, a alteração patológica de vasos sanguíneos, como p. ex. aterosclerose ou a angina de peito. Em particular, estão englobadas as doenças do sistema cardiovascular que estão associadas com a formação de matriz extracelular, em que esta formação pode estar patologicamente alterada.

Numa forma de realização preferida para a utilização deste composto, o composto tem um peso molecular entre 100 e 50000 kDa e numa forma de realização particularmente preferida tem um peso molecular entre 100 e 5000 kDa. A modificação da actividade de um receptor de urotensina II significa que a transmissão de sinal mediada por este pode estar induzida, aumentada, interrompida ou atenuada. A modificação da actividade de um receptor de urotensina II efectua-se em particular através de agonistas ou antagonistas de urotensina II. A modificação do receptor de urotensina II pode efectuar-se no entanto também através dos assim designados moduladores alostéricos. Um agonista da urotensina II é um composto que suporta, mantém ou aumenta o efeito da urotensina II que ocorre 7 naturalmente numa determinada célula, enquanto um antagonista atenua ou suprime este efeito da urotensina II. Um modulador alostérico do receptor de urotensina II pode ser um composto que possua ele próprio apenas afinidade diminuta para o receptor mas que potência ou inibe o efeito de agonistas ou antagonistas. A actividade ou quantidade de um gene ou produto génico é influenciada quando a actividade ou quantidade do gene ou produto génico em questão numa determinada célula aumenta ou diminui em comparação a um controlo. 0 controlo consiste então numa célula comparável que não seja sujeita às medidas que conduzem à influência desta actividade ou quantidade. Como medidas são, neste caso, entendidas em particular a colocação em contacto de um composto com a célula. Uma célula, no sentido indicado acima, pode significar uma ou várias células de um órgão ou tecido de um animal vertebrado. Células deste tipo podem derivar de cérebro, pulmões, músculo, tecido gordo, tecido conjuntivo, do coração ou de outros órgãos. As células podem apresentar-se isoladas ou podem estar ainda associadas ao tecido. Células deste tipo compreendem, em particular, também células de cultura de células. Os animais vertebrados são, por exemplo, ratos, ratinhos, hamster, cobaios e o homem. A urotensina II é um polipéptido. No caso do homem, é composta por 11 aminoácidos. A urotensina II actua como hormona vasoconstritora muito eficaz. Em primatas ela provoca vasoconstrição sistémica, disfunção contráctil do miocárdio e colapso circulatório total. 0 efeito da urotensina II é mediado através do receptor de GPC GPR14. As sequências para GPR14 são conhecidas. No pedido internacional WO 00/75168 está publicada, por exemplo, a sequência do GPR14 do ratinho. O receptor de urotensina II humano recombinante é comercialmente obtenível, por exemplo, de "Euroscreen". A matriz extracelular (ECM) desempenha um papel central a manutenção da identidade estrutural de tecidos. A ECM envolve as estruturas de tecido ou células individuais. A ECM é composta por colagénio, glicoproteínas não colagénicas e proteoglicanos. Neste caso a composição varia nos diferentes tecidos. A ECM forma uma rede altamente especializada, complexa e dinâmica. A par da sua função de suporte, ela participa, entre outras, na transmissão de sinal, na diferenciação celular, adesão, regeneração e migração. Além disso, a ECM desempenha um papel importante na fibrosação de tecidos, em que a esse respeito deve ser entendida uma deposição aumentada de tecido conjuntivo. Isto ocorre por exemplo na cicatrização após lesões no coração após um enfarte cardíaco, na alteração fibrosa dos pulmões ou alteração fibrosa do fígado após intoxicação hepática com solventes orgânicos ou alcoolismo excessivo e persistente. São afectados órgãos, em particular, também no decurso do processo progressivo de envelhecimento na sequência de acontecimentos temporais ou por desgaste excessivo. Funções defeituosas na formação da matriz extracelular desempenham um papel importante, em particular no caso da fibrose. A fibrose está associada com cicatrização excessivamente intensa na sequência de processos de cicatrização de feridas. Podem ser afectados órgãos como o coração, os rins, fígado, pulmões, olhos ou a pele. A fibrose é caracterizada por formação aumentada de colagénio e perdas de função dos órgãos afectados.

Na formação da ECM tomam parte colagénios, por exemplo, colagénio de tipo I ou colagénio de tipo IV, lamininas ou outras proteínas. Na degradação da ECM actuam proteinases que pertencem 9 ao grupo das metaloproteinases, proteinases de serina ou proteinases de cisteína.

As metaloproteinases apresentam domínios funcionais característicos. A sequência de sinal, prodomínio, domínio catalítico e o domínio semelhante à hemopexina C terminal são conservados em diferentes membros da família. A MMP2 e MMP9 contêm domínios semelhantes à fibronectina adicionais. A MMP2 também é conhecida como gelatinase A. Os substratos da MMP2 são colagénio I, II IV, V, VII, X, XI, XIV, elastina, fibronectina, gelatina e laminina. A via de sinal TGFbeta e a activação de CTGF são processos chave para a activação de genes de proteínas de matriz extracelulares, como o colagénio de tipo I. 0 CTGF é, por conseguinte, também designado como citocina fibrogénica. A disponibilização de uma célula compreende a sua preparação, cultura e processamento subsequente. A disponibilização efectua-se, por exemplo, por preparação de material celular adequado a partir de órgãos ou tecidos ou pela replicação de linhas celulares ou microrganismos adequados. Para a cultura podem ser utilizados diferentes meios nutritivos adequados. As células são mantidas à temperatura óptima para o organismo. Eventualmente são adicionados conservantes, antibióticos, indicadores de pH, componentes do soro de sangue, soro de sangue, substâncias auxiliares ou outros ao meio de crescimento respectivamente utilizado. São descritos processos para a preparação, cultura e processamento subsequente em obras de referência (exemplo: Basic Cell Culture; Ed. J. M. Davis; IRL Press; 1994).

Como células adequam-se de um modo preferido aquelas de mamíferos. Estas células podem consistir em células primárias ou 10 linhas celulares. Exemplos para células deste tipo são células primárias de órgãos de mamíferos (p. ex. cérebro, músculo, tecido gordo, tecido conjuntivo, coração, pulmões, fígado, rins, vasos sanguíneos, glândulas hormonais, entre outros). As células podem ser células nervosas, células musculares, células gordas, fibroblastos, leucócitos, células pulmonares, células hepáticas, células renais e outras. Linhas celulares adequadas são, de um modo preferido, células CHO, HEK 293, células COS, células 3T3 de ratinho, células Hela ou outras. De um modo preferido, podem ser adicionalmente utilizadas células de leveduras. É posto à disposição um composto químico, em particular por síntese química ou por isolamento de substâncias químicas a partir de material biológico. 0 material biológico contém células vivas ou não vivas, ou componentes destas.

Para a síntese química de um composto ou o isolamento de uma substância a partir de células biológicas o especialista pode recorrer a métodos de rotina. Métodos deste tipo estão disponibilizados para o especialista em manuais como o "Organic Synthesis Workbook; 1995; John Wiley & Sons; ISBN 3-527-30187-9", o "The Organic Chemistry of Drug Synthesis; 1998; John Wiley & Sons; ISBN 0-471-24510-0" ou o "Bioactive Compounds from Natural Sources; 2001; Taylor & Francis; ISBN 0-7484-0890-8".

Os compostos obtidos por síntese ou isolamento podem ser levados a solução num solvente adequado. Solventes adquados podem conter água, substâncias tampão (p. ex. Tris, Hepes, Mops, entre outros), iões monovalentes e/ou divalentes (p. ex. K+, Na+, Mg2+, Ca2+, entre outros), ácidos (p. ex. HC1, H2S04, ácido fórmico, ácido acético, entre outros), bases (p. ex. NaOH, entre outros), álcool (p. ex. metanol, etanol, glicerol), detergentes 11 (p. ex. dodecilsulfato de sódio, entre outros), solventes orgânicos (p. ex. formamida, acetona, dimetilsulfóxido, entre outros) bem como outros componentes, em particular para a solubilização ou estabilização. Um composto químico para o processo de acordo com a invenção deverá adequar-se como ligando para um GPCR.

Um composto deste tipo pode ser obtido em particular a partir de tecidos ou órgãos de vertebrados, como p. ex. tecido de células epiteliais, tecido cardíaco, tecido cerebral, sangue, soro ou plasma.

Para a colocação em contacto do composto químico com a linha celular indicada, o especialista pode utilizar métodos de rotina do laboratório. A colocação em contacto efectua-se, por exemplo, em Erlenmeyeres, tubos de ensaio, tubos Eppendorf ou em placas de microtítulação. Para a colocação em contacto podem ser utilizadas incubadoras, nas quais são ajustáveis uma temperatura constante de, por exemplo, 30 °C ou 37 °C, bem como condições de C02 ou condições de humidade do ar uniformes. A colocação em contacto pode também ser efectuada, em particular, em dispositivos de um robot de laboratório previstos para o efeito. A colocação em contacto é possível durante intervalos de tempo diferentes de poucos segundos, durante minutos até várias horas. As respectivas condições a seleccionar dependem do receptor, da linha celular e do composto químico. A actividade ou quantidade de um gene ou do seu produto génico pode referir-se à actividade do gene em relação ao seu promotor, à quantidade em ARN e ARNm formado, bem como à actividade enzimática ou à quantidade da proteína codificada por esse gene. A determinação da quantidade de um ARNm numa célula 12 pode efectuar-se por métodos diferentes, como por exemplo PCR ou técnicas de hibridação. Como técnicas de PCR estão à disposição do especialista, em particular, sistemas de PCR em tempo real, que são vendidos comercialmente por diferentes fornecedores. Estes fornecedores são Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Cortett Research, Roche Molecular Biochemicals ou Stratagene. Os sistemas de PCR em tempo real pertencem às ferramentas padronizadas do especialista. Como técnicas de hibridação para a determinação da quantidade de ARN adequam-se, por exemplo, a hibridação por transferência em gota ou a hibridação de Northern. Ambas as técnicas utilizam a formação de uma molécula de ácidos nucleicos de cadeia dupla a partir de duas cadeias individuais separadas provocada por emparelhamento de bases, em que uma cadeia é fixa a uma superfície de suporte e a outra cadeia móvel apresenta uma marcação radioactiva ou de outro tipo relativamente facilmente visualizável. As técnicas de hibridação são do conhecimento do especialista. Ele encontra técnicas deste tipo em manuais de referência como, em particular, em "Current Protocols in Molecular Biology; editado por Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Keven Struhl; John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, 2001. A determinação da actividade ou quantidade de uma proteína pode efectuar-se através da sua actividade enzimática ou com auxílio de anticorpos específicos. No caso da actividade enzimática é determinada a conversão da respectiva enzima em relação ao seu substrato. Para isso é montado um ensaio que assegura à enzima condições de actividade óptimas relativamente a pH, cofactores, meio iónico, temperatura e à concentração de substrato e possibilita uma medição dentro da gama proporcional de conversão. A determinação da conversão de substrato pode 13 efectuar-se por exemplo pela incorporação de precursores marcados radioactivamente em macromoléculas ou pela decomposição de macromoléculas marcadas radioactivamente em produtos de decomposição, pela sua subsequente separação e determinação das respectivas quantidades radioactivas. No caso da utilização de anticorpos para a determinação da quantidade de uma proteína, o especialista serve-se de técnicas como a hibridação de Southern, RIA (Ensaio Radioimonológico), ELISA (Imunoensaio de adsorção ligado à enzima) e outros. 0 especialista também encontra nos previamente indicados "Current Protocols in Molecular Biology" instruções práticas detalhadas para a realização destes métodos de detecção. 0 composto encontra-se no medicamento, de um modo preferido, com um suporte aceitável, na forma de uma composição farmacêutica. 0 suporte tem naturalmente que ser aceitável, no sentido de ser compatível com os outros componentes da composição e não ser lesivo para a saúde do doente. 0 suporte pode ser uma substância sólida ou um líquido, ou ambos e, de um modo preferido, é formulado com o composto como dose individual, por exemplo, como comprimido, que pode conter 0,05% até 95% em peso da substância activa. As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser preparadas de acordo com um dos métodos farmacêuticos conhecidos, que no essencial consistem em misturar os componentes com substâncias de suporte e/ou substâncias auxiliares farmacologicamente aceitáveis. Composições farmacêuticas de acordo com a invenção são aquelas que são adequadas para a administração oral, rectal, tópica, perorai (p. ex. sublingual) e parentérica (p. ex. subcutânea, intramuscular, intradérmica ou intravenosa). 14 A quantidade de um composto que é necessária para alcançar um efeito biológico desejado está dependente de uma série de factores como p. ex. o composto especifico seleccionado, a utilização proposta, o tipo da administração ou o estado clinico do doente. Os valores de quantidades indicados em seguida referem-se a um ligando.

Em geral, a dose diária encontra-se na gama de 0,3 mg até 100 mg (tipicamente de 3 mg até 50 mg) por dia por quilograma de peso corporal, p. ex. 3-10 mg/kg/dia. Uma dose intravenosa pode encontrar-se, p. ex., na gama de 0,3 mg até 1,0 mg/kg, que de um modo adequado pode ser administrada como infusão de 10 ng até 100 ng por quilograma por minuto. Soluções de infusão adequadas para estes fins podem conter, p. ex., de 0,1 ng até 10 mg, tipicamente de 1 ng até 10 mg por mililitro. As doses individuais podem conter, p. ex., de 1 mg até 10 g da substância activa. Com isso, as ampolas para injecções podem conter, por exemplo, de 1 mg até 100 mg e as formulações de dose individual administráveis oralmente, como por exemplo comprimidos ou cápsulas, podem conter, por exemplo, de 1,0 até 1000 mg, tipicamente de 10 até 600 mg.

Abreviaturas

AII Angiotensina II

ColI Colagenase I

Con Controlo

MMP2 Metaloproteinase da matriz II UII Urotensina II. 15

Exemplos 1. Isolamento e cultivo de fibroblastos de corações humanos 0 isolamento de fibroblastos de corações humanos efectuou-se como descrito em Cell and Tissue Research 286, 145 - 153 (1996). A cultura de células resultante consistia em fibroblastos a 96 - 98%.

Para a realização, foi cortado tecido cardíaco em pedaços pequenos e foi incubado três vezes em KHB (tampão de Krebs Henseleit) contendo 2 mg/mL de colagenase e 2 mg/mL de dispase, durante 20 minutos a 37 °C. Os homogenatos foram reunidos e subsequentemente centrifugados. Os sedimentos foram recolhidos em 10 mL de KHB. As células foram adicionadas respectivamente em porções de 2 até 3 mL em recipientes plásticos não revestidos. O volume foi completado a 10 mL com DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle' s Médium) contendo 4,5 mg/L de glucose e 10% de FCS (soro fetal de vitelo) . Após incubação durante 1 hora a 37 °C, as células foram lavadas duas vezes com PBS (soro fisiológico com fosfato) e em seguida foram cultivadas durante cerca de 4-8 semanas a 37 °C e 5% de C02, até ter sido alcançada 90% de confluência. Depois disso seguiram-se duas passagens adicionais de respectivamente 4 semanas de duração. As células das experiências em questão foram utilizadas após a segunda passagem a 70% até 90% de confluência (cerca de 3 meses após o isolamento). 16

2. Estimulação dos fibroblastos de coraçoes humanos através de angiotensina II e urotensina II

Os reagentes para a realização das técnicas de cultura de células foram obtidos de Gibco BRL Life Technologies. As células foram em primeiro lugar mantidas a 37 °C em DMEM livre de soro contendo 4000 mg de glucose/L, 2 mM de L-glutamina,

100 pg/0,1 mg/mL de penicilina/estreptomicina e 0,1% de BSA (albumina de soro bovino) , antes de ter sido adicionada angiotensina II ou urotensina II até respectivamente 0,1 μΜ de concentração final. Em seguida, após 6 horas, foi preparado ARN a partir das células. 3. Realizaçao da quantificaçao de ARN específicos por PCR em tempo real O ARN foi isolado por meio de métodos estandardizados com o auxílio de cloreto de guanidina.

De cada amostra foram transcritos 500 ng de ARN com transcriptase reversa (10 unidades/ng ARN) em ADN. Para a decomposição do ADN, o volume total com cerca de 8 - 10 pg de ARN foi incubado com DNAse I. A quantificação dos ARN efectuou-se com o Light-Cycler e um kit de RT-PCR Fast Start Sybr-Green da Roche Molecular

Biochemicals. Para a mesma finalidade adequam-se também kits correspondentes de outras firmas, como Applied Biosystems,

Bio-Rad ou Stratagene. Como iniciadores foram utilizados para ColI os iniciadores correspondentes às SEQ ID N° 1 e 2, para MMP2 os iniciadores correspondentes às SEQ ID N° 3 e 4, para 17 GAPDH como controlo os iniciadores correspondentes às SEQ ID N° 5 e 6, para TGFbeta os iniciadores correspondentes às SEQ ID N° 7 e 8, e para CTGF os iniciadores correspondentes às SEQ ID N° 9 e 10. A reacção foi em primeiro lugar mantida constante durante 10 minutos a 95 °C. Depois seguiram-se 40 ciclos, em que cada ciclo era composto por uma incubação durante 10 segundos a 95 °C, 5 segundos a 60 °C e 12 segundos a 72 °C. A especificidade da reacção foi confirmada através de uma curva de fusão. O nivelamento das quantidades efectuou-se com ARNm de GAPDH como controlo. 4. Indução de genes que estão envolvidos na síntese da membrana basal em fibroblastos do coração

Os fibroblastos foram isolados de três corações humanos e foram utilizados na primeira passagem. As células foram cultivadas até cerca de 80% de confluência, mantidas sem soro durante 24 horas adicionais e estimuladas com 1 μΜ de urotensina II, 1 μΜ de angiotensina II ou substâncias tampão como controlo durante 6 horas, respectivamente em preparações em duplicado. Os ARNm (colagénio I, metaloproteinase de matriz 2, TGFbetal, CTGF) foram quantificados por meio de "Real time PCR" por utilização de um Light Cyclers™. Como referência padrão foi utilizado o ARNm de GAPDH (gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase). O Real time PCR (reacção da polimerase em cadeia em tempo real) possibilita a determinação quantitativa de ácidos nucleicos específicos. A técnica baseia-se na utilização combinada de corantes fluorescentes com a reacção da polimerase em cadeia de ARN transcrito reversamente. Existem entretanto diferentes fornecedores de kits de ensaio. O sistema é comercialmente 18 obtenível por exemplo de Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Carbett Research, Roche Molecular Biochemicals ou Stratagene. A estimulação por urotensina II conduziu a um aumento significativo dos ARNm de colagénio I, MMP2, TGFbetal e CTGF.

Col 1 MMP2 TGFbetal CTGF Con 0,56 +/- 0,1 0,43 + /- 0,2 0,60 o o 1 + 1 + LO O 0,27 UII 0,92 +/- 0,3* 0,65 + /- 0,3* 0,81 +/- 0,1* O 00 00 + 1 0,2* AI I 0,56 +/- 0,27 0,22 + /- 0,1 0,71 + 1 o o -J 1 + PO O 0,9 *: P < 0,05 vs controlo; A formação destes ARN mostra a enorme importância urotensina II e do seu receptor para a síntese de matriz e a reconstrução de tecidos em vasos e no coração. Os respectivos agonistas e antagonistas têm por conseguinte grande valor farmacológico relativamente a remodelações no coração, em particular após um ataque cardíaco nas áreas afectadas, para a prevenção, impedimento ou reversão da cicatrização no tecido cardíaco, em particular, no entanto, também no caso de tensão arterial elevada ou doenças pulmonares obstrutivas. A angiotensina II é a molécula efectora principal do sistema renina - angiotensina. A hormona peptídica provoca efeitos fisiológicos distintos. Assim, a angiotensina II está envolvida na alteração da resistência periférica. Ela tem influência sobre a função renal e comanda, entre outras, a reabsorção de sódio. Além disso actua como factor de crescimento. 19 5. Indução da síntese de colagenase por urotensina em fibroblastos cardíacos humanos

Foram isolados fibroblastos cardíacos humanos a partir de sete corações humanos explantados em estádio terminal da insuficiência cardíaca devido a cardiomiopatia dilatada. Foram igualmente preparadas quatro preparações de células de corações de dadores saudáveis. Os fibroblastos foram isolados em placas de Petri estéreis de 10 cm e foram cultivados como descrito anteriormente. Após cerca de 12 semanas de cultivo, as células alcançaram a segunda passagem com cerca de 80% de confluência. Neste estado, o soro foi retirado durante 48 horas e, em seguida, foram estimuladas durante intervalos de tempo diferentes (de 6 até 24 horas) com UII, Ang II, TNFalfa, TGFB, UII + TNFa (respectivamente 10~7 mol/L) ou tampão (controlo). Foram realizadas determinações em duplicado ou triplicado. Após a estimulação, as células foram lavadas, removidas das placas de Petri por meio de 1 mL de PBS e centrifugadas em tubos Eppendorf (100 rpm, 5 min, 4 °C) . O sobrenadante foi descartado. A cerca de 50 pL de células foram adicionados 100 pL de tampão de lise (Nonident P40, 0,5%, SDS 0,5%) e foram incubadas em gelo durante 20 minutos adicionais. 0 lisado foi novamente centrifugado (20 minutos, 1400 rpm, 4 °C) e o sobrenadante foi utilizado para as experiências subsequentes. A determinação de proteína foi efectuada com o ensaio de BCA (ácido bicinconínico). Os homogenatos foram diluídos para uma concentração de proteína de 2 pg/pL. O procolagénio de tipo I C-peptídico dos fibroblastos de todos os corações foi determinado por meio de um ensaio ELISA em fase sólida obtenível comercialmente numa placa de microtitulação de 96 poços (TaKaRa Biomedicals, Shuzo Co, Ltd.). 20 0 ensaio foi efectuado de acordo com as instruções do fabricante. Neste caso não se mostrou qualquer actividade cruzada com fibronectina humana, vitronectina, laminina, colagénio de tipo I ou colagénio de tipo III. A determinação dos valores para o procolagénio de tipo I C-peptídico foi determinada com o auxílio de uma curva padrão de 10 - 640 ng/mL. Os padrões foram postos à disposição pelo fabricante. Os valores de absorção das estimulações dos controlos (tampões) foram fixados como 100%. Os valores de absorção das células estimuladas foram fixados em relação aos valores controlo para o mesmo coração. Para os cálculos, foram utilizados respectivamente os valores médios de determinações em duplicado ou triplicado. Para a avaliação estatística da comparação das respostas de estimulação em células controlo e células de insuficiência cardíaca foi utilizado um teste T bilateral, não emparelhado. A proteína de procolagénio I está aumentada nos fibroblastos cardíacos explantados dos corações com falha cardíaca após estimulação com UII (173 +/- 42% do controlo), Ang II (205 +/- 67%), TGFh (202 +/- 52%) e em escala mais diminuta com TNFalfa (139 +/- 26%) (Tabela 1). 0 aumento produziu-se de forma dependente do tempo, no entanto foi observado logo após 6 horas. Em oposição a isto, a quantidade de proteína de colagénio não estava alterada nos fibroblastos dos corações de dadores que foram estimulados com os mesmos péptidos: UII (98% do controlo), Ang II (88%), TGFh (97%) e TNFalfa (86%). As diferenças entre células dos corações controlo e células dos corações com insuficiência cardíaca eram estatisticamente significativas após estimulação com UII e TNFalfa. Foram observadas as mesmas tendências também com Angll e TGFbeta. 21

Tabela 1 Síntese de colagénio em fibroblastos de coraçoes em estado terminal de insuficiência cardíaca (EFH)

Coração Tempo Contr Angll TGFb UII TNF a UII (n °.) (h) (Absorção, em % dos controlos) 1 24 h 100 142 166 198 166 4 24 h 100 471 377 458 262 10 5 h 100 94 142 102 67 11 5 h 100 113 123 243 91 12 12 h 100 _ _ 117 107 128 13 12 h 100 _ _ 165 126 139 14 12 h 100 - - 226 190 218 MW 100 205 202 173 139 162 SEM 67 52 42 26 18 Síntese de colagénio em corações controlo (contr) Coração Tempo Contr AngI I TGFfi UII TNFa (n° .) (h) (Absorção, em % dos controlos) 3 6 h 100 84 84 103 81 3 12 h 100 92 123 80 92 5 6 h 100 88 71 106 77 6 6 h 100 - 110 104 92 MW 100 88 97 98 86 SEM 2 12 6 4 p (EFH contra controlos) 0,3 0,16 0,05 0,02 (N° ): número de código interno para os corações. 22

<110> Aventis Pharma Alemanha GmbH para a sistema <120> Processo para a identificação de compostos terapia de processos de envelhecimento do cardiovascular <130> AVE D-2001/A032 <140> <141> <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 cgttggacct cctggtaatc <210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 2 ccttgttacc gctctctcct 20 23 <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 acctggatgc cgtcgtggac <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 4 tgtggcagca ccagggcagc <210> 5 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 gcaggaggca ttgctgat 1 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens 2 4 <400> 6 caccatcttc caggagcgag 20

<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 gttgtaatgg caggcacagg 20

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 cacactgcaa gtggacatca acg 23

<210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 tctccgtgga gctgaagcaa tagt 24 25 <210> 10

<211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 ggcttaccga ctggaagaca 20

Lisboa, 19 de Outubro de 2010 26

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo in vitro para a identificação de um composto que modifica a actividade do receptor de urotensina II de modo a que sejam influenciadas a actividade ou quantidade de um gene ou produto génico, que está envolvido na composição, formação ou degradação da matriz extracelular, em que a] é posta à disposição uma célula na qual é formado um receptor de urotensina II, b] é posto à disposição um composto químico, c] a célula de a] é posta em contacto com o composto químico de b], d] depois disso é determinada a actividade ou quantidade de um gene ou do seu produto génico a partir da célula de c] , em que este produto génico está envolvido na composição, formação ou degradação da matriz extracelular, e] é comparada a actividade ou quantidade de d] com a actividade ou quantidade desse mesmo gene ou produto génico de uma célula controlo correspondente, que não tinha sido posta em contacto com o composto de b], em que em d] é seleccionado no mínimo um gene do grupo Col 1, MMP2, TGFbetal ou CTGF.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a célula que é posta à disposição é uma célula de mamífero. 1
3. 3. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 2, em que a célula que é posta à disposição é uma célula humana.
4. 4· Processo de acordo com uma ou varias das reivindicações 1 a 3, em que a célula que é posta à disposição é uma célula do coração ou um fibroblasto.
5. 5. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 4, em que o composto que é posto à disposição tem um peso molecular entre 100 e 50 000 kDa.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o peso molecular se encontra entre 100 e 5000 kDa.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que o composto é uma substância natural, uma proteína, um polinucleótido, um composto contendo açúcar ou um composto contendo gordura.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o composto é urotensina II.
9. 9. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 8, em que a determinação de acordo com d] ou e] se efectua por meio de PCR quantitativo.
10. 10. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 8, em que a determinação de acordo com d] ou e] se efectua por meio de uma conversão enzimática. 2
11. 11. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 8, em que a determinação de acordo com d] ou e] se efectua por meio de um anticorpo. Lisboa, 19 de Outubro de 2010 3